JP6840629B2 - 細胞培養器具および細胞培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養器具に関するものである。

細胞培養技術は、創薬、再生医療などの種々の分野で有用な技術として近年注目されている。足場依存性の細胞を培養する際には、一般に、細胞の足場となる基材である細胞培養用膜が用いられる。従来、このような細胞培養用膜を備える細胞培養器具として、例えば、互いに係合する凹凸形状を有する２つのリング状部材の間に細胞培養用膜を配置し、上記凹凸形状の部位において細胞培養用膜の外周を挟み込んで細胞培養用膜を保持する器具が提案されている（例えば、特許文献１参照）。

特開２００５−３４８７３６号公報 特表平１１−５１０３９４号公報

しかしながら、細胞培養用膜は、一般に数μｍ〜数十μｍ程度の薄さであり、このように薄い細胞培養用膜を確実に保持するためには、細胞培養用膜の外周を挟み込むための既述したリング状部材における凹凸形状の寸法精度を、十分に高くする必要があった。このように高い寸法精度が要求されると、細胞培養器具の製造工程の煩雑化やコストの増加を引き起こす可能性がある。そのため、細胞培養器具の構成部材の寸法精度に対する要求を抑えつつ、十分に高い信頼性で細胞培養用膜を保持できる細胞培養器具が望まれていた。また、細胞培養用膜の両面における細胞の播種と培養を容易に行える技術が望まれていた。

本発明は、上述の課題の少なくとも一部を解決するためになされたものであり、以下の形態として実現することが可能である。
本発明の一形態は、細胞培養用膜が内部で水平に保持されると共に、高さ方向に延びる第１のスリットを有する筒状の細胞培養器具を用いて、前記細胞培養用膜の一方の面および他方の面で培養液中において細胞を培養する細胞培養方法であって、前記細胞培養器具は、筒状の第１の内筒であって、該第１の内筒の一方の端部全体を覆うように前記細胞培養用膜を保持するための第１の内筒と、筒状に形成されて、前記第１の内筒と高さ方向が一致するように前記第１の内筒を内部に収容する外筒であって、前記外筒を径方向に弾性変形可能にする前記第１のスリットが前記高さ方向に沿って前記外筒全体に形成されると共に、前記第１の内筒が内部にはめ込まれたときには、前記外筒の弾性復元力により、前記第１の内筒を保持する外筒と、を備え、前記細胞培養用膜の前記一方の面に細胞を播種して培養し、前記一方の面に細胞を播種して培養した後に、前記細胞培養器具を上下反転させ、前記細胞培養用膜の前記他方の面に細胞を播種すると共に、前記第１のスリットを介して前記一方の面上からエアを抜くことを特徴とする。このような形態であれば、細胞培養用膜上に細胞を播種した後に、細胞培養器具を上下反転させたときに、細胞培養用膜における上記細胞を播種した面上に残留するエアを、第１のスリットを介して排出させることが可能になる。また、細胞培養用膜の両面における細胞の播種と培養を容易に行うことができる。
本発明の他の一形態は、細胞培養器具であって；筒状の第１の内筒であって、該第１の内筒の一方の端部全体を覆うように細胞培養用膜を保持するための第１の内筒と；筒状に形成されて、前記第１の内筒と高さ方向が一致するように前記第１の内筒を内部に収容する外筒であって、前記外筒を径方向に弾性変形可能にする第１のスリットが前記高さ方向に沿って前記外筒全体に形成されると共に、前記第１の内筒が内部にはめ込まれたときには、前記外筒の弾性復元力により、前記第１の内筒を保持する外筒と；を備える。このような形態であれば、第１の内筒の一方の端部と重なる領域において高さ方向に延びる第１のスリットを設けて、外筒の弾性復元力により、一方の端部全体を覆うように細胞培養用膜を保持するための第１の内筒を保持するため、各部材の寸法精度に対する要求を抑えつつ十分に高い信頼性で、細胞培養用膜を保持することが可能になる。その結果、細胞培養器具の製造工程の煩雑化やコストの増加を抑えることができる。また、第１の内筒の一方の端部と重なる領域において高さ方向に延びる第１のスリットを設けるため、第１の内筒の一方の端部全体を覆うように細胞培養用膜を保持し、細胞培養用膜上に細胞を播種した後に、細胞培養器具を上下反転させたときに、細胞培養用膜における上記細胞を播種した面上に残留するエアを、第１のスリットを介して排出させることが可能になる。また、細胞培養用膜の両面における細胞の播種と培養を容易に行うことができる。
その他、本発明は、以下のような形態として実現することも可能である。

（１）本発明の一形態によれば、細胞培養器具が提供される。この細胞培養器具は、筒状の第１の内筒と；前記第１の内筒の一方の端部全体を覆って配置された細胞培養用膜であって、前記第１の内筒の前記一方の端部の外周に沿って、前記第１の内筒の外側面側へと折り曲げられた細胞培養用膜と；筒状に形成されて、前記第１の内筒と高さ方向が一致するように前記第１の内筒を内部に収容する外筒であって、少なくとも前記第１の内筒の前記一方の端部と重なる領域において、前記高さ方向に延びる第１のスリットが形成されると共に、前記外筒の内壁面と前記第１の内筒の外側面との間で、前記細胞培養用膜を挟持する外筒と；を備える。
この形態の細胞培養器具によれば、第１の内筒の一方の端部と重なる領域において高さ方向に延びる第１のスリットを設けて、外筒の内壁面と第１の内筒の外側面との間で細胞培養用膜を挟持するため、各部材の寸法精度に対する要求を抑えつつ十分に高い信頼性で、細胞培養用膜を保持することが可能になる。その結果、細胞培養器具の製造工程の煩雑化やコストの増加を抑えることができる。

（２）上記形態の細胞培養器具において、前記第１のスリットは、前記高さ方向に沿って前記外筒全体に形成されていることとしてもよい。この形態の細胞培養器具によれば、一方の端部に細胞培養用膜を配置した第１の内筒を外筒に嵌め込む動作を容易化することができる。

（３）上記形態の細胞培養器具において、前記外筒は、前記第１の内筒の両端部のうちの前記一方の端部により近い側の端部において、該端部の開口を跨ぐように該開口の外周の異なる位置間を連結した第１の把持部を備えることとしてもよい。
このような構成とすれば、把持部を把持することによって細胞培養器具を吊り下げることが可能になり、細胞培養器具を取り扱う操作を容易化することができる。

（４）上記形態の細胞培養器具において、さらに、前記第１の内筒と高さ方向が同じである筒状に形成されて、前記第１の内筒の前記一方の端部側で前記細胞培養用膜を介して前記第１の内筒と接するように前記外筒内に収容される第２の内筒を備えることとしてもよい。
このような構成とすれば、第１の内筒の外側に面する細胞培養用膜の面上に細胞を播種する際に、第１のスリットを介した細胞培養器具の外部への細胞の流出が第２の内筒によって抑えられる。そのため、播種する細胞数の精度を向上させることができる。

（５）上記形態の細胞培養器具において、前記第２の内筒は、前記高さ方向の力を加えることにより、前記外筒内で前記高さ方向にスライド可能であって、スライドさせた位置にて保持可能であることとしてもよい。
このような構成とすれば、第２の内筒内で露出する細胞培養用膜上に細胞を播種した後に、第２の内筒をスライドさせて細胞培養用膜から離間させ、さらに細胞培養器具を上下反転させることにより、細胞培養用膜における上記細胞を播種した面上に残留するエアを、第１のスリットを介して容易に排出させることが可能になる。

（６）上記形態の細胞培養器具において、前記外筒に形成される前記第１のスリットは、前記第１の内筒の前記一方の端部と前記外筒とが重なる位置から、前記第１の内筒から高さ方向に離間する方向に向かって延びるように形成されていることとしてもよい。
このような構成とすれば、前記第１の内筒の外部に面する前記細胞培養用膜の面上に細胞を播種した後に、細胞培養器具を上下反転させたときに、細胞培養用膜における上記細胞を播種した面上に残留するエアを、第１のスリットを介して容易に排出させることが可能になる。

（７）上記形態の細胞培養器具において、前記第１の内筒は、該第１の内筒の両端部のうちの他方の端部において、該他方の端部の開口を跨ぐように該他方の端部の開口の外周の異なる位置間を連結した第２の把持部を備えることとしてもよい。
このような構成とすれば、第１の内筒の端部のうち、前記他方の端部側が鉛直方向上方となる向きに細胞培養器具が配置されるときに、第２の把持部を把持することによって細胞培養器具を吊り下げることが可能になり、細胞培養器具を取り扱う操作を容易化することができる。

（８）上記形態の細胞培養器具において、前記第１の把持部は、前記第１の内筒の軸線上付近で交わる２本の線分状に形成されていることとしてもよい。
このような構成とすれば、第１又は第２の把持部を把持して細胞培養器具を吊り下げる際に、細胞培養用膜の水平を安定して保つことが容易となり、細胞培養用膜上で培養される細胞に対する望ましくない外的刺激（ノイズ）等を抑えることができる。

（９）上記形態の細胞培養器具において、前記第２の把持部は、前記第１の内筒の軸線上付近で交わる２本の線分状に形成されていることとしてもよい。
このような構成とすれば、第１又は第２の把持部を把持して細胞培養器具を吊り下げる際に、細胞培養用膜の水平を安定して保つことが容易となり、細胞培養用膜上で培養される細胞に対する望ましくない外的刺激（ノイズ）等を抑えることができる。

（１０）上記形態の細胞培養器具において、前記第１の内筒には；前記外筒に設けた前記第１のスリットと重なる位置において、前記一方の端部から前記高さ方向に延びる第２のスリットと；前記外筒に設けた前記第１のスリットと重なる位置であって、前記第１の内筒の前記一方の端部における前記第２のスリットが開口する位置において、前記第１の内筒の径方向外側に向かって前記第１のスリットを経由して前記外筒の外側に延びる一対の膜支持部と；が設けられていることとしてもよい。
このような構成とすれば、前記第１の内筒の外部に面する前記細胞培養用膜の面上に細胞を播種する際に、細胞培養用膜における細胞を播種する面の裏面に残留するエアを、第１のスリットおよび第２のスリットを介して排出させることが可能になる。

（１１）上記形態の細胞培養器具において、前記第１の内筒は、該第１の内筒における前記一方の端部近傍の外側面であって、前記細胞培養用膜と接する位置に、凹凸形状が設けられていることとしてもよい。
このような構成とすれば、第１の内筒および外筒によって細胞培養用膜を挟持する際の保持力を高めることができる。

本発明は、装置以外の種々の形態で実現することも可能である。例えば、細胞培養器具用の外筒、細胞培養器具の製造方法、細胞培養用膜の保持方法、あるいは細胞培養器具を用いた細胞培養方法等の形態で実現することが可能である。

本発明の細胞培養器具によれば、第１の内筒の一方の端部と重なる領域において高さ方向に延びる第１のスリットを設けて、外筒の内壁面と第１の内筒の外側面との間で細胞培養用膜を挟持するため、各部材の寸法精度に対する要求を抑えつつ十分に高い信頼性で、細胞培養用膜を保持することが可能になる。その結果、細胞培養器具の製造工程の煩雑化やコストの増加を抑えることができる。

細胞培養器具の構成を表わす断面模式図である。 細胞培養器具の組み立ての様子を説明するための分解斜視図である。 細胞培養器具の上面図である。 細胞培養器具の構成を表わす断面模式図である。 細胞培養器具の組み立ての様子を説明するための分解斜視図である。 細胞培養器具の構成を表わす断面模式図である。 第１の内筒の一部を拡大して示す斜視図である。 細胞培養器具の構成を表わす断面模式図である。 細胞培養器具の構成を表わす断面模式図である。

Ａ．第１の実施形態：
図１は、本発明の第１の実施形態である細胞培養器具１０の構成を表わす断面模式図であり、図２は、細胞培養器具１０の組み立ての様子を説明するための分解斜視図であり、図３は、細胞培養器具１０の上面図である。なお、図３では、図１に示す断面の位置をＡ−Ａ断面として示している。細胞培養器具１０は、外筒１２と、第１の内筒１４と、細胞培養用膜１６と、を備える。

外筒１２は、筒状の部材であって、一方の端部１２ｏから他方の端部１２ｔまで高さ方向に延びる第１のスリット１２ｓが形成されている。外筒１２は、一方の端部１２ｏにおいて、この一方の端部１２ｏの開口を跨ぐように、開口の外周の異なる位置間を連結した第１の把持部１２ｈを備える。具体的には、第１の把持部１２ｈは、第１の内筒１４の軸線上で交わる２本の線分状、すなわち、上面視が十字形状となるように形成されている（図２および図３参照）。外筒１２は、例えば、樹脂材料やゴムにより形成することができる。外筒１２は、高さ方向に第１のスリット１２ｓを設けることにより、径方向に弾性変形可能となる材料により形成すればよい。また、外筒１２は、後述するように第１の内筒１４との間で細胞培養用膜１６を挟んで保持するため、径方向外側に弾性変形して第１の内筒１４と共に細胞培養用膜１６を挟持したときに、径方向内側に向かう十分な把持力を生じ得る材料により形成すればよい。

第１の内筒１４は、筒状の部材であって、外筒１２よりも高さが小さく形成されている。第１の内筒１４の一方の端部１４ｏには、細胞培養用膜１６が配置され、他方の端部１４ｔには、外筒１２に設けた第１の把持部１２ｈと同様の第２の把持部１４ｈが設けられている。第１の内筒１４は、例えば、樹脂材料やガラスにより形成することができる。第１の内筒１４は、後述するように外筒１２との間で細胞培養用膜１６を挟んで保持するため、外筒１２の内壁面から径方向内側に向かう力が加えられたときに、実質的に変形しない剛性を実現できる材料により形成すればよい。

なお、後述するように、細胞培養器具１０は、細胞培養を行なう際には培養液中に浸漬して用いるため、外筒１２および第１の内筒１４は、培養細胞に影響し得る金属イオン等の成分が培養液中に実質的に溶出しない材料により形成すればよい。また、外筒１２および第１の内筒１４は、細胞培養器具１０を培養液中で浮遊させない比重を有する材料により形成することが望ましい。外筒１２および第１の内筒１４を樹脂により形成する場合には、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン（ＰＰ）、シリコーン樹脂、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、およびポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）から選択される樹脂を用いることができる。

細胞培養用膜１６は、細胞培養を行なう際に培養細胞の足場となる膜である。細胞培養用膜１６としては、例えば、ポリウレタン膜、セルロース膜、コラーゲン膜、羊膜、ヒアルロン酸膜等から選択される膜を用いることができる。ここで、本実施形態では、細胞培養用膜１６を折り曲げて外筒１２と第１の内筒１４との間で挟持して細胞培養器具１０を用いるため、細胞培養用膜１６は、上記折り曲げおよび挟持に耐える弾性および強度を有すればよい。また、細胞培養用膜１６として、膜の厚み方向に貫通する多数の細孔を有する多孔質膜を用いる場合には、後述するように両面で異なる種類の細胞を培養して、異種細胞間の相互作用を解析することが可能になる。そのため、膜を厚み方向に貫通する貫通孔の形成が容易であり、弾性および強度が優れているという観点から、細胞培養用膜１６としては、特に多孔質ポリウレタン膜を用いることが望ましい。

細胞培養用膜１６として用いる多孔質ポリウレタン膜は、例えば以下のようにして製造することができる。まず、ポリエーテルポリオール等のポリオールと、芳香族イソシアネート等のイソシアネートと、希釈溶剤とを含む未硬化ポリウレタン原料を用意する。その後、基板上に、用意した未硬化ポリウレタン原料の層を形成する。そして、未硬化ポリウレタン原料の層に対して水蒸気を供給しながらポリウレタン原料の層を硬化させることにより、ポリウレタン多孔質膜が得られる。

未硬化ポリウレタン原料の層に対して水蒸気を供給する具体的な方法としては、例えば、水を入れた密閉容器内において、基板上の未硬化ポリウレタン原料の層の露出面が水に対向するように、未硬化ポリウレタン原料の層を配置する。そして、密閉容器内を所定の温度に維持して飽和蒸気圧にする。これにより、未硬化ポリウレタン原料の層の表面から水蒸気が供給されて、ポリウレタン原料中のイソシアネートと水蒸気とが反応して二酸化炭素を生じる。また、ポリオールとイソシアネートとによって硬化反応が進行する。このように、硬化途中のポリウレタンが発泡することにより、多孔質ポリウレタン膜が得られる。なお、上記した水蒸気の供給を伴う硬化反応における反応温度、反応時間、硬化時に供給する水蒸気の量、およびポリウレタン原料の組成から選択される条件を調節することにより、ポリウレタン多孔質膜の形状を制御することが可能になる。

外筒１２と第１の内筒１４と細胞培養用膜１６とを用いた細胞培養器具１０の組み立て方法は、図２に示すとおりである。すなわち、細胞培養器具１０を組み立てる際には、まず、第１の内筒１４の一方の端部１４ｏ（第２の把持部１４ｈを有しない側の端部）上に、細胞培養用膜１６を配置する。なお、図２では、細胞培養用膜１６を四角形状に表わしているが、異なる形状としてもよい。第１の内筒１４の端部（横断面）よりも十分に大きく、第１の内筒１４の一方の端部１４ｏ全体を覆うことが可能であって、外筒１２と第１の内筒１４とによって細胞培養用膜１６の周縁部を挟持したときに、十分な信頼性で細胞培養用膜１６を保持可能となる大きさであればよい。

その後、第１の内筒１４に対して、一方の端部１４ｏ側から、外筒１２の他方の端部１２ｔ（第１の把持部１２ｈを有しない側の端部）を嵌め込む。これにより、細胞培養用膜１６は、第１の内筒１４の一方の端部１４ｏの外周に沿って折り曲げられ、折り曲げられた位置よりも外周側である周縁部は、第１の内筒１４の外側面と外筒１２の内壁面によって挟持されるようになる。本実施形態では、外筒１２の上記他方の端部１２ｔと、第１の内筒１４の他方の端部１４ｔ（第２の把持部１４ｈを有する側の端部）とが重なるまで、外筒１２を嵌め込む（図１（Ａ）参照）。

外筒１２の内径は、上記嵌め込みを行なう前は、第１の内筒１４の外径よりも小さく形成されている。そのため、外筒１２内に第１の内筒１４および細胞培養用膜１６を収納するために、第１の内筒１４の外側に外筒１２を嵌め込む際には、第１のスリット１２ｓが広がるように外筒１２が押し広げられて、外筒１２は、径方向外側に弾性変形する。これにより、外筒１２から第１の内筒１４側へと、径方向内側に向かう把持力が生じると共に、外筒１２と第１の内筒１４とが、細胞培養用膜１６を介して隙間無く接する。その結果、細胞培養用膜１６が、外筒１２と第１の内筒１４との間で保持される。なおここで、外筒１２の嵌め込みの際には、外筒１２の内径を、内筒１４の外径と略等しく、または若干大きくなるように予め拡径した状態で、内筒１４の外側に外筒１２を嵌め込み、その後、外筒１２をその弾性復元力により縮径させて、細胞培養膜１６を保持させてもよい。上記のように第１の内筒１４の外側に嵌め込まれた外筒１２は、後述するように細胞培養器具１０を上下反転させても外筒１２内における第１の内筒１４の相対的な位置が変化しない程度の把持力で、内筒１４を把持している。

組み立てた細胞培養器具１０を細胞培養に用いる際には、細胞培養器具１０を、さらに細胞培養用のプレートのウエル１１内に入れて（図２参照）、ウエル１１内を培養液で満たせばよい。

図１（Ａ）は、細胞培養用膜１６の一方の面（第１の内筒１４の外部に露出する面）上に細胞αを播種した様子を模式的に表わす。なお、図１では、培養液および細胞培養用プレートのウエル１１については記載を省略している。細胞培養用膜１６の一方の面上に細胞αを播種するには、外筒１２の一方の端部１２ｏが鉛直方向上方に位置するように細胞培養器具１０を培養液中に浸漬した状態で、細胞培養用膜１６の上記一方の面上に形成された外筒１２内の空間に対して、所定量の細胞αを供給すればよい。

図１（Ｂ）は、細胞培養用膜１６の他方の面（第１の内筒１４の内部に露出する面）上に、細胞αとは異なる細胞βをさらに播種した様子を示す。細胞βを播種する際には、図１（Ａ）のように細胞αを播種して所定期間培養した後に、細胞培養器具１０を上下反転させ、細胞培養用膜１６の上記他方の面上に形成された外筒１２および第１の内筒１４内の空間に対して、所定量の細胞βを供給すればよい。細胞培養用膜１６として、厚み方向に貫通する多数の貫通孔を有する多孔質な膜を用いることで、上記のようにして異なる細胞を各々の面で培養し、異種細胞間の相互作用を解析することが可能になる。

以上のように構成された本実施形態の細胞培養器具１０によれば、高さ方向に延びる第１のスリット１２ｓを有する外筒１２を、細胞培養用膜１６を配置した側から第１の内筒１４の外側に嵌め込むため、外筒１２から第１の内筒１４側へと径方向内側に向かう把持力を生じさせて、外筒１２と第１の内筒１４とによって細胞培養用膜１６を挟持することができる。そのため、各部材の寸法精度に対する要求を抑えつつ十分に高い信頼性で、細胞培養用膜１６を保持することが可能になり、その結果、細胞培養器具の製造工程の煩雑化やコストの増加を抑えることができる。

また、本実施形態の細胞培養器具１０によれば、細胞培養器具１０の組み立て動作を簡素化することができる。すなわち、第１の内筒１４の一方の端部１４ｏ上に細胞培養用膜１６を配置して、第１の内筒１４の一方の端部１４ｏ側の開口に沿って細胞培養用膜１６を折り曲げつつ、第１の内筒１４および細胞培養用膜１６の外側に外筒１２を嵌め込むという簡便な動作により、細胞培養器具１０を組み立てることができる。

特に、本実施形態の細胞培養器具１０によれば、外筒１２に形成される第１のスリット１２ｓが、外筒１２の高さ方向全体にわたって形成されているため、端部に細胞培養用膜１６を配置した第１の内筒１４を外筒１２に嵌め込む動作を容易化することができる。

また、本実施形態の細胞培養器具１０によれば、外筒１２の第１の把持部１２ｈおよび第１の内筒１４の第２の把持部１４ｈとして、外筒１２あるいは第１の内筒１４の端部の開口を跨ぐように、該開口の外周の異なる位置間を連結した把持部を設けている。そのため、細胞培養器具１０をウエル１１内に配置する際、あるいは、細胞培養器具１０をウエル１１から引き上げる際に、これらの把持部１２ｈまたは１４ｈを把持することによって細胞培養器具１０を吊り下げることが可能になり、細胞培養器具１０を取り扱う操作を容易化することができる。

特に、本実施形態では、第１の把持部１２ｈおよび第２の把持部１４ｈを第１の内筒１４の軸線上で交わる２本の線分状に形成している。そのため、この２本の線分の交点で把持することにより、細胞培養器具１０の重心の直上付近において細胞培養器具１０を把持することが容易になる。その結果、細胞培養器具１０を吊り下げる際に、細胞培養用膜１６の水平を保ち、細胞培養用膜１６上で培養される細胞に対する望ましくない外的刺激（ノイズ）等を抑えることが容易になる。

なお、第１の把持部１２ｈおよび第２の把持部１４ｈに係る上記２本の線分の交点が存在する「第１の内筒１４の軸線上」とは、第１の内筒１４の軸線上付近を含むものである。具体的には、「上記交点が第１の内筒１４の軸線上に存在する」とは、外筒１２および第１の内筒１４が円柱状である場合には、上記交点を含み第１の内筒１４の軸線に垂直な面において、上記交点が、第１の内筒１４の内周に比べて直径が１０分の１である第１の内筒１４の同心円の範囲内に含まれる構成を含む。また、後述するように、第１の内筒１４は円柱状以外の筒状に形成することが可能であるが、このような場合には、上記交点を含み第１の内筒１４の軸線に垂直な面において、上記交点が、第１の内筒１４の内周を重心が一致する状態で１０分の１に縮小させた範囲内に含まれる構成を含む。なお、細胞培養器具１０を吊り下げる際に、細胞培養膜１６の水平状態を保ち、細胞に対する望ましくない外的刺激（ノイズ）等を抑える観点からは、第１の内筒１４における軸線に垂直な面の形状は、回転対称であることが望ましい。

さらに、本実施形態の細胞培養器具１０によれば、外筒１２に形成される第１のスリット１２ｓは、第１の内筒１４の一方の端部１４ｔと外筒１２とが重なる位置から、第１の内筒１４から高さ方向に離間する方向に向かって延びている。したがって、外筒１２内の空間であって、細胞培養用膜１６の一方の面（最初に播種される細胞αの培養面）上の空間が、細胞αの培養用面の近傍において、第１のスリット１２ｓを介して外筒１２の外部と連通している。そのため、細胞培養器具１０を反転させた時に、細胞αの培養面から、第１のスリット１２ｓを介して、容易にエアを抜くことができる。図１（Ｂ）では、エアが抜かれる様子を矢印で示している。これにより、最初に播種される細胞αの培養面上にエアが残留することに起因する不都合（例えば、細胞αが培養液と接触しないこと）を抑えることができる。

また、本実施形態の細胞培養器具１０によれば、細胞培養用膜１６として、厚み方向に貫通する多数の貫通孔を有する多孔質な膜を用いて、細胞培養用膜の両面において細胞を培養することができる。このような場合には、細胞培養器具１０を反転させるという簡便な操作により、細胞培養用膜１６の各々の面に細胞を播種する動作を容易に行なうことが可能になる。

Ｂ．第２の実施形態：
図４は、本発明の第２の実施形態である細胞培養器具１１０の構成を図１と同様にして表わす断面模式図であり、図５は、細胞培養器具１１０の組み立ての様子を説明するための分解斜視図である。以下の説明では、第１の実施形態の細胞培養器具１０と共通する部分には同じ参照番号を付して、詳しい説明は省略する。細胞培養器具１１０は、外筒１２と、第１の内筒１４と、細胞培養用膜１６と、に加えて、さらに第２の内筒１８を備える。

第２の内筒１８は、第１の内筒１４と同様の外径を有する筒状の部材であって、外筒１２よりも高さが小さく形成されている。第２の内筒１８は、第１の内筒１４と同様の材料により形成することができる。図４に示すように、第２の内筒１８は、第１の内筒１４と高さ方向が同じであって、第１の内筒１４における一方の端部１４ｏ側で細胞培養用膜１６を間に介して第１の内筒１４に接するように、外筒１２内に配置される。なお、第１の内筒１４と外筒１２とが細胞培養用膜１６を挟持する際の把持力を損なわないように、第２の内筒１８の外径は、第１の内筒１４の外径を超えないように形成されている。

図５に示すように、細胞培養器具１１０を組み立てる際には、第１の内筒１４の一方の端部１４ｏ（第２の把持部１４ｈを有しない側の端部）上に細胞培養用膜１６を配置する際に、細胞培養用膜１６上にさらに第２の内筒１８を配置する点が、第１の実施形態と異なっている。その後、第１の内筒１４に対する嵌め込みの方向が第１の実施形態と同様になるように、細胞培養用膜１６を挟持する第１の内筒１４および第２の内筒１８の外側に、外筒１２を嵌め込む。

図４（Ａ）は、図１（Ａ）と同様に、細胞培養用膜１６の一方の面上に細胞αを播種した様子を表わす。また、図４（Ｂ）は、図４（Ａ）の細胞培養器具１１０を反転させて、図１（Ｂ）と同様に細胞培養用膜１６の他方の面上に、細胞αとは異なる細胞βをさらに播種した様子を示す。本実施形態では、内部に第１の内筒１４を収容したときの外筒１２の内径と第２の内筒１８の外径の関係、外筒１２の内壁面と第２の内筒１８の外側面の表面粗さ、および第２の内筒１８の重量とを調節することにより、反転後であっても外筒１２に対する第２の内筒１８の相対的な位置を維持可能となっている。

このような構成としても、第１の実施形態と同様に、外筒１２に第１のスリット１２ｓを設けたことで細胞培養用膜１６を容易に保持できるという既述した効果が得られる。さらに、第２の実施形態では、第２の内筒１８をさらに用いるため、細胞αを播種する際に、細胞培養用膜１６上に供給した細胞αが、細胞培養器具１１０の外部に流出することを抑えられる。そのため、細胞αを播種する際に、播種する細胞数の精度を向上させることができる。

Ｃ．第３の実施形態：
図６は、本発明の第３の実施形態である細胞培養器具２１０の構成を図１と同様にして表わす断面模式図である。以下の説明では、第１の実施形態の細胞培養器具１０と共通する部分には同じ参照番号を付して、詳しい説明は省略する。細胞培養器具２１０は、第１の内筒１４に代えて第１の内筒２１４を備える以外は、細胞培養器具１０と同様の構成を有している。第１の内筒２１４には、第２のスリット２１４ｓおよび一対の膜支持部２１４ｍが設けられている。

図７は、第１の内筒２１４の一部を拡大して示す斜視図である。第２のスリット２１４ｓは、第１の内筒２１４において、一方の端部１４ｏ（第２の把持部１４ｈを有しない側であって細胞培養用膜１６が配置される側の端部。図６参照）から高さ方向に延びるように形成されている。一対の膜支持部２１４ｍは、第１の内筒２１４の一方の端部１４ｏにおける第２のスリット２１４ｓが開口する位置において、第１の内筒２１４の径方向外側に向かって延びるように設けられている。第１の内筒２１４は、第２のスリット２１４ｓおよび膜支持部２１４ｍが、外筒１２に設けた第１のスリット１２ｓと重なり、膜支持部２１４ｍが、第１のスリット１２ｓを経由して外筒１２の外側に延びるように、外筒１２内に配置される。

細胞培養器具２１０を組み立てる際には、第１の実施形態と同様に、第１の内筒２１４の一方の端部１４ｏ上に細胞培養用膜１６を配置して、この一方の端部１４ｏ側から、外筒１２の他方の端部１２ｔ（第１の把持部１２ｈを有しない側の端部）を嵌め込む。これにより、細胞培養用膜１６を、第１の内筒２１４の一方の端部１４ｏの外周に沿って折り曲げて、細胞培養用膜１６の周縁部を、第１の内筒２１４の外側面と外筒１２の内壁面によって挟持する。このとき、第１の内筒２１４には膜支持部２１４ｍが設けられているため、膜支持部２１４ｍの近傍では、細胞培養用膜１６が第１の内筒２１４の外側面に接することがない。その結果、第１の内筒２１４の第２のスリット２１４ｓが細胞培養用膜１６に塞がれることなく、第１の内筒２１４の内部と外筒１２の外部とは、第１のスリット１２ｓおよび第２のスリット２１４ｓを介して連通する。

このような構成としても、第１の実施形態と同様に、外筒１２に第１のスリット１２ｓを設けたことで細胞培養用膜１６を容易に保持できるという既述した効果が得られる。さらに、第３の実施形態では、第１の内筒２１４に第２のスリット２１４ｓおよび膜支持部２１４ｍを設けて第１の内筒２１４内と外筒１２の外部とを連通させている。そのため、図６の状態で細胞培養を行なう際に、細胞培養用膜１６の下側に残留するエアを、容易に排出することができる。図６では、エアが抜かれる様子を矢印で示している。これにより、図１（Ａ）と同様に細胞αを播種して培養する際に、培養面の裏面にエアが残留することに起因する不都合を抑えることができる。さらに本実施形態では、図６の状態から細胞培養器具２１０を上下反転させて、図１（Ｂ）と同様に細胞βを培養する際にも、図１（Ｂ）と同様に、細胞αの培養面から第１のスリット１２ｓを介して容易にエアを抜くことができる。

なお、第３の実施形態では、第２のスリット２１４ｓは、第１の内筒２１４の一方の端部１４ｏから、第１の内筒２１４の高さ方向の途中の位置まで延びる切れ込み状の形状としたが、異なる形状としてもよい。例えば、第１の内筒２１４の高さ方向全体にわたって延びるように、第２のスリット２１４ｓを設けてもよい。第２のスリット２１４ｓは、細胞αの培養面の裏面の直上付近の空間が、外部と連通可能となる形状であればよい。

また、第３の実施形態では、図７に示すように、第１の内筒２１４には、一方の端部１４ｏ近傍の外側面であって、細胞培養用膜１６の周縁部と接する位置に、第１の内筒２１４の側面の周方向に沿って延びる細長い凹部である２本の溝２１４ｃが設けられている。このような構成とすることで、細胞培養用膜１６の周縁部を第１の内筒２１４および外筒１２によって挟持する際の保持力を高めることができる。なお、第１の内筒２１４の外側面に設ける構造は、上記２本の溝状構造のような凹部のみによって形成する他、凸部のみにより形成してもよく、凹部と凸部の組合せにより形成してもよく、細胞培養用膜１６の保持力を高めることができる凹凸形状であればよい。また、このような凹凸形状は、他のいずれの実施形態や変形例に適用してもよい。

Ｄ．第４の実施形態：
図８は、本発明の第４の実施形態である細胞培養器具３１０の構成を、図１と同様にして表わす断面模式図である。以下の説明では、第１〜第３の実施形態と共通する部分には同じ参照番号を付して、詳しい説明は省略する。細胞培養器具３１０は、外筒１２と、第１の内筒２１４と、細胞培養用膜１６と、第２の内筒３１８とを備える。

第２の内筒３１８は、高さ方向が同じになるように第１の内筒２１４と重ねて、第１の内筒２１４と共に細胞培養用膜１６を端面で挟持するように配置される。この第２の内筒３１８は、細胞培養用膜１６を対称面として、第１の内筒２１４と面対称となる形状を有している。すなわち、第２の内筒３１８には、第２のスリット２１４ｓと同様の第３のスリット３１８ｓ、および、膜支持部２１４ｍと同様の膜支持部３１８ｍが設けられている。

このような構成とすれば、第３の実施形態の細胞培養器具２１０と同様の効果を奏すると共に、さらに、細胞αを播種して培養した後、細胞培養器具３１０を上下反転させたときに、細胞αの培養面の直上に残留するエアを、第３のスリット３１８ｓを介して容易に排出可能となる。なお、第３のスリット３１８ｓの形状は、第２のスリット２１４ｓと同じ形状である必要はなく、細胞αの培養面の直上付近の空間が外部と連通可能となる形状であればよい。

Ｅ．第５の実施形態：
図９は、本発明の第５の実施形態である細胞培養器具４１０の構成を表わす断面模式図である。以下の説明では、第１の実施形態の細胞培養器具１０と共通する部分には同じ参照番号を付して、詳しい説明は省略する。細胞培養器具４１０は、外筒１２、第１の内筒１４、および細胞培養用膜１６に加えて、さらに第２の内筒４１８を備えている。

第２の内筒４１８は、高さ方向が同じになるように第１の内筒１４と重ねて、第１の内筒１４と共に細胞培養用膜１６を端面で挟持するように配置される。なお、本実施形態では、外筒１２には第１の把持部１２ｈが設けられておらず、細胞培養用膜１６から離間する側の第２の内筒４１８の端部において、第１の把持部１２ｈと同様の第３の把持部４１８ｈが設けられている。

図９（Ａ）は、図１（Ａ）と同様に、細胞培養用膜１６の一方の面（第２の内筒４１８の内部に露出する面）上に細胞αを播種した様子を表わす。図９（Ｂ）は、図９（Ａ）の状態から、第２の内筒４１８が細胞培養用膜１６から離間するように高さ方向（鉛直方向上方）に第２の内筒４１８を引き上げた様子を表わす。このような第２の内筒４１８の引き上げは、第３の把持部４１８ｈを把持することで、容易に行なうことができる。図９（Ｃ）は、図９（Ｂ）の状態から細胞培養器具４１０を上下反転させて、細胞αの培養面の裏面に、さらに細胞βを播種した様子を表わす。細胞培養器具４１０を上下反転させる動作も、第３の把持部４１８ｈを把持して細胞培養器具４１０を吊り下げつつ引き上げることにより、容易に行なうことができる。

本実施形態では、第２の内筒４１８は、外筒１２を押さえつつ第２の内筒４１８に対して高さ方向上方の力を加えることにより、外筒１２内で第２の内筒４１８を高さ方向にスライドさせて、スライドさせた位置にて保持可能となっている。このような構成は、内部に第１の内筒１４を収容したときの外筒１２の内径と第２の内筒４１８の外径の関係、外筒１２の内壁面と第２の内筒４１８の外側面の表面粗さ、および第２の内筒４１８の重量とを調節することにより、実現可能である。

このような構成としても、第１の実施形態と同様に、外筒１２に第１のスリット１２ｓを設けたことで細胞培養用膜１６を容易に保持できるという既述した効果が得られる。さらに、第５の実施形態では、細胞培養器具４１０の反転に先立って第２の内筒４１８を高さ方向にスライドさせて細胞培養用膜１６から離間させることで、細胞αの培養面上の直上の空間が、外筒１２の第１のスリット１２ｓを介して外筒１２の外部と連通する。そのため、細胞培養器具４１０の反転後には、細胞αの培養面上に残留するエアを、第１のスリット１２ｓを介して容易に排出することができる。図９（Ｃ）では、エアが抜かれる様子を矢印で示している。これにより、細胞αの培養面にエアが残留することに起因する不都合を抑えることができる。

なお、本実施形態では、第１の内筒１４と第２の内筒４１８の高さの合計は、外筒１２の高さよりも短いが、異なる構成としてもよい。細胞培養器具４１０を反転させた後にも、第２の内筒４１８をスライドさせた位置にて保持可能であればよい。また、外筒１２内での第２の内筒４１８の保持は、両者の間の摩擦力を利用するのではなく、例えば、外筒１２の内壁面と第２の内筒４１８の外側面に、両者が係合可能となる係合部を設けてもよい。ただし、繰り返し任意の位置に第２の内筒４１８をスライド可能であるという観点からは、上記摩擦力を利用することが望ましい。

Ｆ．変形例：
・変形例１：
上記各実施形態では、外筒１２に設けた第１のスリット１２ｓは、外筒１２の高さ方向全体にわたって形成されている。これに対して、第１のスリット１２ｓは、外筒１２の高さ方向の一部の領域に形成することとしてもよい。第１のスリット１２ｓは、外筒１２の高さ方向に沿って延びており、少なくとも、細胞培養用膜１６が配置される第１の内筒の端部と重なる位置に設けられていれば、第１の内筒と共に細胞培養用膜１６を挟持することにより、細胞培養用膜１６を保持するための把持力を生じることができる。

なお、外筒１２において高さ方向の一部の領域のみに第１のスリット１２ｓを設ける場合には、外筒１２に対する第１の内筒１４等の挿入を容易にするために、例えば、内筒の挿入側先端部に、先端に向かって縮径するテーパを設けることが好ましい。あるいは、外筒１２において、第１のスリット１２ｓが設けられる領域以外の領域では、第１のスリット１２ｓが設けられる領域に比べて外筒１２の外径を若干大きくして、外筒１２への第１の内筒１４等の嵌め込みを容易化してもよい。

・変形例２：
上記実施形態では、外筒１２、第１の内筒、および第２の内筒に設けた把持部は、いずれも上面視を十字形状としたが、異なる形状としてもよい。把持部の形状は、例えば、外筒あるいは内筒の端部の開口を跨ぐように、該開口の外周の異なる位置間を連結した形状のように、細胞培養器具の把持の容易化が可能であればよい。細胞培養器具の重心の直上付近（軸線上付近）で器具を把持可能となる形状であれば、細胞培養器具を安定して保持し易く、培養細胞に対する外的刺激（ノイズ）を抑え易くなる観点から、特に望ましい。ただし、各実施形態で説明した把持部のうちの少なくとも一部を設けない構成も可能である。

なお、培養細胞に対する外的刺激の低減の観点からは、細胞培養器具は培養液中に沈むことが望ましい。細胞培養器具の比重が十分に大きくない場合には、培養液中に沈んだ状態で細胞培養器具を保持する機構を設けることが望ましい。

・変形例３：
上記実施形態では、細胞培養用膜の両面を用いて細胞培養することとしたが、片面のみを用いて細胞培養してもよい。この場合には、細胞培養用膜の両面間が貫通孔によって連通している必要はないため、例えばＰＥＴ等の樹脂の薄膜から成る基板上に、培養細胞の足場となる層を成膜してもよい。すなわち、培養細胞の足場となる層自身が、十分な弾性および強度を有していなくても、基板を含めた全体で、第１の内筒の端部で折れ曲げられて、第１の内筒と外筒の間で挟持されるための十分な弾性および強度を有していればよい。

細胞培養器具を片面培養に用いる場合には、細胞培養用膜の裏面に対して、播種のために細胞を懸濁した培養液を供給する必要がない。そのため、上記各実施形態のように、外筒１２の高さ方向の中ほどに細胞培養用膜１６を配置するのではなく、外筒１２の他方の端部１４ｔの近傍に細胞培養用膜１６を配置してもよい。

・変形例４：
上記各実施形態では、外筒および内筒（第１の内筒、第２の内筒）を円筒状としたが、異なる構成としてもよい。例えば、内筒を円筒状に形成し、外筒を、この内筒に外接する多角柱状（例えば六角柱や八角柱）としてもよい。また、外筒を円柱状に形成し、内筒を、この外筒に内接する多角柱状としてもよい。あるいは、内筒と外筒の双方を、多角柱状とすることも可能である。内筒の外側面と外筒の内壁面とは、周方向全体にわたって接する必要はなく、細胞培養膜を保持するために十分な把持力が生じる程度に接していればよい。

本発明は、上述の実施形態や実施例、変形例に限られるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において種々の構成で実現することができる。例えば、発明の概要の欄に記載した各形態中の技術的特徴に対応する実施形態、実施例、変形例中の技術的特徴は、上述の課題の一部又は全部を解決するために、あるいは、上述の効果の一部又は全部を達成するために、適宜、差し替えや、組み合わせを行うことが可能である。また、その技術的特徴が本明細書中に必須なものとして説明されていなければ、適宜、削除することが可能である。

１０，１１０，２１０，３１０，４１０…細胞培養器具
１１…ウエル
１２…外筒
１２ｈ…第１の把持部
１２ｏ，１２ｔ…端部
１２ｓ…第１のスリット
１４，２１４…第１の内筒
１４ｈ…第２の把持部
１４ｏ，１４ｔ…端部
１６…細胞培養用膜
１８，３１８，４１８…第２の内筒
２１４ｃ…溝
２１４ｍ，３１８ｍ…膜支持部
２１４ｓ…第２のスリット
３１８ｓ…第３のスリット
４１８ｈ…第３の把持部

Claims (10)

1. 細胞培養用膜が内部で水平に保持されると共に、高さ方向に延びる第１のスリットを有する筒状の細胞培養器具を用いて、前記細胞培養用膜の一方の面および他方の面で培養液中において細胞を培養する細胞培養方法であって、
   前記細胞培養器具は、
   筒状の第１の内筒であって、該第１の内筒の一方の端部全体を覆うように前記細胞培養用膜を保持するための第１の内筒と、
   筒状に形成されて、前記第１の内筒と高さ方向が一致するように前記第１の内筒を内部に収容する外筒であって、前記外筒を径方向に弾性変形可能にする前記第１のスリットが前記高さ方向に沿って前記外筒全体に形成されると共に、前記第１の内筒が内部にはめ込まれたときには、前記外筒の弾性復元力により、前記第１の内筒を保持する外筒と、
   を備え、
   前記細胞培養用膜の前記一方の面に細胞を播種して培養し、
   前記一方の面に細胞を播種して培養した後に、前記細胞培養器具を上下反転させ、前記細胞培養用膜の前記他方の面に細胞を播種すると共に、前記第１のスリットを介して前記一方の面上からエアを抜くことを特徴とする細胞培養方法。
2. 請求項１に記載の細胞培養方法であって、
   前記細胞培養器具は、さらに、
   前記第１の内筒と高さ方向が同じである筒状に形成されて、前記第１の内筒の前記一方の端部側で前記細胞培養用膜を介して前記第１の内筒と接するように前記外筒内に収容される第２の内筒を備え、
   前記細胞培養方法は、
   前記一方の面に細胞を播種して培養した後に、前記第２の内筒を前記外筒内で前記高さ方向にスライドさせて前記細胞培養用膜から離間させ、その後、前記細胞培養器具を上下反転させる
   細胞培養方法。
3. 細胞培養器具であって、
   筒状の第１の内筒であって、該第１の内筒の一方の端部全体を覆うように細胞培養用膜を保持するための第１の内筒と、
   筒状に形成されて、前記第１の内筒と高さ方向が一致するように前記第１の内筒を内部に収容する外筒であって、前記外筒を径方向に弾性変形可能にする第１のスリットが前記高さ方向に沿って前記外筒全体に形成されると共に、前記第１の内筒が内部にはめ込まれたときには、前記外筒の弾性復元力により、前記第１の内筒を保持する外筒と、
   を備える細胞培養器具。
4. 請求項３に記載の細胞培養器具であって、
   前記外筒は、前記第１の内筒の両端部のうちの前記一方の端部により近い側の端部において、該端部の開口を跨ぐように該開口の外周の異なる位置間を連結した第１の把持部を備える
   細胞培養器具。
5. 請求項３又は４に記載の細胞培養器具であって、さらに、
   前記第１の内筒と高さ方向が同じである筒状に形成されて、前記第１の内筒の前記一方の端部側で前記細胞培養用膜を介して前記第１の内筒と接するように前記外筒内に収容される第２の内筒を備える
   細胞培養器具。
6. 請求項５に記載の細胞培養器具であって、
   前記第２の内筒は、前記高さ方向の力を加えることにより、前記外筒内で前記高さ方向にスライド可能であって、スライドさせた位置にて保持可能である
   細胞培養器具。
7. 請求項３から６のうちのいずれか１項に記載の細胞培養器具であって、
   前記第１の内筒は、該第１の内筒の両端部のうちの他方の端部において、該他方の端部の開口を跨ぐように該他方の端部の開口の外周の異なる位置間を連結した第２の把持部を備える
   細胞培養器具。
8. 請求項４に記載の細胞培養器具であって、
   前記第１の把持部は、前記第１の内筒の軸線上付近で交わる２本の線分状に形成されている
   細胞培養器具。
9. 請求項７に記載の細胞培養器具であって、
   前記第２の把持部は、前記第１の内筒の軸線上付近で交わる２本の線分状に形成されている
   細胞培養器具。
10. 請求項３から９のうちのいずれか１項に記載の細胞培養器具であって、
    前記第１の内筒は、該第１の内筒における前記一方の端部近傍の外側面であって、前記細胞培養用膜と接する位置に、凹凸形状が設けられている
    細胞培養器具。

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