JP4288175B2 - アレイ法を実施するための反応容器 - Google Patents
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Description
適に選択することによって得られる。したがって、ほぼ完全に相補的な配列、すなわち互いに対応する配列を有するプローブのみが標的配列との対を維持することが保証される(非特許文献5)。
特許文献13および特許文献14には、時間分解析出反応によるプローブ・アレイ上の分子相互作用の定量的および定性的検出の方法ならびに関連する機器および単回使用の物品が記載されている。
該目的は、実験用反応容器に典型的な形状および/または典型的な寸法を有する反応容器であって、所定領域上に固定化されているプローブ分子を備えた支持要素がその基部表面の1つに配置されている反応容器を提供することにより、本発明に従って解決される。
ような、標準的実験用反応容器用の機器を使用することが可能であるので、分子標的とプローブ分子との特異的相互作用を検出するための本発明の反応容器の使用は、検出反応を行うための追加の機器または追加の付属品を購入する必要がないという重要な利点を有する。本発明の反応容器の他の利点は、該反応容器がハイブリッド形成チャンバとしても機能するので、別個のインキュベーションチャンバが不要であることである。さらに、プローブ分子が固定化されている支持体の表面は、従来の実験用反応容器に典型的な蓋固定またはキャップ固定、例えばエッペンドルフ(Eppendorf)反応容器の安全ロックキャップ固定により汚染および他の不利な外的影響から保護される。
m〜3.2cmである。さらに好ましい高さは、2.6cmまで、2.7cmまで、2.9cmまで、3.0cmまで、3.1cmまで、3.3cmまで、3.4cmまでである。特別な実施形態においては、高さは1.0cm以上であってもよい。本発明の反応容器は、通常の卓上遠心分離機で遠心分離することが可能であり、したがって、例えば、エッペンドルフ(Eppendorf)製の標準ローターを備えた標準卓上遠心分離機のような従来の卓上遠心分離機内で、また、通常のラックおよび例えば、エッペンドルフ(Eppendorf)製のチューブラックのような反応容器用のラックまたはホルダ内でも使用することが可能である。例えば、エッペンドルフ(Eppendorf)製の可変および固定容量ピペットのような通常のピペットまたはシリンジを、分析すべき試料および検出反応を行うために必要な他の試薬を反応容器に挿入するために用いることが可能である。
本発明との関連において、プローブ・アレイは、各プローブの位置が個別に決定されている、表面上の分子プローブの配置構成として理解される。アレイは、画定された部位または所定領域、すなわちいわゆるアレイ要素(特に好ましくは特定のパターンで配置されている)からなり、各アレイ要素が通常1種のプローブのみを含むことが好ましい。
出可能なユニットが結合し得るアンカー基を意味する。
本発明との関連において、基質は、反応媒体中に溶解した形で存在する分子または分子の組合せであって、触媒または結晶核および/または変換剤によって局所的に析出するものと理解される。変換剤は、例えば、銀の析出におけるような還元剤、または酵素的酸化による色素の生産におけるような酸化剤であり得る。
代替例として、支持体を反応容器の蓋に取り付けてもよい。支持要素またはチップ表面を反応容器の蓋に取り付けることは、アフィニティ・マトリックスが検出反応の準備および/または実施のための1つまたは複数の反応工程における条件に対して敏感に反応する場合に特に有利である。これらの反応工程は、本発明の反応容器のこの実施形態において直立の反応容器中で行わせることが可能であり、それにより、アフィニティ・マトリックスまたはチップが反応溶液または試料溶液と接触せずに、保護される。検出反応を行うためには、次いで本発明の反応容器を反転、すなわち蓋を下にして、試料が表面結合プローブと接触するようにする。このようにして、アフィニティ・マトリックスまたはチップの熱的および化学的負荷が減少する。
一般的に、本発明のプローブ・アレイは、その表面上にプローブを有するアレイの形成を可能にする支持体を含む。そのような支持体は、とりわけ、ガラス、フィルタ、電子装置、ポリマー、金属材料等ならびにこれらの材料の任意の組合せからなる群から選択される材料から製造することが可能である。
イロンのようなプラスチックまたは有機ポリマーからなる群から選択される。特別な実施形態において、金属、特にステンレス鋼、白金および/またはアルミニウムも適切な材料として使用可能である。
1つの方法において、個別に合成されたプローブ、例えば、オリゴヌクレオチドを、極めて少量の液体を確実に空間特異的に沈着させる自動機械、いわゆるスポッターを用いて表面に沈着させ、これに共有結合または非共有結合により結合させる。この方法は連続的に行われる。各スポットには個別にプローブを備えつける。
またはネジ(201)により、反応容器(2)とチップ支持体(200)との間の摩擦性かつ液体不浸透性の接続が得られる。この変形例は、内側から反応容器に挿入されるアフィニティ・マトリックス(100)の利点と組立てが簡単であるという利点とを合わせ持っている。欠点は、例えば、締付け接合のような他の接合箇所があることと部品の数がより多いことである。
a)前述した本発明の反応容器を用意する工程、
b)標的と、所定領域に配置したプローブ(アレイ要素)とを相互作用させる工程、および
c)相互作用を検出する工程。
別の実施形態において、標的分子との分子相互作用を検出する役割を果たす、プローブ・アレイ上に配置されたプローブ分子は、少なくとも1つの標識、および少なくとも1つの所定の切断部位、すなわち、特異的に不安定化または切断可能な不安定結合または選択的に切断可能な結合を含む。選択的に切断可能な結合が標識とアレイ表面へのプローブの連結位置との間に配置されることにより、プローブと標的との間の分子相互作用の特異的検出に標識または検出可能ユニットを用いることが可能となっている。この場合、所定の切断部位または選択的に切断可能な結合は、結合の切断によりアレイ表面から検出可能ユニットまたは検出可能ユニットを含むアンカー基が脱離するように、プローブ分子内に配置されている。他方で、プローブ分子が標的分子と特異的に相互作用した標識では、標識に結合したプローブの切断生成物またはプローブ断片が、標的との相互作用によりアレイ表面に固定化されているプローブの第2の切断生成物と結合したままなので、標識もアレイ表面と結合したままである。少なくとも1つの所定の切断部位を含むそのようなプローブ分子の調製については、独国特許出願第101 42 643.7号に詳細に記載され
ている。
Bは、プリン誘導体アデニンおよびグアニンならびにピリミジンのシトシンおよびチミ
ンなどの核酸塩基を表す。
本発明によるプローブ・アレイのプローブ分子内の選択的に切断可能な結合の調製に関するさらなる例は、アミド基、1,2−ジオール基、ジスルフィド基および/またはスルホニル基、ならびに米国特許第5118605号に記載され、該特許に規定されている条件下で切断可能な他の基である。しかし、これらの基は、とりわけ、従来の核酸合成を用いてオリゴヌクレオチドプローブに組込むことが不可能であるため、さほど好ましくない。
PGは、Hおよび
式II中のBは、プリン誘導体アデニンおよびグアニンならびにピリミジンのシトシンおよびウラシルなどの核酸塩基を表す。
別の実施形態において、不安定結合は酵素法により選択的に切断可能である。そのような不安定結合を含むヌクレオチド構築ブロックの例は、米国特許第4775619号および米国特許第4876187号に記載されている。しかし、プローブ分子の固定化の結果として選択的に切断可能な結合が表面に接近することにより酵素活性が著しく阻害されるので、本発明に関しては、選択的に切断可能な結合を切断するための酵素法はさほど好ましくない。したがって、酵素による切断反応は、非常に低い効率を有するにすぎず、偽陽性の測定結果による望ましくない高い信号バックグラウンドが生ずる。したがって、本発明によるプローブ・アレイの好ましい実施形態において、選択的に切断可能な結合は、酵素法により選択的に切断され得ない。
ンタニド(イージーアンドジー(EG&G)[ドイツ連邦共和国フライブルク市ワラク(Wallac、Freiburg)所在]である。
本発明による方法の好ましい実施形態において、析出をもたらす特定の溶解度積を有する付加物を結果として生ずる検出方法を用いる。ほとんど不溶性の通常着色された生成物に変換可能な基質を特にタグ付加に用いる。例えば、基質がほとんど不溶性の生成物へ変換するのを触媒する酵素は、このタグ付加反応に用いることが可能である。アレイ要素上に析出物を生じさせるのに適した一連の可能な反応ならびに析出物を検出する可能性は、例えば、その内容を本願明細書において特に参照する、特許文献16および特許文献14に記載されている。
サイエンティフィック・パブリッシャー・リミテッド(BIOS Scientific
Publishers Limited)、1995年を参照)。したがって、例えば、酵素は、ほとんど不溶性の一般に着色された生成物への基質の変換を触媒する。
通って放射される光の強度Iはランベルト‐ベールの法則に類似した以下の関数を用いて計算することが可能である。
ここで、Iは吸収後の光の強度、I0は吸収前の光の強度、aは吸収係数であり銀析出物による単位面積当たりの遮光量bを乗ずる。強度Iと時間tは、測定量として得ることができる。これらの測定量は、物質ライブラリーを含む支持要素を照射し、カメラを用いて透過光を記録することにより得られる(図19を参照)。この記録を、銀析出を行う間に一定の間隔で繰り返す。個々のライブラリー領域(スポット)の明度値を各記録について評価し、それにより各スポットの強度Iを求める。明度値は、例えば、IconoClust(登録商標)(クロンディアグ(Clondiag)[ドイツ連邦共和国イエナ(Jena)所在]のような標準的なソフトウエアを用いて自動的に計算することが可能である。図20に示す測定曲線は、I/I0を時間tの関数としてプロットして得られる。式(I)により示されるランベルト‐ベールの法則を、そのようにして得られた銀析出の経時変化と以下のように関連づけることが可能である。
F=π*r2 (II)
である。
r=dr/dt*t (III)
である。
b=N*F*k (III)
したがって、時間tの関数としての強度Iの関数は、以下のように計算される:
I=I0*exp(−a’*t2) (IV)
(式中、a’は未知の集成銀の吸収定数である)。
I=I0*exp(−a’H*t2) (V)
(式中、a’Hは非特異的な銀の吸収定数)である。
Ii=I0i*(exp(−a’i*t2)+exp(−a’H*t2))+Oi
(VI)
(式中、Oは装置に依存するオフセット値)である。
a’は標的DNAの濃度と該標的DNAのアレイ要素またはスポットi上での結合強度の尺度である。
τt=(1/a’i)0.5 (VII)
である。
あるいは、標的に直接タグ付加をせず、標的およびタグ付き化合物と相互作用するプローブとのサンドイッチ・ハイブリッド形成またはサンドイッチ反応によりタグ付加を行う。そのような方法の例は以下のとおりである。
− 標的配列と連鎖的にハイブリッド形成する標識オリゴヌクレオチドのサンドイッチ・ハイブリッド形成。標的配列と連鎖的にハイブリッド形成する標識オリゴヌクレオチドは、本発明との関連においては、少なくとも1つが標的配列および他のオリゴヌクレオチドの両方と相補的である1組の標識オリゴヌクレオチドとして理解される。その他のオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成時に標的配列に結合したタグ付きオリゴヌクレオチドの鎖が形成されるように、自己相補的または互いに相補的である。
、Eur J Immunogenet、1991年、2月〜4月、第18巻(1〜2号)、33〜55ページ;ブサト エヌ、バット シーエー(Bsat N、Batt CA)、コーネル大学食品科学部(Department of Food Scienc
e、Cornell University)[米国14853ニューヨーク州イサカ(Ithaca)所在]、「リステリア菌の非放射性検出のための改変逆ドットブロットおよびネスティドPCRアッセイの組合せ(A combined modified reverse dot-blot and nested PCR assay for the specific non-radioactive detection of Listeria monocytogene )」、Mol Cell Probes、1993年6月、第7巻(3号)、199〜207ページ;ブガワン ティーエル、ベゴビッチ エービー、エーリッヒ エイチエー(Bugawan TL、Begovich AB、Erlich HA)、シータス社(Cetus Corp.)ヒト遺伝学部(Department of Human
Genetics)[米国94608カリフォルニア州エメリービレ(Emeryville)所在]、「酵素的に増幅されたDNAと配列特異的な非放射性プローブを用いたHLA−DPBの迅速タイピング(Rapid HLA-DPB typing using enzymatically amplified DNA and nonradioactive sequence-specific oligonucleotide probes)」Immunogenetics、1990年、第32巻(4号)、231〜41ページおよびImmunogenetics、1991年、第34巻(6号)、413ページの正誤表;エリアオウ ジェーエフ、パルメード エフ、アビネンス オー、エドウアード イー、バラグール ピー、ニコラス ジェーシー、クロット ジェー(Eliaou JF、Palmade F、Avinens O、Edouard E、Ballaguer P、Nicolas JC、Clot J)、セント・エロイ・ホスピタル免疫学研究室(Laboratory of Immunology、Saint Eloi Hospital)[フランス国CHUモンペリエ(Montpellier)所在]、「非放射性の逆ドットブロット方法論による包括的HLA−DRB1遺伝子タイピング(Generic HLA-DRBI gene oligotyping by a nonradioactive reverse dot-blot methodology)」Human Immnunol、1992年12月、第35巻(4号)、215〜22ページ;モエレマンス エム、ダニールス ジー、ファンディジク エー、ランガンガー ジー、デメイ ジェー(Moeremans M、Daneels G、Van Dijck A、Langanger G、De Mey J)、「免疫金および免疫金/銀染色を用いたドットブロット免疫重層アッセイにおける抗原抗体反応の高感度な可視化(Sensitive visualization of antigen-antibody reactions in dot and blot immune overlay assays with immunogold and immunogold/silver staining)」J.Immunol Methods、1984年11月30日、第74巻(2号)、353〜60ページ;クレマース エーエフ、ジャンセンインデワル エヌ、ウィーガント ジェー、ダークス アールダブリュ、ワイスビーク ピー、ファンデルプレグ エム、ランデジェント ジェーイー(Cremers AF、Jansen in de Wal N、Wiegant J、Dirks RW、Weisbeek P、van der Ploeg M、Landegent JE)、「非放射性in situハイブリダイゼーション。反射型電子顕微鏡を用いた数種の免疫組織化学的検出システムの比較(Non-radioactive in situ hybridization。A comparison of several immunocytochemical detection system using reflection-contrast and electron microscopy )」、Histochemistry、
1987年、第86巻(6号)、609〜15ページ。
本発明の1実施形態において、標的には、可溶性基質の不溶性生成物への変換を触媒する触媒、好ましくは酵素が付与されている。アレイ要素上に析出物の形成をもたらす反応は、この場合、標的に結合した触媒、好ましくは酵素の存在下における可溶性基質の不溶性生成物への変換である。酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼからなる群から選択されることが好ましい。可溶性基質は、3,3’−ジアミノベンジジン、4−クロロ−1−ナフトール、3−アミノ−9−エチルカルバゾール、p−フェニレンジアミン−HCl/ピロカテコール、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン、ナフトール/ピロニン、ブロモクロルインドリルリン酸
、ニトロブルーテトラゾリウム(ニトロテトラゾリウムブルー)およびフェナジンメトサルフェートからなる群から選択される。例えば、無色の可溶性水素供与体、例えば、3,3’−ジアミノベンジジンは、過酸化水素の存在下で不溶性の有色生成物に変換される。酵素の西洋ワサビペルオキシダーゼは、供与体から水素イオンを過酸化水素に転移させ、水を生成させる。
とのハイブリッド形成は、既知の標準プロトコールによっても起こる(特に、非特許文献4を参照されたい)。形成されたハイブリッドは、例えば、ソラーレンを挿入後の架橋結合を介した共有結合、あるいは、米国特許第4599303号に記載のような、例えばインターカレーターの結合による非共有結合により、安定化させることが可能である。
特異的プローブによる標的の結合または認識は、通常、至適条件下での自発的な非共有結合である。非共有結合性化学結合も含まれる。媒体の組成ならびに他の化学的および物理的因子が結合の速度と強さに影響する。したがって、例えば核酸認識の場合、厳密性が低いほど、そして温度が高いほど、完全には相補的でない2つの鎖の間の結合の速度と強さは低い。抗原/抗体またはリガンド/受容体相互作用の結合条件を最適化することも必要であるが、結合条件は通常特異性が低い。
電気測定は、微小電極アレイの使用、または微小キャパシタンス・センサの使用による伝導度測定により、あるいは電界効果トランジスタ・アレイ(FETアレイ)を用いた電位測定により行うことが可能である。微小電極を用いる伝導度測定では、2つの電極の間の電気抵抗の変化を析出反応中に追跡する(イー ブラウン、ワイ エイチェン、ユー シバン、ジー ベン−ヨセフ(E.Braun、Y.Eichen、U.Sivan、G.Ben−Yoseph)、Nature、1998年、第391巻、775ページ)。微小キャパシタンス・センサを用いる誘電率測定の場合、相互に配置させた2つの電極のキャパシタンスの変化を測定する(エム マドウ(M.Madou)、「微小加工技術の基礎(Fundamentals of Microfabrication)」、CRCプレス[ボカラトン(Boca Raton)所在]、1997年)。FETアレイを用いる電位測定では、センサ表面上の電位の変化を測定する(エム マドウ(M.Madou)、「微小加工技術の基礎(Fundamentals of Microfabrication)」、CRCプレス[ボカラトン(Boca Raton)所在]、1997年)。
り検出することが可能である。したがって、オートラジオグラフィーでは、放射性析出物で覆われた表面をX線フィルムに直接接触させる。フルオログラフィーでは、放射性析出物で覆われた表面を、放射性放射エネルギーを蛍光に変換するサリチル酸ナトリウムのような蛍光化学物質で被覆する。増感スクリーンを用いる間接オートラジオグラフィーでは、β線放射性析出物で覆われた表面を、放射線を青色光に変換する増感スクリーン上に載せる(エフ ロットスペイチ、エイチ ゾーバス(F.Lottspeich、H.Zorbas)を参照、上記参照)。しかし、放射能を用いる検出法は、健康上のリスクおよびそれに関して満たすべき安全上の規制のため、望ましくないことが多い。
シェファー(A.Hubert、R.Schaefer)、「磁区(Magnetic Domains)」、スプリンガー(Springer)、1998年)。
ナノ表面トポグラフィを測定するためにナノチップを用いてトンネル電流を測定する(オー マルチ、エム アメリン(O.Marti、M.Amrein)、「生物学におけるSTMとSFM(STM and SFM in biology)」、アカデミックプレスインコーポレイテッド(Academic Press Inc.)[サンディエゴ(San Diego)所在]、1993年)。
フライシャー、エフ ベルグナー(V.Fleischer、F.Bergner)、DGZfP NDT会議ドレスデン(Dresden)、1997年)。
a)前述した本発明の少なくとも1つの反応容器と、
b)特異的相互作用を検出するための検出装置と、
からなる、前述の方法を実施するための装置に関する。
好ましい実施形態では、本発明による装置は、少なくとも1つの光源も含む。本発明との関連において光源は、支持体への均一な照射が確実になされるものであることが好ましい。光源は、レーザー、発光ダイオード(LED)、表面発光体および高圧ランプからなる群から選択されることが特に好ましい。
析出物の形成を光学的に検出するための本発明の装置の例示的構造の構成要素は、均一な照射のための低電力(500mcd)光源、例えばLEDと、検出器、例えばCCDカメラとから構成される。特に、金/銀システムを用いる場合、触媒による基質の析出を介した増強効果の結果として、表面の光学的特性の変化が著しいため、析出物を検出するのに平床型スキャナ、スライド・スキャナまたは同等の装置で十分である。
他の実施形態において、連続的検出が保証されるように複数の反応容器を装置内に配置する。例えば、本発明の装置内に試料を雑誌または回転木馬の形で配置することにより、時差的な連続読み出しを実現することが可能である。
− 検出装置により記録された信号強度を収集し、
− 必要な場合、信号強度をアナログ画像に変換する
ためにプログラムされているコンピュータをさらに含むことがさらに好ましい。
図5〜12に表面結合物質ライブラリー(102)を読み取るために使用可能な様々な光学的原理を示す。検出および読取装置に用いる反応容器中で、試料または標的と物質ライブラリー(102)のいくつかのライブラリー要素のプローブとの特異的相互作用が起こり、それにより相互作用生成物がいくつかの表面上に生成する。
/または相互作用反応の後の表面結合物質ライブラリーの吸収または反射比を図5〜17に示す読み出しシステム(1000)により画像化する。
図5に反応容器(1)を読み出すための本発明による装置の基本配置を示す。非干渉性光源(1001)からの光は照射光学部品(1002)によりチューブ(1)内にあるライブラリー・チップ(100)上の表面結合DNAライブラリーに照射される。信号は、読み出し光学部品(1004)を用いてCCDカメラ(1005)により記録される。
て半透明鏡を通って反応容器(1)内にあるライブラリー・チップ(100)上の表面結合DNAライブラリー(102)に照射される。反射信号が半透明鏡(1009)により読み出し光学部品(1004)上へと屈折し、そこからCCDカメラ(1005)上に像が造られる。試料の反射が不十分であるという欠点は、透過効果により、独立の鏡としての、または試料支持体の裏面に施された層としての試料の後ろの鏡層(1010)を用いて照射光が反射されることによって補われる。
1300)の位置を示す。可動往復台(1300)が図に示す矢印に沿って移動し、それにより反応容器(1)を閉じる。読取機器(1000)を用いて測定可能とするために、同時に光源(1008)を反応容器(1)の上に摺動させる。スライダー(1300)が閉じているとき、往復台(1320)は光源と反応容器(1)との間に位置する。可動往復台は、アフィニティ・マトリックス(100)を照射可能にするために検出開口部(1323)を有する。
ポリプロピレン製で公称内容積1.5mlの、エッペンドルフ(Eppendorf)の標準的な反応試験チューブを再融解のために用いた。この目的のために反応チューブの底側にキャップを付け、その側から一部の材料を旋削した。次いで、チューブをピン上にのせ、熱金型上に押し付けて、開口部または凹所(8)、チップ支持体(6)ならびに接着縁部(7)をチューブに型押した(図1を参照)。
a)試験系
ヒトcyp2D6遺伝子はヒトシトクロムP450をコードする。この酵素は、様々な薬物および活性物質の代謝において重要な役割を果たしている。cyp2D6遺伝子における突然変異は、ある種の薬剤に対する過敏症または不耐性をもたらすことがある。cyp2D6について少なくとも14種のそのような突然変異(点突然変異または欠失)が記載されている。これらの突然変異(G1749C、dT1795、G1934A、G2064A)を選別するためには、各野生型または突然変異が分析する試料中に存在するかどうかを試験しなければならない。
MicroGridII Arrayer(商品名)(バイオロボティックス(BioRobotics)[英国ケンブリッジ所在])を用いて、21〜25ヌクレオチドの長さを有する40種のアミノ修飾オリゴヌクレオチド(プローブ)をエポキシ化ガラス表面(スライドガラスの寸法:75mm×25mm)(101)上の画定された部位に沈着させ、共有結合により固定化した(ライブラリー要素またはアレイ要素)。プローブを、それぞれ第1が野生型、第2が突然変異であるライブラリー要素の対に分割した。
℃で30分間焼成して、ライブラリー要素をスライドガラス上のエポキシド基に共有結合させた。これに続いて、以下の順序、すなわち
600mlの2回蒸留したH2O+600μlのトリトンX100で5分間
600mlの2回蒸留したH2O+60μlのHCl(濃)で2×2分間
100mM KCl溶液で30分間
2回蒸留したH2Oで1分間すすぎ
圧縮空気で乾燥
の多段階洗浄工程に供した。
分析すべき試料(以下標的と呼ぶ)は、cyp2D6のエキソン3/4(KDL24、関連する突然変異に対する野生型として配列決定することにより遺伝子型を決定)を対象とした患者DNAのビオチン標識PCR物とした。PCR混合物は次のとおり、すなわち
プライマー1:cyp2D6_3/4−f、配列5’−CACGCGCACGTGCCCGTCCCA−3’、最終濃度200nM
プライマー2:cyp2D6_3/4r−5’Bio、配列5’−Bio−CTCTCGCTCCGCACCTCGCGCAGA−3’、最終濃度200nM
dNTPs、最終濃度200μM
Advantage(登録商標)cDNA−Polymerase−Mix(商品名)(50倍、クロンテック(Clontech)[米国パロアルト(Palo Alto)所在]、最終濃度1倍
Advantage(登録商標)cDNA PCR反応緩衝液(商品名)(10倍、クロンテック(Clontech)[米国パロアルト(Palo Alto)所在]、最終濃度1倍
鋳型DNA(KDL24)、80ng
水を加えて50μlとする
とした。
1 変性(10分、95℃)
2 変性(30秒、95℃)
3 アニーリング(30秒、65℃)
4 伸長(80秒、72℃)
5 工程2〜4を29回反復
6 伸長(7分、72℃)
7 冷却(4℃、後続の処理まで)
を用いてPCRを行った。
反応容器(1)中でハイブリッド形成反応させるため、得られたPCR生成物のうち4μlを146μlの6×SSPE緩衝液(1Lの2回蒸留したH2O中52.59g NaCl、8.28g NaH2PO4×H2O、2.22g EDTA×2H2Oであり、NaOHでpH7.4に調整)/0.1%SDSと混合し、組立て済みの反応容器(1)に加えた。ハイブリッド形成溶液を変性(5分、95℃)した後、緩やかに振とうしな
がら65℃で60分間インキュベーションを行った。次いで、ハイブリッド形成溶液を反応容器(1)から除去した。その後、2つの洗浄工程、すなわち、2×SSC/0.2%SDS(30℃で500μl)および2×SSC(20℃で500μl)で各10分間の洗浄工程に供した。次いで、調製済み複合溶液(Streptavidin−Gold(商品名)、ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル(British Biocell International)、EM.STP5、最終濃度は6×SSPE/0.1%SDS中250pg/μl)を反応容器(1)中のチップ(100)に加え、反応容器(1)を37℃で15分間インキュベートした。複合溶液を除去した後、反応容器(1)中のチップ(100)を振とうしながら2×SSC/0.2%SDS(30℃で500μl)、2×SSC(20℃で500μl)および0.2×SSC(20℃で500μl)でそれぞれ10分間洗浄した。
銀増強のために、反応容器(1)中の組込みチップ(100)を銀現像液(ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル(British Biocell International)[英国カーディフ(Cardiff)所在]、SEKL15)で覆い、反応容器(1)を銀の読取機器(1000)に挿入した。読取機器(1000)は、調節(Temperierung)付きの試料受容部、読み出し部および照明を供えた旋回アーム(1101)からなっている(図13および14を参照)。試料を複数のLEDの拡散照射アレイ(1008)を用いた透過光で照射した。追加の拡散器により試料の均一な照射が可能になり、偏りは最大値から10%未満であった。
Claims (45)
- 分子標的とプローブ分子との特異的相互作用を検出するための反応容器であって、実験用反応容器(チューブ)に典型的な形状と寸法とを有し、所定領域にプローブ分子が固定化されたチップまたはアフィニティ・マトリックスからなる支持要素が該反応容器の基部表面中の1表面に配置されていることを特徴とする反応容器。
- 前記実験用反応容器の基部表面が前記支持要素を受承するための凹所を有することを特徴とする請求項1に記載の反応容器。
- 支持要素の検出表面の部分が光学的に透過性であることを特徴とする請求項1または2に記載の反応容器。
- 前記検出表面と向かい合う基部表面が光学的に透過性であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の反応容器。
- 前記支持要素の材料がガラスおよびシリコンのうち少なくともいずれかであることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の反応容器。
- 前記支持要素の材料が、Borofloat(登録商標)33、石英ガラス、単結晶CaF2および単結晶シリコンからなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の反応容器。
- 前記容器の材料が、ガラスと、ガラスセラミックと、プラスチック被覆ガラスと、プラスチックと、金属とからなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載の反応容器。
- 前記プラスチックが、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、PVC、ポリメチルメタクリレート、シリコンプラスチック、ゴム、ポリテトラフルオロエチレンおよびナイロンのうち少なくともいずれかであることと、前記金属が、ステ
ンレス鋼、白金およびアルミニウムのうち少なくともいずれかであることとのうち少なくともいずれかを特徴とする請求項7に記載の反応容器。 - 100μl〜2.5mlの範囲の充填容積を有することを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載の反応容器。
- 1.5mlの充填容積を有することを特徴とする請求項9に記載の反応容器。
- 固定化プローブ分子がタンパク質ライブラリー、ペプチドライブラリーおよび核酸ライブラリーからなる群から選択される物質ライブラリーであることを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項に記載の反応容器。
- 前記タンパク質ライブラリーが抗体ライブラリー、受容体タンパク質ライブラリーおよび膜タンパク質ライブラリーのうち少なくともいずれかであることを特徴とする請求項11に記載の反応容器。
- 前記ペプチドライブラリーが受容体リガンドのライブラリー、薬理学的に活性なペプチドのライブラリーおよびペプチドホルモンのライブラリーのうち少なくともいずれかであることを特徴とする請求項11に記載の反応容器。
- 前記核酸ライブラリーがDNA分子ライブラリーおよびRNA分子ライブラリーのうち少なくともいずれかであることを特徴とする請求項11に記載の反応容器。
- 分子標的とプローブ分子との特異的相互作用を検出するための装置であって、
a)請求項1〜14のいずれか1項に記載の少なくとも1つの反応容器と、
b)該特異的相互作用を検出するための検出装置と、
からなる装置。 - 前記検出装置がカメラからなることを特徴とする請求項15に記載の装置。
- 前記検出装置がさらに読み出し光学部品を備えてなることを特徴とする請求項16に記載の装置。
- 前記カメラがCCDカメラまたはCMOSカメラであることを特徴とする請求項16または17に記載の装置。
- さらに光源を含むことを特徴とする請求項15〜18のいずれか1項に記載の装置。
- 前記光源が支持体の均一な照射を保証することを特徴とする請求項19に記載の装置。
- 光源がスペクトル干渉により支持体の均一な照射を保証する複数の拡散発光光源からなる照射アレイであることを特徴とする請求項19または20に記載の装置。
- 光源がレーザー、発光ダイオード(LED)、表面発光体および高圧ランプからなる群から選択されることを特徴とする請求項19〜21のいずれか1項に記載の装置。
- 反応容器の蓋が均一な照射を保証するように構成されていることを特徴とする請求項15〜22のいずれか1項に記載の装置。
- 光フィルタからさらになることを特徴とする請求項15〜23のいずれか1項に記載の
装置。 - フィルタ交換器からさらになることを特徴とする請求項24に記載の装置。
- 光源と支持体との間に位置する半透明鏡からさらになることを特徴とする請求項15〜25のいずれか1項に記載の装置。
- 反応容器が検出装置と直接接触していることを特徴とする請求項15〜26のいずれか1項に記載の装置。
- 連続的な検出が保証されるように複数の反応容器が配置されていることを特徴とする請求項15〜27のいずれか1項に記載の装置。
- 温度制御ユニットからさらになることを特徴とする請求項15〜28のいずれか1項に記載の装置。
- 検出装置により記録される信号強度を収集するためにプログラムされているコンピュータからさらになることを特徴とする請求項15〜29のいずれか1項に記載の装置。
- 前記コンピュータが、仮想信号強度のアナログ像への変換を保証するためにさらにプログラムされていることを特徴とする請求項30に記載の装置。
- 分子標的とプローブ分子との特異的相互作用を検出する方法であって、
a)請求項1〜14のいずれか1項に記載の反応容器または請求項15〜31のいずれか1項に記載の装置を用意する工程と、
b)該標的を、所定領域またはアレイ要素上に配置されているプローブ分子と相互作用させる工程と、
c)相互作用を検出する工程と、
からなる方法。 - 前記相互作用を検出するために、相互作用が起こるアレイ要素上に析出物を生じる反応を行うことを特徴とする請求項32に記載の方法。
- 工程c)において、前記析出物の生成の時間的推移を、前記アレイ要素上で信号強度の形で検出することを特徴とする請求項33に記載の方法。
- 前記アレイ要素上に析出物の形成をもたらす反応が、可溶性基質の金属析出物への変換であることを特徴とする請求項33または34に記載の方法。
- 前記アレイ要素上に析出物の形成をもたらす反応が、元素銀を形成するための、銀化合物の化学的還元であることを特徴とする請求項35に記載の方法。
- 前記銀化合物が、硝酸銀、乳酸銀、酢酸銀または酒石酸銀であることを特徴とする請求項36に記載の方法。
- 還元剤がホルムアルデヒドおよびヒドロキノンからなる群から選択されることを特徴とする請求項36または37に記載の方法。
- 可溶性基質の金属析出物への変換が、標的に結合した金属クラスターまたはコロイド状金属粒子の存在下で起こることを特徴とする請求項35〜38のいずれか1項に記載の方
法。 - 可溶性基質の金属析出物への変換が、金クラスターまたはコロイド状金粒子の存在下で起こることを特徴とする請求項39に記載の方法。
- 金属クラスターまたはコロイド状金属粒子の標的への結合が、直接または標的に結合したアンカー分子を介して起こることを特徴とする請求項39または40に記載の方法。
- 標的とプローブとの相互作用が、2つのヌクレオチド配列間のハイブリッド形成であることを特徴とする請求項32〜41のいずれか1項に記載の方法。
- アレイ要素上の析出物の存在の検出が、光線の、析出物による反射、吸収または拡散によって行われることを特徴とする請求項32〜42のいずれか1項に記載の方法。
- 前記光線がレーザー光線もしくは発光ダイオードであることを特徴とする請求項43に記載の方法。
- マイクロアレイを用いる試験を行うための、請求項1〜14のいずれか1項に記載のデバイスまたは請求項15〜31のいずれか1項に記載の装置の使用。
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