TWI657246B - 檢測單基因遺傳疾病的自動注液方法及裝置 - Google Patents

Abstract

一種檢測單基因遺傳疾病的自動注液方法，係將微量試管定位於架體，導引件定位於固定裝置，樣本承接件定位於移動裝置並且抵靠於導引件，液態樣本注入樣本承接件，移動裝置驅動樣本承接件移動至檢測晶片的最內側，使得液態樣本均勻分布於檢測晶片的表面並且藉由毛細現象滲透入並且區分在檢測晶片的一或數萬個小孔。藉此，本發明不僅實現單基因遺傳疾病(例如脊髓性肌肉萎縮症)的樣本自動注液分區，而且檢測晶片的每個小孔中具有等量的液態樣本，達到數位化基因拷貝數判讀結果，提升檢測單基因遺傳疾病的效率、檢測準確性、穩定性及再現性。

Description

檢測單基因遺傳疾病的自動注液方法及裝置

本發明係有關一種自動注液方法及裝置，尤其是一種檢測單基因遺傳疾病的自動注液方法及裝置。

單基因遺傳疾病有很多種，例如脊髓性肌肉萎縮症(Spinal Muscular Atrophy，SMA)、杜顯氏肌肉萎縮症(Duchenne Muscular Dystrophy，DMD)、多發性內分泌腺瘤病、魚鱗病、血友病以及部分多囊腎患者(Polycystic Kidney Disease，PKD)等。以下將以各種檢測脊髓性肌肉萎縮症的方法作為範例，說明各種檢測單基因遺傳疾病的方法問題所在。

脊髓性肌肉萎縮症(Spinal Muscular Atrophy，SMA)發生率位居所有的染色體隱性遺傳疾病當中的第二位，而致死率居第一位。在臨床上，脊髓性肌肉萎縮症依據發病時間又可分為三種類型：第一型(又稱Werdnig-Hoffmann disease)，發病時間在出生6個月內，病情發展迅速，壽命不超過2歲，半數以上的脊髓性肌肉萎縮症患者屬於此類；第二型(又稱Dubowitz disease)為慢性嬰兒型(中間型)，發病時間在出生6~18個月，經照護多數能活至成年；第三型(又稱Wohlfart-Kugelberg-Welander disease)為青少年型(輕型)，發病時間在出生18個月後，病情發展緩慢，長期存活率較高。

脊髓性肌肉萎縮症的症狀為身體軀幹和四肢近端骨骼肌進行性肌無力、肌萎縮，一般認為是相關基因的缺失或者突變所造成的，而其中又以脊髓運動神經元( Survival Motor Neurons ， SMN)基因扮演最主要的角色。進一步地說，SMN蛋白的功能是維護脊髓前角細胞功能；當 SMN基因缺失或者突變時，SMN蛋白表現下降甚至消失，導致脊髓前角細胞變性，從而使個體身體軀幹和四肢近端骨骼肌進行性肌無力、肌萎縮。因此，習知的檢測脊髓性肌肉萎縮症的方法主要是檢測 SMN基因缺失或者突變狀況。

SMN基因座落在5號染色體長臂1區3帶2亞帶(5q13.2)上，全長20kb，包括9個外顯子(exon)和8個內含子(intron)。 SMN基因有兩個非常相似基因拷貝，分別為 SMN1基因和 SMN2基因。 SMN1(或稱 SMNt)基因位在端粒端， SMN2(或稱 SMNc)基因位於著絲粒端。 SMN1基因和 SMN2基因為兩個高度同源的倒位重複DNA序列，差別在於：3'端有5個鹼基是不同的。此一差異使得 SMN2基因的第7外顯子與 SMN1基因的單個鹼基差異(c.840C＞T)，導致此兩個基因拷貝所編碼的蛋白產物略有不同。換句話說， SMN1基因可編碼出完整而且穩定的SMN功能蛋白， SMN2基因主要可編碼出功能缺陷的截短SMN蛋白和少部分(10~50%)編碼出完整而且穩定的SMN功能蛋白。當 SMN1基因功能完全喪失時， SMN2基因的表現對SMN蛋白的功能具有一定的補充作用，因而被定義為SMA的修飾基因。 SMN2基因表現具有生物活性的SMN蛋白量雖然較少，但隨著拷貝數增加，也會有表現量的累積效應，從而使患者的臨床症狀有一定程度的減輕。

隨著以降低脊髓性肌肉萎縮症患兒出生率為目標的預防計畫與措施的相繼實施，以及脊髓性肌肉萎縮症發病分子機制和分子流行病學的深入研究，研發準確可靠、簡單實用、能夠實現自動化和標準化、適合大規模人群篩查和常規分子診斷、高通量同時快速檢測精準定量 SMN1和 SMN2基因拷貝數，從而檢測出脊髓性肌肉萎縮症帶因或患者的相關方法及裝置為當前迫切之需。

目前檢測脊髓性肌肉萎縮症的方法包括單鏈構象多態性分析(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)、聚合酶連鎖反應-限制酶片段長度多型性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)、即時定量聚合酶鏈鎖反應(Quantitative Real-time PCR ，qPCR)、變性高效能液相色譜分技術(Denaturing High Performance Liquid Chromatography ，DHPLC)和多重連接探針擴增(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification，MLPA)等。通過分析 SMN1基因目的片段是否有缺失及缺失的數目而進行常規和產前基因診斷。其中PCR-單鏈構象多態性分析法、單鹼基突變PCR技術和變性高校液相色譜技術分析 SMN基因7、8號外顯子突變的情況。

然而，現有檢測脊髓性肌肉萎縮症的方法普遍存在準確率低、操作複雜而且耗時、檢測試劑成本高、只能偵測到基因出現大片段缺失的異常和需要昂貴的儀器設備等問題。PCR-RFLP則有無法判斷帶因者的問題。

上述技術方法都是基於 SMN1基因目的序列缺失狀況的檢測，沒有將 SMN2基因目的序列缺失或多拷貝分析納入檢測範疇，也沒有基於 SMN1/2基因的全面檢測與分析。此種情況主要是由以下三個方面造成的：其一，沒有意識到 SMN2基因在脊髓性肌肉萎縮症臨床分型中的重要作用；其二，由於 SMN2基因與 SMN1基因序列高度同源，只有5個鹼基的差異，同時檢測 SMN1基因和 SMN2基因，對技術提出了更高的要求；其三，當在同一體系中增加TaqMan探針數量時，會增加優化和檢測難度。而且，如果只針對 SMN1基因序列進行檢測，由於 SMN1基因和 SMN2基因序列高度相似，往往出現假陽性檢測結果。此外，由於螢光定量檢測中參比序列選擇的不合適，導致檢測結果受DNA提取方法影響大，檢測結果重複率和準確率較差。因此，選擇合適的參比序列並採用對 SMN1基因序列和 SMN2基因序列進行檢測，無論從臨床實際應用上還是檢測技術要求上都是十分必要的。

而近年最新發展出的MLPA基因診斷技術定量 SMN1及 SMN2基因套數，檢測受檢者是否帶有最常見的 SMN1基因缺失突變。此方法具有準確性高和再現性高等優點，並改善目前SMA基因篩檢時，定量 SMN1及 SMN2基因套數易產生誤差的問題，準確度高達98%以上。

但是，MLPA檢測方法檢測單一樣本所需的試劑成本較高，而且還需要使用特殊的分析儀器，檢測時間長達24小時，成本昂貴，加重患者經濟負擔，難以在臨床上進行大規模人群篩檢和技術推廣。上述方法都是基於螢光相對定量來分析基因拷貝數，容易有誤差造成判讀風險。

再者，現有的單基因遺傳疾病的液態樣本注液方法之一是將檢測晶片設在微量試管(eppendorf tube)中，然後操作微量吸管(pipetman)，藉由微量吸管前端的吸量管尖(pipette tip)吸取約15μl的基因樣本，然後伸入微量試管的腔室，將液態樣本滴在檢測晶片(chip)上，使樣本區分在一或數萬個微小孔中，達到數位化偵測的效果，以檢測出是否有遺傳疾病。

然而， 微量試管的底部呈倒錐狀，檢測晶片延伸至微量試管的最內側，即使是最小量的微量吸管(亦即，10μl的微量吸管)所使用的吸量管尖也無法完全伸入微量試管最內側，所以液態樣本只能分布在檢測晶片靠近微量試管的開口的一端的區域的表面，無法分布在檢測晶片靠近微量試管最內側的一端的區域的表面，導致液態樣本無法均勻地分布在檢測晶片的整個表面，降低檢測單基因遺傳疾病的準確性。

本發明的主要目的在於提供一種檢測單基因遺傳疾病的自動注液方法及裝置，不僅實現了單基因遺傳疾病(例如脊髓性肌肉萎縮症)的樣本自動注液分區，而且還可將液態樣本均勻地塗佈在檢測晶片的整個表面，使液態樣本能夠藉由毛細現象均勻地進入檢測晶片的每個小孔，令檢測晶片的每個小孔中具有等量的液態樣本，達到數位化絕對定量基因拷貝數判讀結果，判讀容易且準確度高，提升檢測單基因遺傳疾病的效率、檢測準確性、穩定性及再現性，實現數位化且準確的分析單基因遺傳疾病。

為了達成前述的目的，本發明將提供一種檢測單基因遺傳疾病的自動注液方法，包括下列步驟：

(a)一檢測晶片具有複數小孔，檢測晶片設於一微量試管的一腔室，一導引件插入微量試管的腔室，導引件的一第一端部靠近檢測晶片的一端。

(b)微量試管定位於一架體，導引件的一第二端部定位於一固定裝置上。

(c)一樣本承接件的一固定部定位於一移動裝置，樣本承接件的一承載部的一注入端部的一端抵靠於導引件的表面。

(d)一液態樣本注入樣本承接件的承載部的注入端部的一液體注入孔並且接觸導引件的表面。

(e)移動裝置驅動樣本承接件帶著液態樣本沿著導引件的表面往靠近架體的方向移動並且進入微量試管的腔室，接著移動裝置驅動樣本承接件帶著液態樣本沿著檢測晶片的表面移動至檢測晶片的最內側，使得液態樣本均勻分布於檢測晶片的表面並且藉由毛細現象滲透入檢測晶片的該等小孔中。

(f)移動裝置驅動樣本承接件往遠離架體的方向移動並且離開微量試管的腔室。

較佳地，導引件的第一端部的頂端高於檢測晶片的表面，當移動裝置驅動樣本承接件往遠離架體的方向移動時，導引件的第一端部將殘留於樣本承接件的承載部的注入端部的液體注入孔中的液態樣本刮除。

較佳地，導引件的第一端部的前端突出一凸起部，導引件的第一端部的前端的端面緊密地抵靠於檢測晶片的一端的端面，同時凸起部的底部緊密地抵靠於檢測晶片的表面，當移動裝置驅動樣本承接件往遠離架體的方向移動時，凸起部將殘留於樣本承接件的承載部的注入端部的液體注入孔中的液態樣本刮除。

較佳地，導引件的表面塗佈一層疏水性材料。

較佳地，檢測晶片的表面塗佈一層親水性材料。

為了達成前述的目的，本發明將提供一種檢測單基因遺傳疾病的自動注液裝置，包括一機台、一架體、一固定裝置以及一移動裝置。

架體設於機台的頂面，用以供一微量試管定位於其上並且一檢測晶片設於微量試管，檢測晶片具有複數小孔。

固定裝置設於機台的頂面，用以供一導引件的一第二端部定位於其上並且導引件的一第一端部靠近檢測晶片的一端。

移動裝置可移動地設於機台的頂面，用以供一樣本承接件的一固定部定位於其上，樣本承接件的一承載部的一注入端部的一端抵靠於導引件的表面，一液態樣本注入樣本承接件的承載部的注入端部的一液體注入孔並且接觸導引件的表面。

其中，移動裝置驅動樣本承接件帶著液態樣本沿著導引件的表面往靠近架體的方向移動並且進入微量試管的腔室，接著移動裝置驅動樣本承接件帶著液態樣本沿著檢測晶片的表面移動至檢測晶片的最內側，使得液態樣本均勻分布於檢測晶片的表面並且藉由毛細現象滲透入檢測晶片的該等小孔中；接著移動裝置驅動樣本承接件往遠離架體的方向移動並且離開微量試管的腔室。

較佳地，架體包含一基座、一承座及一載座，基座設於機台的頂面，承座設於基座的頂面並且其面向固定裝置的一側開設一溝槽，溝槽用以供微量試管的底部插入於其中並且抵頂於溝槽的內壁面，載座設於基座的頂面，位於承座與固定裝置之間，並且開設一定位槽，定位槽用以供微量試管穿設並且定位於其上。

較佳地，基座藉由複數緊固件鎖固於機台的頂面，基座遠離固定裝置的一端界定為一第一端，基座靠近固定裝置的一端界定為一第二端，載座一體成形於基座的第二端，承座固定於載座和基座的第一端之間。

較佳地，固定裝置的頂面開設一嵌槽，嵌槽用以供導引件的第二端部嵌設於其中。

較佳地，機台的頂面開設一滑槽，移動裝置包括一滑塊及一夾持結構，滑塊滑設於滑槽，夾持結構包含一座體及一夾板，座體連結滑塊，位於固定裝置的上方，並且用以供樣本承接件的固定部設置於其上，夾板樞設於座體並且用以供選擇性地夾住樣本承接件的固定部，滑塊沿著滑槽滑動並且驅動夾持結構在固定裝置的上方往靠近或遠離架體的方向移動。

本發明的功效在於，不僅實現了單基因遺傳疾病(例如脊髓性肌肉萎縮症)的樣本自動注液分區，而且還可將液態樣本均勻地塗佈在檢測晶片的整個表面，使液態樣本能夠藉由毛細現象均勻地進入檢測晶片的每個小孔，令檢測晶片的每個小孔中具有等量的液態樣本，達到數位化絕對定量基因拷貝數判讀結果，判讀容易且準確度高，提升檢測單基因遺傳疾病的效率、檢測準確性、穩定性及再現性，實現數位化且準確的分析單基因遺傳疾病。

以下配合圖式及元件符號對本發明的實施方式做更詳細的說明，俾使熟習該項技藝者在研讀本說明書後能據以實施。

請參閱圖1，圖1是本發明的方法的流程方塊圖。本發明係提供一種檢測單基因遺傳疾病的自動注液方法，包括下列步驟：

步驟S1：一檢測晶片10具有複數小孔11(參見圖12)，檢測晶片10設於一微量試管20的一腔室21。一導引件30插入微量試管20的腔室21，導引件30的一第一端部31靠近檢測晶片10的一端，如圖2、圖3及圖4所示。

請參閱圖2、圖3及圖4，圖2是本發明的方法的步驟S1的示意圖，其中內含檢測晶片10的八連排PCR反應管和導引件30彼此分離，圖3是本發明的方法的步驟S1的示意圖，其中導引件30的條狀體插入內含檢測晶片10的八連排PCR反應管，圖4是圖3的導引件30的條狀體插入內含檢測晶片10的八連排PCR反應管的側視圖。在本實施例中，本發明採用八個微量試管20連成一排的八連排PCR反應管以及八片檢測晶片10；而且導引件30的第一端部31為八個條狀體，導引件30的一第二端部32為板體，該等條狀體間隔地從板體的一端延伸，使得導引件30呈齒梳狀。因為每個微量試管20都有一蓋體而且八片檢測晶片10已經設於八個微量試管20的腔室21中，因此在步驟S1中，必須先將八個微量試管20(亦即，八連排PCR反應管)的八個蓋體全都打開，再將導引件30的八個條狀體插入八個微量試管20的腔室21中，使得導引件30的八個條狀體分別緊密地抵靠於八片檢測晶片10的一端。每個檢測晶片10包含一或數萬個小孔11，如圖12所示。

步驟S2：微量試管20定位於一架體102，導引件30的第二端部32定位於一固定裝置103上。

請參閱圖5A、圖5B及圖6，圖5A是本發明的裝置的立體圖，圖5B是本發明的裝置的另一視角的立體圖，圖6是本發明的方法的步驟S2的示意圖。具體來說，架體102包含一基座1021、一承座1022及一載座1023；基座1021設於一機台101的頂面；承座1022設於基座1021的頂面並且其面向固定裝置103的一側開設一溝槽10221，溝槽10221用以供微量試管20的底部插入於其中並且抵頂於溝槽10221的內壁面，藉以避免微量試管20往遠離固定裝置103的方向移動；載座1023設於基座1021的頂面，位於承座1022與固定裝置103之間，並且開設一定位槽10231，定位槽10231用以供微量試管20穿設並且定位於其上，避免微量試管20晃動。本實施例的承座1021呈ㄇ字形，然不以此為限，先予敘明。固定裝置103設於機台101的頂面並且其頂面開設一嵌槽1031，嵌槽1031用以供導引件30的第二端部32嵌設於其中。較佳地，導引件30的第二端部32的二側邊分別突出二嵌塊321、322，使導引件30的第二端部32呈T形；嵌槽1031的二側邊分別凹設二缺口10311、10312，使嵌槽1031呈T形並且對應導引件30的第二端部32的形狀。導引件30的第二端部32嵌設於嵌槽1031的同時，導引件30的第二端部32的二嵌塊321、322嵌設於嵌槽1031的二側邊的二缺口10311、10312，藉以使導引件30的第二端部32穩固地定位於固定裝置103上。

在較佳實施例中，如圖5A所示，固定裝置103還包括二卡榫1032、1033，該二卡榫1032、1033設於固定裝置103的頂面，靠近嵌槽1031遠離架體102的一側，並且延伸至嵌槽1031的上方。請參考圖6，導引件30的第二端部32嵌設於嵌槽1031的時候，該二卡榫1032、1033延伸至嵌槽1031的部分的底端緊密地抵靠於導引件30的第二端部32的一部分的頂面，藉以使導引件30的第二端部32更加穩固地定位於固定裝置103上。

在較佳實施例中，基座1021藉由複數緊固件1024鎖固於機台101的頂面，基座1021遠離固定裝置103的一端界定為一第一端10211，基座1021靠近固定裝置103的一端界定為一第二端10212。載座1023一體成形於基座1021的第二端10212。承座1022固定於載座1023和基座1021的第一端10211之間。藉此，架體102十分穩固地設置在機台101的頂面，可有效增加微量試管20定位於其上的穩定度。

在較佳實施例中，定位槽10231貫穿載座1023的頂部，因此微量試管20可從定位槽10231的上方進入定位槽10231，使微量試管20較為容易進入定位槽10231，如圖5A、圖5B及圖6所示。

須說明的是，因為本發明採用八個微量試管20連成一排的八連排PCR反應管而且導引件30的第二端部32為板體，所以載座1023開設八個定位槽10231而且固定裝置103的頂面的嵌槽1031的形狀對應導引件30的第二端部32的形狀，如圖6所示。在步驟S2中，八個微量試管20連成一排的八連排PCR反應管先穿過載座1023的八個定位槽10231，然後插入承座1022的溝槽10221中，並且該等微量試管20的底部抵頂於溝槽10221的內壁面；最後，再將導引件30的第二端部32對準固定裝置103的頂面的嵌槽1031並嵌設於其中；從而完成將八個微量試管20連成一排的八連排PCR反應管定位於架體102，以及將導引件30的第二端部32定位於固定裝置103的目的。

步驟S3：樣本承接件40的一固定部41定位於一移動裝置104，樣本承接件40的一承載部42的一注入端部421的一端抵靠於導引件30的表面，如圖7、圖8及圖9所示。

請參閱圖7、圖8及圖9；圖7是本發明的方法的步驟S3的示意圖，其中本發明的裝置的移動裝置104的夾持結構1042的夾板10422被掀開，樣本承接件40的固定部41設置在本發明的裝置的移動裝置104的座體10421；圖8是本發明的方法的步驟S3的示意圖，其中本發明的裝置的移動裝置104的夾持結構1042的夾板10422夾住樣本承接件40的固定部41；圖9是圖8的樣本承接件40的承載部42的注入端部421的一端抵靠於導引件30的表面的側視圖。具體而言，機台101的頂面開設一滑槽1011；移動裝置104包括一滑塊1041及一夾持結構1042；滑塊1041滑設於滑槽1011；夾持結構1042包含一座體10421及一夾板10422；座體10421連結滑塊1041，位於固定裝置103的上方，並且用以供樣本承接件40的固定部41設置於其上；夾板10422樞設於座體10421並且用以供選擇性地夾住樣本承接件40的固定部41。

在較佳實施例中，座體10421的頂面設有二定位凸部10423，夾板10422開設二容槽10424，樣本承接件40的固定部41呈板狀並且其兩側分別設有二定位凹部411，如圖7所示。在步驟S3中，請參閱圖7，先將夾板10422掀開；接著，將樣本承接件40的固定部41的二定位凹部411固定在座體10421的二定位凸部10423；最後，請參閱圖8以及圖9，將夾板10422向下樞擺，使得夾板10422夾住樣本承接件40的固定部41，同時座體10421的二定位凸部10423進入夾板10422的二容槽10424中，樣本承接件40的承載部42的注入端部421的一端自然會抵靠於導引件30的表面。在本實施例中，因為樣本承接件40包含八個承載部42，所以八個承載部42的注入端部421的一端分別抵靠於導引件30的八個條狀體的表面。

步驟S4：一液態樣本50注入樣本承接件40的承載部42的注入端部421的一液體注入孔4211並且接觸導引件30的表面，如圖10A及圖10B所示。

在本實施例中，因為樣本承接件40包含八個承載部42，所以有八份液態樣本50注入樣本承接件40的八個承載部42的注入端部421的液體注入孔4211。

步驟S5：移動裝置104驅動樣本承接件40帶著液態樣本50沿著導引件30的表面往靠近架體102的方向移動並且進入微量試管20的腔室21，如圖11A及圖11B所示。接著移動裝置104驅動樣本承接件40帶著液態樣本50沿著檢測晶片10的表面移動至檢測晶片10的最內側，使得液態樣本50均勻分布於檢測晶片10的表面並且藉由毛細現象滲透入檢測晶片10的該等小孔11中，如圖12至圖15所示。

更詳言之，一開關105設於機台101的表面，一控制裝置106設於機台101中並且電性連接開關105和移動裝置104，如圖5B及圖5C所示。按壓開關105，以啟動移動裝置104。

請參閱圖11A及圖11B；圖11A是本發明的方法的步驟S5的示意圖，其中樣本承接件40的承載部42的注入端部421帶著液態樣本50沿著導引件30的條狀體的表面進入微量試管20的腔室21；圖11B是圖11A的側視圖。移動裝置104係藉由滑塊1041沿著滑槽1011滑動並且驅動夾持結構1042在固定裝置103的上方往靠近架體102的方向移動，使得夾持結構1042驅動樣本承接件40的八個承載部42的注入端部421帶著八份液態樣本50沿著導引件30的八個條狀體的表面往靠近架體102的方向移動並且進入八個微量試管20的腔室21。

請參閱圖12至圖15；圖12是本發明的方法的步驟S5的示意圖，其中樣本承接件40的承載部42的注入端部421接觸到檢測晶片10；圖13是本發明的方法的步驟S5的示意圖，其中樣本承接件40的承載部42的注入端部421開始移動於檢測晶片10的表面；圖14是本發明的方法的步驟S5的示意圖，其中樣本承接件40的承載部42的注入端部421移動於檢測晶片10的兩端之間的表面；圖15是本發明的方法的步驟S5的示意圖，其中液態樣本50滲透入檢測晶片10的小孔11。接著，夾持結構1042驅動樣本承接件40的八個承載部42的注入端部421帶著八份液態樣本50沿著八片檢測晶片10的表面移動至八片檢測晶片10的最內側，使得每份液態樣本50均勻分布於每片檢測晶片10的表面並且藉由毛細現象滲透入每片檢測晶片10的一萬個小孔11中，完成液態樣本50分區，如圖12至圖15所示。

步驟S6：移動裝置104驅動樣本承接件40往遠離架體102的方向移動並且離開微量試管20的腔室21。

更詳言之，控制裝置106控制移動裝置104藉由滑塊1041沿著滑槽1011滑動並且驅動夾持結構1042在固定裝置103的上方往遠離架體102的方向移動，使得夾持結構1042驅動樣本承接件40沿著導引件30的八個條狀體的表面往遠離架體102的方向移動並且離開八個微量試管20的腔室21。

在另一實施例中，一感應裝置107設於機台101中並且電性連接控制裝置106，如圖5C所示。在樣本承接件40的承載部42的注入端部421碰觸到微量試管20的腔室21的最深處的內壁面的瞬間，其碰觸力量傳遞至感應裝置107。感應裝置107以此判斷樣本承接件40的承載部42的注入端部421碰觸到微量試管20的腔室21的最深處的內壁面，並且傳送一感應訊號1071至控制裝置106。控制裝置106在接收到感應訊號1071之後，控制移動裝置104藉由滑塊1041沿著滑槽1011滑動並且驅動夾持結構1042在固定裝置103的上方往遠離架體102的方向移動，使得夾持結構1042驅動樣本承接件40沿著導引件30的八個條狀體的表面往遠離架體102的方向移動並且離開八個微量試管20的腔室21。

綜合上述，本發明的檢測單基因遺傳疾病的自動注液方法，不僅實現了單基因遺傳疾病(例如脊髓性肌肉萎縮症)的樣本自動注液分區，而且還可將液態樣本50均勻地塗佈在檢測晶片10的整個表面，使液態樣本50能夠藉由毛細現象均勻地進入檢測晶片10的每個小孔11，令檢測晶片10的每個小孔11中具有等量的液態樣本50，達到數位化絕對定量基因拷貝數判讀結果，判讀容易且準確度高，提升檢測單基因遺傳疾病的效率、檢測準確性、穩定性及再現性，實現數位化且準確的分析單基因遺傳疾病。

在較佳實施例中，導引件30的第一端部31的頂端高於檢測晶片10的表面，如圖4所示。較佳地，導引件30的表面從其第一端部31往其第二端部32的方向朝下傾斜而成為一斜面。當移動裝置104驅動樣本承接件40往遠離架體102的方向移動時，導引件30的第一端部31將殘留於樣本承接件40的承載部42的注入端部421的液體注入孔4211中的液態樣本50刮除。藉此，此技術特徵能夠有效減少樣本承接件40的承載部42的注入端部421的液體注入孔4211中的液態樣本50的殘留量，甚至完全刮乾淨，有助於提升檢測單基因遺傳疾病的效率、檢測準確性、穩定性及再現性。

然而，如果導引件30的第一端部31和檢測晶片10之間有縫隙的話，液態樣本50從導引件30的表面移動到檢測晶片10的表面的過程中，會有部分液態樣本50滲入縫隙中而漏失，降低檢測單基因遺傳疾病的效率、檢測準確性、穩定性及再現性。因此，在較佳實施例中，導引件30的第一端部31的前端突出一凸起部311，導引件30的第一端部31的前端的端面緊密地抵靠於檢測晶片10的一端的端面，同時凸起部311的底部緊密地抵靠於檢測晶片10的表面，如圖4所示。當移動裝置104驅動樣本承接件40往遠離架體102的方向移動時，凸起部311將殘留於樣本承接件40的承載部42的注入端部421的液體注入孔4211中的液態樣本50刮除。藉此，導引件30的第一端部31不僅能夠輕易地定位在檢測晶片10上，而且導引件30的第一端部31和檢測晶片10之間沒有任何縫隙產生，有助於液態樣本50完完全全地從導引件30的表面移動到檢測晶片10的表面，而且能夠被導引件30的第一端部31刮乾淨，不會有一丁點液態樣本50漏失，更加提升檢測單基因遺傳疾病的效率、檢測準確性、穩定性及再現性。

在較佳實施例中，導引件30的表面塗佈一層疏水性材料。藉此，液態樣本50沿著導引件30的表面移動的時候，不會殘留在導引件30的表面，從而能夠完整地塗佈於檢測晶片10的表面。

在較佳實施例中，檢測晶片10的表面塗佈一層親水性材料。藉此，液態樣本50沿著檢測晶片10的表面移動的時候，能夠更快速地分布於檢測晶片10的表面，並且快速地藉由毛細現象滲透入檢測晶片10的複數小孔11中。

值得一提的是，本發明的檢測單基因遺傳疾病的自動注液方法係用於檢測單基因遺傳疾病，例如，脊髓性肌肉萎縮症(Spinal Muscular Atrophy，SMA) 、杜顯氏肌肉萎縮症(Duchenne Muscular Dystrophy，DMD)、多發性內分泌腺瘤病、魚鱗病、血友病以及部分多囊腎患者(Polycystic Kidney Disease，PKD)等。不同的單基因遺傳疾病，其液態樣本50的製作方法略有差異，以下將以脊髓性肌肉萎縮症的液態樣本50的製作方法作為範例說明。脊髓性肌肉萎縮症的液態樣本50的製作方法如下：

樣本取得：抽取受檢者(例如做產檢的孕婦)外周全血標本或者口腔黏膜標本，EDTA抗凝，採用常規檢測試劑盒提取得到基因體DNA(Genomic DNA，gDNA)標本。

樣本製備：取200ng的上述基因體DNA，添加限制酶 EcoRI，並且在攝氏37度的溫度下反應20分鐘，使得基因體DNA被限制酶 EcoRI切開。以攝氏85度的溫度加熱5分鐘去除限制酶 EcoRI的活性。

配製反應混合液：先把 SMN1和 SMN2基因共用引物(primer)和參比序列引物(reference sequence primer)配製成最終濃度為500nM與400nM的混合液；參比序列探針(refernce sequence probe)配製成最終濃度200nM，再分別加入 SMN1基因探針( SMN1gene probe)和 SMN2基因探針( SMN2gene probe)在不同的管體內。然後加入反應體系中除了樣本基因體DNA以外的其他各成分。每次根據所需檢測的標本量，取相應數量的八連排PCR反應管。根據PCR反應總用量，計算各組分所需總量，後將配製成反應混合液分裝於微量試管中。最後加入上述製備完成的樣本基因體DNA10ng，蓋體蓋上之後，利用一離心機以8000rpm的轉速離心30秒，藉以完成液態樣本50的配製。

本發明的檢測單基因遺傳疾病的自動注液方法完成之後，將檢測晶片10的該等小孔11中的液態樣本50封住，使得液態樣本50位於檢測晶片10的該等小孔11的中間，然後放入螢光定量PCR擴增儀中。反應程式設定為：攝氏95度預變性5分鐘；攝氏95度50秒+攝氏63度90秒，40個迴圈，於攝氏70度最終延長5分鐘。

本實施例係以檢測脊髓性肌肉萎縮症為範例，因此步驟末採集FAM、HEX螢光訊號，分別代表 SMN1或 SMN2和參比序列。根據定量檢測所獲得的拷貝數，以HEX訊號所代表的參比序列拷貝數為對照標本。將 SMN1或 SMN2所測得的拷貝數比對參比序列的套數，得出來的結果就是 SMN的套數。依下述公式進行計算：

取得參比序列的套數：因為是雙套體，因此HEX訊號所代表的參比序列拷貝數除以二等於X。

計算待測 SMN1或 SMN2的拷貝數：FAM訊號所得的拷貝數，除以上述的X等於Y。Y就是 SMN1或 SMN2的拷貝數。

最後根據上述方法可直接精確地得知 SMN1： SMN2的套數，無須對照標準曲線，即可得知是否正常或帶原肌肉萎縮基因。例如 SMN1： SMN2是2：1、2：2、3：1、2：0、3：0、4：0或者2：3都是正常無帶原；若結果是1：1、1：2、1：3的話就是帶原者。如果 SMN1缺失，則是脊髓性肌肉萎縮症的患者。

所以根據此數據變化規律，以絕對定量法方式，直接分析 SMN1、 SMN2基因目的序列的相對拷貝數，實現缺失型SMA的快速分子診斷。檢測時間縮短為4小時，檢測準確度高達98%以上，預計95%以上的脊髓性肌肉萎縮症可以因此檢測方式篩檢出帶原或罹病，方便在臨床上進行大規模群篩查和技術推廣，或是早期發現提早用藥以控制病情。

復請參閱圖5A、圖5B及圖5C，圖5A是本發明的裝置的立體圖，圖5B是本發明的裝置的另一視角的立體圖，圖5C是本發明的裝置的部分構件的連接關係方塊圖。本發明係提供一種檢測單基因遺傳疾病的自動注液裝置100，包括機台101、架體102、固定裝置103、移動裝置104、開關105、控制裝置106以及感應裝置107。本發明的檢測單基因遺傳疾病的自動注液裝置100的各個構件的連結關係、運作方式及其功效等細節已如前述。

以上所述者僅為用以解釋本發明的較佳實施例，並非企圖據以對本發明做任何形式上的限制，是以，凡有在相同的創作精神下所作有關本發明的任何修飾或變更，皆仍應包括在本發明意圖保護的範疇。

10‧‧‧檢測晶片

11‧‧‧小孔

20‧‧‧微量試管

21‧‧‧腔室

30‧‧‧導引件

31‧‧‧第一端部

311‧‧‧凸起部

32‧‧‧第二端部

321、322‧‧‧嵌塊

40‧‧‧樣本承接件

41‧‧‧固定部

411‧‧‧定位凹部

42‧‧‧承載部

421‧‧‧注入端部

4211‧‧‧液體注入孔

50‧‧‧液態樣本

100‧‧‧檢測單基因遺傳疾病的自動注液裝置

101‧‧‧機台

1011‧‧‧滑槽

102‧‧‧架體

1021‧‧‧基座

10211‧‧‧第一端

10212‧‧‧第二端

1022‧‧‧承座

10221‧‧‧溝槽

1023‧‧‧載座

10231‧‧‧定位槽

1024‧‧‧緊固件

103‧‧‧固定裝置

1031‧‧‧嵌槽

10311、10312‧‧‧缺口

1032、1033‧‧‧卡榫

104‧‧‧移動裝置

1041‧‧‧滑塊

1042‧‧‧夾持結構

10421‧‧‧座體

10422‧‧‧夾板

10423‧‧‧定位凸部

10424‧‧‧容槽

105‧‧‧開關

106‧‧‧控制裝置

107‧‧‧感應裝置

1071‧‧‧感應訊號

S1~S6‧‧‧步驟

圖1是本發明的方法的流程方塊圖。 圖2是本發明的方法的步驟S1的示意圖，其中內含檢測晶片的八連排PCR反應管和導引件彼此分離。 圖3是本發明的方法的步驟S1的示意圖，其中導引件的條狀體插入內含檢測晶片的八連排PCR反應管。 圖4是圖3的側視圖。 圖5A是本發明的裝置的立體圖。 圖5B是本發明的裝置的另一視角的立體圖。 圖5C是本發明的裝置的部分構件的連接關係方塊圖。 圖6是本發明的方法的步驟S2的示意圖。 圖7是本發明的方法的步驟S3的示意圖，其中本發明的裝置的移動裝置的夾持結構的夾板被掀開，樣本承接件的固定部設置在本發明的裝置的移動裝置的座體。 圖8是本發明的方法的步驟S3的示意圖，其中本發明的裝置的移動裝置的夾持結構的夾板夾住樣本承接件的固定部。 圖9是圖8的樣本承接件的承載部的注入端部的一端抵靠於導引件的表面的側視圖。 圖10A是本發明的方法的步驟S4的示意圖。 圖10B是圖10A的側視圖。 圖11A是本發明的方法的步驟S5的示意圖，其中樣本承接件的承載部的注入端部帶著液態樣本沿著導引件的條狀體的表面進入微量試管的腔室。 圖11B是圖11A的側視圖。 圖12是本發明的方法的步驟S5的示意圖，其中樣本承接件的承載部的注入端部接觸到檢測晶片。 圖13是本發明的方法的步驟S5的示意圖，其中樣本承接件的承載部的注入端部開始移動於檢測晶片的表面。 圖14是本發明的方法的步驟S5的示意圖，其中樣本承接件的承載部的注入端部移動於檢測晶片的兩端之間的表面。 圖15是本發明的方法的步驟S5的示意圖，其中液態樣本滲透入檢測晶片的小孔。

Claims (10)

1. 一種檢測單基因遺傳疾病的自動注液方法，包括下列步驟： (a)一檢測晶片具有複數小孔，該檢測晶片設於一微量試管的一腔室，一導引件插入該微量試管的腔室，該導引件的一第一端部靠近該檢測晶片的一端； (b)該微量試管定位於一架體，該導引件的一第二端部定位於一固定裝置上； (c)一樣本承接件的一固定部定位於一移動裝置，該樣本承接件的一承載部的一注入端部的一端抵靠於該導引件的表面； (d)一液態樣本注入該樣本承接件的承載部的注入端部的一液體注入孔並且接觸該導引件的表面； (e)該移動裝置驅動該樣本承接件帶著該液態樣本沿著該導引件的表面往靠近該架體的方向移動並且進入該微量試管的腔室，接著該移動裝置驅動該樣本承接件帶著該液態樣本沿著該檢測晶片的表面移動至該檢測晶片的最內側，使得該液態樣本均勻分布於該檢測晶片的表面並且藉由毛細現象滲透入該檢測晶片的該等小孔中；以及 (f)該移動裝置驅動該樣本承接件往遠離該架體的方向移動並且離開該微量試管的腔室。
2. 如申請專利範圍第1項所述的檢測單基因遺傳疾病的自動注液方法，其中該導引件的第一端部的頂端高於該檢測晶片的表面，當該移動裝置驅動該樣本承接件往遠離該架體的方向移動時，該導引件的第一端部將殘留於該樣本承接件的承載部的注入端部的液體注入孔中的液態樣本刮除。
3. 如申請專利範圍第2項所述的檢測單基因遺傳疾病的自動注液方法，其中該導引件的第一端部的前端突出一凸起部，該導引件的第一端部的前端的端面緊密地抵靠於該檢測晶片的一端的端面，同時該凸起部的底部緊密地抵靠於該檢測晶片的表面，當該移動裝置驅動該樣本承接件往遠離該架體的方向移動時，該凸起部將殘留於該樣本承接件的承載部的注入端部的液體注入孔中的液態樣本刮除。
4. 如申請專利範圍第1項所述的檢測單基因遺傳疾病的自動注液方法，其中該導引件的表面塗佈一層疏水性材料。
5. 如申請專利範圍第1項所述的檢測單基因遺傳疾病的自動注液方法，其中該檢測晶片的表面塗佈一層親水性材料。
6. 一種檢測單基因遺傳疾病的自動注液裝置，包括： 一機台； 一架體，設於該機台的頂面，用以供一微量試管定位於其上並且一檢測晶片設於該微量試管，該檢測晶片具有複數小孔； 一固定裝置，設於該機台的頂面，用以供一導引件的一第二端部定位於其上並且該導引件的一第一端部靠近該檢測晶片的一端；以及 一移動裝置，可移動地設於該機台的頂面，用以供一樣本承接件的一固定部定位於其上，該樣本承接件的一承載部的一注入端部的一端抵靠於該導引件的表面，一液態樣本注入該樣本承接件的承載部的注入端部的一液體注入孔並且接觸該導引件的表面； 其中，該移動裝置驅動該樣本承接件帶著該液態樣本沿著該導引件的表面往靠近該架體的方向移動並且進入該微量試管的腔室，接著該移動裝置驅動該樣本承接件帶著該液態樣本沿著該檢測晶片的表面移動至該檢測晶片的最內側，使得該液態樣本均勻分布於該檢測晶片的表面並且藉由毛細現象滲透入該檢測晶片的該等小孔中；接著該移動裝置驅動該樣本承接件往遠離該架體的方向移動並且離開該微量試管的腔室。
7. 如申請專利範圍第6項所述的檢測單基因遺傳疾病的自動注液裝置，其中該架體包含一基座、一承座及一載座，該基座設於該機台的頂面，該承座設於該基座的頂面並且其面向該固定裝置的一側開設一溝槽，該溝槽用以供該微量試管的底部插入於其中並且抵頂於該溝槽的內壁面，該載座設於該基座的頂面，位於該承座與該固定裝置之間，並且開設一定位槽，該定位槽用以供該微量試管穿設並且定位於其上。
8. 如申請專利範圍第7項所述的檢測單基因遺傳疾病的自動注液裝置，其中該基座藉由複數緊固件鎖固於該機台的頂面，該基座遠離該固定裝置的一端界定為一第一端，該基座靠近該固定裝置的一端界定為一第二端，該載座一體成形於該基座的第二端，該承座固定於該載座和該基座的第一端之間。
9. 如申請專利範圍第6項所述的檢測單基因遺傳疾病的自動注液裝置，其中該固定裝置的頂面開設一嵌槽，該嵌槽用以供該導引件的第二端部嵌設於其中。
10. 如申請專利範圍第6項所述的檢測單基因遺傳疾病的自動注液裝置，其中該機台的頂面開設一滑槽，該移動裝置包括一滑塊及一夾持結構，該滑塊滑設於該滑槽，該夾持結構包含一座體及一夾板，該座體連結該滑塊，位於該固定裝置的上方，並且用以供該樣本承接件的固定部設置於其上，該夾板樞設於該座體並且用以供選擇性地夾住該樣本承接件的固定部，該滑塊沿著該滑槽滑動並且驅動該夾持結構在該固定裝置的上方往靠近或遠離該架體的方向移動。