JP4258053B2 - 天然物由来殺菌剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ユーカリ属植物葉の極性有機溶媒抽出物とキトサンとを含む天然物由来の殺菌剤に関し、詳しくは、種々の微生物に対して低濃度で殺菌効果があり、かつ殺菌力に持続性のある安全性の高い殺菌剤に関する。本発明の殺菌剤は、医療施設、食肉加工施設、畜舎、鶏舎、食肉、鳥類卵殻、飼料等の殺菌剤として、又、飼料、ウエットティッシュ、おむつ等に配合し、殺菌力を付加する殺菌剤として使用することができる。さらにニキビや水虫を予防する殺菌剤として使用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
ユーカリ属植物は約600種類存在し、その精油やエタノール抽出物等が喘息薬・防腐剤・芳香剤等の用途で医薬品・医薬部外品・食品添加物・香料として用いられている（西村弘行著、未来の生物資源ユーカリ、１９８７年）。ユーカリ精油の主要成分であるシネオールに関しては防腐剤としての効果や、抗菌活性物質（ビスービグアニド化合物）の作用増強が報告されている（特開昭62-289511号）。又、Eucalyptus perriniana（ユーカリプタス・ペリニアナ）の有機溶媒抽出物から単離されたGrandinol（グランジノール）（Agric. Biol. Chem., 54,1,231,1990）やE. macrocarpa（ユーカリプタス・マクロカルパ）から単離されたMacrocarpal-A（マクロカルパル−Ａ）（Agric. Biol. Chem., 54,12,3221）にはStaphylococcus aureus（スタフィロコッカス・オーレウス）、Bacillus subtilis（枯草菌）に対して抗菌活性があることが報告されている。
【０００３】
一方、キトサンはカニの甲羅等に含まれるキチンを脱アセチル化したもので、食品添加物としても用いられている。キトサンについては、Fusarium（フザリウム）属、Escherichia coli（大腸菌）、Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）、Bacillus subtilus（枯草菌）等に対して抗菌活性があることが報告されている（Experimental Mycology 8, 276, 1984, フードケミカル 2, 22, 1988）。
【０００４】
２種類以上の抗菌成分を混合した場合の相乗効果に関する報告例としては、リファンピシンとキトサン（特開昭59-46208）、スルホンアミド類とキトサン(特開昭59-46223）、キトサンとアスコルビン酸（特開平2-35065）、ユーカリ有機溶媒抽出物（種は不明）とアルキル硫酸ナトリウム（特開昭58-39615）があり、ユーカリとキトサンの組み合わせでは報告はされていない。切り花活性剤（特開4-316506）、植物有害生物防除剤（特開平7-033602）でユーカリ抽出物、キトサンの組み合わせ例が報告されているが、抗菌活性の相乗効果に関しては記載されていない。
【０００５】
ニキビは皮脂腺に存在するニキビ菌（Propionibacterium acnes）の増殖が原因となり誘発される。又、水虫は白癬菌（Trichophyton mentagrophytes）の感染により誘発される。従って、Propionibacterium acnesやTrichophyton mentagrophytesを効率的に殺菌することができれば、ニキビや水虫を予防することができる。
【０００６】
近年、医療施設や老人ホームにおいて、MRSA（メチシリン耐性ブドウ球菌）、VRE（バンコマイシン耐性腸球菌）等の病原菌による院内感染が増加していり、これらの病原菌を効率的に殺菌することが緊急の課題となっている。
【０００７】
又、食肉加工場では、病原性大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ菌（Salmonella enteritidis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）等の食中毒菌による食肉加工機械（肉ひき機、サイレントカッター、スライサー、混和機、充填機、食肉脱水機等）や加工施設の汚染が問題となっている。
【０００８】
食肉加工場では食肉の殺菌工程において次亜塩素酸ナトリウムが殺菌剤として使用されている。具体的には、次亜塩素酸ナトリウム溶液に枝肉等の食肉を一定時間浸漬する方法で行われているが、この方法では次亜塩素酸ナトリウムが食肉や食肉から溶出される肉汁の蛋白質と化学反応を起こし、殺菌力が低下、消滅するという問題がある。又、食肉に付着した次亜塩素酸反応物の人体への安全性にも問題がある。従って、食肉の殺菌工程において、殺菌中に殺菌力が低下しない、人体に対して安全性の高い殺菌剤が望まれている。
又、上記問題を解決するような殺菌剤が、殺菌処理した畜肉に長時間殺菌力を維持させることができれば、畜肉を長時間新鮮に保つことができ、輸送中における商品の劣化を軽減・防止することも可能となる。
【０００９】
家畜自体への病原菌汚染を軽減することも食肉加工場での汚染防止につながる。その一手段として畜舎の殺菌がある。特に問題となっている病原性大腸菌（Escherichia coli）は牛、羊、豚等の家畜に生息しており、特に牛の汚染率が高い。又、サルモネラ菌（Salmonella enteritidis）も鶏や鶏卵を介して伝染し、問題となっている。例えば、畜舎が病原菌に汚染されていると、畜舎内で家畜や家畜に接触した人の手等を介して汚染が拡大する可能性がある。従って、畜舎を殺菌することも病原菌を効率良く排除するために重要である。
【００１０】
牛、豚、鶏等の家畜飼育場では、飼料が細菌に汚染されたり、飼料中で細菌が繁殖する等の問題が起こっている。飼料が病原菌に汚染されると、動物に害を及ぼすだけでなく、動物の糞が汚染源となり、さらに汚染を拡大する。従来、動物の生育を促進するために、抗生物質を添加した飼料が考案されているが、耐性菌の出現や抗生物質の残留等の問題があり、現在、抗生物質の使用が制限されている。又、魚類においても、病原菌感染予防・治療のために抗生物質が使用されており、問題となっている。
【００１１】
近年、鶏卵や卵加工品では、特にサルモネラ菌による食中毒が年々増加傾向にあり、卵の殻を殺菌することは汚染を軽減・防止することが可能である。
【００１２】
尿素分解菌（Proteus vulgaris）はおむつかぶれに関与することが報告されていおり、殺菌剤をおむつに配合することにより、おむつかぶれの発生を軽減、防止することができると考えられる。
【００１３】
上記の様々な病原菌に対する殺菌剤として、アルコール、合成殺菌剤、次亜塩素酸ナトリウム等の塩素系薬剤が使用されている。しかし、アルコールでは殺菌力の持続性、合成殺菌剤や塩素系薬剤では人体に対する安全性に問題がある。従って、上記病原菌に対する殺菌剤は直接、人体・動物の皮膚に触れたり、経口接種される可能性もあるので、安全性の高い殺菌剤が求められている。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
安全性が高く、低濃度で上記病原菌に対して殺菌力があり、かつ、殺菌力に持続性があり、又、食肉の殺菌工程において殺菌中に殺菌力に低下のない、殺菌工程で繰り返し使用可能な殺菌剤を提供することを課題とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、ユーカリ属極性有機溶媒抽出物とキトサンとを含む殺菌剤が、ユーカリ抽出物とキトサンの相乗効果により、低濃度で殺菌力を発揮し、かつ、殺菌力に持続性があり、又、食肉（ハム、ソーセージ等の加工品も含む）の殺菌剤として使用した場合、殺菌力に低下が起こらないことを見いだした。さらに、上記組成の殺菌剤にグリセリン脂肪酸エステルを添加した場合、殺菌力の持続性が向上し、又、ユーカリ抽出物の作用により、グリセリン脂肪酸エステルの抗カビ力が増強されることを見いだした。本殺菌剤は、医療施設、食肉加工施設、畜舎、鶏舎、鳥類卵殻、食肉等の殺菌に使用することができ、又、飼料、ウエットティッシュ、おむつ等に配合することにより殺菌力を付加することができることを見いだし本発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明は、ユーカリ属植物葉の極性溶媒抽出物とキトサンとを含む殺菌剤である。前記ユーカリ属植物葉の極性有機溶媒抽出物としては、非極性有機溶媒による脱脂または水蒸気蒸留により精油を除去したユーカリ属植物葉を極性有機溶媒で抽出した画分が挙げられる。
【００１７】
前記極性有機溶媒としてはハロゲン化炭化水素、エーテル、低級脂肪酸エステル、ケトン、低級アルコールから選ばれる溶媒またはこれらの任意の混合溶媒が、前記非極性有機溶媒としてはアルカンが挙げられる。
【００１８】
また、前記ユーカリ属植物葉の極性溶媒抽出物としては、下記式（Ｉ）で表されるジヒドロカルコン化合物を主要な殺菌成分として含む抽出物が挙げられる。
【００１９】
【化２】
【００２０】
本発明はまた、好ましい態様として、ニキビ菌、白癬菌、アスペルギルス又はペニシリウム属に属する微生物に対して使用される殺菌剤、鳥類卵殻、医療施設、食肉又は食肉加工施設の殺菌に用いられる殺菌剤、及び飼料、ウエットティッシュ、又はおむつに配合する殺菌剤として使用される殺菌剤を提供する。
本発明の殺菌剤は、すでに安全性が知られている天然物を有効成分とするため、人体に対して安全性が高い。
【００２１】
尚、本発明において「殺菌」とは、細菌等の微生物を死滅させること、及び増殖を阻害することの両方を含む概念である。本明細書において、用途に応じて慣用されている「殺菌」及び「抗菌」の用語を用いるが、いずれも前記の概念から外れるものではない。また、「食肉加工施設」とは、食肉加工場、食肉加工場に付設された設備または機械、及び食肉加工に用いる刃物等の調理器具またはテーブル等を含む。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
＜１＞ユーカリ属植物の極性有機溶媒抽出物
本発明の殺菌剤に用いるユーカリ属植物の極性有機溶媒抽出物（以下、「ユーカリ抽出物」ともいう）は、ユーカリ属植物の葉を極性有機溶媒で抽出して得られる抽出物である。
【００２４】
原料となる葉は、ユーカリ属に属する植物の葉であれば使用可能で、ユーカリプタス・グランディス（Eucalyptus grandis）、ユーカリプタス・ボツリオイデス（Eucalyptus botryoides）、ユーカリプタス・グロブルス（Eucalyptus globulus）、ユーカリプタス・カマルジュレンシス（Eucalyptus camaldulensis）、ユーカリプタス・クレブラ（Eucalyptus crebra）、ユーカリプタス・マクラタ（Eucalyptus maculata）、ユーカリプタス・ビミナリス（Eucalyptus viminalis）等の植物の葉を用いることができる。これらのユーカリ葉は、単独の植物由来の葉を用いてもよく、２種以上の植物由来の葉を組み合わせて用いることもできる。
【００２５】
上記のようなユーカリ属植物葉を、極性有機溶媒で抽出する。抽出に先立って、葉を適当な大きさに破砕したり、粉末化するなど、溶媒抽出し易いように前処理する。極性有機溶媒としては、クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、メチルエーテル、エチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル等の低級脂肪酸エステル類、又はアセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、メタノール、エタノール、プロパノール等の低級アルコール類、プロピレングリコール、ブチレングリコール等のグリコール類が挙げられる。これらの溶媒は、単独で用いてもよく、任意の２種又は３種以上の混合溶媒として用いてもよい。上記溶媒の中では、得られる抽出物の殺菌活性の点から酢酸エチル、アセトン、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコールが好ましく、エタノール、プロピレングリコールがさらに好ましい。
【００２６】
抽出方法としては、一般に用いられる方法でよく、例えば極性有機溶媒中に原料ユーカリ葉を長時間浸漬する方法、極性有機溶媒の沸点以下の温度で加温、撹拌しながら抽出を行い、濾過して抽出物を得る方法などがある。得られた抽出物は、減圧濃縮等によって濃縮することが好ましい。
【００２７】
また、上記抽出・分離操作中、殺菌活性の高いユーカリ抽出物を得るには、ユーカリ葉を直接極性有機溶媒で抽出するよりも、ユーカリ葉を乾燥後、非極性有機溶媒で脱脂し、精油を除去してから極性有機溶媒で抽出する態様が好ましい。非極性溶媒で脱脂する過程では精油が除去される。この操作は水蒸気蒸留により精油を除去した後の残渣に極性溶媒を添加し抽出する方法でも行うことができる。前記非極性溶媒としては、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン等のアルカンが挙げられる。
しかし、脱脂操作は本発明に必須ではなく、直接、ユーカリ属植物葉を極性有機溶媒で抽出して得られる画分も、本発明の殺菌剤に使用することができる。その場合の極性有機溶媒としては、低級アルコール、またはプロピレングリコール、ブチレングリコール等のグリコール類が挙げられる。
【００２８】
ユーカリ葉抽出物の殺菌活性と収率を合わせて総合評価すると、殺菌活性が強く、抽出物の収率が高い方法は、脱脂時に用いる非極性溶媒としてヘキサンを、抽出溶媒としてエタノールを組み合わせる態様が好ましい。
【００２９】
後記製造例に示すように、ユーカリプタス・マクラタの葉抽出物には、殺菌力を有する化合物として、前記式（Ｉ）で表される新規なジヒドロカルコン化合物及び公知のフラボン化合物（ユーカリプチン(eucalyptin)及び８−デスメチル−ユーカリプチン(8-desmethyl-eucalyptin)（Aust. J. Chem. 17, 692, 1964; Aust. J. Chem. 17, 464, 1964））が含まれている。ユーカリ葉に含まれる殺菌作用を示す化合物には、これらの化合物以外の化合物も含まれていると考えられるが、本発明に用いるユーカリ抽出物を調製する際に、これらの化合物またはその類縁体を指標とすることができると推定される。また、本発明に用いるユーカリ抽出物の具体的態様として、前記ジヒドロカルコン化合物もしくはフラボン化合物またはこれらの類縁体の少なくとも１種または２種以上を主要な殺菌成分として含む抽出物、あるいは精製したこれらの化合物またはその類縁体が挙げられる。
【００３０】
＜２＞キトサン
キトサン（ポリβ−１，４−グルコサミン）は、キチンの脱アセチル化物であり、例えばカニ、エビ等の甲殻類の殻、あるいは昆虫の外骨格に含まれているキチンを、高濃度熱アルカリ溶液中で脱アセチル化することにより得られる。また、キトサン生産菌を培養することによっても得ることができる。また、市販品を用いることもできる。
【００３１】
本発明に用いるキトサンの分子量は特に制限されないが、低粘度であることが好ましく、５〜５０ｃｐ程度（0.5%キトサン濃度）が好ましい。また、水溶性を高めたキトサンオリゴ糖やキトサン乳酸塩、キトサン塩酸塩等のキトサン誘導体を用いることもできるが、殺菌力の強い殺菌剤を調製するためには、キトサンを用いることが好ましい。
【００３２】
＜３＞本発明の殺菌剤
本発明の殺菌剤は、上記ユーカリ抽出物及びキトサンとを含む。殺菌剤の剤型は特に制限されず、例えば、液状、ペースト状、スプレー剤、ムース剤等、適用方法に応じて多岐にわたって選択され、噴霧、浸漬、塗布、拭き取り等の方式によって行われる。液状とする場合は、ユーカリ抽出物とキトサンを適当な溶媒に溶解させ、殺菌液として用いることができる。溶媒としては、エタノールと水の混合液（比率は任意）に、例えば、キトサンを溶解させる為の乳酸、酢酸等の酸を添加した溶媒が用いられる。但し、高濃度のエタノールはタンパク質を変性させるので、食肉等の殺菌剤として使用する場合は、エタノール濃度を0〜10%程度の範囲にするのが望ましい。尚、水溶性を高めたキトサンオリゴ糖や水溶性を高めたキトサン誘導体を用いる場合は、前記の酸は添加しなくてまもよい。
【００３３】
本発明の殺菌剤中におけるユーカリ抽出物及びキトサンの含有量は、その使用態様・剤形により適宜変更しうるが、例えば、これらを合計で０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．００１〜１．０重量％程度含有させることが例示される。尚、不揮発性のプロピレングリコール、ブチレングリコール等のグリコール類をユーカリ属葉の抽出溶媒として用いる場合は、ユーカリ抽出液として０．１〜１０容量％程度含有させることが例示される。この範囲の上限を越えると、殺菌剤の芳香に影響することがあり、下限を下回ると効果が得にくくなることがあるので、上記範囲が好ましい。ユーカリ抽出物とキトサンは、上記濃度の範囲内において任意の比率で混合することができる。キトサンを溶解させる為の酸（乳酸、酢酸等）は、キトサンを溶解し得る範囲で任意の濃度で配合することができる。
【００３４】
又、ユーカリ抽出物とキトサンを含む組成の殺菌剤にグリセリン脂肪酸エステルを添加する場合、上記ユーカリ抽出物及びキトサンを含む組成に０．０００１〜２０重量％、好ましくは、０．００１〜１．０重量％のグリセリン脂肪酸エステル類を添加することが例示される。
【００３５】
本殺菌剤を食肉の殺菌剤として使用する場合は、殺菌中に牛肉から溶出される成分の影響で殺菌剤のｐＨが上昇し、ｐＨ５．５を超えると殺菌力が低下するため、殺菌剤のｐＨを５．５以下、好ましくは５．０以下に維持するように乳酸、酢酸等の酸、あるいはｐＨ調製剤を添加することが例示される。添加の方法はあらかじめ殺菌剤中に高濃度の酸、あるいはｐＨ調製剤を添加しておいても良いし、殺菌中に連続的に酸を添加し、ｐＨを５．５以下に維持させてもよい。
【００３６】
上記殺菌剤には、本発明の効果を損なわない範囲で、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等に一般的に用いられる各種成分、酸度調節剤、安定化剤、界面活性剤、抗酸化剤等に用いられている成分を配合することができ、２成分以上配合しても良い。更に、殺菌効果をさらに増強する目的で他の殺菌剤と併用してもよい。
【００３７】
食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等に一般的に用いられる各種成分としては、例えば、界面活性剤（アニオン性、カチオン性、両性又は非イオン性界面活性剤）、抗酸化剤（ステアリン酸エステル、ノルジヒドログアセレテン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、パラヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、セサモール、セサモリン、ゴシポール等）、保湿剤（プロピレングリコール、1、3-ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、コンドロイチン硫酸及びその塩、ヒアルロン酸及びその塩、乳酸ナトリウム、ローヤルゼリーエキス、等）又、その他、コラーゲン、低級アルコール、多価アルコール、水溶性高分子、ｐＨ調節剤、香料、清涼剤、安定化剤、動植物抽出物、動植物性蛋白質及びその分解物、動植物性多糖類及びその分解物、動植物性糖蛋白質及びその分解物、微生物培養代謝成分、アミノ酸及びその塩、消臭・脱臭剤、乳化剤等と共に配合し、併用して用いることができる。
【００３８】
酸度調節剤としては、例えば、アジピン酸、クエン酸、クエン酸三ナトリウム、グリシン、グリセリン脂肪酸エステル、グルコノデルタラクトン、グルコン酸、コハク酸、コハク酸一ナトリウム、コハク酸二ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、DL-酒石酸、L-酒石酸、DL-酒石酸ナトリウム、L-酒石酸ナトリウム、炭酸塩類、二酸化炭素、乳酸、乳酸ナトリウム、フマル酸、フマル酸一ナトリウム、リゾチーム、DL-リンゴ酸、DL-リンゴ酸ナトリウム、リン酸、リン酸塩類、重合リン酸塩類、イタコン酸、フィチン酸等が挙げられる。
【００３９】
界面活性剤としては例えば、モノステアリン酸グリセロール、トリオレイン酸ポリグリセロール等のグリセリン脂肪酸エステル、有機酸モノグリセリド、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、レシチン、リゾレシチン、ポリエチレングリコール、ポリオキシアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリアミン、アルキルポリオキシエチレン硫酸エステル塩、アルキル硫酸エステル塩、アシルメチルタウリン塩、N-アシルグルタミン酸塩、アルキルアミドベタイン等が挙げられる。
【００４０】
抗酸化剤としてはカテキン、トコフェロール、プロポリス、エラグ酸、動植物抽出物（セージ、セリ、ローズマリー等）が挙げられる。
【００４１】
殺菌剤としては、殺菌活性がある物質、抽出物であれば特に制限はなく、例えば、ヒノキチオール、トリクロサン、塩化セチルピリジニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、動植物抽出物、精油等が挙げられる。
【００４２】
ユーカリ属植物抽出物とキトサンを含有する殺菌剤は、ユーカリ抽出物とキトサンの相乗効果により、MRSA、Staphylococcus aureus、Escherichia coli、Salmonella typhimurium（サルモネラ・チフィムリウム）、Salmonella enteritidis、 Enterococcus faecalis（VRE：バンコマイシン耐性腸球菌）、Pseudomonas putida（緑膿菌）、Bacillus subtilis、Bacillus cereus（バチルス・セレウス）、Vibrio parahaemolyticus（ビブリオ・パラヘモリティカス）、Arthrobacter globiformis（アースロバクター・グロビフォルミス）、Brevibacterium linens（ブレビバクテリウム・リネンス）、Proteus vulgaris、Propionibacterium acnes, Trichophyton mentagrophytesに対して強い殺菌力を発揮し、また、この殺菌力に持続性がある。又、ユーカリ抽出物及びキトサン共に安全性が高く、他の成分として安全性の高いものを選択することにより、安全性の高い殺菌剤を調製することができる。
【００４３】
前記ユーカリ抽出物とキトサンを含む組成にグリセリン脂肪酸エステルを添加した殺菌剤は、ユーカリ抽出物とグリセリン脂肪酸エステルとの相乗効果によりAspergillus niger（アスペルギルス・ニガー）、Penicillium citrinum（ペニシリウム・シトリナム）等のカビに対しても効果を発揮する。又、本殺菌剤をエタノールと水の混合液系として調製した場合も、エタノールの瞬間的な殺菌作用も加わるため、上記カビに対しても効果を発揮する。
【００４４】
従って、本殺菌剤は、例えば、一般家庭や飲食店等において、テーブル、食器類、まな板、調理台、トイレの便座等の家庭用品、畜舎、鶏舎、動物飼育用建物・器具類、食肉加工施設・機械類、飲食店や一般家庭の厨房、人や動物等の皮膚、鶏卵やウズラ等の卵殻、又、病院や老人ホームにおいてドア、ドアの取っ手、床、ベッドの手すり、手術用器具等の医療機器、医療設備、肉、魚、野菜等の食品、植物の種子の殺菌剤として、又、ウェットティシュ、おむつ、シーツ類、衣類、衛生綿類、おしり拭き、不織布、油取り紙、食品包装用の紙類（シート）、食品の下に敷く紙類（シート）、下紙スリッパ、おしぼり、タオル、カバー、動物・魚類等の飼料、ガム、キャンディー、かまぼこ、ちくわ等の水産ねり製品、ソーセージ、ハム等の畜産製品、洋菓子類、和菓子類、生めん、ソバ等のめん類、ソース、醤油等の調味料、漬物、惣菜等、卵加工品、サンドイッチ、マヨネーズ、シュークリーム等に殺菌力を付加する殺菌剤として使用することができる。又、本殺菌剤は石鹸、洗浄剤、クリーム等に配合したり、経口薬剤等に添加することもできる。
【００４５】
本殺菌剤を食肉の殺菌工程で使用する場合、殺菌力に低下が起こらないので、殺菌工程において繰り返して使用することができる。又、本殺菌剤は、食肉を殺菌処理した場合、食肉表面の細菌の増殖を長時間にわたり抑制する効果があるので、食肉を長時間新鮮に保つことができる。
【００４６】
本殺菌剤を鳥類卵殻の殺菌剤として使用する場合、本発明の殺菌剤を卵殻表面に付着させた鳥類の卵は、そのまま流通させることができる。
【００４７】
本発明の殺菌剤をスプレーとして使用する場合、内容物を収納する容器としては、内容物を噴霧できる容器であれば良く、例えば、エアゾール方式、トリガー方式等のスプレー容器が挙げげられる。エアゾール方式では、例えば、炭酸ガス、窒素ガス、ジメチルエーテル等の噴霧剤を添加して用いる。
【００４８】
【実施例】
以下、実施例、試験例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は例示的であり、本発明の範囲は特許請求の範囲により規定される。
【００４９】
【製造例１】
ユーカリ（Eucalyptus grandis、 Eucalyptus botryoides, Eucalyptus globulus, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus crebra, Eucalyptus maculata, Eucalyptus viminalis)の葉を乾燥し（それぞれ乾燥重量３０ｇ）、それぞれアセトン５００mlで３日間室温で抽出した。抽出液は減圧下溶媒を留去し、アセトン抽出物を得た。
【００５０】
【製造例２】
ユーカリ（Eucalyptus grandis, Eucalyptus botryoides, Eucalyptus globulus, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus crebra, Eucalyptus maculata, Eucalyptus viminalis)の葉を乾燥し（それぞれ乾燥重量３０ｇ）、それぞれエタノール５００mlで３日間室温で抽出した。抽出液は減圧下溶媒を留去し、エタノール抽出物を得た。
【００５１】
【製造例３】
ユーカリ（Eucalyptus grandis, Eucalyptus botryoides, Eucalyptus globulus, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus crebra, Eucalyptus maculata, Eucalyptus viminalis)の葉を乾燥し（それぞれ乾燥重量３０ｇ）、それぞれｎ−ヘキサン５００mlで２日間室温で脱脂後、エタノール５００mlで３日間室温で抽出した。抽出液は減圧下溶媒を留去し、エタノール抽出物を得た。
【００５２】
【製造例４】
ユーカリ（E. maculata)の葉を乾燥し（乾燥重量５００ｇ）、ｎ−ヘキサン６Ｌで２日間室温で脱脂後、アセトン６Ｌで３日間室温で抽出した。抽出液は減圧下溶媒を留去し、アセトン抽出物約６５ｇ（葉からの収率13%）を得た。
【００５３】
【製造例５】
ユーカリ（Eucalyptus grandis, Eucalyptus botryoides, Eucalyptus globulus, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus crebra, Eucalyptus maculata, Eucalyptus viminalis）の葉を乾燥し（それぞれ乾燥重量３０ｇ）、それぞれプロピレングリコール５００ｍｌで３日間室温で抽出した。
【００５４】
【製造例６】
ユーカリ（Eucalyptus grandis, Eucalyptus botryoides, Eucalyptus globulus, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus crebra, Eucalyptus maculata, Eucalyptus viminalis）の葉を乾燥し（それぞれ乾燥重量３０ｇ）、それぞれ１，３−ブチレングリコール５００ｍｌで３日間室温で抽出した。
【００５５】
次に、アセトン抽出物を最初にヘキサンと水で分配抽出し、ヘキサン層を分離後、残った水層をジクロロメタンで分配抽出し、さらに酢酸エチル、ｎ−ブタノールの順に分配抽出した。活性の高い画分として酢酸エチル画分を濃縮し、酢酸エチル抽出物を約２３ｇ得た（葉からの収率4.6%）。
【００５６】
次に、酢酸エチル画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ヘキサン−酢酸エチル混液で溶出した。ヘキサン／酢酸エチル＝３／１混液で溶出した画分を濃縮し３．９２ｇの活性画分を得た（葉からの収率0.78%)。この画分をさらにＯＤＳ−ＨＰＬＣに付し、メタノール−蒸留水＝80／20混液で分取し、化合物（Ｉ）を１．３３ｇ（葉中含有率0.27%)、化合物（II）を１５６mg（葉中含有率0.031%）、化合物（III)を１２５mg（葉中含有率0.025%）得た。
【００５７】
化合物（II）及び（III)は理化学データよりそれぞれ既知フラボン化合物 eucalyptin 及び 8-desmethyl-eucalyptin（Aust. J. Chem. 17, 692, 1964; Aust. J. Chem. 17, 464, 1964）であることが判明した。
【００５８】
化合物（Ｉ）は次の理化学的性質より新規ジヒドロカルコン化合物であることが判明した。
【００５９】
分子量： EI-MS m/z 286(M+), 181, 154、分子式：Ｃ17Ｈ18Ｏ4
【００６０】
ＵＶ（λmax MeOH）：286nm(ε=21700)
【００６１】
ＩＲ（νmax KBr)：3296, 2944, 2924, 1650, 1595, 1516, 1429, 1274, 1247, 1213, 1147, 1112, 1082, 886, 799, 742, 720, 699, 468cm-1
【００６２】
1H-ＮＭＲ（δDMSO-d6)：1.86(3H, s), 2.89(1H, t, J=7.6), 3.32(1H, t, J=7.6), 3.77(3H, s), 6.08(1H,s), 7.15-7.30(5H, m), 10.92(1H, s), 13.64(1H, s) ppm
【００６３】
13C-ＮＭＲ（δDMSO-d6) ：7.2, 30.1, 45.3, 55.4, 90.3, 102.3, 104.1, 125.8, 128.3, 141.6, 160.5, 162.0, 163.2, 204.7 ppm
【００６４】
〔ユーカリ抽出物とキトサンの抗菌活性〕
＜１＞製造例３のユーカリ抽出物及びキトサンについて、抗菌活性を調べた。使用した菌株は以下のとおりである。
【００６５】
MRSA RIM 0310925、Staphylococcus aureus IFO12732、Escherichia coli IFO12734、Salmonella typhimurium IFO12529、Salmonella enteritidis IFO3313、Enterococcus faecalis IFO12970、Pseudomonas putida IFO3738、Bacillus subtilis JCM1465、Bacillus cereus IFO3001、Vibrio parahaemolyticus IFO12711、Arthrobacter globiformis IFO12137、Brevibacterium linens IFO12142、Proteus vulgaris IFO30456、Propionibacterium acnes ATCC6919、Trichophyton mentagrophytes IFO05466。
【００６６】
表１に示す培養条件で各菌株を前培養後、生理食塩水で希釈し、細菌については、菌数を約5×108個/mlに調製した。又、真菌（Trichophyton mentagrophytes）については、胞子数を5×106個/mlに調製した。尚、Propionibacterium acnesについては嫌気性条件下で培養した。
【００６７】
【表１】
【００６８】
製造例３のユーカリ抽出物をDMSOに溶解し、この溶液を抽出物の最終濃度が63〜0.2μg/mlになるように10μlを、培地190μlを入れた９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。一方、キトサン（和光純役：キトサン10）については滅菌蒸留水（0.005%乳酸添加 pH5.3）に溶解し、この溶液をキトサンの最終濃度が63〜0.2μg/mlになるように10μlを培地190μlを入れた９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。最後に各ウェルに上記菌懸濁液を10μl加え、表１に示す各菌の培養に適した条件で培養し、細菌については、２４時間後、真菌（Trichophyton mentagrophytes）については７日後に発育の有無を肉眼で観察し、最小発育阻止濃度（MIC）を調べた。
【００６９】
表２に各ユーカリ抽出物およびキトサンのMIC値の結果を示す。ユーカリ抽出物は、MRSA、Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis、Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Arthrobacter globiformis、Propionibacterium acnes、Trichophyton mentagrophytesに対する抗菌活性が特に強く、キトサンと比べて、明らかに抗菌スペクトルが異なることが判明した。
【００７０】
【表２】
【００７１】
又、精油の抗菌活性を調べるために水蒸気蒸留により精油をユーカリ属植物葉から回収し、上記と同様の方法で各種細菌に対して最小発育阻止濃度を調べた。尚、精油を溶解させる溶媒としてエタノールを用いた。
【００７２】
ユーカリ属より得た精油のMIC値を表３に示すが精油画分については強い抗菌活性は認められなかった。
【００７３】
【表３】
【００７４】
＜２＞製造例５のユーカリ抽出物について、以下の方法で抗菌活性を調べた。
【００７５】
製造例５のユーカリ抽出物を滅菌蒸留水で１０倍希釈し、この希釈液10μlを、表１に示す培地190μlを入れた９６ウェルプレートの各ウェルに添加した（抽出物は原液の200倍希釈）し、上記と同様の方法で抗菌活性を調べた。
【００７６】
表４に結果を示すが、本抽出物（200倍希釈液）には、MRSA、Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Arthrobacter globiformis、Propionibacterium acnes、Trichophyton mentagrophytesに対して抗菌活性が認められた。
【００７７】
【表４】
【００７８】
＜ユーカリ抽出物、キトサンを併用した場合の殺菌力試験＞
製造例２のユーカリ抽出物をDMSOに溶解し2倍希釈系列を作成した。一方、キトサンを滅菌蒸留水（乳酸添加）に溶解した。各々を50μlを滅菌蒸留水900μlと混合した（ユーカリ抽出物の最終濃度：0〜2500μg/ml、キトサンの最終濃度：0〜125μg/ml、乳酸濃度：キトサン１ｇに対して乳酸0.6mlの割合で添加）。
【００７９】
表１に示す条件で細菌（Staphylococcus aureus IFO12732、Bacillus subtilis JCM1465、Escherichia coli IFO12734）を培養後、10μlを上記混合液に添加し、S. aureus、B. subtilisについては1時間、E. coliについては4時間、室温で放置した。放置後、1mlを15mlニュートリエント寒天培地に添加し、24時間各菌の培養に適した条件で培養し、菌の発育の有無を観察した（菌が発育：＋、菌が発育せず：−）。表５にS. aureusの結果を示すが、ユーカリ抽出物1.0μg/ml、キトサン3.1μg/ml併用した場合、最小殺菌濃度（MBC）の値よりFIC Indexは0.19となり、相乗効果が認められた（FIC Indexが0.5以下で相乗効果あり）。表６にB. subtilisの結果を示すが、ユーカリ抽出物0.5μg/ml、キトサン3.1μg/ml併用した場合、FIC Indexは0.312となり、相乗効果が認められた。又、表７にE. coliの結果を示すが、ユーカリ抽出物78μg/ml、キトサン7.8μg/ml併用した場合FIC Indexは0.187となり、相乗効果が認められた（FIC Index＝（A成分とB成分を併用したときのA成分のMBC／単独使用のときのA成分のMBC）＋（A成分とB成分を併用したときのB成分のMBC／単独使用のときのB成分のMBC）：第25回日本防菌防黴学会年次大会p.35参照）。
【００８０】
【表５】
【００８１】
【表６】
【００８２】
【表７】
【００８３】
＜殺菌剤の殺菌力の持続性試験＞
〔実施例１〜３〕
製造例３のユーカリ抽出物とキトサン、及び他の成分を、表８に示す割合で混合し、実施例１〜３及び比較例１〜４の殺菌剤を作成した。ユーカリ抽出物とキトサンは重量％、乳酸とエタノールは容量％で示す。
【００８４】
【表８】
【００８５】
【試験例１】
紙面上での殺菌力の持続性試験
乾熱滅菌したペーパーディスク（直径8mm）に表８に示す各種殺菌剤を25μlしみ込ませ、7日間放置した。表１に示す条件で前培養した菌懸濁液を生理食塩水で希釈後、このペーパーディスク上に10μlしみ込ませた。１分間放置後、直ちに生理食塩水（１ｍｌ）の入った試験管に移し、ボルテックスで１分間撹拌し、ペーパーディスク中の菌を溶出させた。この生理食塩水を希釈し、一定量を寒天培地上に塗布することにより生菌数をカウントした。尚、対照として水を、又、既存の殺菌剤のコントロールとして70%エタノールを用いた。各実施例の結果を表９に、比較例の結果を表１０に示す。殺菌剤塗布後、7日間経過した時点でも、ユーカリ抽出物とキトサンをともに含む各実施例の殺菌剤には強い殺菌力が維持されており、ユーカリ抽出物単独（比較例１〜３）あるいはキトサン単独（比較例４）で含む殺菌剤と比較して殺菌力が強かった。
【００８６】
【表９】
【００８７】
【表１０】
【００８８】
【試験例２】
抗白癬菌活性測定
乾熱滅菌したペーパーディスク（直径8mm）に表８に示す殺菌剤を25μlしみ込ませ24時間放置し、ペーパーディスクを乾燥させた。あらかじめ調製した白癬菌（Trichophyton mentagrophytes）の胞子懸濁液を塗布した寒天培地上にこのペーパーディスクを置き、28℃で５日間培養し、ペーパーディスクの周りに阻止円ができるかどうかを観察した。尚、コントロールに既知の殺菌剤として７０％エタノールを用いた。表１１に示すようにユーカリ抽出物とキトサンをともに含む各実施例の殺菌剤の方がユーカリ抽出物単独で含む殺菌剤に比べ径の大きい阻止円が形成された。一方、キトサン単独で含む殺菌剤（比較例４）では阻止円は形成されなかった。すなわち、ユーカリ抽出物に白癬菌に対する抗菌力に持続性があり、キトサンにより抗菌力が増強された。
【００８９】
【表１１】
【００９０】
【試験例３】
ステンレス上での殺菌力の持続性試験
滅菌したステンレス板上に表８に示す各殺菌剤を噴霧し（15μl/cm2）、無菌室内で７日間放置し乾燥させた。前記と同様にして前培養した各細菌の懸濁液を生理食塩水で希釈後、このステンレス板上に10μlのせた。10分間放置後、脱脂綿でステンレス板上の菌を拭き取り、菌を生理食塩水中に溶出させ、生菌数を測定した。各実施例の結果を表１２、比較例の結果を表１３に示す。尚、既存の殺菌剤として７０％エタノールについても比較検討した。ユーカリ抽出物とキトサンをともに含む各実施例の殺菌剤を塗布したステンレス板上には、７日間経過した時点でも、強い殺菌力が維持されていた。又、この殺菌力はユーカリ抽出物単独（比較例１〜３）あるいはキトサン単独（比較例４）で含む殺菌剤の殺菌力と比較して強かった。
【００９１】
【表１２】
【００９２】
【表１３】
【００９３】
【試験例４】
卵殻上での殺菌力の持続性試験
滅菌した鶏卵殻表面に表８に示す組成の殺菌剤を噴霧し（15μl/cm2）、無菌室内で７日間放置し乾燥させた。前培養した菌懸濁液を生理食塩水で希釈後、この希釈した菌懸濁液10μlをこの鶏卵殻表面にのせた。10分間放置後、脱脂綿で鶏卵殻表面の菌を拭き取り、菌を生理食塩水中に溶出させ、生菌数を測定した。尚、ブランクとして水を、コントロールに既知の殺菌剤として７０％エタノールを用いた。実施例の結果を表１４、比較例の結果を表１５に示す。キトサン単独（比較例４）、ユーカリ抽出物単独（比較例１〜３）に比べ、ユーカリ抽出物とキトサンをともに含む殺菌剤（実施例１〜３）では殺菌率が高かった。すなわち、７日経過した時点でも卵殻表面に殺菌力が維持されていた。
【００９４】
【表１４】
【００９５】
【表１５】
【００９６】
〔実施例４〕
製造例２のユーカリ抽出物、キトサン、グリセリン脂肪酸エステル、及び他の成分を、表１６に示す割合で混合し、実施例４及び比較例５の殺菌剤を作成した。ユーカリ抽出物とキトサンは重量％、乳酸とエタノールは容量％で示す。
【００９７】
【表１６】
【００９８】
【試験例５】
ステンレス上での殺菌力の持続性試験（グリセリン脂肪酸エステルの影響）
表１６に示す殺菌剤について、試験例３と同様の方法でステンレス上での殺菌力の持続性を調べた（１ケ月間放置）。結果を表１７に示すが、殺菌剤噴霧後（15μl/cm2）、１ケ月経過した時点で比較した場合、ユーカリ抽出物とキトサンにグリセリン脂肪酸エステルを添加した組成（実施例４）では添加しない組成（比較例５）に比べ強い殺菌力が維持されていた。
【００９９】
【表１７】
【０１００】
〔実施例５〜７〕
製造例５のユーカリ抽出物とキトサン、及び他の成分を、表１８に示す割合で混合し、実施例５〜７の殺菌剤を作成した。キトサンは重量％、ユーカリ抽出物、乳酸は容量％で示す。
【０１０１】
【表１８】
【０１０２】
【試験例６】
紙面上での殺菌力の持続性試験
表１８に示す殺菌剤について、試験例１と同様の方法で殺菌力の持続性を調べた（７日間放置）。その結果を表１９に示す。殺菌剤塗布後、７日間経過した時点でも、ユーカリ抽出物とキトサンをともに含む各実施例の殺菌剤には強い殺菌力が維持されていた。
【０１０３】
【表１９】
【０１０４】
〔実施例８、９〕
製造例３のユーカリ抽出物（E. globulus, E. maculata）とキトサン、及び他の成分を表２０に示す割合で混合し、実施例８、９及び比較例６〜９の殺菌剤を作製した。尚、ユーカリ、キトサンは重量％、乳酸は容量％である。
【０１０５】
【表２０】
【０１０６】
【試験例７】
肉エキスと混合した場合の殺菌剤の殺菌力試験
表２０の殺菌剤について、以下の方法で牛肉エキス（和光純薬）と混合した場合、殺菌力の低下が起こるかどうかを調べた。又、次亜塩素酸ナトリウムについても比較検討した。使用した菌株は以下のとおりである。 Staphylococcus aureus IFO12732、Salmonella enteritidis IFO03313。
【０１０７】
表２０に示した各種殺菌剤１ｍｌと５％牛肉エキス（滅菌蒸留水に溶解）１ｍｌを1対１の割合で混合し、室温で放置した。10分後、これらの各種殺菌剤及び混合液にあらかじめ調製しておいた菌液10μlを添加し、攪拌後放置し、混合液中の細菌数の変化（細菌を添加してから1分後、5分後、10分後）を調べた。尚、予備実験より５％牛肉エキス１ｍｌ当たりの一般生菌数は１０以下であることを確認した。表２１、表２２に示すように0.02%次亜塩素酸ナトリウムは牛肉エキスと混合することにより、殺菌力が低下することが判明した。一方、ユーカリ抽出物とキトサンをともに含む殺菌剤（実施例８、９）では牛肉エキスと混合しても殺菌力の低下がみられなかった。又、ユーカリ抽出物とキトサンをともに含む殺菌剤（実施例８、９）ではユーカリ抽出物単独（比較例６、７）、キトサン単独（比較例８）で含む殺菌剤と比較して殺菌力が強化されていることが判明した。
【０１０８】
【表２１】
【０１０９】
【表２２】
【０１１０】
〔実施例１０、１１〕
製造例５のユーカリ抽出物（E. globulus, E. maculata）とキトサン、及び乳酸を表２３に示す割合で混合し、実施例１０、１１の殺菌剤を作製した。尚、ユーカリ抽出物と乳酸は容量％、キトサンは重量％である。
【０１１１】
【表２３】
【０１１２】
【試験例８】
肉エキスと混合した場合の殺菌剤の殺菌力試験
表２３に示す殺菌剤について、試験例７と同様の方法で殺菌力を調べた。結果を表２４に示す。その結果、各実施例の殺菌剤には、強い殺菌力があった。
【０１１３】
【表２４】
【０１１４】
〔実施例１２、１３〕
製造例５のユーカリ抽出物（E. globulus）とキトサン、及び乳酸を表２５に示す割合で混合し、実施例１２、１３及び比較例１０、１１の殺菌剤を作製した。尚、ユーカリ抽出物（プロピレングリコール抽出物）と乳酸は容量％、キトサンは重量％である。
【０１１５】
【表２５】
【０１１６】
【試験例９】
牛肉と混合した場合の殺菌剤の殺菌力試験
表２５に示した各種殺菌剤１００ｍｌを容器に入れ、次に牛肉（ブロック）２１ｇをこの殺菌剤中に浸し、室温で放置した。２４時間後、牛肉を取り除き、この殺菌剤中に存在する一般細菌（牛肉から溶出した細菌）を無菌フィルターで取り除いた。この牛肉処理後の殺菌剤２ｍｌにStaphylococcus aureus、又はSalmonella enteritidisの菌液30μlを添加し、添加してから５分後の殺菌剤中の細菌数を調べた。又、次亜塩素酸ナトリウムについても比較検討した。
【０１１７】
表２６に示すように0.01%次亜塩素酸ナトリウムは牛肉と混合した場合、Staphylococcus aureus、Salmonella enteritidisに対する殺菌力が低下した。ユーカリ抽出物とキトサンをともに含む殺菌剤のうち、乳酸濃度が0.030%の殺菌剤（実施例１２）では、Staphylococcus aureusに対する殺菌力は維持されていたが、Salmonella enteritidisに対する殺菌力の低下を引き起こした。尚、この時の殺菌剤のpHは4.2（殺菌前）から5.9（殺菌後）に上昇した。一方、乳酸濃度が0.30%の殺菌剤（実施例１３）では、Staphylococcus aureus、Salmonella enteritidisに対して強い殺菌力が維持されていた。尚、この時の殺菌剤のpHは3.1（殺菌前）から4.8（殺菌後）に上昇した。以上の結果から、牛肉殺菌中に牛肉から溶出される成分の影響で殺菌剤のpHが上昇し、殺菌力の低下を引き起こすが、あらかじめ殺菌剤中の乳酸濃度を高くして、殺菌剤のpHを低い領域（pH4.8付近まで）に維持させておけば、殺菌力の低下を防止できることが判明した。
【０１１８】
【表２６】
【０１１９】
【試験例１０】
殺菌剤で処理した牛肉表面の細菌数の測定
表２５に示した実施例１２および比較例１０の殺菌剤を用いて以下の実験を行った。容器内に各殺菌剤５０ｍｌを入れ、次に牛肉（ブロック）１５ｇをこの殺菌剤中に浸し、室温で放置（表面殺菌）した。５分後、殺菌剤を取り除き、牛肉のみを容器内で４℃で保存した。一定時間後（▲１▼１日後、▲２▼３日後、▲３▼６日後）、この牛肉の入った容器に２５ｍｌの生理食塩水を添加し、振盪した。生理食塩水中に溶出した牛肉表面の細菌数を測定した。尚、殺菌処理する前の牛肉表面に存在する細菌数は牛肉１ｇ当たり１０個以下であることを予備実験より確認した。又、滅菌水、次亜塩素酸ナトリウムについても比較検討した。表２７に殺菌剤処理後の牛肉表面に存在する細菌数（牛肉１ｇ当たり）を示す。ユーカリ抽出物とキトサンをともに含む殺菌剤（実施例９）で牛肉を処理した場合、滅菌水、0.01%次亜塩素酸ナトリウムで牛肉を処理した場合に比べ、牛肉表面において細菌の増殖を抑制する効果が認められた。
【０１２０】
【表２７】
【０１２１】
〔実施例１４〕
表２８に示す組成の飼料を調製し、乾熱滅菌した。各成分は重量％である。一方、製造例２のユーカリ抽出物（E. globulus）とキトサン、及び他の成分を表２９に示す割合で混合し、実施例１４及び比較例１１、１２に示す組成の殺菌剤を作製した。尚、ユーカリ抽出物とキトサンは重量％、乳酸、エタノール、滅菌水は容量％である。
【０１２２】
【表２８】
【０１２３】
【表２９】
【０１２４】
【試験例１１】
殺菌剤配合飼料の殺菌力試験
表２９に示す実施例１４および比較例１１、１２の殺菌剤１０ｍｌを表２８に示す飼料１０ｇと混合し、乾燥させた。この飼料１ｇに表１に示す条件で前培養した大腸菌：Escherichia coli IFO12734の菌液を生理食塩水で希釈後、この希釈した菌液50μlをしみ込ませ室温で放置した。一定時間後（３日後、６日後、１５日後）、飼料に生理食塩水を添加、攪拌し、飼料中に存在する細菌を遊離させた。この生理食塩水に存在する生菌数を調べ、飼料１ｇ当たりに存在する生菌数を求めた。表３０に結果を示すが、ユーカリ抽出物とキトサンを配合した飼料（実施例１４）ではコントロール（比較例１１，１２）に比べ細菌の増殖が抑制された。
【０１２５】
【表３０】
【０１２６】
〔実施例１５〕
製造例２のユーカリ抽出物とキトサン、及び他の成分を表３１に示す割合で混合し、実施例１５及び比較例１３の殺菌剤を作製した。尚、ユーカリ抽出物とキトサンは重量％、乳酸は容量％で示す。
【０１２７】
【表３１】
【０１２８】
【試験例１２】
ウエットティッシュの殺菌力持続性試験
表３１に示す殺菌剤１００ｍｌをティッシュペーパー２０ｇに含浸させ、ウエットティッシュを作成した。無菌室内であらかじめ滅菌しておいたステンレス板の一角（1cm×1cm）をこのウエットティッシュで拭き、２４時間放置した。各菌株について菌懸濁液を10μlをステンレス板上にのせた。１０分間放置後、滅菌した綿棒でステンレス板をふき取り、この綿棒を生理食塩水中に移し、撹拌した。この生理食塩水を一定量寒天培地に塗布し、生菌数を測定した。表３２に結果を示すが、実施例１５を含浸させたウエットティッシュでステンレス板を拭いた場合、２４時間経過した時点でもステンレス板上には強い殺菌力が維持されていた。
【０１２９】
【表３２】
【０１３０】
〔実施例１６〕
製造例２のユーカリ抽出物とキトサン、及び他の成分を表３３に示す割合で混合し、実施例１６及び比較例１４の殺菌剤を作製した。尚、ユーカリ抽出物とキトサンは重量％、乳酸は容量％で示す。
【０１３１】
【表３３】
【０１３２】
【試験例１３】
おむつの殺菌力試験
表３３に示す殺菌剤１００ｍｌをおむつ基紙（30×65 cm）１５ｇに含浸させ、乾燥させ、紙おむつを作製した。この紙おむつを正方形（1×1cm）に切り取り、オートクレーブで滅菌した。切り取った紙おむつ0.75gを３００ｍｌ容三角フラスコ（生理食塩水７０ｍｌ）に添加した。次に、各菌株の菌懸濁液５ｍｌをこの三角フラスコに添加し、２５℃で振盪した（回転数320rpm）。１時間後に三角フラスコの生理食塩水１ｍｌを取り出し、希釈後、寒天培地に塗布することにより、生理食塩水中に存在する生菌数を求めた。尚、ブランクとして紙オムツを添加しない場合、コントロールとして殺菌剤を含浸させない場合の滅菌率も求めた。滅菌率は以下の計算式より求めた。表３４に結果を示すが、ユーカリ抽出物とキトサンを含む殺菌剤（実施例１６）を含浸させた紙おむつの各菌に対する滅菌率は99.9％であり、コントロールに比べ強い殺菌効果があることが判明した。
【０１３３】
【表３４】
【０１３４】
〔実施例１７〕
製造例２のユーカリ抽出物、キトサン、グリセリン脂肪酸エステル、及び他の成分を表３５に示す割合で混合し、実施例１７及び比較例１５の殺菌剤を作製した。尚、ユーカリ抽出物とキトサンは重量％、グリセリン脂肪酸エステル、乳酸は容量％で示す。
【０１３５】
【表３５】
【０１３６】
【試験例１４】
殺カビ試験
表３５に示す殺菌剤１ｍｌを入れた滅菌試験管にカビ（Aspergillus niger IFO9455, Penicillium citrinum IFO6352）の胞子懸濁液50μlを添加し、攪拌後、室温で放置した。１時間後、一定量をポテトデキストロース培地に塗布し、カビのコロニー数（生菌数）を調べた。表３６に結果を示すが、ユーカリ抽出物とグリセリン脂肪酸エステルを共に添加した殺菌剤（実施例１７）は、ユーカリ抽出物単独（比較例１５）、グリセリン脂肪酸エステル単独（比較例１６）に比べてカビ（Aspergillus niger, Penicillium citrinum）に対する殺菌効果が強いことが判明した。
【０１３７】
【表３６】
【０１３８】
【試験例１５】
抗カビ試験
表３５に示す実施例１７の殺菌剤１００ｍｌをおむつ基紙（30×65 cm）１５ｇに含浸させ、乾燥させ、紙おむつを作製した。この紙おむつを正方形（1×1cm）に切り取り、オートクレーブで滅菌し後、あらかじめ、カビ（Aspergillus niger, Penicillium citrinum）の胞子懸濁液を塗布したポテトデキストロース寒天培地上に置き、２８℃で７日間静置培養した。尚、コントロールとして殺菌剤を含浸させない紙おむつを用いた。表３７に結果を示すが、実施例１７の殺菌剤では阻止円（ハロー）が形成され、抗カビ力があることが判明した。
【０１３９】
【表３７】
【０１４０】
【試験例１７】
急性毒性試験
製造例２のユーカリ抽出物（E. globulus 及びE. maculata）をエタノール／オリーブオイル（１／１）に溶解し、４５日齢のマウスに経口投与（各試験区１０匹使用）、及び皮下注射した（各試験区１０匹使用）。経口投与では0.5〜14.5g/kgまでの６水準、又、皮下注射では0.3〜6.5g/kgまでの６水準について急性毒性試験を行い、２週間マウスの状態を観察した。いずれの試験区においてもマウスは生存し、皮膚の異常も見られなかった。この毒性試験結果は、厚生省の普通薬としての急性毒性基準であるマウス皮下注射LD50＞0.2g/kgよりも遥かに高い値であり、非常に安全な医薬・医薬部外品であることを示す。
【０１４１】
【発明の効果】
本発明により、低濃度で殺菌力があり、かつ殺菌力に持続性のある殺菌剤が提供される。本殺菌剤は、MRSA、Staphylococcus aureus、 Escherichia coli、Salmonella typhimurium、Salmonella enteritidis、 Enterococcus faecalis(VRE)、Pseudomonas putida、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、 Vibrio parahaemolyticus、Arthrobacter globiformis、Brevibacterium linens、Proteus vulgaris、Propionibacterium acnes, Trichophyton mentagrophytesに対して殺菌効果があり、医療施設、食肉加工施設、畜舎、鶏舎、鳥類卵殻、食肉等の殺菌剤として、又、飼料、ウエットティッシュ、おむつ等に配合し殺菌力を付加する殺菌剤として使用することができ、又、ニキビや水虫を予防する殺菌剤として使用できる。さらに、本殺菌剤を食肉（ハム、ソーセージ等の加工品も含む）の殺菌剤として使用する場合、殺菌力に低下が起こらないため、殺菌工程で繰り返し使用することができる。本発明の殺菌剤に配合される成分は、人体に対して安全性が確かめられている。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ユーカリ属植物葉の極性有機溶媒抽出物とキトサンとを含む天然物由来の殺菌剤に関し、詳しくは、種々の微生物に対して低濃度で殺菌効果があり、かつ殺菌力に持続性のある安全性の高い殺菌剤に関する。本発明の殺菌剤は、医療施設、食肉加工施設、畜舎、鶏舎、食肉、鳥類卵殻、飼料等の殺菌剤として、又、飼料、ウエットティッシュ、おむつ等に配合し、殺菌力を付加する殺菌剤として使用することができる。さらにニキビや水虫を予防する殺菌剤として使用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
ユーカリ属植物は約600種類存在し、その精油やエタノール抽出物等が喘息薬・防腐剤・芳香剤等の用途で医薬品・医薬部外品・食品添加物・香料として用いられている（西村弘行著、未来の生物資源ユーカリ、１９８７年）。ユーカリ精油の主要成分であるシネオールに関しては防腐剤としての効果や、抗菌活性物質（ビスービグアニド化合物）の作用増強が報告されている（特開昭62-289511号）。又、Eucalyptus perriniana（ユーカリプタス・ペリニアナ）の有機溶媒抽出物から単離されたGrandinol（グランジノール）（Agric. Biol. Chem., 54,1,231,1990）やE. macrocarpa（ユーカリプタス・マクロカルパ）から単離されたMacrocarpal-A（マクロカルパル−Ａ）（Agric. Biol. Chem., 54,12,3221）にはStaphylococcus aureus（スタフィロコッカス・オーレウス）、Bacillus subtilis（枯草菌）に対して抗菌活性があることが報告されている。
【０００３】
一方、キトサンはカニの甲羅等に含まれるキチンを脱アセチル化したもので、食品添加物としても用いられている。キトサンについては、Fusarium（フザリウム）属、Escherichia coli（大腸菌）、Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）、Bacillus subtilus（枯草菌）等に対して抗菌活性があることが報告されている（Experimental Mycology 8, 276, 1984, フードケミカル 2, 22, 1988）。
【０００４】
２種類以上の抗菌成分を混合した場合の相乗効果に関する報告例としては、リファンピシンとキトサン（特開昭59-46208）、スルホンアミド類とキトサン(特開昭59-46223）、キトサンとアスコルビン酸（特開平2-35065）、ユーカリ有機溶媒抽出物（種は不明）とアルキル硫酸ナトリウム（特開昭58-39615）があり、ユーカリとキトサンの組み合わせでは報告はされていない。切り花活性剤（特開4-316506）、植物有害生物防除剤（特開平7-033602）でユーカリ抽出物、キトサンの組み合わせ例が報告されているが、抗菌活性の相乗効果に関しては記載されていない。
【０００５】
ニキビは皮脂腺に存在するニキビ菌（Propionibacterium acnes）の増殖が原因となり誘発される。又、水虫は白癬菌（Trichophyton mentagrophytes）の感染により誘発される。従って、Propionibacterium acnesやTrichophyton mentagrophytesを効率的に殺菌することができれば、ニキビや水虫を予防することができる。
【０００６】
近年、医療施設や老人ホームにおいて、MRSA（メチシリン耐性ブドウ球菌）、VRE（バンコマイシン耐性腸球菌）等の病原菌による院内感染が増加していり、これらの病原菌を効率的に殺菌することが緊急の課題となっている。
【０００７】
又、食肉加工場では、病原性大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ菌（Salmonella enteritidis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）等の食中毒菌による食肉加工機械（肉ひき機、サイレントカッター、スライサー、混和機、充填機、食肉脱水機等）や加工施設の汚染が問題となっている。
【０００８】
食肉加工場では食肉の殺菌工程において次亜塩素酸ナトリウムが殺菌剤として使用されている。具体的には、次亜塩素酸ナトリウム溶液に枝肉等の食肉を一定時間浸漬する方法で行われているが、この方法では次亜塩素酸ナトリウムが食肉や食肉から溶出される肉汁の蛋白質と化学反応を起こし、殺菌力が低下、消滅するという問題がある。又、食肉に付着した次亜塩素酸反応物の人体への安全性にも問題がある。従って、食肉の殺菌工程において、殺菌中に殺菌力が低下しない、人体に対して安全性の高い殺菌剤が望まれている。
又、上記問題を解決するような殺菌剤が、殺菌処理した畜肉に長時間殺菌力を維持させることができれば、畜肉を長時間新鮮に保つことができ、輸送中における商品の劣化を軽減・防止することも可能となる。
【０００９】
家畜自体への病原菌汚染を軽減することも食肉加工場での汚染防止につながる。その一手段として畜舎の殺菌がある。特に問題となっている病原性大腸菌（Escherichia coli）は牛、羊、豚等の家畜に生息しており、特に牛の汚染率が高い。又、サルモネラ菌（Salmonella enteritidis）も鶏や鶏卵を介して伝染し、問題となっている。例えば、畜舎が病原菌に汚染されていると、畜舎内で家畜や家畜に接触した人の手等を介して汚染が拡大する可能性がある。従って、畜舎を殺菌することも病原菌を効率良く排除するために重要である。
【００１０】
牛、豚、鶏等の家畜飼育場では、飼料が細菌に汚染されたり、飼料中で細菌が繁殖する等の問題が起こっている。飼料が病原菌に汚染されると、動物に害を及ぼすだけでなく、動物の糞が汚染源となり、さらに汚染を拡大する。従来、動物の生育を促進するために、抗生物質を添加した飼料が考案されているが、耐性菌の出現や抗生物質の残留等の問題があり、現在、抗生物質の使用が制限されている。又、魚類においても、病原菌感染予防・治療のために抗生物質が使用されており、問題となっている。
【００１１】
近年、鶏卵や卵加工品では、特にサルモネラ菌による食中毒が年々増加傾向にあり、卵の殻を殺菌することは汚染を軽減・防止することが可能である。
【００１２】
尿素分解菌（Proteus vulgaris）はおむつかぶれに関与することが報告されていおり、殺菌剤をおむつに配合することにより、おむつかぶれの発生を軽減、防止することができると考えられる。
【００１３】
上記の様々な病原菌に対する殺菌剤として、アルコール、合成殺菌剤、次亜塩素酸ナトリウム等の塩素系薬剤が使用されている。しかし、アルコールでは殺菌力の持続性、合成殺菌剤や塩素系薬剤では人体に対する安全性に問題がある。従って、上記病原菌に対する殺菌剤は直接、人体・動物の皮膚に触れたり、経口接種される可能性もあるので、安全性の高い殺菌剤が求められている。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
安全性が高く、低濃度で上記病原菌に対して殺菌力があり、かつ、殺菌力に持続性があり、又、食肉の殺菌工程において殺菌中に殺菌力に低下のない、殺菌工程で繰り返し使用可能な殺菌剤を提供することを課題とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、ユーカリ属極性有機溶媒抽出物とキトサンとを含む殺菌剤が、ユーカリ抽出物とキトサンの相乗効果により、低濃度で殺菌力を発揮し、かつ、殺菌力に持続性があり、又、食肉（ハム、ソーセージ等の加工品も含む）の殺菌剤として使用した場合、殺菌力に低下が起こらないことを見いだした。さらに、上記組成の殺菌剤にグリセリン脂肪酸エステルを添加した場合、殺菌力の持続性が向上し、又、ユーカリ抽出物の作用により、グリセリン脂肪酸エステルの抗カビ力が増強されることを見いだした。本殺菌剤は、医療施設、食肉加工施設、畜舎、鶏舎、鳥類卵殻、食肉等の殺菌に使用することができ、又、飼料、ウエットティッシュ、おむつ等に配合することにより殺菌力を付加することができることを見いだし本発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明は、ユーカリ属植物葉の極性溶媒抽出物とキトサンとを含む殺菌剤である。前記ユーカリ属植物葉の極性有機溶媒抽出物としては、非極性有機溶媒による脱脂または水蒸気蒸留により精油を除去したユーカリ属植物葉を極性有機溶媒で抽出した画分が挙げられる。
【００１７】
前記極性有機溶媒としてはハロゲン化炭化水素、エーテル、低級脂肪酸エステル、ケトン、低級アルコールから選ばれる溶媒またはこれらの任意の混合溶媒が、前記非極性有機溶媒としてはアルカンが挙げられる。
【００１８】
また、前記ユーカリ属植物葉の極性溶媒抽出物としては、下記式（Ｉ）で表されるジヒドロカルコン化合物を主要な殺菌成分として含む抽出物が挙げられる。
【００１９】
【化２】
本発明はまた、好ましい態様として、ニキビ菌、白癬菌、アスペルギルス又はペニシリウム属に属する微生物に対して使用される殺菌剤、鳥類卵殻、医療施設、食肉又は食肉加工施設の殺菌に用いられる殺菌剤、及び飼料、ウエットティッシュ、又はおむつに配合する殺菌剤として使用される殺菌剤を提供する。
本発明の殺菌剤は、すでに安全性が知られている天然物を有効成分とするため、人体に対して安全性が高い。
【００２１】
尚、本発明において「殺菌」とは、細菌等の微生物を死滅させること、及び増殖を阻害することの両方を含む概念である。本明細書において、用途に応じて慣用されている「殺菌」及び「抗菌」の用語を用いるが、いずれも前記の概念から外れるものではない。また、「食肉加工施設」とは、食肉加工場、食肉加工場に付設された設備または機械、及び食肉加工に用いる刃物等の調理器具またはテーブル等を含む。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
＜１＞ユーカリ属植物の極性有機溶媒抽出物
本発明の殺菌剤に用いるユーカリ属植物の極性有機溶媒抽出物（以下、「ユーカリ抽出物」ともいう）は、ユーカリ属植物の葉を極性有機溶媒で抽出して得られる抽出物である。
【００２４】
原料となる葉は、ユーカリ属に属する植物の葉であれば使用可能で、ユーカリプタス・グランディス（Eucalyptus grandis）、ユーカリプタス・ボツリオイデス（Eucalyptus botryoides）、ユーカリプタス・グロブルス（Eucalyptus globulus）、ユーカリプタス・カマルジュレンシス（Eucalyptus camaldulensis）、ユーカリプタス・クレブラ（Eucalyptus crebra）、ユーカリプタス・マクラタ（Eucalyptus maculata）、ユーカリプタス・ビミナリス（Eucalyptus viminalis）等の植物の葉を用いることができる。これらのユーカリ葉は、単独の植物由来の葉を用いてもよく、２種以上の植物由来の葉を組み合わせて用いることもできる。
【００２５】
上記のようなユーカリ属植物葉を、極性有機溶媒で抽出する。抽出に先立って、葉を適当な大きさに破砕したり、粉末化するなど、溶媒抽出し易いように前処理する。極性有機溶媒としては、クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、メチルエーテル、エチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル等の低級脂肪酸エステル類、又はアセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、メタノール、エタノール、プロパノール等の低級アルコール類、プロピレングリコール、ブチレングリコール等のグリコール類が挙げられる。これらの溶媒は、単独で用いてもよく、任意の２種又は３種以上の混合溶媒として用いてもよい。上記溶媒の中では、得られる抽出物の殺菌活性の点から酢酸エチル、アセトン、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコールが好ましく、エタノール、プロピレングリコールがさらに好ましい。
【００２６】
抽出方法としては、一般に用いられる方法でよく、例えば極性有機溶媒中に原料ユーカリ葉を長時間浸漬する方法、極性有機溶媒の沸点以下の温度で加温、撹拌しながら抽出を行い、濾過して抽出物を得る方法などがある。得られた抽出物は、減圧濃縮等によって濃縮することが好ましい。
【００２７】
また、上記抽出・分離操作中、殺菌活性の高いユーカリ抽出物を得るには、ユーカリ葉を直接極性有機溶媒で抽出するよりも、ユーカリ葉を乾燥後、非極性有機溶媒で脱脂し、精油を除去してから極性有機溶媒で抽出する態様が好ましい。非極性溶媒で脱脂する過程では精油が除去される。この操作は水蒸気蒸留により精油を除去した後の残渣に極性溶媒を添加し抽出する方法でも行うことができる。前記非極性溶媒としては、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン等のアルカンが挙げられる。
しかし、脱脂操作は本発明に必須ではなく、直接、ユーカリ属植物葉を極性有機溶媒で抽出して得られる画分も、本発明の殺菌剤に使用することができる。その場合の極性有機溶媒としては、低級アルコール、またはプロピレングリコール、ブチレングリコール等のグリコール類が挙げられる。
【００２８】
ユーカリ葉抽出物の殺菌活性と収率を合わせて総合評価すると、殺菌活性が強く、抽出物の収率が高い方法は、脱脂時に用いる非極性溶媒としてヘキサンを、抽出溶媒としてエタノールを組み合わせる態様が好ましい。
【００２９】
後記製造例に示すように、ユーカリプタス・マクラタの葉抽出物には、殺菌力を有する化合物として、前記式（Ｉ）で表される新規なジヒドロカルコン化合物及び公知のフラボン化合物（ユーカリプチン(eucalyptin)及び８−デスメチル−ユーカリプチン(8-desmethyl-eucalyptin)（Aust. J. Chem. 17, 692, 1964; Aust. J. Chem. 17, 464, 1964））が含まれている。ユーカリ葉に含まれる殺菌作用を示す化合物には、これらの化合物以外の化合物も含まれていると考えられるが、本発明に用いるユーカリ抽出物を調製する際に、これらの化合物またはその類縁体を指標とすることができると推定される。また、本発明に用いるユーカリ抽出物の具体的態様として、前記ジヒドロカルコン化合物もしくはフラボン化合物またはこれらの類縁体の少なくとも１種または２種以上を主要な殺菌成分として含む抽出物、あるいは精製したこれらの化合物またはその類縁体が挙げられる。
【００３０】
＜２＞キトサン
キトサン（ポリβ−１，４−グルコサミン）は、キチンの脱アセチル化物であり、例えばカニ、エビ等の甲殻類の殻、あるいは昆虫の外骨格に含まれているキチンを、高濃度熱アルカリ溶液中で脱アセチル化することにより得られる。また、キトサン生産菌を培養することによっても得ることができる。また、市販品を用いることもできる。
【００３１】
本発明に用いるキトサンの分子量は特に制限されないが、低粘度であることが好ましく、５〜５０ｃｐ程度（0.5%キトサン濃度）が好ましい。また、水溶性を高めたキトサンオリゴ糖やキトサン乳酸塩、キトサン塩酸塩等のキトサン誘導体を用いることもできるが、殺菌力の強い殺菌剤を調製するためには、キトサンを用いることが好ましい。
【００３２】
＜３＞本発明の殺菌剤
本発明の殺菌剤は、上記ユーカリ抽出物及びキトサンとを含む。殺菌剤の剤型は特に制限されず、例えば、液状、ペースト状、スプレー剤、ムース剤等、適用方法に応じて多岐にわたって選択され、噴霧、浸漬、塗布、拭き取り等の方式によって行われる。液状とする場合は、ユーカリ抽出物とキトサンを適当な溶媒に溶解させ、殺菌液として用いることができる。溶媒としては、エタノールと水の混合液（比率は任意）に、例えば、キトサンを溶解させる為の乳酸、酢酸等の酸を添加した溶媒が用いられる。但し、高濃度のエタノールはタンパク質を変性させるので、食肉等の殺菌剤として使用する場合は、エタノール濃度を0〜10%程度の範囲にするのが望ましい。尚、水溶性を高めたキトサンオリゴ糖や水溶性を高めたキトサン誘導体を用いる場合は、前記の酸は添加しなくてまもよい。
【００３３】
本発明の殺菌剤中におけるユーカリ抽出物及びキトサンの含有量は、その使用態様・剤形により適宜変更しうるが、例えば、これらを合計で０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．００１〜１．０重量％程度含有させることが例示される。尚、不揮発性のプロピレングリコール、ブチレングリコール等のグリコール類をユーカリ属葉の抽出溶媒として用いる場合は、ユーカリ抽出液として０．１〜１０容量％程度含有させることが例示される。この範囲の上限を越えると、殺菌剤の芳香に影響することがあり、下限を下回ると効果が得にくくなることがあるので、上記範囲が好ましい。ユーカリ抽出物とキトサンは、上記濃度の範囲内において任意の比率で混合することができる。キトサンを溶解させる為の酸（乳酸、酢酸等）は、キトサンを溶解し得る範囲で任意の濃度で配合することができる。
【００３４】
又、ユーカリ抽出物とキトサンを含む組成の殺菌剤にグリセリン脂肪酸エステルを添加する場合、上記ユーカリ抽出物及びキトサンを含む組成に０．０００１〜２０重量％、好ましくは、０．００１〜１．０重量％のグリセリン脂肪酸エステル類を添加することが例示される。
【００３５】
本殺菌剤を食肉の殺菌剤として使用する場合は、殺菌中に牛肉から溶出される成分の影響で殺菌剤のｐＨが上昇し、ｐＨ５．５を超えると殺菌力が低下するため、殺菌剤のｐＨを５．５以下、好ましくは５．０以下に維持するように乳酸、酢酸等の酸、あるいはｐＨ調製剤を添加することが例示される。添加の方法はあらかじめ殺菌剤中に高濃度の酸、あるいはｐＨ調製剤を添加しておいても良いし、殺菌中に連続的に酸を添加し、ｐＨを５．５以下に維持させてもよい。
【００３６】
上記殺菌剤には、本発明の効果を損なわない範囲で、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等に一般的に用いられる各種成分、酸度調節剤、安定化剤、界面活性剤、抗酸化剤等に用いられている成分を配合することができ、２成分以上配合しても良い。更に、殺菌効果をさらに増強する目的で他の殺菌剤と併用してもよい。
【００３７】
食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等に一般的に用いられる各種成分としては、例えば、界面活性剤（アニオン性、カチオン性、両性又は非イオン性界面活性剤）、抗酸化剤（ステアリン酸エステル、ノルジヒドログアセレテン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、パラヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、セサモール、セサモリン、ゴシポール等）、保湿剤（プロピレングリコール、1、3-ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、コンドロイチン硫酸及びその塩、ヒアルロン酸及びその塩、乳酸ナトリウム、ローヤルゼリーエキス、等）又、その他、コラーゲン、低級アルコール、多価アルコール、水溶性高分子、ｐＨ調節剤、香料、清涼剤、安定化剤、動植物抽出物、動植物性蛋白質及びその分解物、動植物性多糖類及びその分解物、動植物性糖蛋白質及びその分解物、微生物培養代謝成分、アミノ酸及びその塩、消臭・脱臭剤、乳化剤等と共に配合し、併用して用いることができる。
【００３８】
酸度調節剤としては、例えば、アジピン酸、クエン酸、クエン酸三ナトリウム、グリシン、グリセリン脂肪酸エステル、グルコノデルタラクトン、グルコン酸、コハク酸、コハク酸一ナトリウム、コハク酸二ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、DL-酒石酸、L-酒石酸、DL-酒石酸ナトリウム、L-酒石酸ナトリウム、炭酸塩類、二酸化炭素、乳酸、乳酸ナトリウム、フマル酸、フマル酸一ナトリウム、リゾチーム、DL-リンゴ酸、DL-リンゴ酸ナトリウム、リン酸、リン酸塩類、重合リン酸塩類、イタコン酸、フィチン酸等が挙げられる。
【００３９】
界面活性剤としては例えば、モノステアリン酸グリセロール、トリオレイン酸ポリグリセロール等のグリセリン脂肪酸エステル、有機酸モノグリセリド、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、レシチン、リゾレシチン、ポリエチレングリコール、ポリオキシアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリアミン、アルキルポリオキシエチレン硫酸エステル塩、アルキル硫酸エステル塩、アシルメチルタウリン塩、N-アシルグルタミン酸塩、アルキルアミドベタイン等が挙げられる。
【００４０】
抗酸化剤としてはカテキン、トコフェロール、プロポリス、エラグ酸、動植物抽出物（セージ、セリ、ローズマリー等）が挙げられる。
【００４１】
殺菌剤としては、殺菌活性がある物質、抽出物であれば特に制限はなく、例えば、ヒノキチオール、トリクロサン、塩化セチルピリジニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、動植物抽出物、精油等が挙げられる。
【００４２】
ユーカリ属植物抽出物とキトサンを含有する殺菌剤は、ユーカリ抽出物とキトサンの相乗効果により、MRSA、Staphylococcus aureus、Escherichia coli、Salmonella typhimurium（サルモネラ・チフィムリウム）、Salmonella enteritidis、 Enterococcus faecalis（VRE：バンコマイシン耐性腸球菌）、Pseudomonas putida（緑膿菌）、Bacillus subtilis、Bacillus cereus（バチルス・セレウス）、Vibrio parahaemolyticus（ビブリオ・パラヘモリティカス）、Arthrobacter globiformis（アースロバクター・グロビフォルミス）、Brevibacterium linens（ブレビバクテリウム・リネンス）、Proteus vulgaris、Propionibacterium acnes, Trichophyton mentagrophytesに対して強い殺菌力を発揮し、また、この殺菌力に持続性がある。又、ユーカリ抽出物及びキトサン共に安全性が高く、他の成分として安全性の高いものを選択することにより、安全性の高い殺菌剤を調製することができる。
【００４３】
前記ユーカリ抽出物とキトサンを含む組成にグリセリン脂肪酸エステルを添加した殺菌剤は、ユーカリ抽出物とグリセリン脂肪酸エステルとの相乗効果によりAspergillus niger（アスペルギルス・ニガー）、Penicillium citrinum（ペニシリウム・シトリナム）等のカビに対しても効果を発揮する。又、本殺菌剤をエタノールと水の混合液系として調製した場合も、エタノールの瞬間的な殺菌作用も加わるため、上記カビに対しても効果を発揮する。
【００４４】
従って、本殺菌剤は、例えば、一般家庭や飲食店等において、テーブル、食器類、まな板、調理台、トイレの便座等の家庭用品、畜舎、鶏舎、動物飼育用建物・器具類、食肉加工施設・機械類、飲食店や一般家庭の厨房、人や動物等の皮膚、鶏卵やウズラ等の卵殻、又、病院や老人ホームにおいてドア、ドアの取っ手、床、ベッドの手すり、手術用器具等の医療機器、医療設備、肉、魚、野菜等の食品、植物の種子の殺菌剤として、又、ウェットティシュ、おむつ、シーツ類、衣類、衛生綿類、おしり拭き、不織布、油取り紙、食品包装用の紙類（シート）、食品の下に敷く紙類（シート）、下紙スリッパ、おしぼり、タオル、カバー、動物・魚類等の飼料、ガム、キャンディー、かまぼこ、ちくわ等の水産ねり製品、ソーセージ、ハム等の畜産製品、洋菓子類、和菓子類、生めん、ソバ等のめん類、ソース、醤油等の調味料、漬物、惣菜等、卵加工品、サンドイッチ、マヨネーズ、シュークリーム等に殺菌力を付加する殺菌剤として使用することができる。又、本殺菌剤は石鹸、洗浄剤、クリーム等に配合したり、経口薬剤等に添加することもできる。
【００４５】
本殺菌剤を食肉の殺菌工程で使用する場合、殺菌力に低下が起こらないので、殺菌工程において繰り返して使用することができる。又、本殺菌剤は、食肉を殺菌処理した場合、食肉表面の細菌の増殖を長時間にわたり抑制する効果があるので、食肉を長時間新鮮に保つことができる。
【００４６】
本殺菌剤を鳥類卵殻の殺菌剤として使用する場合、本発明の殺菌剤を卵殻表面に付着させた鳥類の卵は、そのまま流通させることができる。
【００４７】
本発明の殺菌剤をスプレーとして使用する場合、内容物を収納する容器としては、内容物を噴霧できる容器であれば良く、例えば、エアゾール方式、トリガー方式等のスプレー容器が挙げげられる。エアゾール方式では、例えば、炭酸ガス、窒素ガス、ジメチルエーテル等の噴霧剤を添加して用いる。
【００４８】
【実施例】
以下、実施例、試験例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は例示的であり、本発明の範囲は特許請求の範囲により規定される。
【００４９】
【製造例１】
ユーカリ（Eucalyptus grandis、 Eucalyptus botryoides, Eucalyptus globulus, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus crebra, Eucalyptus maculata, Eucalyptus viminalis)の葉を乾燥し（それぞれ乾燥重量３０ｇ）、それぞれアセトン５００mlで３日間室温で抽出した。抽出液は減圧下溶媒を留去し、アセトン抽出物を得た。
【００５０】
【製造例２】
ユーカリ（Eucalyptus grandis, Eucalyptus botryoides, Eucalyptus globulus, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus crebra, Eucalyptus maculata, Eucalyptus viminalis)の葉を乾燥し（それぞれ乾燥重量３０ｇ）、それぞれエタノール５００mlで３日間室温で抽出した。抽出液は減圧下溶媒を留去し、エタノール抽出物を得た。
【００５１】
【製造例３】
ユーカリ（Eucalyptus grandis, Eucalyptus botryoides, Eucalyptus globulus, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus crebra, Eucalyptus maculata, Eucalyptus viminalis)の葉を乾燥し（それぞれ乾燥重量３０ｇ）、それぞれｎ−ヘキサン５００mlで２日間室温で脱脂後、エタノール５００mlで３日間室温で抽出した。抽出液は減圧下溶媒を留去し、エタノール抽出物を得た。
【００５２】
【製造例４】
ユーカリ（E. maculata)の葉を乾燥し（乾燥重量５００ｇ）、ｎ−ヘキサン６Ｌで２日間室温で脱脂後、アセトン６Ｌで３日間室温で抽出した。抽出液は減圧下溶媒を留去し、アセトン抽出物約６５ｇ（葉からの収率13%）を得た。
【００５３】
【製造例５】
ユーカリ（Eucalyptus grandis, Eucalyptus botryoides, Eucalyptus globulus, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus crebra, Eucalyptus maculata, Eucalyptus viminalis）の葉を乾燥し（それぞれ乾燥重量３０ｇ）、それぞれプロピレングリコール５００ｍｌで３日間室温で抽出した。
【００５４】
【製造例６】
ユーカリ（Eucalyptus grandis, Eucalyptus botryoides, Eucalyptus globulus, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus crebra, Eucalyptus maculata, Eucalyptus viminalis）の葉を乾燥し（それぞれ乾燥重量３０ｇ）、それぞれ１，３−ブチレングリコール５００ｍｌで３日間室温で抽出した。
【００５５】
次に、アセトン抽出物を最初にヘキサンと水で分配抽出し、ヘキサン層を分離後、残った水層をジクロロメタンで分配抽出し、さらに酢酸エチル、ｎ−ブタノールの順に分配抽出した。活性の高い画分として酢酸エチル画分を濃縮し、酢酸エチル抽出物を約２３ｇ得た（葉からの収率4.6%）。
【００５６】
次に、酢酸エチル画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ヘキサン−酢酸エチル混液で溶出した。ヘキサン／酢酸エチル＝３／１混液で溶出した画分を濃縮し３．９２ｇの活性画分を得た（葉からの収率0.78%)。この画分をさらにＯＤＳ−ＨＰＬＣに付し、メタノール−蒸留水＝80／20混液で分取し、化合物（Ｉ）を１．３３ｇ（葉中含有率0.27%)、化合物（II）を１５６mg（葉中含有率0.031%）、化合物（III)を１２５mg（葉中含有率0.025%）得た。
【００５７】
化合物（II）及び（III)は理化学データよりそれぞれ既知フラボン化合物 eucalyptin 及び 8-desmethyl-eucalyptin（Aust. J. Chem. 17, 692, 1964; Aust. J. Chem. 17, 464, 1964）であることが判明した。
【００５８】
化合物（Ｉ）は次の理化学的性質より新規ジヒドロカルコン化合物であることが判明した。
【００５９】
分子量： EI-MS m/z 286(M+), 181, 154、分子式：Ｃ17Ｈ18Ｏ4
【００６０】
ＵＶ（λmax MeOH）：286nm(ε=21700)
【００６１】
ＩＲ（νmax KBr)：3296, 2944, 2924, 1650, 1595, 1516, 1429, 1274, 1247, 1213, 1147, 1112, 1082, 886, 799, 742, 720, 699, 468cm-1
【００６２】
1H-ＮＭＲ（δDMSO-d6)：1.86(3H, s), 2.89(1H, t, J=7.6), 3.32(1H, t, J=7.6), 3.77(3H, s), 6.08(1H,s), 7.15-7.30(5H, m), 10.92(1H, s), 13.64(1H, s) ppm
【００６３】
13C-ＮＭＲ（δDMSO-d6) ：7.2, 30.1, 45.3, 55.4, 90.3, 102.3, 104.1, 125.8, 128.3, 141.6, 160.5, 162.0, 163.2, 204.7 ppm
【００６４】
〔ユーカリ抽出物とキトサンの抗菌活性〕
＜１＞製造例３のユーカリ抽出物及びキトサンについて、抗菌活性を調べた。使用した菌株は以下のとおりである。
【００６５】
MRSA RIM 0310925、Staphylococcus aureus IFO12732、Escherichia coli IFO12734、Salmonella typhimurium IFO12529、Salmonella enteritidis IFO3313、Enterococcus faecalis IFO12970、Pseudomonas putida IFO3738、Bacillus subtilis JCM1465、Bacillus cereus IFO3001、Vibrio parahaemolyticus IFO12711、Arthrobacter globiformis IFO12137、Brevibacterium linens IFO12142、Proteus vulgaris IFO30456、Propionibacterium acnes ATCC6919、Trichophyton mentagrophytes IFO05466。
【００６６】
表１に示す培養条件で各菌株を前培養後、生理食塩水で希釈し、細菌については、菌数を約5×108個/mlに調製した。又、真菌（Trichophyton mentagrophytes）については、胞子数を5×106個/mlに調製した。尚、Propionibacterium acnesについては嫌気性条件下で培養した。
【００６７】
【表１】
製造例３のユーカリ抽出物をDMSOに溶解し、この溶液を抽出物の最終濃度が63〜0.2μg/mlになるように10μlを、培地190μlを入れた９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。一方、キトサン（和光純役：キトサン10）については滅菌蒸留水（0.005%乳酸添加 pH5.3）に溶解し、この溶液をキトサンの最終濃度が63〜0.2μg/mlになるように10μlを培地190μlを入れた９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。最後に各ウェルに上記菌懸濁液を10μl加え、表１に示す各菌の培養に適した条件で培養し、細菌については、２４時間後、真菌（Trichophyton mentagrophytes）については７日後に発育の有無を肉眼で観察し、最小発育阻止濃度（MIC）を調べた。
【００６９】
表２に各ユーカリ抽出物およびキトサンのMIC値の結果を示す。ユーカリ抽出物は、MRSA、Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis、Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Arthrobacter globiformis、Propionibacterium acnes、Trichophyton mentagrophytesに対する抗菌活性が特に強く、キトサンと比べて、明らかに抗菌スペクトルが異なることが判明した。
【００７０】
【表２】
又、精油の抗菌活性を調べるために水蒸気蒸留により精油をユーカリ属植物葉から回収し、上記と同様の方法で各種細菌に対して最小発育阻止濃度を調べた。尚、精油を溶解させる溶媒としてエタノールを用いた。
【００７２】
ユーカリ属より得た精油のMIC値を表３に示すが精油画分については強い抗菌活性は認められなかった。
【００７３】
【表３】
＜２＞製造例５のユーカリ抽出物について、以下の方法で抗菌活性を調べた。
【００７５】
製造例５のユーカリ抽出物を滅菌蒸留水で１０倍希釈し、この希釈液10μlを、表１に示す培地190μlを入れた９６ウェルプレートの各ウェルに添加した（抽出物は原液の200倍希釈）し、上記と同様の方法で抗菌活性を調べた。
【００７６】
表４に結果を示すが、本抽出物（200倍希釈液）には、MRSA、Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Arthrobacter globiformis、Propionibacterium acnes、Trichophyton mentagrophytesに対して抗菌活性が認められた。
【００７７】
【表４】
＜ユーカリ抽出物、キトサンを併用した場合の殺菌力試験＞
製造例２のユーカリ抽出物をDMSOに溶解し2倍希釈系列を作成した。一方、キトサンを滅菌蒸留水（乳酸添加）に溶解した。各々を50μlを滅菌蒸留水900μlと混合した（ユーカリ抽出物の最終濃度：0〜2500μg/ml、キトサンの最終濃度：0〜125μg/ml、乳酸濃度：キトサン１ｇに対して乳酸0.6mlの割合で添加）。
【００７９】
表１に示す条件で細菌（Staphylococcus aureus IFO12732、Bacillus subtilis JCM1465、Escherichia coli IFO12734）を培養後、10μlを上記混合液に添加し、S. aureus、B. subtilisについては1時間、E. coliについては4時間、室温で放置した。放置後、1mlを15mlニュートリエント寒天培地に添加し、24時間各菌の培養に適した条件で培養し、菌の発育の有無を観察した（菌が発育：＋、菌が発育せず：−）。表５にS. aureusの結果を示すが、ユーカリ抽出物1.0μg/ml、キトサン3.1μg/ml併用した場合、最小殺菌濃度（MBC）の値よりFIC Indexは0.19となり、相乗効果が認められた（FIC Indexが0.5以下で相乗効果あり）。表６にB. subtilisの結果を示すが、ユーカリ抽出物0.5μg/ml、キトサン3.1μg/ml併用した場合、FIC Indexは0.312となり、相乗効果が認められた。又、表７にE. coliの結果を示すが、ユーカリ抽出物78μg/ml、キトサン7.8μg/ml併用した場合FIC Indexは0.187となり、相乗効果が認められた（FIC Index＝（A成分とB成分を併用したときのA成分のMBC／単独使用のときのA成分のMBC）＋（A成分とB成分を併用したときのB成分のMBC／単独使用のときのB成分のMBC）：第25回日本防菌防黴学会年次大会p.35参照）。
【００８０】
【表５】
【表６】
【表７】
＜殺菌剤の殺菌力の持続性試験＞
〔実施例１〜３〕
製造例３のユーカリ抽出物とキトサン、及び他の成分を、表８に示す割合で混合し、実施例１〜３及び比較例１〜４の殺菌剤を作成した。ユーカリ抽出物とキトサンは重量％、乳酸とエタノールは容量％で示す。
【００８４】
【表８】
【試験例１】
紙面上での殺菌力の持続性試験
乾熱滅菌したペーパーディスク（直径8mm）に表８に示す各種殺菌剤を25μlしみ込ませ、7日間放置した。表１に示す条件で前培養した菌懸濁液を生理食塩水で希釈後、このペーパーディスク上に10μlしみ込ませた。１分間放置後、直ちに生理食塩水（１ｍｌ）の入った試験管に移し、ボルテックスで１分間撹拌し、ペーパーディスク中の菌を溶出させた。この生理食塩水を希釈し、一定量を寒天培地上に塗布することにより生菌数をカウントした。尚、対照として水を、又、既存の殺菌剤のコントロールとして70%エタノールを用いた。各実施例の結果を表９に、比較例の結果を表１０に示す。殺菌剤塗布後、7日間経過した時点でも、ユーカリ抽出物とキトサンをともに含む各実施例の殺菌剤には強い殺菌力が維持されており、ユーカリ抽出物単独（比較例１〜３）あるいはキトサン単独（比較例４）で含む殺菌剤と比較して殺菌力が強かった。
【００８６】
【表９】
【表１０】
【試験例２】
抗白癬菌活性測定
乾熱滅菌したペーパーディスク（直径8mm）に表８に示す殺菌剤を25μlしみ込ませ24時間放置し、ペーパーディスクを乾燥させた。あらかじめ調製した白癬菌（Trichophyton mentagrophytes）の胞子懸濁液を塗布した寒天培地上にこのペーパーディスクを置き、28℃で５日間培養し、ペーパーディスクの周りに阻止円ができるかどうかを観察した。尚、コントロールに既知の殺菌剤として７０％エタノールを用いた。表１１に示すようにユーカリ抽出物とキトサンをともに含む各実施例の殺菌剤の方がユーカリ抽出物単独で含む殺菌剤に比べ径の大きい阻止円が形成された。一方、キトサン単独で含む殺菌剤（比較例４）では阻止円は形成されなかった。すなわち、ユーカリ抽出物に白癬菌に対する抗菌力に持続性があり、キトサンにより抗菌力が増強された。
【００８９】
【表１１】
【試験例３】
ステンレス上での殺菌力の持続性試験
滅菌したステンレス板上に表８に示す各殺菌剤を噴霧し（15μl/cm2）、無菌室内で７日間放置し乾燥させた。前記と同様にして前培養した各細菌の懸濁液を生理食塩水で希釈後、このステンレス板上に10μlのせた。10分間放置後、脱脂綿でステンレス板上の菌を拭き取り、菌を生理食塩水中に溶出させ、生菌数を測定した。各実施例の結果を表１２、比較例の結果を表１３に示す。尚、既存の殺菌剤として７０％エタノールについても比較検討した。ユーカリ抽出物とキトサンをともに含む各実施例の殺菌剤を塗布したステンレス板上には、７日間経過した時点でも、強い殺菌力が維持されていた。又、この殺菌力はユーカリ抽出物単独（比較例１〜３）あるいはキトサン単独（比較例４）で含む殺菌剤の殺菌力と比較して強かった。
【００９１】
【表１２】
【表１３】
【試験例４】
卵殻上での殺菌力の持続性試験
滅菌した鶏卵殻表面に表８に示す組成の殺菌剤を噴霧し（15μl/cm2）、無菌室内で７日間放置し乾燥させた。前培養した菌懸濁液を生理食塩水で希釈後、この希釈した菌懸濁液10μlをこの鶏卵殻表面にのせた。10分間放置後、脱脂綿で鶏卵殻表面の菌を拭き取り、菌を生理食塩水中に溶出させ、生菌数を測定した。尚、ブランクとして水を、コントロールに既知の殺菌剤として７０％エタノールを用いた。実施例の結果を表１４、比較例の結果を表１５に示す。キトサン単独（比較例４）、ユーカリ抽出物単独（比較例１〜３）に比べ、ユーカリ抽出物とキトサンをともに含む殺菌剤（実施例１〜３）では殺菌率が高かった。すなわち、７日経過した時点でも卵殻表面に殺菌力が維持されていた。
【００９４】
【表１４】
【表１５】
〔実施例４〕
製造例２のユーカリ抽出物、キトサン、グリセリン脂肪酸エステル、及び他の成分を、表１６に示す割合で混合し、実施例４及び比較例５の殺菌剤を作成した。ユーカリ抽出物とキトサンは重量％、乳酸とエタノールは容量％で示す。
【００９７】
【表１６】
【試験例５】
ステンレス上での殺菌力の持続性試験（グリセリン脂肪酸エステルの影響）
表１６に示す殺菌剤について、試験例３と同様の方法でステンレス上での殺菌力の持続性を調べた（１ケ月間放置）。結果を表１７に示すが、殺菌剤噴霧後（15μl/cm2）、１ケ月経過した時点で比較した場合、ユーカリ抽出物とキトサンにグリセリン脂肪酸エステルを添加した組成（実施例４）では添加しない組成（比較例５）に比べ強い殺菌力が維持されていた。
【００９９】
【表１７】
〔実施例５〜７〕
製造例５のユーカリ抽出物とキトサン、及び他の成分を、表１８に示す割合で混合し、実施例５〜７の殺菌剤を作成した。キトサンは重量％、ユーカリ抽出物、乳酸は容量％で示す。
【０１０１】
【表１８】
【試験例６】
紙面上での殺菌力の持続性試験
表１８に示す殺菌剤について、試験例１と同様の方法で殺菌力の持続性を調べた（７日間放置）。その結果を表１９に示す。殺菌剤塗布後、７日間経過した時点でも、ユーカリ抽出物とキトサンをともに含む各実施例の殺菌剤には強い殺菌力が維持されていた。
【０１０３】
【表１９】
〔実施例８、９〕
製造例３のユーカリ抽出物（E. globulus, E. maculata）とキトサン、及び他の成分を表２０に示す割合で混合し、実施例８、９及び比較例６〜９の殺菌剤を作製した。尚、ユーカリ、キトサンは重量％、乳酸は容量％である。
【０１０５】
【表２０】
【試験例７】
肉エキスと混合した場合の殺菌剤の殺菌力試験
表２０の殺菌剤について、以下の方法で牛肉エキス（和光純薬）と混合した場合、殺菌力の低下が起こるかどうかを調べた。又、次亜塩素酸ナトリウムについても比較検討した。使用した菌株は以下のとおりである。 Staphylococcus aureus IFO12732、Salmonella enteritidis IFO03313。
【０１０７】
表２０に示した各種殺菌剤１ｍｌと５％牛肉エキス（滅菌蒸留水に溶解）１ｍｌを1対１の割合で混合し、室温で放置した。10分後、これらの各種殺菌剤及び混合液にあらかじめ調製しておいた菌液10μlを添加し、攪拌後放置し、混合液中の細菌数の変化（細菌を添加してから1分後、5分後、10分後）を調べた。尚、予備実験より５％牛肉エキス１ｍｌ当たりの一般生菌数は１０以下であることを確認した。表２１、表２２に示すように0.02%次亜塩素酸ナトリウムは牛肉エキスと混合することにより、殺菌力が低下することが判明した。一方、ユーカリ抽出物とキトサンをともに含む殺菌剤（実施例８、９）では牛肉エキスと混合しても殺菌力の低下がみられなかった。又、ユーカリ抽出物とキトサンをともに含む殺菌剤（実施例８、９）ではユーカリ抽出物単独（比較例６、７）、キトサン単独（比較例８）で含む殺菌剤と比較して殺菌力が強化されていることが判明した。
【０１０８】
【表２１】
【表２２】
〔実施例１０、１１〕
製造例５のユーカリ抽出物（E. globulus, E. maculata）とキトサン、及び乳酸を表２３に示す割合で混合し、実施例１０、１１の殺菌剤を作製した。尚、ユーカリ抽出物と乳酸は容量％、キトサンは重量％である。
【０１１１】
【表２３】
【試験例８】
肉エキスと混合した場合の殺菌剤の殺菌力試験
表２３に示す殺菌剤について、試験例７と同様の方法で殺菌力を調べた。結果を表２４に示す。その結果、各実施例の殺菌剤には、強い殺菌力があった。
【０１１３】
【表２４】
〔実施例１２、１３〕
製造例５のユーカリ抽出物（E. globulus）とキトサン、及び乳酸を表２５に示す割合で混合し、実施例１２、１３及び比較例１０、１１の殺菌剤を作製した。尚、ユーカリ抽出物（プロピレングリコール抽出物）と乳酸は容量％、キトサンは重量％である。
【０１１５】
【表２５】
【試験例９】
牛肉と混合した場合の殺菌剤の殺菌力試験
表２５に示した各種殺菌剤１００ｍｌを容器に入れ、次に牛肉（ブロック）２１ｇをこの殺菌剤中に浸し、室温で放置した。２４時間後、牛肉を取り除き、この殺菌剤中に存在する一般細菌（牛肉から溶出した細菌）を無菌フィルターで取り除いた。この牛肉処理後の殺菌剤２ｍｌにStaphylococcus aureus、又はSalmonella enteritidisの菌液30μlを添加し、添加してから５分後の殺菌剤中の細菌数を調べた。又、次亜塩素酸ナトリウムについても比較検討した。
【０１１７】
表２６に示すように0.01%次亜塩素酸ナトリウムは牛肉と混合した場合、Staphylococcus aureus、Salmonella enteritidisに対する殺菌力が低下した。ユーカリ抽出物とキトサンをともに含む殺菌剤のうち、乳酸濃度が0.030%の殺菌剤（実施例１２）では、Staphylococcus aureusに対する殺菌力は維持されていたが、Salmonella enteritidisに対する殺菌力の低下を引き起こした。尚、この時の殺菌剤のpHは4.2（殺菌前）から5.9（殺菌後）に上昇した。一方、乳酸濃度が0.30%の殺菌剤（実施例１３）では、Staphylococcus aureus、Salmonella enteritidisに対して強い殺菌力が維持されていた。尚、この時の殺菌剤のpHは3.1（殺菌前）から4.8（殺菌後）に上昇した。以上の結果から、牛肉殺菌中に牛肉から溶出される成分の影響で殺菌剤のpHが上昇し、殺菌力の低下を引き起こすが、あらかじめ殺菌剤中の乳酸濃度を高くして、殺菌剤のpHを低い領域（pH4.8付近まで）に維持させておけば、殺菌力の低下を防止できることが判明した。
【０１１８】
【表２６】
【試験例１０】
殺菌剤で処理した牛肉表面の細菌数の測定
表２５に示した実施例１２および比較例１０の殺菌剤を用いて以下の実験を行った。容器内に各殺菌剤５０ｍｌを入れ、次に牛肉（ブロック）１５ｇをこの殺菌剤中に浸し、室温で放置（表面殺菌）した。５分後、殺菌剤を取り除き、牛肉のみを容器内で４℃で保存した。一定時間後（▲１▼１日後、▲２▼３日後、▲３▼６日後）、この牛肉の入った容器に２５ｍｌの生理食塩水を添加し、振盪した。生理食塩水中に溶出した牛肉表面の細菌数を測定した。尚、殺菌処理する前の牛肉表面に存在する細菌数は牛肉１ｇ当たり１０個以下であることを予備実験より確認した。又、滅菌水、次亜塩素酸ナトリウムについても比較検討した。表２７に殺菌剤処理後の牛肉表面に存在する細菌数（牛肉１ｇ当たり）を示す。ユーカリ抽出物とキトサンをともに含む殺菌剤（実施例９）で牛肉を処理した場合、滅菌水、0.01%次亜塩素酸ナトリウムで牛肉を処理した場合に比べ、牛肉表面において細菌の増殖を抑制する効果が認められた。
【０１２０】
【表２７】
〔実施例１４〕
表２８に示す組成の飼料を調製し、乾熱滅菌した。各成分は重量％である。一方、製造例２のユーカリ抽出物（E. globulus）とキトサン、及び他の成分を表２９に示す割合で混合し、実施例１４及び比較例１１、１２に示す組成の殺菌剤を作製した。尚、ユーカリ抽出物とキトサンは重量％、乳酸、エタノール、滅菌水は容量％である。
【０１２２】
【表２８】
【表２９】
【試験例１１】
殺菌剤配合飼料の殺菌力試験
表２９に示す実施例１４および比較例１１、１２の殺菌剤１０ｍｌを表２８に示す飼料１０ｇと混合し、乾燥させた。この飼料１ｇに表１に示す条件で前培養した大腸菌：Escherichia coli IFO12734の菌液を生理食塩水で希釈後、この希釈した菌液50μlをしみ込ませ室温で放置した。一定時間後（３日後、６日後、１５日後）、飼料に生理食塩水を添加、攪拌し、飼料中に存在する細菌を遊離させた。この生理食塩水に存在する生菌数を調べ、飼料１ｇ当たりに存在する生菌数を求めた。表３０に結果を示すが、ユーカリ抽出物とキトサンを配合した飼料（実施例１４）ではコントロール（比較例１１，１２）に比べ細菌の増殖が抑制された。
【０１２５】
【表３０】
〔実施例１５〕
製造例２のユーカリ抽出物とキトサン、及び他の成分を表３１に示す割合で混合し、実施例１５及び比較例１３の殺菌剤を作製した。尚、ユーカリ抽出物とキトサンは重量％、乳酸は容量％で示す。
【０１２７】
【表３１】
【試験例１２】
ウエットティッシュの殺菌力持続性試験
表３１に示す殺菌剤１００ｍｌをティッシュペーパー２０ｇに含浸させ、ウエットティッシュを作成した。無菌室内であらかじめ滅菌しておいたステンレス板の一角（1cm×1cm）をこのウエットティッシュで拭き、２４時間放置した。各菌株について菌懸濁液を10μlをステンレス板上にのせた。１０分間放置後、滅菌した綿棒でステンレス板をふき取り、この綿棒を生理食塩水中に移し、撹拌した。この生理食塩水を一定量寒天培地に塗布し、生菌数を測定した。表３２に結果を示すが、実施例１５を含浸させたウエットティッシュでステンレス板を拭いた場合、２４時間経過した時点でもステンレス板上には強い殺菌力が維持されていた。
【０１２９】
【表３２】
〔実施例１６〕
製造例２のユーカリ抽出物とキトサン、及び他の成分を表３３に示す割合で混合し、実施例１６及び比較例１４の殺菌剤を作製した。尚、ユーカリ抽出物とキトサンは重量％、乳酸は容量％で示す。
【０１３１】
【表３３】
【試験例１３】
おむつの殺菌力試験
表３３に示す殺菌剤１００ｍｌをおむつ基紙（30×65 cm）１５ｇに含浸させ、乾燥させ、紙おむつを作製した。この紙おむつを正方形（1×1cm）に切り取り、オートクレーブで滅菌した。切り取った紙おむつ0.75gを３００ｍｌ容三角フラスコ（生理食塩水７０ｍｌ）に添加した。次に、各菌株の菌懸濁液５ｍｌをこの三角フラスコに添加し、２５℃で振盪した（回転数320rpm）。１時間後に三角フラスコの生理食塩水１ｍｌを取り出し、希釈後、寒天培地に塗布することにより、生理食塩水中に存在する生菌数を求めた。尚、ブランクとして紙オムツを添加しない場合、コントロールとして殺菌剤を含浸させない場合の滅菌率も求めた。滅菌率は以下の計算式より求めた。表３４に結果を示すが、ユーカリ抽出物とキトサンを含む殺菌剤（実施例１６）を含浸させた紙おむつの各菌に対する滅菌率は99.9％であり、コントロールに比べ強い殺菌効果があることが判明した。
【０１３３】
【表３４】
〔実施例１７〕
製造例２のユーカリ抽出物、キトサン、グリセリン脂肪酸エステル、及び他の成分を表３５に示す割合で混合し、実施例１７及び比較例１５の殺菌剤を作製した。尚、ユーカリ抽出物とキトサンは重量％、グリセリン脂肪酸エステル、乳酸は容量％で示す。
【０１３５】
【表３５】
【試験例１４】
殺カビ試験
表３５に示す殺菌剤１ｍｌを入れた滅菌試験管にカビ（Aspergillus niger IFO9455, Penicillium citrinum IFO6352）の胞子懸濁液50μlを添加し、攪拌後、室温で放置した。１時間後、一定量をポテトデキストロース培地に塗布し、カビのコロニー数（生菌数）を調べた。表３６に結果を示すが、ユーカリ抽出物とグリセリン脂肪酸エステルを共に添加した殺菌剤（実施例１７）は、ユーカリ抽出物単独（比較例１５）、グリセリン脂肪酸エステル単独（比較例１６）に比べてカビ（Aspergillus niger, Penicillium citrinum）に対する殺菌効果が強いことが判明した。
【０１３７】
【表３６】
【試験例１５】
抗カビ試験
表３５に示す実施例１７の殺菌剤１００ｍｌをおむつ基紙（30×65 cm）１５ｇに含浸させ、乾燥させ、紙おむつを作製した。この紙おむつを正方形（1×1cm）に切り取り、オートクレーブで滅菌し後、あらかじめ、カビ（Aspergillus niger, Penicillium citrinum）の胞子懸濁液を塗布したポテトデキストロース寒天培地上に置き、２８℃で７日間静置培養した。尚、コントロールとして殺菌剤を含浸させない紙おむつを用いた。表３７に結果を示すが、実施例１７の殺菌剤では阻止円（ハロー）が形成され、抗カビ力があることが判明した。
【０１３９】
【表３７】
【試験例１７】
急性毒性試験
製造例２のユーカリ抽出物（E. globulus 及びE. maculata）をエタノール／オリーブオイル（１／１）に溶解し、４５日齢のマウスに経口投与（各試験区１０匹使用）、及び皮下注射した（各試験区１０匹使用）。経口投与では0.5〜14.5g/kgまでの６水準、又、皮下注射では0.3〜6.5g/kgまでの６水準について急性毒性試験を行い、２週間マウスの状態を観察した。いずれの試験区においてもマウスは生存し、皮膚の異常も見られなかった。この毒性試験結果は、厚生省の普通薬としての急性毒性基準であるマウス皮下注射LD50＞0.2g/kgよりも遥かに高い値であり、非常に安全な医薬・医薬部外品であることを示す。
【０１４１】
【発明の効果】
本発明により、低濃度で殺菌力があり、かつ殺菌力に持続性のある殺菌剤が提供される。本殺菌剤は、MRSA、Staphylococcus aureus、 Escherichia coli、Salmonella typhimurium、Salmonella enteritidis、 Enterococcus faecalis(VRE)、Pseudomonas putida、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、 Vibrio parahaemolyticus、Arthrobacter globiformis、Brevibacterium linens、Proteus vulgaris、Propionibacterium acnes, Trichophyton mentagrophytesに対して殺菌効果があり、医療施設、食肉加工施設、畜舎、鶏舎、鳥類卵殻、食肉等の殺菌剤として、又、飼料、ウエットティッシュ、おむつ等に配合し殺菌力を付加する殺菌剤として使用することができ、又、ニキビや水虫を予防する殺菌剤として使用できる。さらに、本殺菌剤を食肉（ハム、ソーセージ等の加工品も含む）の殺菌剤として使用する場合、殺菌力に低下が起こらないため、殺菌工程で繰り返し使用することができる。本発明の殺菌剤に配合される成分は、人体に対して安全性が確かめられている。
Claims (14)
- ユーカリ属植物葉の極性有機溶媒抽出物と、キトサンと、グリセリン脂肪酸エステルとを含む殺菌剤であって、
前記極性有機溶媒は、アセトン、エタノール、プロピレングリコールまたはブチレングリコールである、
殺菌剤。 - 前記ユーカリ属植物葉の極性有機溶媒抽出物が、アルカンによる脱脂または水蒸気蒸留により精油を除去したユーカリ属植物葉を前記極性有機溶媒で抽出した画分である請求項１記載の殺菌剤。
- 前記ユーカリ属植物葉の極性有機溶媒抽出物および前記キトサンを合計量で０．０００１〜１０重量％含有する請求項１または２記載の殺菌剤。
- 前記ユーカリ属植物葉の極性有機溶媒抽出物が、下記式（Ｉ）で表されるジヒドロカルコン化合物を主要な殺菌成分として含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の殺菌剤。
- 前記グリセリン脂肪酸エステルを０．０００１〜２０重量％含有する請求項１〜４のいずれか一項記載の殺菌剤。
- ニキビ菌に対して使用される請求項１〜５のいずれか一項記載の殺菌剤。
- 白癬菌に対して使用される請求項１〜５のいずれか一項記載の殺菌剤。
- アスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属に属する微生物に対して使用される請求項１〜５のいずれか一項記載の殺菌剤。
- 鳥類卵殻の殺菌に使用される請求項１〜５のいずれか一項記載の殺菌剤。
- 医療施設の殺菌に使用される請求項１〜５のいずれか一項記載の殺菌剤。
- 食肉及び食肉加工施設の殺菌に使用される請求項１〜５のいずれか一項記載の殺菌剤。
- 飼料に配合する殺菌剤として使用される請求項１〜５のいずれか一項記載の殺菌剤。
- ウエットティッシュに配合する殺菌剤として使用される請求項１〜５のいずれか一項記載の殺菌剤。
- おむつに配合する殺菌剤として使用される請求項１〜５のいずれか一項記載の殺菌剤。
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