JP4241377B2 - レクチンの単離 - Google Patents
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Description
レクチンは、炭水化物結合ドメインの存在によって特徴付けられる蛋白質である。コレクチンは、サブユニットのオリゴマー構造を含むレクチンの群であり、各サブユニットは炭水化物結合ドメインを有する。イン・ビボにおいては、レクチンは、異なる分子質量を持つレクチンの集団に導く種々の数のサブユニットに表れる。
溶液からマンノース−結合レクチン(MBL)、またはその誘導体および変種のごときレクチン(本明細書中では、集合的にレクチンと称する)を単離する速くて単純な方法はかなり重要である。
それに結合した、所定濃度の糖誘導体を有する固体支持体を確立し、
該調製物を該固体支持体に適用し、
固体支持体に結合した糖誘導体にレクチンを結合させ、
洗浄液で固体支持体を洗浄して、未結合汚染物を除去し、次いで、
所望により、固体支持体から該レクチン(類)を回収することを含む。
低分子量レクチンおよび高分子量レクチンを含むレクチン調製物を得、該調製物は比率R=R0を有し、
該調製物を単離方法、好ましくは、前記した調製物からの少なくとも1つのレクチンを単離する方法に適用し、
回収されたレクチン分子を含む組成物を得ることを含む。
該調製物を単離方法、好ましくは、前記した調製物から少なくとも1つのレクチンを単離する方法に適用し、
回収されたレクチン分子を含む組成物を得ることを含む。
該レクチン調製物を得、
該調製物を単離方法、好ましくは、前記した調製物から少なくとも1つのレクチンを単離する方法に適用し、
回収されたレクチン分子を含む組成物を得ることを含む。
該調製物を単離方法、好ましくは、前記した調製物から少なくとも1つのレクチンを単離する方法に適用し、
洗浄液の未結合レクチン分子を含む組成物を得ることを含む。
ここに、中程度分子質量は第一の所定の分子量未満であって、第二の所定の分子量を超える分子量であり、高分子質量は第一の所定の分子量未満またはそれと等しい分子量であり、低分子質量は第二の所定の分子量未満またはそれと等しい分子質量であり、
当該方法は、低分子質量レクチン、中程度分子質量レクチンおよび高分子質量レクチンを含むレクチン組成物を得、該調製物は比率R=R0を有し、
該組成物の単離方法、好ましくは前記した調製物から少なくとも1つのレクチンを単離する方法に適用し、
回収されたレクチン分子を含む組成物を得、次いで、
所望により単離方法、好ましくは前記した調製物から少なくとも1つのレクチンを単離する方法に組成物を適用する工程を反復する;
工程を含む。
もう1つの態様において、本発明は、
少なくとも1つのアミノ糖で誘導体化した固体支持体を確立し、
種々のレクチン分子を含む調製物を該固体支持体に適用し、
該レクチンを、固体支持体にカップリングしたアミノ糖に結合させ、
洗浄液で固体支持体を洗浄して、未結合汚染物を除去し、次いで、
所望により、固体支持体から該レクチン(類)を回収する;
ことを含む、該調製物から少なくとも1つのレクチンを単離する方法に関する。
糖誘導体
好ましい具体例において、用語糖誘導体は糖に由来する化合物を意味し、ここに、誘導された化合物は、所定の向きに固体支持体にカップリングする能力を有する。本発明者らは、なぜ従来の単離方法が効率を欠くかの理由の1つを突き止めた。かくして、レクチンは糖上の特異的結合部位に結合し、先行技術からのおよび他の固体支持体にランダムにカップリングした糖を用いる場合、あるパーセンテイジのカップリングした糖は、結合部位がレクチンに結合する位置にはないのでレクチンに結合しないことが判明した。
用語糖誘導体は、糖から誘導されるいずれの化合物も意味する。本発明の意味においては、糖は、5−員環(ペントース)または6−員環(ヘキソース)またはその組合わせであるかを問わず、またT−形態またはL−形態であるかを問わず、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖および多糖を含めたいずれの炭水化物も、ならびにカルボニル基の還元によって(アルジトール)、末端基のカルボン酸への酸化によって、またはもう1つの基によるヒドロキシ基の置換によって単糖から誘導される物質も意味する。それは、これらの化合物の
誘導体も含む。
本発明は、特に、アミノ基から選択される反応性基を有する糖誘導体に関し、ここに、該アミノ基は、例えば、第一級アミノ基、第二級アミノ基および第三級アミノ基よりなる群から選択することができる。
マンノサミン、グルコサミン、アロサミン、アルトサミン、リボサミン、アラビノサミン、グロサミン、イドサミン、ガラクトサミン、タロサミン、キシロサミン、リキソサミンのごときアミノアルドース。特に、D−マンノサミン、D−グルコサミン、D−アドサミン、D−アルトロサミン、D−リボサミン、D−アラビノサミン、L−グロサミン、L−イドサミン、L−ガラクトサミン、L−タロサミン、L−キシロサミン、L−リキソサミン。
ソルボサミン、タガトサミン、サイコサミン、フルクトサミンのごときアミノケトース。特に、D−ソルボサミン、D−タガトサミン、L−サイコサミン、L−フルクトサミン。
特に、MDLの単離に関し、アミノ糖の以下の例が適する:マンノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、フルクトサミン。特に、D−マンノサミン、D−グルコサミン、L−ガラクトサミン、L−フコサミン。
より好ましくは、グルコサミンおよびマンノサミンよりなる群から選択されるアミノ糖、最も好ましくはL−フコサミン、D−グルコサミンおよびD−マンノサミンなる群から選択されるアミノ糖を用いることができ、特にD−グルコサミンまたはD−マンノサミンを用いることができる。D−マンノサミンの式は、本明細書中においては、遊離D−マンノサミンおよび樹脂に結合したD−マンノサミンとして以下に示す。
固体支持体は、レクチンを捕獲し、および/または単離するのに用いられるいずれの支持体であってもよい。かくして、固体支持体は、クロマトグラフィー樹脂および磁性粒子のごとき単離および精製で用いるいずれのカラムまたはフィルターまたは粒子であっても良い。
1)糖誘導体にカップリングすることができる固体支持体上の位置(リガンドアーム)の濃度、
2)リガンドアーム当たりの糖誘導体の濃度;
によって決定される。
本発明による洗浄液は、当業者に知られたいずれの適当な洗浄液であってもよい。特に、緩衝液は、レクチンおよびアミノ糖のごとき糖誘導体の間の会合に干渉することができる1以上の成分を含むことができる。
本発明により単離されたレクチンはいずれのレクチンであってもよい。例えば、レクチンは、例えば、MBL(マンノース−結合レクチン)、SP−A(肺界面活性剤プロテインA)、SP−D(肺界面活性剤プロテインD)、BK(またはBC、ウシコングルチニン)およびCL−43(コレクチン−43)のごときコレクチンであってよい。コレクチンは、全て、以下の人工物を呈する:それらは鎖間ジスルフィド結合を形成するように見えるN−末端システインリッチの領域、続いてのコラーゲン−様領域、α−ラセンコイルド−コイル領域、および最後に、パターン−認識領域であって、炭水化物認識ドメイン(CRD)というC−型レクチンドメインを有する。名称コレクチンはコラーゲンおよびレクチンドメイン双方の存在に由来する。α−ラセンコイルド−コイル領域は個々のポリペプチドのトリマー化を開始して、コラーゲン三重コイルを形成し、それにより、各々が3つの個々のポリペプチドよりなるコレクチンサブユニットを生成し、他方、N−末端領域はサブユニットのオリゴマーの形成を媒介する。異なるコレクチンは区別される高次の構造、典型的には、サブユニットのテトラマーまたはサブユニットのヘキサマーを呈する。
特に、本発明はMBLを単離するのに適し、これは、本発明の実施例として以下により徹底的に記載するが、本発明を限定するものではない。
本明細書中に記載する比率Rはいずれかの適当な方法を用いて計算することができる。好ましい具体例においては、試料中のR値の定量的見積もりは以下のごとき行う:
SDS−PAGEイミュノブロットをTIFFファイル、またはもう1つの非圧縮ビットマップファイルにスキャンする。試料バンドに沿った画素密度を、Windows4.0(登録商標)についてのScionイメージ(Scion Corporation, www.scioncorp.comでのフリーウエアーデータバージョン)のごときピクチャー評価プログラムで測定され、(Excelのような)データ評価プログラムに送る。
該方法はMBLのごとき低および高質量レクチン双方を有するいずれのレクチン出発物質に適用することもできるが、組換えにより製造された調製物からのMBLのごとき、高質量レクチンを製造するのに特に適している。
−ヒトMBLペプチドをコードする遺伝子発現構築体またはその機能的同等体を調製し、
−宿主細胞培養を該構築体で形質転換し、
−培養基中で宿主細胞培養を培養し、それにより、ポリペプチドの発現およびポリペプチドの培養基への分泌を得、
−種々のMBL分子を含む調製物を得る;
ことによって得られる。
前記したごとく、本発明はMBLの速い生産を可能とする。MBLの生産は以下の工程によって行うことができる。
単離−本発明の適用
従って、レクチン組成物は、さらに、本発明の方法を適用する単離に先立って、または本発明の方法による単離に引き続いて、いずれかの適切な手段によって精製することができる。
本発明により得られた組換えMBL組成物の機能は、好ましくは、血漿または血清MBLの機能と似ている。この意味において、MBLの機能は、機能的同等体に関し前記した補体系を活性化することができることを意味する。該機能は、MBLの1ng当たりのMBL活性の単位のごときMBLの特異的活性として表すことができる。特異的活性として表した組換えMBLの機能は、少なくとも、血清から精製されたMBLの特異的活性の少なくとも50%、より好ましくは血清から精製されたMBLの特異的活性の少なくとも75%のごとき、血清から精製されたMBLの特異的活性の少なくとも25%である。
ELISAによる評価は、同様に、例えば、工程7においてビオチン−標識抗−C4を適用し;8)アルカリ性ホスファターゼ−標識アビジンを適用し;9)基質を適用し;次いで10)色強度を読み取ることによって行うことができる。キャリブレーション曲線は、1つの選択された正常な血漿の希釈を用いて構築することができる。本発明に関しては、以下の血清が有用な血清の例である:血漿プールLJ 6.57 28/04/97。機能は、MBLの1ng当たりのMBL活性の単位のごときMBLの特異的活性として表すことができる。
実施例1:
固定化されたアミノ糖を用いるMBLの精製
HyQベースの培地(HyClone)中で、WO 00/70043に記載されたMBLをコードする発現構築体を含むHEK293ベースの細胞系に似たヒト細胞系によってMBLを組換えにより生産し、引き続いて、固定化されたアミノ糖を用いることによってアフィニティークロマトグラフィーによってMBLを精製した。
固定化されたアミノ糖を用いるMBLの選択されたサイズ−画分の精製
レクチンオリゴマーの選択された画分は、アミノ糖リガンド濃度を調整することによって得ることができる。
固定化されたアミノ糖での一連のカラムを用いるMBLの選択されたサイズ−画分の精製
固定化されたアミノ糖を用いる血漿由来MBLの精製
D−マンノサミンカラムは実施例1に記載したごとく調製される。1/2リットルの血漿は血液バンクから入手し、CaCl2の添加後に軽く加熱することによって凝固させる。得られた血清をカラムに添加し、しばらくした後、EDTA含有緩衝液を用いて洗浄蛋白質を溶出させる。対応する適量の特異的イムノアッセイ、順送り、および溶出する主なピークにより、MBLがカラムからの溶出する主なピークにほとんど全部見出される。
D−マンノサミン以外の固定化されたアミノ糖を用いるMBLの精製
NH2基を介する固定化の後、固定化されたD−マンノサミンはレクチンに結合することができるいずれかのアミノ糖と交換することができる。リガンド濃縮の同一効果が見られる。
対応する適用のMBL特異的イムノアッセイ、順送りおよび溶出する主なピークにより、MBLは、高いリガンド濃度でのカラム(「高−sub」カラム)から溶出する主なピーク中にほとんど全部が見出される(図3)。
固定化されたアミノ糖を用いるレクチンの大規模精製
アフィニティークロマトグラフィーは容易に10倍までスケールアップされる。
大きなD−グルコサミンカラムは、5.0gのD−グルコサミン(Sigma,カタログ番号G4875)を100mLの懸濁されたNHS−活性化Sepharose FF(Amersham Biosciences,カタログ番号17−0906−02)にカップリングすることによって調製される。カップリング条件は、正確に、NHS−活性化ゲルについての販売業者の指令書に記載されている通りであった。10リットルの組換えにより生産されたMBLを含む細胞培養ブロスをカラムに添加し、EDTA含有緩衝液を用いて溶出させる。
固定化されたアミノ糖を用いるレクチンの検出
アミノ糖はマイクロタイターウエルに固定化し、レクチンの検出で適用することができる。
Claims (28)
- −アミノ糖分子の一部分に反応部分として位置する第一級アミノ基および該分子の他の部分にマンノース結合レクチン(MBL)結合部位を有する少なくとも1つのアミノ糖で誘導体化した固体支持体を確立し、ここに該アミノ糖はアミノ基を介して該固体支持体にカップリングしており、
−種々のレクチン分子を含む調製物を該固体支持体に適用し、
−該固体支持体にカップリングしたアミノ糖にレクチンを結合させ、
−洗浄液で固体支持体を洗浄して、結合しなかった汚染物を除去し、次いで、
−所望により、固体支持体から該レクチン(類)を回収する
ことを含む該調製物から少なくとも1つのMBLを単離する方法。 - 該アミノ糖がマンノサミン、グルコサミン、ガラクトースアミン、フルクトサミン、D−マンノースアミン、D−グルコサミン、L−ガラクトースアミンおよびL−フコサミンよりなる群から選択される単糖である請求項1記載の方法。
- 該アミノ糖がD−マンノサミンおよびD−グルコサミンよりなる群から選択される請求項1記載の方法。
- 該固体支持体がクロマトグラフィーカラム樹脂であって、0 . 1mgないし1000mgアミノ糖/ml樹脂の所定の濃度を該固体支持体にカップリングする請求項1記載の方法。
- MBLが該固体支持体から回収される請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- MBLが純粋な形態で回収される請求項5記載の方法。
- 該固体支持体がクロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィー樹脂、フィルター、プラスチック表面、ガラス表面および磁性粒子から選択される請求項1ないし6のいずれか1項に記載の方法。
- 該カラムがN−ヒドロキシスクシンイミド活性化樹脂、臭化シアン活性化樹脂およびエポキシ活性化樹脂から選択される請求項7記載の方法。
- 該プラスチック表面が活性化されたマイクロタイタープレートである請求項7記載の方法。
- 該洗浄液が、二価金属イオンキレート剤およびMBLに結合することができる糖よりなる群から選択される1またはそれを超える成分を含み、該糖がマンノース、N−アセチルマンノサミン、グルコース、N−アセチルグルコサミン、フルクトース、N−アセチルフルクトサミン、ガラクトースおよびN−アセチルガラクトサミン、サッカロースおよびマルトースよりなる群から選択される請求項1ないし9のいずれか1項に記載の方法。
- 種々のMBL分子を含む組成物の比率Rを増加させる方法であって、ここにRは所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するMBL分子の濃度に対する所定の分子量を超える高分子量を有するMBL分子の濃度の比率であり、
低分子量MBLおよび高分子量MBLを含むMBL調製物を得、ここに該調製物は比率R=R 0 を有し、
該調製物を請求項1ないし9のいずれか1項に記載の単離する方法に適用し、ついで
回収したMBL分子を含む組成物を得る
ことを含む該方法。 - 種々のMBL分子を含む組成物の製法であって、ここに、該MBL分子の全てはダイマーMBLについての所定の分子量を超える分子量を有し、
所定の分子量を超える高分子量を有するMBL分子および所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するMBL分子を含むMBL調製物を得、ここに該調製物は比率R=R 0 を有し、Rは所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子の濃度に対する所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子の濃度の比率であり、
請求項1ないし9のいずれか1項に記載の単離する方法に該調製物を適用し、
回収したレクチン分子を含む組成物を得る
ことを含む該製法。 - 所定の分子量を超える高分子量を有するMBL分子およびダイマーレクチンについての分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するMBL分子を含むMBL調製物から、種々のMBL分子を含む組成物を分離する方法であって、ここに、該MBL分子の全ては所定の分子量を超える高分子量を有し、ここに該調製物は比率R=R 0 を有し、Rは所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するMBL分子の濃度に対する所定の分子量を超える高分子量を有するMBL分子の濃度の比率であり、
該MBL調製物を得、
請求項1ないし9のいずれか1項に記載の単離方法に該調製物を適用し、ついで
回収したMBL分子を含む組成物を得る
ことを含む該方法。 - 種々のMBL分子を含む組成物の製法であって、ここに、該MBL分子の全ては所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有し、
所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子および所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子を含むMBL調製物を得、ここに、該調製物は比率R=R 0 を有し、Rは所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子の濃度に対する所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子の濃度の比率であり、
請求項1ないし9のいずれか1項に記載の単離方法に該調製物を適用し、ついで
洗浄液の結合しなかったMBL分子を含む組成物を得る
ことを含む該製法。 - 種々のMBL分子を含む調製物の比率Rを増加させる方法であって、ここにRは高分子量および低分子量を有するMBL分子の濃度に対する中間的分子量を有するレクチンの濃度の比率であり、
ここに、該中間的分子量は第1の所定の分子量未満であって第2の所定の分子量を超える分子量であり、高分子量は第1の所定の分子量を超えるかまたはそれと等しい分子量であって、低分子量は第2の所定の分子量未満またはそれと等しい分子量であり;
a)低分子量MBL、中間的分子量MBLおよび高分子量MBLを含むMBL調製物を得、該調製物は比率R=R 0 を有し;ついで
b)請求項1ないし9のいずれか1項に記載の単離方法に該調製物に適用し;
c)回収したMBL分子を含む組成物を得、ついで
d)所望により、異なる濃度のアミノ糖を有する固体支持体を用いて工程b)を繰り返す
工程を含む該方法。 - 組成物の高分子量MBLの少なくとも50%が、225kDaを超えるような、250kDaを超えるような、300kDaを超えるような、200kDaを超える分子量を有する請求項15記載の方法。
- 低分子量MBLが200kDa未満の分子量を有するMBLを含む請求項15記載の方法。
- MBL調製物が組換えMBL調製物である請求項1ないし17のいずれか1項に記載の方法。
- MBL調製物を
−ヒトMBLペプチドをコードする遺伝子発現コンストラクトを調製し、
−該コンストラクトで宿主細胞培養物を形質転換し、
−該宿主細胞培養物を培地で培養し、それによって培地へのポリペプチドの発現および分泌を得、ついで
−種々のMBL分子を含む調製物を得る
ことによって得る請求項18記載の方法。 - 遺伝子発現コンストラクトがヒトMBL遺伝子からの少なくとも1つの イントロン配列を含む請求項19記載の方法。
- 遺伝子発現コンストラクトがヒトMBL遺伝子からの少なくとも2つのエクソン配列を含む請求項20記載の方法。
- 遺伝子発現コンストラクトがMBLサブユニットをコードするcDNA配列を含む請求項19記載の方法。
- 宿主細胞培養物をイン・ビトロ (in vitro) で培養する請求項19記載の方法。
- 宿主細胞培養物が真核生物宿主細胞培養物である請求項19記載の方法。
- 宿主細胞培養物が哺乳動物宿主細胞培養物である請求項19記載の方法。
- クロマトグラフィーカラム樹脂である固体支持体であって、当該固体支持体は、マンノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、フルクトサミン、D−マンノサミン、D−グルコサミン、L−ガラクトサミンおよびL−フコサミンよりなる群から選択される0 . 1mgないし1000mgアミノ糖/ml樹脂の所定の濃度の、第一級アミノ基を有する少なくとも1つのアミノ糖が当該固体支持体に共有的にカップリングしており、該アミノ糖はアミノ基を介して当該固体支持体にカップリングしている該固体支持体。
- アミノ糖がD−マンノサミンおよびD−グルコサミンよりなる群から選択される請求項26記載の固体支持体。
- 該カラムがN−ヒドロキシスクシンイミド活性化樹脂、臭化シアン活性化樹脂およびエポキシ活性化樹脂から選択される請求項26記載の固体支持体。
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