CN100447150C

CN100447150C - 凝集素的分离方法

Info

Publication number: CN100447150C
Application number: CNB028243196A
Authority: CN
Inventors: 芬恩·马西森
Original assignee: NatImmune AS
Current assignee: NatImmune AS
Priority date: 2001-10-19
Filing date: 2002-10-18
Publication date: 2008-12-31
Anticipated expiration: 2022-10-18
Also published as: ES2254759T3; DE60207678D1; US20040019186A1; EP1335932B1; WO2003033522A1; DE60207678T2; JP2005511537A; JP4241377B2; EP1335932A1; CN1599747A; ATE311400T1; US7049414B2; DK1335932T3

Abstract

本发明涉及特别包括甘露糖结合凝集素(MBL)的适用于重组产生的凝集素作为原料的凝集素组合物的分离方法和涉及高分子量凝集素的凝集素制品的富集方法。该方法意味着使用糖衍生物修饰的固相支持体，其中固相支持体上一定浓度的糖衍生物用于分离预定的凝集素寡聚体。

Description

凝集素的分离方法

发明领域

本发明涉及特别包括甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)的适合于使用重组生产的凝集素作为原料的凝集素组合物的分离方法和涉及高分子量凝集素的凝集素制品的富集方法。

发明背景

凝集素是特征在于存在糖结合结构域的蛋白质。胶原凝素是一组含有亚单位寡聚结构的凝集素，每个亚单位含有糖结合结构域。以可产生具有不同分子量的凝集素群的不同数量的亚单位表示体内凝集素。

MBL属于胶原凝素族蛋白家族且特征在于各自由与胶原视杆细胞(collagenous rod)结合的钙依赖性C-型糖识别域(CRD)组成的亚单位的寡聚结构。MBL通过相关的丝氨酸蛋白酶(MASP-甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶)、即通过与C1q类似的机制激活补体系统。甘露糖结合蛋白(Mannose-binding protein，MBL)是用于患有与功能和/或临床症状相关的遗传性或获得性MBL-缺乏的患者的取代或置换疗法的蛋白质。

将来源于人血浆的MBL装配入各自由三条相同的多肽链组成的亚单位寡聚体。MBL分子中的亚单位数量是可变的[Lipscombe RJ等：“由不同基因型的个体表达的人甘露糖结合蛋白的不同理化特性”(“Distinctphysicochemical characteristics of human mannose binding protein expressed byindividuals of differing genotype”)-《免疫学》(Immunology)85(1995)660-667。]，但提示生物活性多肽是由三个以上亚单位组成的寡聚体。血浆含有三个以上亚单位的寡聚体以及变性和结构异常的蛋白质形式，它们例如在SDS凝胶上产生相当于高级寡聚体的显性MBL带之间的带。

重组生产的MBL显示出与血浆衍生的MBL相似的寡聚体变化形式[Vorup-Jensen T等：“人甘露聚糖结合凝集素的重组表达”(Recombinantexpression of human mannan binding lectin)-《国际免疫药物学》(Int.Immunopharm.)1(2001)677-687]。然而，重组生产的MBL通常具有高于血浆衍生的MBL含量的低分子量形式。低分子量形式MBL包括例如单多肽链、单一亚单位和二聚化亚单位。

一般通过使包括凝集素的组合物上与用凝集素结合的糖修饰的柱分离凝集素。然而，柱的效力可变。在PCT申请WO 00/70043中描述了从低分子量形式中分离高分子量寡聚体的方法，其中使重组生产的MBL在特定的柱上进行分级分离，其中该柱本身对MBL不具有任何亲和性。

发明内容

从溶液中快速而简便分离凝集素、诸如甘露糖结合凝集素(MBL)或其衍生物及其变体(本文共同命名为凝集素)的方法具有显著重要性。

此外，控制凝集素的分子量分布也具有显著的重要性，因为所述凝集素多肽类的不同寡聚体具有不同的生物功能和活性。

本发明描述了凝集素、诸如MBL的分离方法，该方法通过将所述制品施加在与预定浓度的糖衍生物偶联的固相支持体上来进行。该方法用作制备、纯化和/或配制所述多肽过程中的单元操作。与其它方法比较，本发明方法有利的是可以用于改变所述多肽寡聚体的组成以便从所述多肽的低分子量寡聚体中分离所述多肽的高分子量寡聚体或从高分子量寡聚体和低分子量寡聚体中分离中间分子量寡聚体。

因此，本发明的一个目的是提供从包括各种凝集素分子的制品中分离至少一种凝集素的方法，该方法包括下列步骤：

建立与预定浓度的糖衍生物偶联的固相支持体；

将所述制品施加在所述固相支持体上；

使所述凝集素结合与所述固相支持体偶联的糖衍生物；

用洗涤液洗涤所述的固相支持体以除去未结合的污染物；和

任选从所述固相支持体上回收所述凝集素。

所谓的术语″预定浓度″指的是将具有预定浓度的糖衍生物的预定体积施加在使糖衍生物与固相支持体偶联的固相支持体的预定体积或面积上。在一个实施方案中，该术语指的是预定浓度的糖衍生物与预定体积或面积的固相支持体偶联。

所谓术语″污染物″指的是凝集素制品中的污染物和因其分子量较小而未与所述糖衍生物结合的凝集素。特别当需要中间分子量凝集素时，所述的污染物可以含有使用如下所述的两步或多步法时所需的凝集素。因此，术语″污染物″与包括未结合凝集素在内的未结合物质的含义相同。

所谓术语″各种凝集素分子″优选指的是各种凝集素分子的寡聚体，所述的凝集素分子具有诸如如下所述的相同或基本上相同的结构亚单位。

本发明的第二个目的是提供与预定浓度的糖衍生物共价偶联的这类固相支持体，其中所述的糖衍生物优选是氨基糖。

本发明的另一个目的涉及改变溶液中凝集素的寡聚体分布的方法。因此，本发明在一个实施方案中涉及增加包括各种凝集素分子的组合物中比值R的方法，其中R是具有高于预定分子量的分子量的高凝集素分子浓度与具有低于或等于预定分子量的低分子量的凝集素分子浓度之比，所述的方法包括下列步骤：

获得包括低分子量凝集素和高分子量凝集素的凝集素制品，所述的制品具有的比值R＝R₀；

对该制品施用一种分离方法，优选从如上文所述的制品中分离至少一种凝集素的方法；

获得包括回收的凝集素分子的组合物。

由此获得了具有比原料的高分子量凝集素寡聚体的含量增加的组合物。

特别地，所述比值的增加产生了包括具有高于二聚体凝集素分子量的分子量的组合物。因此，本发明在另一个方面中涉及包括各种凝集素分子的组合物的生产方法，其中基本上所有所述的凝集素分子均具有高于预定的二聚体凝集素分子量的分子量，所述的方法包括下列步骤：

获得包括具有高于预定分子量的高分子量的凝集素分子和具有低于或等于预定分子量的低分子量的凝集素分子的凝集素制品，所述的制品具有的比值R＝R₀，其中R是具有高于预定分子量的很高分子量的凝集素分子浓度与具有低于或等于预定分子量的低子量的凝集素分子浓度之比；

获得包括回收的凝集素分子的组合物。

由于用于所述方法的原料包括高分子量凝集素和低分子量凝集素，所以本发明还涉及从凝集素制品中分离包括各种凝集素分子的方法，其中基本上所有所述的凝集素分子均具有高于预定分子量的高分子量，所述的凝集素制品包括具有高于预定分子量的高分子量的凝集素分子和具有低于或等于二聚体凝集素分子量的低分子量的凝集素分子，所述的制品具有的比值R＝R₀，其中R是具有高于预定分子量的高分子量的凝集素分子浓度与具有低于或等于预定分子量的低分子量的凝集素分子浓度之比；所述的方法包括下列步骤：

获得所述的凝集素制品；

获得包括回收的凝集素分子的组合物。

就大部分目的而言，高分子量凝集素是所需的凝集素；然而，就某些应用而言，则需要低分子量凝集素；且由此本发明进一步涉及包括各种凝集素分子的组合物的生产方法，其中基本上所有所述的凝集素分子均具有低于或等于预定分子量的低分子量，所述的方法包括下列步骤：

获得凝集素制品，该制品包括具有高于预定分子量的高分子量的凝集素分子和具有低于或等于预定分子量的低分子量的凝集素分子，所述的制品具有的比值R＝R₀，其中R是具有高于预定分子量的高分子量的凝集素分子浓度与具有低于或等于预定分子量的低分子量的凝集素分子浓度之比；

获得包括洗涤液中未结合的凝集素分子的组合物。

就上述所有方法而言，优选回收的凝集素分子组合物具有的比值R＝R₁，其中R₁至少为1。诸如至少为1.05、诸如至少为1.10、诸如至少为1.15、诸如至少为1.25、诸如至少为1.50、诸如至少为1.75、诸如至少为2.0、诸如至少为2.5、诸如至少为3.0、诸如至少为4.0、诸如至少为5.0、诸如至少为6.0、诸如至少为7.0、诸如至少为8.0、诸如至少为9.0、诸如至少为10.0、诸如至少为15、诸如至少为20、诸如至少为30、诸如至少为40、诸如至少为50、诸如至少为60、诸如至少为70、诸如至少为80、诸如至少为90、诸如至少为100、诸如至少为100、诸如至少为1000、诸如至少为10000。

就上述公开的所有方法而言，预定的分子量优选是二聚体凝集素的分子量，更优选三聚体凝集素的分子量。

就大部分目的而言，高分子量凝集素是所需的凝集素；然而，在某些实施方案中，可能需要中间分子量凝集素。因此，本发明在另一个方面中涉及增加包括各种凝集素分子的制品的比值R的方法，其中R是具有中间分子量的凝集素浓度与具有高分子量和低分子量的凝集素分子浓度之比，其中中间分子量是低于第一种预定的分子量而高于第二种预定的分子量的分子量，高分子量是高于或等于第一种预定分子量的分子量且低分子量是低于或等于第二种预定分子量的分子量，所述的方法包括下列步骤：

获得包括低分子量凝集素、中间分子量凝集素和高分子量凝集素的凝集素制品，所述的制品具有的比值R＝R₀；

对该制品施用一种分离方法，优选从如上文所述的制品中分离至少一种凝集素的方法；和

获得包括回收的凝集素分子的组合物；和

任选重复对该制品施用一种分离方法的步骤，优选从如上文所述的制品中分离至少一种凝集素的方法。

在一个实施方案中，第一种预定的分子量可以是七聚体凝集素的分子量，而第二种预定的分子量是二聚体凝集素的分子量。

本发明在另一个方面中涉及从包括各种凝集素分子的制品中分离至少一种凝集素的方法，该方法包括下列步骤：

建立用至少一种氨基糖衍生的固相支持体；

将所述制品施加在所述固相支持体上；

使所述凝集素结合与所述固相支持体偶联的氨基糖；

用洗涤液洗涤所述的固相支持体以除去未结合的污染物；和

任选从所述固相支持体上回收所述凝集素。

所谓术语″衍生的(deriveatized)″指的是如上所述使氨基糖与固相支持体偶联。

本发明的凝集素可以任意凝集素，其中产生几种寡聚化形式，例如胶原凝素(collectins)，诸如甘露糖结合凝集素。本发明特别涉及MBL组合物的生产方法。所谓术语MBL指的是甘露糖结合凝集素(或如某些作者命名的甘露糖结合蛋白)。MBL优选是具有例如PCT申请WO 00/70043中所示蛋白质序列的人MBL或其属于MBL的功能等价物的衍生物或变体。在本发明在下文中描述了与凝集素相关的MBL。

本发明的方法使所述凝集素的大规模生产成为可能。因此，本发明在另一个方面中涉及任何工业化或大规模生产MBL的方法，这些方法包括在生产所述MBL的过程中施用所述方法的步骤。

附图

附图1中解释了上如实施例1中所述的含有固定化D-甘露糖胺的柱并从该柱上洗脱的重组生产的MBL的洗脱分布。该附图表示使用对抗血浆衍生的MBL的单克隆抗体进行的SDS-PAGE蛋白质印迹。MW＝标记(kDa)，A＝上柱物(来自使用本发明前的重组来源的MBL)，R＝在上柱过程中获得自始至终的级分；E＝用EDTA洗涤后的洗脱级分(使用本发明后的重组衍生的MBL)。

附图2解释了如上实施例2中所述的含有固定化D-甘露糖胺的柱并从该柱上洗脱的重组生产的MBL的洗脱分布。该附图表示使用对抗血浆衍生的MBL的单克隆抗体进行的SDS-PAGE蛋白质印迹。′假拟′：未与氨基糖偶联的柱，′低-sub′＝与少量氨基糖偶联的柱，′高-sub′＝与大量氨基糖偶联的柱，′高-sub R′＝使用NaOH再生后与大量氨基糖偶联的柱。MW＝标记(kDa)，A＝上柱物，R＝在上柱过程中获得自始至终的级分；E＝用EDTA洗涤后的洗脱级分，PI＝血浆来源的MBL(对照品)。

附图3解释了上如实施例5中所述的含有两种浓度的固定化D-葡糖胺的柱并从该柱上洗脱的重组生产的MBL的洗脱分布。该附图表示使用对抗血浆来源的MBL的单克隆抗体进行的SDS-PAGE蛋白质印迹。A＝上柱物(来自使用本发明前的重组来源的MBL)，R＝在上柱过程中获得自始至终的级分；E＝用EDTA洗涤后的洗脱级分(使用本发明后的重组来源的MBL)，PI＝血浆来源的MBL(对照品)。

发明详述

糖衍生物

在优选的实施方案中，术语糖衍生物(sugar derivative)指的是来源于糖的化合物，其中来源的化合物具有以预定方向的方式与固相支持体偶联的能力。本发明者已经确定了以前的分离方法为何缺乏功效的原因之一。由此发现凝集素与糖类上的特异性结合部位结合，且当现有技术使用以随机方式与柱和其它固相支持体偶联的糖类时，所偶联的百分比的糖类不能结合凝集素，因为结合部位并没有定位以结合凝集素。

因此，本发明的糖衍生物优选含有定向偶联固相支持体的反应基团。这种糖衍生物可以是能够在该糖衍生物与固相支持体偶联时结合凝集素的任意衍生物。当该衍生物时游离形式时，糖衍生物不能结合凝集素，即不偶脸，当能够以偶联形式结合凝集素时，本发明也可以使用未偶联的形式。

可以通过将反应基引入糖、优选引入特定位置获得预定方向的糖，由此能够使糖衍生物以特定方向的方式与固相支持体偶联，即与固相支持体的偶联通过使反应基而发生。因此，所谓术语″定向偶联″指的是糖通过糖分子上特定的预定基团与固相支持体偶联，使得糖分子的游离部分以预定方式定向。

在单糖中，结合部位和反应基团定位于相同的单糖结构上；然而，在二糖类和高级寡糖类和多糖类中，结合部位可以定位于另一个单糖结构上而非反应基上。在本文的上下文中，术语″单糖结构″指的是能够形成糖上环的结构。例如，二糖含有两个单糖结构。在优选的实施方案中，反应基团位于远离结合部位的位置上，由此获得具有无位阻的结合部位的最佳可能性。

糖类

术语糖衍生物指的是来源于糖的任意化合物。在本文的上下文中，糖指的是碳水化合物，包括单糖类、二糖类、三糖类、寡糖类和多糖类，无论是5-元环(戊糖)还是6-元环(己糖)或其组合；或无论是D-型还是L-型；以及来源于通过还原羰基(糖醇类)、将端基氧化成羧酸或通过用另一个基团取代羟基的单糖类的物质。还包括这些化合物的衍生物。

单糖类包括多羟基醛类H-[CHOH]_n-CHO和多羟基酮类H-[CHOH]_n-CO-[CHOH]_m-H，即醛糖类、二醛糖类、醛酮糖类、酮糖类、二酮糖类、脱氧糖类、氨基糖类及它们的衍生物。

醛糖类包括含有醛羰基的单糖类，即多羟基醛类H-[CHOH]_n-CHO。醛糖类还包括含有可能因醛糖环合产生醛羰基(半缩醛基)的单糖类。

酮糖类包括含有酮基的单糖类，即多羟基酮类H-[CHOH]_n-CO-[CHOH]_m-H，即酮糖类(ketones)还包括含有可能因酮糖环合产生酮羰基(半缩酮基)的单糖类。

吡喃糖类是含有四氢呋喃的环状半缩醛类或环状半缩酮类(5-元环)。

呋喃糖类是含有四氢呋喃的环状半缩醛类或环状半缩酮类(5-元环)。

二醛糖类、二酮糖类、酮醛糖类(醛酮糖类、aldosuloses)、糖醇类是含有一个以上醛和/或酮的单糖类。

醛糖糖酸类、酮酸类是醛基与羧基交换的醛糖类。

糖类衍生物的实例是：糖醛酸类，即第一个CH₂OH-基已与羧基交换的醛糖类；糖二酸类(aldaric acids)，即第一个CH₂OH-基已与羧基交换的醛糖糖酸类；脱氧糖类，即羟基已与氢交换的单糖类；氨基糖类，即羟基已与氨基交换的单糖类。

还包括糖基胺类，它是氨基糖类，其中半缩醛基(环合后形成的)上的羟基已与氨基交换。

在本文的上下文中，使用术语乙缩醛的一般含义，即因醛糖或酮糖环合产生的单糖类。此外，苷类是因单糖、寡糖和多糖的半缩醛与半缩酮羟基与另一个单糖、寡糖和多糖的羟基之间消去水而产生的乙缩醛类。

在本发明的上下文中，术语糖或本文所述的任意糖类和衍生物包括所述糖类的各种立体形式，包括D-型和L-型、α-型和β-型。因此，作为实例，甘露糖胺指的是任意立体形式的甘露糖胺，包括D-甘露糖胺、L-甘露糖胺和(D，L)-甘露糖胺。仅当使用特定的立体形式时，它才是例如所述的D-甘露糖胺。

具体的衍生物

本发明特别涉及带有选自氨基的反应基的糖衍生物，其中所述的氨基例如可以选自伯氨基、仲氨基和叔氨基组成的组。

本发明特别涉及作为糖衍生物的氨基糖的应用。氨基糖可以是氨基单糖类、氨基二糖类、氨基寡糖类和氨基多糖类，其中当所述氨基糖与固相支持体偶联时，至少一个氨基以起反应基作用的方式被引入。

合适的氨基单糖类的实例是：

氨基醛糖类，诸如甘露糖胺、葡糖胺、阿洛糖胺、阿卓糖胺、核糖胺、阿拉伯糖胺、古洛糖胺、艾杜糖胺、半乳糖胺、塔罗糖胺、木糖胺、来苏糖胺。特别是D-甘露糖胺、D-葡糖胺、D-阿洛糖胺、D-阿卓糖胺、D-核糖胺、D-阿拉伯糖胺、L-古洛糖胺、L-艾杜糖胺、L-半乳糖胺、L-塔罗糖胺、L-木糖胺、L-来苏糖胺。

氨基酮糖类，诸如山梨糖胺、塔格糖胺、阿洛酮糖胺、果糖胺。特别是D-山梨糖胺、D-塔格糖胺、L-阿洛酮糖胺(psicosamine)、L-果糖胺。

氨基脱氧醛糖类，诸如岩藻糖衍生物，例如岩藻糖胺和岩藻糖基胺，优选L-岩藻糖胺。

下列氨基糖类的实例特别合适分离MBL：甘露糖胺、葡糖胺、半乳糖胺、果糖胺。特别是D-甘露糖胺、D-葡糖胺、L-半乳糖胺、L-岩藻糖胺。

可以使用更优选自葡糖胺和甘露糖胺组成的组的氨基糖类，最优选自L-岩藻糖胺、D-葡糖胺和D-甘露糖胺组成的组的氨基糖类，特别是D-葡糖胺和D-甘露糖胺。下文将D-甘露糖胺的通式作为D-甘露糖胺与和树脂结合的D-甘露糖胺表示。

D-甘露糖胺偶联到树脂的 D-甘露糖胺

还可以使用带有作为位于分子一部分上的反应基的氨基和凝集素结合部位、特别是该分子另一部分上的MBL结合部位的二糖类、寡糖类和多糖类。

例如，所述的氨基糖可以是任意含有氨基的二糖衍生物，其中二糖的至少一个单糖亚单位选自甘露糖和葡萄糖组成的组。优选二糖类的实例包括含有氨基的蔗糖衍生物、诸如蔗糖胺和麦芽糖衍生物、诸如麦芽糖胺以及琼脂糖胺、纤维素糖胺(cellulosamine)和直链淀粉胺(amylosamine)。优选的二糖衍生物是蔗糖胺。

此外，所述的氨基糖例如可以是葡糖胺的多聚体，诸如葡糖胺二聚体、葡糖胺寡聚体或葡糖胺聚合物。

固相支持体

固相支持体可以是用于俘获和/或分离凝集素的任意支持体。

因此，所述的固相支持体可以是用于分离和纯化的任意的柱、滤器或颗粒，诸如色谱树脂和磁性颗粒。

此外，所述的固相支持体可以是能够例如结合凝集素用于进一步分析的表面，诸如塑料表面和玻璃表面。塑料表面例如可以选自微量滴定板、ELISA孔和活化的微量滴定板组成的组。活化的微量滴定板例如可以是来自Life Technologies的氰尿酰氯活化的CovaLink^TMNH₂伯胺

在本发明的一个实施方案中，任何能够共价结合胺类、优选伯胺类的固相支持体均可以用于本发明。

有用的柱可以是选自N-N-羟基琥珀酰亚胺活化树脂(例如来自APBiotech的NHS-琼脂糖4FF、来自BioRad的Affi-Gel 10、来自BioRad的Affi-Gel 15或来自BioRad的Affi-Prep)、溴化氰活化的树脂(例如来自APBiotech的CNBr-活化的琼脂糖4FF)、来自APBiotech的ECH琼脂糖4B、来自AP-Biotech的活化的CH-琼脂糖4B和环氧(epoxy)活化的树脂(诸如环氧活化的琼脂糖6B)及其相应交联树脂组成的组的任意的柱。

预定浓度的糖衍生物可以与本发明的固相支持体偶联。应按照预定分子量是本发明特定实施方案所需的要求选择糖衍生物的预定浓度。

糖衍生物的浓度由两种因素决定：

1)能够偶联糖衍生物的固相支持体上的位置(配体臂)的浓度；

2)糖衍生物/配体臂的浓度(concentration of sugar derivative per ligandarms)。

在大部分情况下，配体臂/体积固相支持体的浓度由固相支持体的生产方法决定且可以通过使标记的配体与固相支持体偶联来控制该浓度。

通过调节与配体臂偶联的糖衍生物的体积和浓度来调节糖衍生物/配体臂的浓度。

一般来说，当需要相对低的预定分子量时，使用高预定浓度的糖衍生物；而当需要相对高的预定分子量时，使用低预定浓度的糖衍生物。

例如，可以根据与特定量的固相支持体偶联的糖衍生物的量来决定糖衍生物的的预定浓度。例如，当固相支持体是色谱柱树脂时，单糖衍生物的预定浓度优选为0.1mg糖衍生物/ml树脂-1000mg糖衍生物/ml树脂，更优选0.5mg糖衍生物/ml树脂-500mg糖衍生物/ml树脂，甚至更优选2mg糖衍生物/ml树脂-100mg糖衍生物/ml树脂。

在本文的上下文中，固相支持体的标准品是如实施例中所述用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)残基修饰的交联的琼脂糖树脂。优选使用15-25μmol配体臂/ml沥干树脂(drained resin)。认为这类固相支持体特别能够结合5μmol二肽/ml沥干树脂或1-2/μmolα-胰凝乳蛋白酶原/ml沥干树脂。

由这种标准化固相支持体可以得到为从各种凝集素中获得所需的凝集素而与树脂偶联的糖衍生物的预定浓度区间。

使用与预定浓度的糖衍生物偶联的标准柱获得了高于二聚体凝集素分子量的如本文所述分离的高分子量凝集素，其中所述的糖衍生物的预定浓度为10μmol/ml沥干树脂-100/mol/ml沥干树脂，诸如20μmol/ml沥干树脂-80μmol/ml沥干树脂，诸如30μmol/ml沥干树脂-70μmol/ml沥干树脂，诸如40μmol/ml沥干树脂-60//ml沥干树脂。就单糖类而言，所述的浓度相当于2mg/ml沥干树脂-20mg/ml沥干树脂，诸如4mg/ml沥干树脂-16

mg/ml沥干树脂，诸如6mg/ml沥干树脂-14mg/ml沥干树脂，诸如8mg/ml沥干树脂-12mg/ml沥干树脂。

使用与预定浓度的糖衍生物偶联的标准柱获得了高于三聚体凝集素分子量的如本文所述分离的高分子量凝集素，其中所述的糖衍生物的预定浓度为10μmol/ml沥干树脂-80μmol/ml沥干树脂，诸如20μmol/ml沥干树脂-60μmol/ml沥干树脂，诸如40μmol/ml沥干树脂-60μmol/ml沥干树脂。

使用与预定浓度的糖衍生物偶联的标准柱获得了高于四聚体凝集素分子量的如本文所述分离的高分子量凝集素，其中所述的糖衍生物的预定浓度为10μmol/ml沥干树脂-60μmol/ml沥干树脂，诸如20μmol/ml沥干树脂-70μmol/ml沥干树脂，诸如30μmol/ml沥干树脂-60μmol/ml沥干树脂，诸如30μmol/ml沥干树脂-50μmol/ml沥干树脂。

通过使用与预定浓度的糖衍生物偶联的标准柱生产了也能够结合低分子量凝集素、诸如二聚体凝集素的高配体固相支持体，其中所述的糖衍生物的预定浓度高于200μmol/ml沥干树脂，诸如高于300μmol/ml沥干树脂，诸如高于400μmol/ml沥干树脂，诸如高于500μmol/ml沥干树脂。

洗涤液

本发明的洗涤液可以是本领域技术人员所公知的任意合适的洗涤液。特别地，该缓冲液可以包括一种或多种能够干扰凝集素与糖衍生物、诸如氨基糖之间的结合的成分。

在本发明的一个实施方案中，所述的洗涤液包括一种或多种选自能够结合凝集素的糖类、能够结合凝集素的糖衍生物和二价金属离子螯合剂组成的组的成分。

例如，能够结合凝集素的糖类和/或糖衍生物可以是能够结合凝集素的任意单糖和/或单糖衍生物。例如，所述的洗涤液中可以包括用于偶联本发明固相支持体(参见上文)的任意糖衍生物或相应的非衍生的糖或相应的进一步修饰的糖。

例如，这类单糖可以选自甘露糖、N-乙酰基甘露糖胺、葡萄糖、N-乙酰基葡糖胺、岩藻糖、N-乙酰基-岩藻糖胺、半乳糖和N-乙酰基半乳糖胺组成的组。特别地，所述的单糖可以选自D-葡萄糖、D-甘露糖、L-岩藻糖和L-半乳糖组成的组。

能够结合凝集素的糖类和/或糖衍生物还可以是任意的二糖、二糖衍生物、三糖、三糖衍生物、寡糖、寡糖衍生物、多糖或多糖衍生物，其中至少糖的部分能够结合凝集素。有用的寡糖类的实例包括、但不限于蔗糖和麦芽糖。

二价金属离子螯合剂是能够螯合二价金属离子的任意试剂。例如，二价金属离子可以是Ca²⁺。二价金属离子螯合剂的实例包括、但不限于EDTA和柠檬酸盐。

此外，可以按照适合于本领域技术人员所公知的洗脱凝集素的任意其它方式制备洗涤液。例如，该洗涤液可以含有高盐浓度或酸性pH。

凝集素

按照本发明分离的凝集素可以是任意的凝集素。例如，所述的凝集素可以是胶原凝素，诸如：例如MBL(甘露糖结合凝集素)、SP-A(肺表面活性蛋白A)、SP-D(肺表面活性蛋白D)、BK(或BC，牛胶固素)和CL-43(胶原凝素-43)。胶原凝素均显示出下列结构：它们带有看起来用于形成链间二硫键的N-末端富含半胱氨酸的区、紧随的是胶原样区、即α-螺旋卷曲螺旋区且最后是属于模式识别区且称作糖识别域(CRD)的C-型凝集素结构域。胶原凝素的名来源于存在的胶原蛋白和凝集素结构域。α-螺旋卷曲螺旋区启动各多肽的三聚化而形成胶原蛋白三股螺旋，由此产生各自由3个独立多肽组成的胶原凝素亚单位，而N-末端区介导形成亚单位寡聚体。不同的胶原凝素表现出独特的高级有序结构，一般为亚单位的四聚体或亚单位的六聚体。

在本发明的优选实施方案中，所述的凝集素是MBL或ficolin；在更优选的实施方案中，所述的凝集素是MBL。

术语凝集素可以是天然出现的凝集素及其变体，诸如突变体，所述的突变体能够结合糖。

本发明特别适合于分离MBL，在下文作为本发明的实施例更充分地讨论，但不作为限定本发明的范围。

本发明的凝集素可以含有一个或多个亚单位。特别地，诸如MBL这样的胶原凝素可以含有一个或多个亚单位且胶原凝素的每个亚单位一般由3个独立的多肽组成。例如，诸如MBL这样的胶原凝素可以是亚单位的单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体、十一聚体、十二聚体或诸如MBL这样的胶原凝素甚至可以含有12个以上的亚单位。

组合物

可以使用任意合适的方法计算本文所述的比值R。在优选的实施方案中，可以如下对样品的R值进行定量估计：

将SDS-PAGE免疫印迹扫描成TIFF文件或另一种不可压缩的位图文件。用图像评价程序、诸如Windows 4.0下应用的Scion Image(ScionCorporation，在www.scioncorp.com上下载的β版免费软件)测定沿样品带的像素密度并输出至数据评价程序(如Excel)。

根据标记的移动确定相当于预定分子量的移动。在优选的实施方案中，预定的分子量是二聚化凝集素的分子量(就MBL而言约为200kDa)且由此可以根据标记(例如Precision Protein Standards，BioRad)的移动确定相当于二聚化凝集素的移动。将高于参比移动点(就二聚化MBL而言为200kDa)的总像素信号除以低于参比移动点(就二聚化MBL而言为200kDa)的总像素信号计算R值。将R₀定义为原料的比值，而R₁是在实施本发明方法后回收的凝集素样品在整个相应评价过程中的比值。

比值R的增加程度取决于具有R₀比值的原料，即是凝集素制品的原料，例如MBL制品。优选组合物中至少50％的高分子量凝集素具有高于二聚体凝集素分子量的分子量，优选具有高于三聚体凝集素分子量的分子量。当所述的凝集素是MBL时，由此优选组合物中至少50％的高分子量MBL具有高于200kDa、诸如高于225kDa、诸如高于250kDa、诸如高于300kDa的分子量。

通过生产本发明的MBL组合物，优选该MBL组合物基本上不含它在天然宿主生物体中产生时任何天然与MBL结合的杂质，例如不含当MBL纯化自血浆MBL时与MBL结合的杂质。

该方法可以用于从任何MBL来源、诸如任何哺乳动物重组MBL或由血浆生产高分子量MBL组合物。然而，MBL来源优选是重组MBL，更优选组合物中的MBL来源于人，诸如MBL，其中MBL亚单位由含有如PCT申请WO 00/70043中SEQ ID NO：1所示的序列的三个肽序列或其功能等价物装配而成。

重组生产

尽管所述方法可以用于含有低分子量和高分子量凝集素的任何凝集素原料，诸如MBL，但是该方法特别适合于由重组产生的制品生产高分子量凝集素，诸如MBL。

因此，所述的MBL制品优选是重组制品，其中MBL制品通过下列步骤得到：

-制备编码人MBL肽或其功能等价物的基因表达构建体；

-用该构建体转化宿主细胞培养物；

-在培养基中培养所述的宿主细胞培养物，由此得到表达和分泌入培养基的多肽；

-获得包括各种MBL分子的制品。

按照本发明，来自MBL基因的序列可以来自人MBL基因或来自免疫系统在这方面起类似于人免疫系统的作用的其它动物种类的MBL基因。本发明重组MBL制品的优选实施方案实例描述在PCT申请WO 00/70043的实施例1中，将该文献引入本文作为参考。在该实施例中，通过使用含有来自人MBL基因的序列的表达载体制备重组MBL。

本发明还涉及含有属于人MBL基因序列的功能衍生物的序列的表达载体的应用。所谓所述的功能衍生物指的是含有碱基对改变的序列，而这些碱基对的改变不会使所述表达载体产生功能差异或基本上不会使所述表达载体产生功能差异且按照这种方式制备的MBL与通过使用含有来自人MBL基因的未改变序列的表达载体制备的MBL具有相差无几的功能性。

除纯化方法外，优选所述的基因表达构建体和宿主细胞也有利于生产高级寡聚体。因此，所述的基因表达构建体优选含有至少一种来自人MBL基因的内含子序列或其功能等价物。此外，所述的基因表达构建体可以含有至少两种来自人MBL基因的外显子序列或其功能等价物。更优选所述的基因表达构建体含有至少三种来自人MBL基因的外显子序列或其功能等价物。当含有一种以上外显子时，该外显子序列优选如在人MBL基因中的排列方式排列。

尽管优选所述序列含有内含子序列，但是就某些应用而言，便利的是所述的表达构建体含有编码MBL亚单位的cDNA序列或其功能等价物。

本发明的特征在于MBL基因表达构建体而非MBL cDNA构建体在哺乳动物细胞系或转基因动物中表达rMBL以便获得具有在基本上与天然人MBL类似的非变性和变性条件下的结构特性的重组MBL中的应用。所谓″重组人MBL″指的是由工程核酸表达的人MBL且所谓″MBL基因表达构建体″指的是适合于在哺乳动物细胞系中表达并含有来自人MBL基因或来自其它动物种类的MBL基因的外显子序列和至少一种内含子序列的表达载体，其中所述的其它动物种类诸如、但不限于黑猩猩和猕猴。

优选所述的DNA序列编码如专利申请WO 00/70043的SEQ ID NO：1中所示的多肽序列或功能等价物，其中功能等价物如上述所定义。SEQ IDNO：1相当于具有数据库登记号NO：P11226的MBL序列。通过下列步骤可以得到所述的等价物：修饰如SEQ ID NO：1所示的肽序列，诸如将相应特性加工成本发明中所述序列的序列，而其中一个或多个氨基酸已经被其它氨基酸取代。优选功能等价物含有保守取代，即其中一个或多个氨基酸被具有相似特性的氨基酸取代，使得蛋白质化学领域的普通技术人员可以预计未改变的蛋白质的二级结构和三级结构。适合于保守取代的氨基酸包括那些具有功能相似侧链的氨基酸。例如：例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸这样的疏水残基可以取代另一种这类残基。类似地，保守取代可以包括：互换亲水残基(例如：精氨酸和赖氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；苏氨酸和丝氨酸)；碱性残基(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)；和/或酸性残基(例如天冬氨酸和谷氨酸)。或者，还可以或可选地通过缺失或添加氨基酸或对氨基酸进行化学修饰来修饰功能等价物，条件是多肽的功能得到保护。

在一个实施方案中，分离的MBL肽、包括其任何功能等价物可以含有至少80个氨基酸残基、诸如至少100个氨基酸残基、诸如至少150个氨基酸残基、诸如至少200个氨基酸残基、例如至少220个氨基酸残基、诸如至少250个氨基酸残基。

在优选的实施方案中，所述的表达载体适合于在哺乳动物细胞系或在含有来自人MBL基因或来自其它动物种类的MBL基因的外显子序列和至少一种内含子序列的转基因动物中表达，其中所述的其它动物种类诸如、但不限于黑猩猩和猕猴。在一个实施方案中，在转基因动物中培养所述的宿主细胞培养物。在本文的上下文中，所谓转基因动物指的是已经遗传修饰而含有和表达人MBL基因或其片段或其模拟物的动物。

在优选的实施方案中，本发明的表达构建体含有基于病毒的载体，诸如基于DNA病毒的载体、基于RNA病毒的载体或基于嵌合病毒的载体。DNA病毒的实例是巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、猿猴病毒40、牛乳头瘤病毒、腺伴随病毒、腺病毒、痘苗病毒和杆状病毒。

在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基于病毒的表达系统。

在将腺病毒用作表达载体的情况中，可以使本发明的核酸分子与腺病毒转录/翻译控制复合体、例如晚期启动子和三联前导序列连接。然后可以通过体外或体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组。插入病毒基因组的非必需区(例如E1或E3区)会产生存活的且能够在感染宿主中表达MASP-3基因产物的重组病毒(例如，参见Logan和Shenk，《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：3655-3659，1984)。还需要特定的起始信号来有效翻译插入的核酸分子。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在将完整基因或cDNA、包括其拥有的起始密码子和相邻序列插入适宜的表达载体的情况中，可以不需要其它翻译控制信号。然而，在仅插入部分编码序列的情况中，必须提供外源性翻译控制信号，包括、可能是ATG起始密码子。此外，该起始密码子必须与所需编码序列的读框协调以确保完整插入片段的翻译。这些外源性翻译控制信号和起始密码子可以具有不同来源，既可以是天然的、也可以是合成的。可以通过包含适宜的转录增强子元件、转录终止子等来提高表达功效(参见Bittner等，《酶学方法》(Methods in Enzymol.)153：516-544，1987)。

RNA病毒的实例是泽姆利基森林病毒、新培斯病毒、Poko virus、狂犬病毒、流感病毒、SV5、呼吸道合胞病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、Kunjin virus、仙台病毒、疱疹性口腔炎病毒和反录病毒。

嵌合病毒的实例是腺病毒、新培斯病毒和腺病毒-腺伴随病毒。

有关特异性载体参照Makrides，S.C.的“用于哺乳动物细胞中基因转移和表达的载体成分”(″Components of vectors for Gene Transfer and Expressionin Mammalian Cells″)，将该文献引入本文作为参考。

特别使用EB病毒来源的复制或功能衍生物或其模拟物，包括pREP9载体。

本发明在一个方面中提供了编码人MBL的表达构建体，其特征在于含有来自人MBL基因的一种或多种内含子序列、包括其功能衍生物。另外，它含有选自病毒或真核细胞基因、包括哺乳动物和昆虫基因的启动子区。

优选将启动子区选择为不同于人MBL启动子且优选为了使MBL产率和MBL寡聚体的大小分布最优化，选择与所述载体和宿主细胞起最优化作用的启动子区。

在优选的实施方案中，所述的启动子区选自包括劳斯肉瘤病毒长末端重复启动子和巨细胞病毒立即早期启动子和延伸因子-1α启动子在内的组。

在另一个实施方案中，所述的启动子区选自微生物、诸如其它病毒、酵母和细菌的基因。

为了获得较高产率的重组MBL，所述的启动子区可以含有增强子元件，诸如小鼠血管内皮生长因子基因的5′末端未翻译区的QBI SP163元件。该构建体用于转化宿主细胞以获得能够表达MBL的宿主细胞培养物。该宿主细胞培养物优选是真核宿主细胞培养物。在本文的上下文中所谓转化真核细胞指的是将重组DNA导入细胞。该过程中所用的表达构建体的特征在于具有选自哺乳动物基因、包括人基因和与诸如来自黑猩猩的基因极其类似的基因的MBL编码区。所用表达构建体的特征还在于启动子区选自病毒或真核细胞、包括哺乳动物细胞和来自昆虫的细胞的基因。

本发明用于生产重组MBL的方法的特征在于宿主细胞培养物优选是真核细胞且例如是哺乳动物细胞培养物。优选的宿主细胞培养物是人肾细胞培养物，且甚至在更优选的形式中，所述的宿主细胞培养物是人胚胎肾细胞(HEK细胞)培养物。本发明的特征在于HEK 293细胞系在生产重组人MBL中的应用。所谓″HEK 293细胞系″指的是来源于人胚胎肾组织的任何细胞系，诸如、但不限于寄存在美国模式培养物保藏所(American TypeCulture Collection)并给予寄存号CRL-1573和CRL-10852的细胞系。

其它细胞可以是鸡胚胎成纤维细胞、仓鼠卵巢细胞、幼仓鼠的肾细胞、人宫颈癌细胞、人黑素瘤细胞、人肾细胞、人脐血管内皮细胞、人脑内皮细胞、人口腔肿瘤细胞、猴肾细胞、小鼠成纤维细胞、小鼠肾细胞、小鼠结缔组织细胞、小鼠少突神经胶质细胞、小鼠巨噬细胞、小鼠成纤维细胞、小鼠成神经细胞瘤细胞、小鼠前-B细胞、小鼠B淋巴瘤细胞、小鼠浆细胞瘤细胞、小鼠畸胎癌细胞、大鼠星形胶质瘤细胞、大鼠哺乳动物上皮细胞、COS、CHO、BHK、293、VERO、海拉细胞、MDCK、WI38和NIH 3T3细胞。

此外，可以选择调节插入序列表达或以所需的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞品系。蛋白质产物的这类修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)对该蛋白质的功能而言是重要的。不同的宿主细胞具有翻译后加工和修饰蛋白质和基因产物的特性和特定机制。可以选择适宜的细胞系或宿主系统以便确保对所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为了这一目的，可以使用具有适当加工基因产物的初级转录物、糖基化和磷酸化的细胞器的真核宿主细胞。上述那些哺乳动物细胞类型可以用作合适的宿主细胞。

可以在任何合适的培养基中培养宿主细胞培养物。培养基的实例是例如补充了如胰岛素、运铁蛋白、硒和胎牛血清的RPMI-1640或DMEM。

纯化

如上所述，本发明可以快速生产MBL。可以通过下列步骤生产MBL：

发酵-培养表达MBL的细胞

分离-施用本发明的方法

因此，可以通过任意合适的方式在分离前施用本发明的方法或随后按照本发明分离对凝集素组合物进行进一步纯化。例如，可以通过任何物理-化学分离方法进一步纯化所述的凝集素组合物，包括、但不限于：过滤法；沉淀法；色谱法；诸如基于电荷的离子交换；基于大小的凝胶渗透；基于疏水性的疏水作用；或亲和色谱法。

此外，在一次分离步骤中使用一次以上本发明的方法是可能的。特别地，可以在分离步骤中使用本发明的两种或多种不同方法，其中所述方法的差异在于选择的固相支持体、选择的糖衍生物和/或选择的与所述固相支持体偶联的糖衍生物的预定浓度。

例如，能够首先使用与第一种预定浓度的糖衍生物偶联的固相支持体进行凝集素分离且然后使用与第二种预定浓度的糖衍生物偶联的固相支持体分离凝集素，其中第一种预定浓度可以高于或低于第二种预定浓度。

特别当分离中间分子量的凝集素时，可以使用应用至少两种具有不同糖衍生物浓度的不同固相支持体的两步分离法。在一个两步分离法的实例中，在污染级分、即具有分子量低于第一步中预定分子量的未结合级分中得到了所需的凝集素，例如任何低于七聚体的凝集素。在第二步中，将未结合的级分施加在相对于预定分子量而言具有另一个截断点的不同固相支持体上，例如结合高于二聚体分子量的任何凝集素。由此在洗脱与第二种固相支持体结合的凝集素时，获得了所需的三聚体、四聚体、五聚体和六聚体的中间分子量的组合物。当然可以以相反的顺序实施所述的两个步骤而获得相同的组合物，这对本领域技术人员而言是显而易见的。

功能性

按照本发明获得的重组MBL组合物的功能性优选与血浆或血清MBL的功能性类似。在本文的上下文中，MBL的功能性指的是激活如上所述与功能等价物相关的补体系统的能力。将功能性表示为MBL的特异性活性，诸如MBL的活性单位/ng MBL。表示为特异性活性的重组MBL组合物的功能性优选至少为纯化自血清的MBL的特异性活性的25％，诸如至少为纯化自血清的MBL的特异性活性的50％，更优选至少为纯化自血清的MBL的特异性活性的75％。

可以通过MBL形成使补体系统活化的MBL/MASP复合体的能力来评价其功能性。当MBL/MASP裂解C4时，活性硫羟酸酯暴露且C4与邻近的亲核基团共价结合。C4b的主要部分由此与包被的塑料孔充分结合且可以用抗-C4抗体检测。

通过下列步骤构建用于MBL功能活性的定量TRIFMA：1)用溶于100ml缓冲液的1mg甘露聚糖包被微量滴定孔；2)用Tween-20封闭；3)施加测试样品，例如稀释的MBL制品；4)施加MBL缺乏血清(该步骤导致形成MBL/MASP复合体)；也可以在施用至微量滴定孔前混合MBL和MBL缺乏血清；5)以5mg/ml施加纯化的补体因子C4；6)在37℃下保温1小时；7)施加Eu-标记的抗-C4抗体；8)施加增强溶液；和9)通过时间分辨荧光测定法读取Eu。在每一步骤之间在室温下保温并洗涤平板，但在步骤8与9之间不实施该步骤。

例如，类似地可以通过在步骤7中应用生物素标记的抗-C4、8)施加碱性磷酸酶-标记的抗生物素蛋白、9)施加底物和10)读取色强度而使用ELISA进行估计。可以使用一种选择的正常血浆的稀释液构建校准曲线。涉及本发明的下列血清是有用血清的实例：血浆库LJ 6.5728/04/97。可以将功能性表示为MBL的特异性活性，诸如MBL的活性单位/ng MBL。

另一种用于测定MBL功能等价物的试验是测定与细胞上的受体/多种受体结合的能力。

可以通过细胞荧光测定术分析MBL与细胞上的受体/多种受体的相互作用。1)将浓度为50μg/ml的MBL与2×10⁵个细胞一起温育。结合在含有1％FCS和0.1％叠氮化钠的磷酸缓冲盐水溶液(PBS)中进行。2)为了检测细胞结合的MBL，施用生物素化的抗-MBL抗体；3)随后添加链霉抗生物素-FITC；和4)通过荧光测定法分析该混合物。

需要本发明化合物治疗的所述疾病、疾患和/或情况包括：例如MBL缺乏的疾病的治疗；与免疫抑制剂化疗相关的癌症和感染的治疗，特别包括那些与癌症治疗过程中的情况相关或与器官植入和/或移植相关的感染的治疗。本发明还包括与再发性流产相关的疾病的治疗方法。

因此，所述的药物组合物可以特别用于治疗和/或预防临床疾病，这些疾病选自：感染；MBL缺乏；癌症；与化疗相关的疾病，诸如感染；与人免疫缺陷病毒(HIV)相关的疾病；与先天性或获得性免疫缺陷相关的疾病。更具体的说有下列疾病：慢性炎性脱髓鞘性多神经病变(CIDP)；多灶性运动神经病；多发性硬化；重症肌无力；伊-朗综合征；视神经炎；癫痫；原发性抗磷脂综合征；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮；全身性硬皮病；脉管炎；韦格纳肉芽肿病；斯耶格伦综合征；青少年类风湿性关节炎；自身免疫性中性白细胞减少；自身免疫性溶血性贫血；中性白细胞减少；克罗恩病；溃疡性结肠炎；腹部疾病；哮喘；脓毒性休克综合征、慢性疲劳综合征；银屑病；中毒性休克综合征；糖尿病；窦炎；扩张型心肌病；心内膜炎；动脉粥样硬化；原发性血内丙种球蛋白过少/原发性无丙种球蛋白血症，包括普通可变免疫缺陷症、威-奥综合征和重度联合免疫缺(SCID)；患有慢性淋巴性白血病(CLL)和多发性骨髓瘤的患者的继发性血内丙种球蛋白过少/原发性无丙种球蛋白血症；急性和慢性特发性血小板减少性紫癜(ITP)；异基因骨髓移植(BTM)；川崎病；和格-巴综合征。

给药途径可以是任何适宜的途径，诸如静脉内、肌内、皮下或经皮。此外，本发明关注肺部或局部给药。

可以特别给予MBL组合物以预防和/或治疗具有与先天性或获得性MBL缺乏相关的临床症状或处于发生这类症状危险中的患者的感染。各种情况可以导致对MBL-缺乏个体的易感性增加，诸如化疗或其它治疗细胞的毒性疗法、癌症、AIDS、遗传分布、慢性感染和中性白细胞减少。

看起来用化疗治疗的癌症患者通常因针对免疫系统细胞的药物方案的不良反应而导致对感染易感，这是在治疗这种疾病的过程中使用MBL疗法的背景。所观察到的MBL的低血浆浓度(低于500ng/ml)表示对临床上明显的感染的易感性增加且可以通过给予重组或天然血浆衍生的MBL来加强这些患者的免疫防御。

由此可以在开始给予疗法等前且至少在部分化疗过程中将所述的药物组合物给予一定期限。

可以在化疗前作为一般的″加强剂″给予MBL组合物或可以对那些仅处于发生MBL缺乏危险中的患者给予MBL组合物。可以通过测定治疗前的MBL水平且仅使那些进行MBL水平低于预定水平的患者进行治疗来确定处于危险中的患者群。对大部分组而言，将测定低MBL水平的极限估计为低于500ng/ml。可以通过如实施例9中所述的时间分辨免疫荧光测定法、ELISA、RIA或浊度测定法来测定MBL水平。

给予MBL的另一种适应征是在当MBL水平低于50％的正常水平、诸如低于300ng/ml或低于200ng/ml时出现的适应征。

以合适的剂量方案给予MBL组合物，特别是通常在适宜的间隔给予MBL组合物，例如在化疗过程中每周给予一次或两次。

正常的每次给药剂量为1-100mg，诸如2-10mg，大部分情况下的每次剂量为5-10mg。在大部分情况下给予约0.1mg/kg体重。

因此，本发明在一个方面中涉及MBL、包括rMBL、其片段或模拟物在治疗癌症和例如免疫系统和生殖系统疾病和疾患中的应用，所述的治疗由产生、重建、提高和/或刺激补体系统的调理和/或杀菌活性组成，即提高免疫防御识别和杀伤微生物病原体的能力。

此外，本发明的一个方面是本发明的重组组合物在由组成部分组成的进一步包括另一种药物的试剂盒中的应用。特别地，所述的另一种药物可以是抗菌药，诸如抗生素。

据报导由于与流产相关，所以增加患者中低血浆浓度MBL的给药频率，否则就无法解释再发性流产，这是通过在这些病例中经给予重组MBL重建MBL水平而降低对流产易感性的背景。

就本发明化合物的性质而言，看起来本发明在其广泛方面涉及能够起调理素作用的化合物，即能够通过所述化合物与巨噬细胞之间的直接相互作用或通过介导靶表面上的补体沉积而促进巨噬细胞吸收的化合物。其具体的实例是MBL、其片段或其模拟物。本发明基于所公开的重组人MBL的合成方法，其中看起来所述的重组人MBL比过去获得的更接近天然人MBL的结构。

现在已经足够具体地说明和解释了本发明的各个方面，而下面的优选实施方案的非限制性实施例是对本发明进一步解释。

实施例

实施例1：

使用固定化氨基糖纯化MBL

MBL由人细胞系、如WO 00/70043中所述的包括编码MBL的表达构建体的基于HEK293的细胞系在基于HyQ的培养基(HyClone)中以重组方式产生且随后通过亲和色谱法、使用固定化氨基糖纯化MBL。

通过使1.0g的D-甘露糖胺(ICNBiomedicals，Cat.no.102252)与13.5mL悬浮的NHS-活化的琼脂糖FF(Amersham Biosciences，Cat.no.17-0906-02)偶联来制备D-甘露糖胺柱。

偶联条件确切地如供应商对NHS-活化的凝胶的说明书中所述：首先，用冰冷的1mM HCl洗涤树脂。随后在4℃下将该树脂与氨基糖(100mg/mLD-甘露糖胺、10mM NaH₂PO₄，pH＝7.0)一起保温过夜。第二天用乙醇胺缓冲液(100mM，pH 7.0)封闭树脂并填充入HR10/10柱。最终用稀(weak)Tris缓冲液(pH 7.4)将该柱平衡3次，而在另一种可选的方式中使用稀乙酸盐缓冲液(pH＝3.1)。

将1升细胞培养物加到柱上并使用含有EDTA的缓冲液洗脱。

始终进行的对相应上柱的MBL特异性免疫测定和洗脱的主要峰显示在洗脱的主要峰中几乎完全地发现了MBL(附图1)。通过色谱技术、诸如使用琼脂糖6(来自Amersham Biosciences的预填充HR 10/30)的大小排阻色谱法或还原后的MALDI-MS研究易于对MBL含量进行验证。

实施例2：

使用固定化氨基糖纯化选择的MBL的大小级分

可以通过调整氨基糖配体的浓度而得到凝集素寡聚体的选择级分。

通过使0.1g的D-甘露糖胺(Sigma，Cat.no.M4670)与12.5mL悬浮的NHS-活化的琼脂糖FF(Amersham Biosciences，Cat.no.17-0906-02)偶联来制备具有相对低配体浓度的树脂。

通过使1.0g的D-甘露糖胺(Sigma，Cat.no.M4670)与12.5mL悬浮的NHS-活化的琼脂糖FF(Amersham Biosciences，Cat.no.17-0906-02)偶联来制备具有相对高配体浓度的类似树脂。

通过在与12.5mL悬浮的NHS-活化的琼脂糖FF(Amersham Biosciences，Cat.no.17-0906-02)偶联的过程中使用不含氨基糖的偶联缓冲液来制备不含配体的′假拟(dummy)′柱。

在所有情况中，偶联条件确切地如供应商对NHS-活化的凝胶的说明书中所述。将1升的细胞培养物肉汤(如实施例1中所述制备)加到每个柱上并使用含有EDTA的缓冲液洗脱。始终进行的对相应上柱的MBL特异性免疫测定和洗脱的主要峰显示在从具有高配体浓度的柱(′high-sub′柱)上洗脱的主要峰中几乎完全地发现了MBL。

在从具有低配体浓度的柱(′low-sub′柱)上洗脱的主要峰中发现了选择的MBL高分子量级分且在自始至终的级分中均观察到了剩余的MBL。在′假拟′柱上自始至终的级分中均发现了所有的MBL，这一结果表明MBL亲和性是配体特异性的(附图2)。

实施例3：

使用一系列含有固定化氨基糖的柱纯化选择的MBL的大小级分

通过使用一系列具有不同配体浓度的柱得到凝集素寡聚体的具体级分。

将1升的细胞培养物肉汤(如实施例1中所述制备)连续加到两个柱上：第一个柱是具有低氨基糖配体浓度的柱(如实施例2中所述的′low-sub′柱)，而第二个柱是具有高氨基糖配体浓度的柱(如实施例2中所述的′high-sub′柱)。

在′high-sub′柱上俘获来自′low-sub′柱上的自始至终的级分(run-throughfraction)。然后用EDTA缓冲液(50mM，pH 7.4)洗脱每个柱。来自′low-sub′柱的洗脱级分含有高分子量大小的MBL，它具有的平均大小分布高于原始上柱物(application)。来自′high-sub′柱的洗脱级分含有具有低于′low sub′柱洗脱液分子量的MBL级分，但不含低分子量大小的MBL，如单体MBL或二聚化MBL。

实施例4：

使用固定化氨基糖纯化血浆来源的MBL

可以使用固定化氨基糖纯化来自血浆的凝集素。

如实施例1中所述制备D-甘露糖胺柱。半升血浆获自血库且在加入CaCl₂后通过轻度加热使其凝固。将得到的血清加到柱上并在短暂洗涤后用含有EDTA的缓冲液洗脱蛋白质。对始终进行的相应上柱的MBL特异性免疫测定和洗脱的主要峰显示在从该柱上洗脱的主要峰中几乎完全地发现了MBL。

通过色谱技术、诸如使用琼脂糖6(来自Amersham Biosciences的预填充HR 10/30)的大小排阻色谱法、使用MonoQ(来自APBiotech的HR 5/5)的阴离子交换色谱法或MBL ELISA(Statens Serum Institute，Copenhagen)易于对MBL含量进行验证。

实施例5：

使用固定化氨基糖而非D-甘露糖胺纯化MBL

固定化D-甘露糖胺可以与在通过NH₂基固定后能够结合凝集素的任意氨基糖交换。观察到了配体浓度的相同作用。

通过使0.1g的D-葡糖胺(Sigma，Cat.no.G4875)与12.5mL悬浮的NHS-活化的琼脂糖FF(Amersham Biosciences，Cat.no.17-0906-02)偶联来制备具有相对低配体浓度的树脂。通过使1.0g的D-葡糖胺(Sigma，Cat.no.G4875)与12.5mL悬浮的NHS-活化的琼脂糖FF(Amersham Biosciences，Cat.no.17-0906-02)偶联来制备具有相对高配体浓度的类似树脂。在两种情况中，偶联条件确切地如供应商对NHS-活化的凝胶的说明书中所述。

将1升的细胞培养物肉汤(如实施例1中所述制备)加到每个柱上并使用含有EDTA的缓冲液洗脱。

对始终进行的相应上柱的MBL特异性免疫测定和洗脱的主要峰显示在从具有高配体浓度的柱(′high-sub′柱)上洗脱的主要峰中几乎完全地发现了MBL(附图3)。

实施例6：

使用固定化氨基糖进行的大规模凝集素纯化

易于将亲和色谱法按比例放大10倍。

通过使5.0g的D-葡糖胺(Sigma，Cat.no.G4875)与100mL悬浮的NHS-活化的琼脂糖FF(Amersham Biosciences，Cat.no.17-0906-02)偶联来制备大D-葡糖胺柱。偶联条件确切地如供应商对NHS-活化的凝胶的说明书中所述。将10升含有重组产生的MBL的细胞培养物肉汤加到该柱上并使用含有EDTA的缓冲液洗脱。

对始终进行的相应上柱的MBL特异性免疫测定和洗脱的主要峰显示在主要峰中几乎完全地发现了MBL。通过色谱技术、诸如使用琼脂糖6(来自Amersham Biosciences的预填充HR 10/30)的大小排阻色谱法、使用MonoQ(来自APBiotech的HR 5/5)的阴离子交换色谱法、SDS-PAGE与使用Hyb131-01(Statens Serum Institute)的蛋白质印迹、MBL特异性ELISA′s(Statens Serum Institute)、氨基酸组合物分析和还原后的MALDI-MS研究易于对MBL含量进行验证。

实施例7：

使用固定化氨基糖对凝集素的检测

可以将氨基糖固定在微量滴定孔中并用于检测凝集素。

通过如供应商所述将所述孔与1.0μg氨基糖/孔一起保温过夜使D-葡糖胺与微量滴定孔(来自Life Technologies的氰尿酰氯活化的CovaLink NH₂)偶联。将含有MBL的样品稀释液加入到各孔中并在室温下保温3小时。随后在室温下施用检测抗体、如Hyb131-01(Statens Serum Institute)3小时，随后与HRP-或AP-标记的二次抗体(抗-IgG，Dako)一起保温1小时。在加入酶底物后，用ELISA读出器估计MBL的量。

Claims

1.从包括各种凝集素分子的制品中分离至少一种甘露糖结合凝集素的方法，该方法包括下列步骤：

-建立用至少一种带有伯氨基的氨基糖衍生的固相支持体；

-将所述制品施加在所述固相支持体上；

-使所述凝集素结合与所述固相支持体偶联的氨基糖；

-用洗涤液洗涤所述的固相支持体以除去未结合的污染物；和

-任选从所述固相支持体上回收所述凝集素。

2.权利要求1所述的方法，其中所述的氨基糖选自半乳糖胺、甘露糖胺、葡糖胺、阿洛糖胺、阿卓糖胺、核糖胺、阿拉伯糖胺、古洛糖胺、艾杜糖胺、岩藻糖胺、塔罗糖胺、木糖胺、来苏糖胺、山梨糖胺、塔格糖胺、阿洛酮糖胺和果糖胺组成的组。

3.权利要求1所述的方法，其中所述的氨基糖选自D-甘露糖胺、D-葡糖胺、D-阿洛糖胺、D-阿卓糖胺、D-核糖胺、D-阿拉伯糖胺、L-古洛糖胺、L-艾杜糖胺、L-半乳糖胺、L-岩藻糖胺、L-塔罗糖胺、L-木糖胺和L-来苏糖胺组成的组。

4.权利要求1所述的方法，其中所述的氨基糖选自D-甘露糖胺和D-葡糖胺组成的组。

5.权利要求1所述的方法，其中从所述的固相支持体上回收凝集素。

6.权利要求5所述的方法，其中凝集素是以纯的形式回收的。

7.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中从所述的固相支持体选自色谱柱、色谱树脂、滤器、塑料表面、玻璃表面和磁性颗粒。

8.权利要求7所述的方法，其中所述的柱选自N-羟基琥珀酰亚胺活化的树脂、溴化氰活化的树脂、环氧活化的树脂、来自Amersham Biosciences的ECH琼脂糖4B和来自Amersham Biosciences的活化的CH-琼脂糖4B。

9.权利要求7所述的方法，其中所述的塑料表面是活化的微量滴定板。

10.权利要求1所述的方法，其中所述的洗涤液包括一种或多种成分，它们选自能够结合所述凝集素的糖类、能够结合所述凝集素的糖衍生物和二价金属离子螯合剂组成的组。

11.权利要求10所述的方法，其中所述的糖选自甘露糖、甘露糖胺、N-乙酰基甘露糖胺、葡萄糖、葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺、果糖、果糖胺、N-乙酰基果糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、蔗糖和麦芽糖组成的组。

12.增加包括各种凝集素分子的组合物中比值R的方法，其中R是具有高于预定分子量的高分子量的凝集素分子浓度与具有低于或等于预定分子量的低分子量的凝集素分子浓度之比，所述的方法包括下列步骤：

对该制品施用如权利要求1-11中任意一项所述的分离方法；

获得包括回收的凝集素分子的组合物。

13.包括各种凝集素分子的组合物的生产方法，其中所有所述的凝集素分子均具有高于二聚体凝集素预定的分子量的分子量，所述的方法包括下列步骤：

获得包括具有高于预定分子量的高分子量的凝集素分子和具有低于或等于预定分子量的低分子量的凝集素分子的凝集素制品，所述的制品具有比值R＝R₀，其中R是具有高于预定分子量的高分子量的凝集素分子浓度与具有低于或等于预定分子量的低分子量的凝集素分子浓度之比；

对该制品施用如权利要求1-11中任意一项所述的分离方法；

获得包括回收的凝集素分子的组合物。

14.从凝集素制品中分离包括各种凝集素分子的组合物的方法，其中所有所述的凝集素分子均具有高于预定分子量的高分子量，所述的凝集素制品包括具有高于二聚体凝集素预定分子量的高分子量的凝集素分子和具有低于或等于二聚体凝集素的分子量的低分子量的凝集素分子，所述的制品具有比值R＝R₀，其中R是具有高于预定分子量的高分子量的凝集素分子浓度与具有低于或等于预定分子量的低分子量的凝集素分子浓度之比；所述的方法包括下列步骤：

获得所述的凝集素制品；

对该制品施用如权利要求1-11中任意一项所述的分离方法；

获得包括回收的凝集素分子的组合物。

15.包括各种凝集素分子的组合物的生产方法，其中所有所述的凝集素分子均具有低于或等于预定分子量的低分子量，所述的方法包括下列步骤：

获得凝集素制品，该制品包括具有高于预定分子量的高分子量的凝集素分子和具有低于或等于预定分子量的低分子量的凝集素分子，所述的制品具有比值R＝R₀，其中R是具有高于预定分子量的高分子量的凝集素分子浓度与具有低于或等于预定分子量的分子量的凝集素分子浓度之比；

对该制品施用如权利要求1-11中任意一项所述的分离方法；

获得包括洗涤液中未结合的凝集素分子的组合物。

16.增加包括各种凝集素分子的制品的比值R的方法，其中R是具有中间分子量的凝集素浓度与具有高分子量和低分子量的凝集素分子浓度之比，其中中间分子量是低于第一种预定的分子量而高于第二种预定的分子量的分子量，高分子量是高于或等于第一种预定分子量的分子量且低分子量是低于或等于第二种预定分子量的分子量，所述的方法包括下列步骤：

a)获得包括低分子量凝集素、中间分子量凝集素和高分子量凝集素的凝集素制品，所述的制品具有比值R＝R₀；和

b)对该制品施用如权利要求1-11中任意一项所述的分离方法；和

c)获得包括回收的凝集素分子的组合物；和

d)任选重复步骤b)。

17.权利要求12-16中任意一项所述的方法，其中所述的凝集素是甘露糖结合凝集素(MBL)。

18.权利要求16所述的方法，其中所述组合物中至少50％的高分子量MBL具有高于200kDa的分子量。

19.权利要求16所述的方法，其中所述的低分子量MBL包括具有低于200kDa分子量的MBL。

20.权利要求1所述的方法，其中所述的MBL制品是重组MBL制品。

21.权利要求20所述的方法，其中所述的MBL制品通过下列步骤得到：

-制备编码人MBL肽的基因表达构建体；

-用该构建体转化宿主细胞培养物；

-获得包括各种MBL分子的制品。

22.权利要求21所述的方法，其中所述的基因表达构建体含有至少一种来自人MBL基因的内含子序列。

23.权利要求22所述的方法，其中所述的基因表达构建体含有至少两种来自人MBL基因的外显子序列。

24.权利要求21所述的方法，其中所述的基因表达构建体含有编码MBL亚单位的cDNA序列。

25.权利要求21所述的方法，其中在体外培养所述的宿主细胞培养物。

26.权利要求21所述的方法，其中所述的宿主细胞培养物是真核宿主细胞培养物。

27.权利要求21所述的方法，其中所述的宿主细胞培养物是哺乳动物宿主细胞培养物。

28.固相支持体，其中所述的固相支持体与预定浓度的至少一种带有伯氨基的氨基糖共价偶联。

29.权利要求28所述的固相支持体，其中所述的氨基糖选自半乳糖胺、岩藻糖胺、甘露糖胺、葡糖胺、阿洛糖胺、阿卓糖胺、核糖胺、阿拉伯糖胺、古洛糖胺、艾杜糖胺、半乳糖胺、塔罗糖胺、木糖胺、来苏糖胺、山梨糖胺、塔格糖胺、阿洛酮糖胺和果糖胺组成的组。

30.权利要求28所述的固相支持体，其中所述的固相支持体选自色谱柱、色谱树脂、滤器、塑料表面、玻璃表面和磁性颗粒。

31.权利要求29所述的固相支持体，其中所述的柱选自N-羟基琥珀酰亚胺活化的树脂、溴化氰活化的树脂、环氧活化的树脂、来自APBiotech的ECH琼脂糖4B和来自AP-Biotech的活化的CH-琼脂糖4B。