JPH05505793A - 乳分泌抑制 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 乳分泌迎創 発■の背景 １、発明の分野 この発明は、ヤギ乳から分離される新しい蛋白質、並びに、泌乳動物の乳分泌抑 制のための、その蛋白質あるいはその抗体の使用法に関する。

２、従来技術の説明 泌乳動物の乳分盛事は、乳を取る頻度によって調整される。言い換んれば、動物 が子孫を産む要求や農場主の搾乳制度の需要に応じて、動物の乳供給に合うよう に働くメカニズムがある。このコントロールは、搾乳つまり乳しぼりの間、孔形 成ホルモンを与えることによって達成される。しかしながら、スコツトランド、 Ａｙｒのハンナ研究所の泌乳山羊に関する研究者たちの研究により、別の要因が 関係していることが明らかになった。これは、局部的なレベル、すなわち、乳房 の個々の腺で、乳分泌を減少させる抑制因子である。

この抑制因子が、分子量１Ｏ−３０ＫＤａのホエー蛋白質を含むヤギの乳牛に存 在するということは既に明らかになっていた。そして、この範囲の分子量は、ホ エーの限外ろ過に使われる公称メツシュサイズのフィルターで決定される６その 抑制因子の効果は、ｖｉｔｒｏ及びｖｉｖｏの両方で、既に実証されいる。ｉｎ 　ｖｉｔｒｏ法は、Ｃ，Ｊ、Ｗｉｌｄｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ　 。

２４２．２８５−２８８　（１９８７）によって、記述されているが、乳分−を 持つウサギの乳房組織と乳分−を持たない乳房組織の数片の移植培養を行ない、 ラグドースとカゼインの合成の抑制作用を実証することから成り立っている。Ｇ −Ｍ、Ｓｔｅｗａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙｌ１８ ．Ｒ１−Ｒ３（１９８８）を参照のこと。ｉｎ　ｖｉｖｏ法（Ｃ，、Ｊ、Ｗｉ　 ｌｄｅ　ｅｔ。

ａｌ、、Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ ｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ７３，３９１−３９７　（１９８８））では、乳分−は 、乳頭を介してヒツジの一本の乳腺の中に注入された。乳分画供与量に依存する 、乳量（その乳腺に特有のものであるが）の一時的減少が観察された。この研究 の多様な他の様相について記述する、他の論文はＣ，Ｊ、Ｗｉｌｄｅ　ｅｔ　ａ ｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｓｏｃ、Ｔｒａｎｓ、１５，９１６−９１７　（１９８ ８）、Ｃ，Ｊ。

Ｗｉｌｄｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、、９９ ２゜３１５−３１９　（１９８９）、Ｊ、ＭｃＫｉｎｎｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ 、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１１９　（追録）、１６７　（１９８８）及び　Ｍ、 Ｐｅａｋｅｒａｎｄ　Ｄ、Ｒ，Ｂｌでｃｈｆｏｒｄ、Ｊ、Ｄａｉｒｙ　Ｒｅｓ、 、５５．４１−４８．である。

１９８９年３月、ニューオーリンズでの、「母乳および乳汁分泌のための国際研 究協会」で、Ｃ，Ｊ、ワイルド博士によって行われた講義の短い報告書が、乳腺 生物学ニュースレター（１９８９年５月）に公表された。レポートには、「この 抑制剤が精製され、その構造が決定された。」と書かれてあったが、その詳細は 記述されておらず、また、このレポートの著者は、それが事実の基礎のないまっ たくの推測であることを認めている。

化学的あるいは生物学的合成を行なう目的のために、このヤギ乳抑制剤が単一化 合物であるか、協力して行動する２つあるいはそれ以上の化合物かどうか決め、 １０−３０のＫＤａ分画からそれまたはそれらを分離し、同定できるほど十分に 精製するという問題が残されたままだった。

発咀の要約 陰イオン交換クロマトグラフィによって１０−３０のＫＤａの分画をいくつかの ピークに分離することが可能であることが判明している。

また、抑制活動は、最も豊富なものの１つでないは特別のピークに主として集申 すことが決定されている。ある蛋白質がこのピークから分離されておシバその特 性が決定され、また、乳分泌抑制物質としてのその活動も確認された。さらに、 この抑制物質の効果を中和するこの抑制物の抗体が、少なくとも部分的に発見さ れた。

ＤＥＡＥ　（ジエチルアミノエチル）セルロースを使用する従来のイオン交換ク ロマトグラフィーイオン交換樹脂は、１Ｏ−３０ＫＤａ分画の構成要素を有効に 分離しなかった。結果として、このカラから溶離された試料に対する生物検定実 験はあいまいな結果を与えた。同様に、１Ｏ−３０ＫＤａ分画のゲルろ過は、個 々の成分にそれを有効に分離しなかった。

信頼性の程度はことなるが、この発明の蛋白質を定義する多様な方法がある。現 在推奨される１つの定義は、泌乳するヤギによる乳分泌を抑制する蛋白質であり 、（ａ）約７．６ＫＤａの解糖された形の蛋白質のゲルろ過グロマトグラフイに よって決定されるような、ある分子量を持ち、（ｂ）Ａｌａ　（１）−Ｇ］、ｙ −Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｘａａ　（５）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｘａａ−Ｖａｌ−Ａｓｎ 　（５）（ここで、Ｘａａは同一かあるいは異なる未知のアミノ酸である）で始 まるＮ一端アミノ酸連鎖（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ○：１）を持ち、かつ（Ｃ）ヤギの 乳中に解糖された形で見つけられる蛋白質である。

代替的定義では、泌乳ヤギによる乳分泌を抑制し、（ｄ）（１）公称１０−３０ のｋＤａの、乳ホエー蛋白質分画を陰イオン交換カラム上で分離するとき、第３ 有意ピークに存在し、ペンダント−ＣＨ２Ｎ　（ＣＨｉ）ａ”グループを持つ単 分散親水性重合体の粒子を含む主蛋白質であり、その粒子直径が１０＋０．５μ ｍ（特に“Ｍｏｎｏ　Ｑ″カラムであり、２０ｍＭのビストリスプロパン（１， ３−ビス［トリス（メチル−３重（ヒドロキシメチル）アミバブロバン）緩衝液 、ｐＨ７，０および酢酸ナトリウム傾斜を使用して、と定義される蛋白質である 。　（ｄ）（１）のこの定義は場合によって補足されてもよい、補足的定義（ｄ ）（２）では、（ｄ）（１）の定義の前記第３ビーグが、等電、克クロマトグラ フィのカラム上で分離される場合得られる、第２有意ピークに存在する主蛋白質 で、ペンダント３次（−Ｎ”ＨＲ２）および４次（−Ｎ″ＨＲ３）アミングルー プを持つ単分散親木性重合体の粒子を含んでいる蛋白質であるという定義が与え られる。Ｒは有機代替物（必ずしも同一物ではない）であり、粒子直径はｌｏ± ０．　５μｍ（特に“ｍｏｎｏ　Ｐ”カラム）を使用してｐＨ５，５およびｐＨ ４，０の両性緩衝液の０．０２５Ｍのビベ’ｓジン−ＨＣｌ、５．５−４．５の 範囲でｐＨ傾斜を作成するために。

しかし、この蛋白質の別の可能な定義上の特徴は（ｅ）以下のその近似的経験的 アミノ酸組成を含むものである。

Ａｓｘ６．Ｔｈｒ２，５ｅｒ４．Ｇｌｘ７．Ｐｒｏ４．Ｇｌｙ７．ＡｌａＶａｌ ｌ、１１ｅ２．Ｌｅｕ４．Ｔｙｒｌ、Ｐｈｅ２．Ｌｙｓ３．ＨｉｓＡ、ｒｇ２． Ｍｅｔ５．Ｃｙｓｌ、　ＴｒｐＯ。

（Ａｓｘ＝ＡｓｎあるいはＡｓｐ；Ｇｌｘ＝ＧｌｎあるいはＧｌｕ）この組成は 、親水性アミノ酸中に豊富にある。特徴（ｂ）および（ｅ）（単独であるいは他 のものとともに）によってこの蛋白質を定義することができる。

この蛋白質の抑制作用をともなう、（ａ）がら（ｅ）までの特徴の、１つあるい は２つ以上の任意の組合せは、この蛋白質を特有の性質を持つものとして定義す るのに十分であるかもしれない。したがって、残余の特徴が確認され、この蛋白 質の同一性に関して全く疑いの余地が残されていないにもががわらず、それらの 組合せの１つあるいはそれら組合せのある面が後に再決定され、ゴの定義に十分 に近似していないということが判明した場合に備えて、出願人は、（ａ）から（ ｅ）のすべであるいはほぼすべての組合せに不必要に限定することを望まない。

正確に述べるならば、どの特徴が最も意味があり、また、最も信頼性のあるもの であるかは、どちらにしろ、判断上の問題であるが、出願人の現在の判断を反映 する上述の推奨定義が、この蛋白質の定義である。したがってここで述べられる 特徴の任意の組合せによって定義され、この明細書の推奨例からＳ−可能な特徴 を含む組合せによって定義される蛋白質は、この発明によって包含されているも のと考慮されべきものであると判断される。

この蛋白質を定義するために有用な特性は等電点（ｐＩ）である、定１ｄ（１） の第３ビーグが、ポリアクリルアミトル管の中で等電点電気泳動で、約４゜８か ら４．９までのｐＩを与えることがわかった。しかしながら、定義ｄ（２）の第 ２ピークは、等電点クロマトグラフィで、明白にｐＨ４，２で溶離された。

この発明は、解糖された形のあるいは解糖されていない形の抑制蛋白質を含んで いる。

ポリクロナール抗体であれ、モノクロナール抗体であれ、あるいは工学的に作り 出された抗体であれ、この蛋白質の抗体は、この発明の範囲内にある。

国内特許法が許す範囲で、ヤギあるいは他の動物に対して、乳量を減少させる抑 制物質の投与あるいは、少なくとも部分的にこの抑制物質の作用を抑えるこの抑 制物質に対する抗体の投与はこの発明の範囲内にある。

区面五簡単ｌ説明 図１および図２は、２つの異なる緩衝液中でのイオン交換クロマトグラフィによ る１Ｏ−３０ＫＤａ分画の分離を示す。

図３は、図１のクロマトグラフィの様々なピークからの試料が、この発明の蛋白 質を含んでいるピークに対して上げられた抗血清に結びつく能力がテストされた ＥＬＩＳＡの結果を示す、また 図４は、陰イオン交換クロマトグラフィによって得られた３つの蛋白質ピークの 等電５へクロマトグラフィによる分離を示す。

推探１】り唯）豆咀 この発明の蛋白質は解糖された形で乳中に存在する。解糖効果は、乳腺内の適切 な細胞へこの蛋白質を単に結びつけるためであると信じられている。非解糖の形 で乳腺に局所的にこの蛋白質を投与することができるであろうと予測される。

乳腺外植片培養中のラクトーゼとカゼインの合成を抑える抑制作用が、抑制物質 を含んでいる分画の投与量に依存することは、１０　３０ＫＤａの分画を使用し て、実証されている。さらに、外植片が、抑制物質のない新鮮な媒質中で洗浄さ れ、再培養されて、抑制物質を含んでいる分画に曝された場合、ラクトーゼとカ ゼインを合成する能力は回復する。ｖｉｖｏでは、乳腺へのこの蛋白質の投与は １回の投与後、数時間以内で乳量を減少させ、乳量の完全な回復には２４−３６ 時間を要するということが知られている。しかしながら、搾乳頻度の変化、した がってａｕｔｏｃｒｉｎｅ抑制が、数週間にわたって持続されたとき、合成能力 （すなわちａｕｔｏｃｒｉｎｅ抑制に帰着可能な乳分泌細胞の分化の程度）に影 響があった。

乳腺細胞活動に対するこれらの長期にわたる影響には、プロラグチンに対する細 胞表面ホルモン受容体の数の変化が伴う。４週の間、１日に３回泌乳ヤギを搾乳 すると、細胞分化および１細胞当たりのプロラクチン受容体の数が増加するが、 一方、２１週以上延長する搾乳効率の減少は乳腺細胞活動およびプロラクチン受 容体数を減少させる。したがって、これらの長期的影響およびさらにこの発明の ａｕｔ。

ｃｒｉｎｅ抑制による短時間の調整は、第１に内分泌抑制に対する個々の乳腺の 感度の１形によるものであるかもしれない。

この発明の蛋白質に対する抗体は、例えば、ポリプロナル抗血清、マウスモノク ロナル抗体あるいは組換え型技術や、現在利用可能な任意の方法によって工業的 に作られた抗体のようなものを挙げることができる。その後、乳量を増加する必 要がある場合に、受動免疫化法をを利用して自然の抑制効果を減少させることが できる。しかしながら、頻繁に、乳割当てを満たすために乳量を減らす必要があ るだろう、その様な場合には、抑制物質それ自身が投与される。予防接種におけ る、従来の既知の担体およびアジュバントを使用することができる。

この発明は、ここに定義された抑制物質に反応するいかなる動物にも適用できる 。１Ｏ−３０ＫＤａのヤギ乳分画がウサギの乳腺に注入され、乳蓄積およびそれ に関係する酵素活動が成功裡に減少するのが見られたので、この抑制物質は他の いくつかの泌乳動物に有効であろう。

ヤギ乳量に対する有意の効果が、ｌｏｏｍｌの乳から生成された抑制分画を皮肉 注射するこによって得られた。ウサギの乳蓄積に対する有意な片側性の効果が、 片側の４つの乳腺の各々に、２０−２５　ｍ　ｌの乳から得られたｔｏ−３０Ｋ Ｄａ分画の２０倍濃度１．０−１．２５ｍ１を注入することによって得られた。

０゜１μｇ／ｍｌの乳中の推定抑制物質濃度で、これは、ヤギの有効な皮肉投与 量が１乳腺当たり１０ｍｇであることを示唆する。したがって、抑制物質を５０ μｇ（特に５−２０μｇ）の範囲で注入することによって、効果を期待すること ができる。

必要に応じて、（たとえば、毎日）、この投与量は繰り返されるだろう。

また、長い期間にわたって与えられる場合には、その量をおそらく減らすことに なるだろう。

この発明の蛋白質は、例１に記述される方法またはそれに基づく何らかの変形さ れた方法によって、ヤギの乳から得ることができる。純水中で広範囲な透析（蛋 白質を保持するための適切な膜、例えば約６ＫＤａの公称分子量カットオフ付き のものを使用して）および凍結乾燥によって溶離液かも純粋な形でそれを回収す ることができる。しかしながら、タンパク質合成によって、あるいは組換え型Ｄ ＮＡ法によってそれを合成することが予想される。

次の腹数例はこの発明を説明するものである。

」圧 この例はこの発明の抑制物質の調製および特性について説明する。

上−ヤキ乳分画の調製 乳は午前搾乳で、中央乳汁分泌（それがどこを示しているかを除いて）で英国の ５ａａｎｅｎヤギから得られた。また、それは、遠心分離法によって脱脂（２５ ００ｇ、１５”Ｃｌ２Ｏ分）され、グラスウールによってろ過された。脱脂乳は 、５ｐｅｃｔｒｏｐｏｒ−１透析膜（分子量カットオフ６０００−８０００タル トンズ）を使用して、１０ｍｍのへベス、ｐＨ７，４，４０ボリユームに対して 透析サレルカ、アルイハ、遠心分離（８０，０００ｇ、１’５’Ｃ，２時間）さ れて、１ペレツトのカゼインミ細胞およびホエー蛋白質を含んでいる澄んだ上澄 み液を産出した。

＊ニー蛋白質分ｔｔ部分＋、ｔ、分子ｆｆ１１０，０００．３０，０００．５０ ，０００および３００，０００ダルトン（Ｄａ）の公称カットオフ値でフィルタ ーを使用して、限外ろ過にかけられた。各々の場合、濃縮水ボリュームは９５％ に減少させられ、４ボリユームの１０ｍｍヘペス、ｐＨ７゜４、で洗浄された。

１０．０ＯＯｄａ未満の分子量試料を含んでいるる液が凍結乾燥によって濃縮さ れた。他のろ液、および３０，０ＯＯｄａのフィルターで得られた濃縮水は、１ ０，０ＯＯｄａのフィルターでの限外ろ過により濃縮された。分画はガンマ照射 、あるいはフィルター滅菌によって殺菌された。１０，０００−３０，０ＯＯｄ ａの分画は、蒸留水中で徹底的に透析され、そして陰イオン交換グロマトグラフ イのかわりに凍結乾燥によって濃縮された。

２、ヤギホエー蛋白質の陰イオン交換グロマトグラフイ。

１０−３０のＫＤａホエー分画は、ＦＰＬＣ（急速蛋白質液体グロマトグラフィ ）を使用して、Ｍｏｎｏ　Ｑ　ＨＲＩＯ／１０°陰イオン交換カラム（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ社）で分離された。“Ｍｃ＋ｎｏ　Ｑ”は、強力な陰イオン交換器で 、Ｍｏｎｏ　Ｂｅａｄｓ（単分散親水性重合体粒子（１０±０．５ｐｍ直径）を ベースにしおり、これはマイナスに帯電している成分を、４次アミングループ［ −ＣＨＩＮ　（ＣＨｓ）ｓ”］を介して結びつける。２つの緩衝液システムが使 用された。

（ａ）２０ｍｍのビストリスプロパン、ｐＨ７，０（１，３−ビス〔トリス（ヒ ドロキシメチル）メチルアミノコプロパン〕、個々の蛋白質を溶離するために酢 酸ナトリウム傾斜を使用。この緩衝液システムは生物検定実験（図１）用の蛋白 質を調製するために使用された。

（ｂ）１０ｍｍのイミダゾール、ｐＨ７，０、塩化ナトリウム（図２）の溶離傾 斜を使用。この緩衝液システムは類似分離を生み出したが、（ａ）より鋭し＼ビ ークを有していた。

ホエー分画は、原乳の濃度の２倍で、適切な軌道緩衝液（２０ｍｍのビストリス プロパンあるいは１０ｍｍのイミダゾール）中に溶かされた。また、溶液はｐＨ ７，０に調節した。クロマトグラフィ前に、試料および緩衝液は０．２のμｍフ ィルターを通してろ過された。さらに、緩衝液は使用前にガス抜きされた。２倍 に濃縮されたホエー分画２ｍｌは各分離用にロードされた。流量は４．０ｍｌ／ 分だった。

カラムから溶離された蛋白質ピークを含んでいる分画は、蒸留水中で広範囲に透 析された。また、それらは次の段階で使用される前に、−２０１Ｃで凍結乾燥さ れ保存された。

図面の図１は、グロマトグラフイカラムからの蛋白質の溶離を示す、左手の縦座 標の蛋白質濃度（２８０ｎｍで光吸収として）は、溶離れた試料の累積量に対し て実線でプロットされている。横座標は、右手の縦座標は溶離液（ａ）中で使用 される酢酸ナトリウム傾斜（０〜１．０Ｍ）を示すために、較正されており、傾 斜は破線によってプロットされている。ピークにはＶｏ＝ボイド量（カラムに結 びかない試料を含む）で、そして１−８の溶離順序にラベルがつけられてｔする 。

図面の図２は図１に類似したプロットであるが、イミダゾール緩衝液システムに 対するものである。右手の縦座標はＯ−１，０Ｍの塩化ナトリウム傾斜で較正さ れている。６５６５−８Ｏの溶離量で中央の２つのビークは、それぞれ図１のＮ ｏ、３とＮｏ、４に対応すると考えられる。

図１および２は典型的なグロマトグラフィに関するものであるが、ビークの相対 的大きさは、調製によって変化する。

３、ヤギ乳分画乳腺組織の乳腺外植片 生物薄片、はぼ１ｃｍ３、重さ０．５−０．７ｍｇの小片柔組織が、外植片とし て培養された。外植片は、「酵素学の方法４７２，７２４−７４２　（１９８１ 年）にＲ，Ｄｉ　ｌ　ｓ＆１．Ａ、Ｆｏｒｓｙｔｈによりによって記述されてい るように、中央の充満しているニューシーラントホワイトウサギの乳腺組織から 調製された。外植片は、それぞれ３０個の外植片を保持するステンレス鋼グリッ ド上の定義された培地（媒質１９９：Ｇｉｂｃｏヨーロッパ株式会社、Ｐａ１ｓ ｌｅｙ、英国）に培養された。外植片は媒質に接してはいたが、媒質中に完全に 沈んだ状態ではなかった。媒質は、インシュリン（５μｇ／ｍｌ）、コルチソル （１００ｎｇ／ｍｌ）およびプロラクチン（１μｇ／ｍｌ）で完全に補足された 。外植片は、２４時間後に媒質で充足されて、４２時間の空気／ＣＯ２（１９： 　１　ｖ／ｖ）の大気下でこの媒質に培養された０次に、外植片（１つの処理当 たり３あるいは４のグループ）のグループはホルモンを含んでいる新鮮な媒質の 中へ転送された。また、ヤギ乳の分画の１つは上述されるような陰イオン交換グ ロマトグラフイによって得られた。乳分画は、原乳の２倍の濃度で、１０ｍｍの ヘペス、ｐＨ７，４中に溶かされた。また、それらは、正常強度培地でその原乳 濃度の１００％になるように、２倍に濃縮された同量の培地に加えられた。コン トロール培養は、乳分画用の希釈剤だけを内包したものであるが、各実験に含ま れた。乳分画が存在する状態あるいは乳分画が無い状態での、さらに６時間培養 の間のラクトーゼとカゼイン合成の平均割合は、　［Ｕ−１４ｃ］グルコース（ Ｕ＝均一にラベルされた；　０．１８ｍＣ１／ｍｍ０１）およびＬ４４．５−” Ｈコロイシン（２，２２ｍＣ１／ｍｍｏｌ）をそれぞれこの培地に付加して、測 定された。６時間周期で、外植片と培地は分離され、液体窒素中に冷凍保存され た。

外植片は５ｍＭのエチレングリコール−ビス−Ｎ−（２−アミノエチルエーテル ）Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ酸（ＥＧＴＡ）および２ｍ ｍのフェニルメタン−スルフォニルフルオライドを含んでいる１０ｍｍのトリス ／Ｈｅ１ｐＨ７，０，１，０ｍｌ中に４°Ｃで、ガラス／ＰＴＦＥホモジナイザ ーで１０ストロークごとに均質化された。それから、３０秒間超短波処理がそれ に続いた。（Ｋｏｎｔｅｓ超音波細胞破壊器、３０％最大出力）また１粒子のな い上澄み液が１０，０００ｇで遠心分離よって５分間調製された。　［３Ｍ］ラ ベルカゼインが、その等電点で沈殿によって粒子のない上澄み液から調製された 。そしてその沈殿物は、Ｃ，Ｊ、Ｗｉｌｄｅ　Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、１５ １．５１９−５３２　（１９８４年）によって記述されるように、５ＤＳ−ボリ アクラマイトゲル電気泳動にかけられた。カゼインポリペプチドに対応するバン ドはクーマシーブリリャントブルーブルーで染色することによって、視覚化され た。そして、それらはＳ。

Ｍ、Ｒｕ５ｓｅｌ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ７１４，３４− ４５　（１９８２年）に記述されるように、取り除かれ、［３Ｈ］放射能が数え られた。

［”Ｃ］ラクトーゼは、エタノール／ジエチルエーテル（３°１、ｖ　／　ｖ　 ）を使用して、外植片ホモジネートと培地から選択的に沈殿させられ（Ｎ、Ｊ、 Ｋｕｈｎ＆Ａ、Ｗｈｉ　ｔｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、−１４８，７７−８４（１ ９７５））、それからその沈殿物が数えられた。結果は、非培養培地の抽出後［ １４（ｊ放射能測定によって、培地（通常０．０８％より大きい）から［１４Ｃ ］グルコースのキャリスルーに対して補正された。乳分画の付加は、外植片の外 細胞空間と媒質との間に分泌された生成物の分布に影響しなかった。

放射性物質（カゼインとラグトーゼ）の量は、乳分画が加えられていなかった外 植片によって生成された放射性物質の百分率として表現された。結果は表１に示 されている。測定件数はかっこ内に示されている。

紅 分画　ラクトーゼ合成　カゼイン合成 −笈迎話物質一　−２迎だ物質 非分画　２９．５±　５．６　（１３）　３２．２±　５．２＊＊Ｖｏｉｄ量　 ６．２＋　７．７　（９）　７．９＋　８．７ビーク１＋２　１．Ｏ±１５．６ 　（５）　１３．１±　９．６ピーク３　３１５±　７．２　（１３）　３５． １±　３．６＊＊＊ピーク４　３０．１±　７．７　（７）　７．２±１０．２ ピーク５　１０．８±２０．６　（１１）　１７．７±　７．６ピーク６　５． ５±　５．２　（１０）　６．３±　８．３ピーク７　１４．２±　８．４　（ ５）　１．０±　８．０ピーク８　２３．４±１０．５　（３）　（１３，９± 　７．９Ｓ）刺激値（つまりカゼイン合成）は、乳が加えられなかった抑制刺激 値を明白に超過した。ビーク８は、それがテストされた３つの実験で、外植片に 対する非特定の影響を持ったかもしれない多くの蛋白質（傾斜によって分離され ていなかった）を含んでいた。

＊ｐ＜ｏ、ｏｓ：＊＊ｐ＜０．０１　；＊＊＊ｐ＜ｏ、００１表１から、ラクト ーゼ合成を抑制する際、ビーク３および４がもつとも活発だったということがわ かる。ラクトーゼ合成は乳量の主な決定要素である。

４　ビー　の　ル　゛　ロマ　− ビーク３のゲルろ過は、”ＦＰＬＣ”グロマトグラフイシステム、および５ｕｐ ｅｒｏｓｅ１２ＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａ（ｉａ）を使用して行なわ れた。緩衝液は１００ｍｍのＫＣＩを含んでいるｐＨ７，５の５０ｍｍのトリス ／ＨＣＩだった。また、それは使用前、ろ過され、脱気された（０．２μｍフィ ルター）、試料（慣例的に２００μｍの最大のボリュームに１−１０μｇ）は、 同じ緩衝液に溶かされ、使用前にろ過された（０．２のμｍフィルター）、カラ ムは分子量２００，０００−１２，４００の範囲で分子量標準、アプロチニン（ 分子量６．５００）およびボビンーラグトアルブミン（分子量１４，２００）を 使用して、口径を測定された。（シグマＭＷ−ＯＦ−２００キット）、較正曲線 ログ［Ｖｅ／Ｖｏ対分子量］が調整された。ここで、各蛋白質の、Ｖｏ＝ボイド 量、およびＶｅ＝溶離量、Ｖｏはデクストランブルー（シグマ；近似分子量２， ０ＯＯＫＤａ）を使用して決定された。ビーク３蛋白質の分子量はこのように約 ７，６ＫＤａであると決められた。（分子量での５ＤＳ−ＰＡＧＥによる試し決 定は変則的結果を与えた：高分子量が形をａｇｇｒｅｇａｔｅ　ｔ、ているよう に見える。）、予想外に低い分子量は、限外ろ過中の公称１０，０００のドルト ンフィルターのグロッギングにより、おそらく説明することができる。これが、 より小さな分子を保留してしまう。

旦−蛋血質屏糖評価 ゲルろ過クロマトグラフィにより分離されたビーク３蛋白質のヘキソース決定は 、Ｒ，Ｇ、５ｐｉｒｏ　（’酵素学の方法」、８．４−５（１９６６年））によ り記述されるような“Ａｎｔｈｒｏｎｅ”法によるものだった。

この方法により、ビーク蛋白質は、１００μｇ蛋白質（２つの決定の平均）につ き７０μｇヘキソースを含んでおり、解糖を示していた。抑制非解糖蛋白質（ポ ビン−ラクトアルブミンおよびＲＮａｓｅ　Ａ）は、分析条件の下でソ無視でき る量のヘキソースを含んでいた。

６　ホエー　の　占 等電点電気泳動は、管ゲル（直径４ｍｍ；長さ１１．５ｃｍ）中で行なわれた。

Ｐ、Ｈ，Ｏ’　Ｆａｒｒｅｌ　ＩＪ、Ｂｉｏｌ　（Ｃｈｅｍ：　２５０４００７ −４０２１　（１９７５）’）により記述されるように、アンフォリン（４％の ｖ／ｖ　ｐＨ範囲５−８．１％のｖ／ｖｐＨ範囲３．５−１０　；　Ｂ　ｉ　ｏ Ｒａｄ）の混合物を用いて、４％のボリアクルアミド１ゲルが不可欠なものとし て調製された。混合物の使用）、また、それは、範囲４．０−９．０ｉｎ線形の 傾斜を与えた。試料（ビーク３蛋白質の２５μｇ）は、９．５Ｍの尿素、２％（ Ｗ／Ｖ）のＮＰ４０．１．６％（ｖ　／　ｖ　）のｐＨ５−８μｍｐｈｐＨ５− ８ａ、および０．４％（ｖ／ｖ）のｐＨ３，５−１０アンフオリンを含んでいる 溶液中に溶かされた。陽極溶液および陰極溶液はそれぞれ１０ｍｍのＨＩＰＯ， および２０ｍｍのＮａＯＨだった。電気泳動は１８時間３００ｖで行ない、４時 間４００Ｖでその後続けられた。その後、ゲルは、５％（ｗ／ｖ）のＴＣＡ１５ ％（Ｗ／ｖ）スルフオサルチル酸／１％（ｖ／ｖ）メタノールに、２５％（Ｖ／ Ｖ）のイソプロパノルア１０％（Ｖ／Ｖ）酢酸に最初に押し出され固定した。ま た、それらは、０．１％（Ｗ／Ｖ）のクーマシーブルーを含んでいる、イソプロ パツル／１０％（Ｖ／Ｖ）酢酸２５％（Ｖ／Ｖ）で染色された。脱色はイソプロ パツル／酢酸で行われた。

ビーク３蛋白質の等電点は、４．８５であることがこのようにしてわかった。

二一ヱえス酸 アミノ酸組成が決定され、と−グ３中のアミノ酸の経験的な比率は標準値として アルギニン−２を使用して計算された。結果は表２に示される。

スｌ アミノ酸　ネット量（ｎｍｏ　ｌ　ｅ　ｓ）　アミノ酸比率Ａｓｘ　（Ａｓｐ／ Ａｓｎ）　６．９３７　６Ｔｈｒ　２．５８７　２ Ｓｅｔ　５．４３９　４ Ｇｌｘ　（Ｇｉｎ／Ｇｌｕ）　９．１７３　７Ｐｒｏ　４．４０４　４ Ｇ１ｙ　８．１８１　７ Ａｌａ　６．２０４　５ Ｖａｌ　標準、未知量 １１ｅ　１．３９８　２ Ｌｅｕ　４．６０４　４ Ｔｙｒ　０．７５２　１ 上記の経験的なアミノ酸組成データから計算された分子量番ま７１３６だった。

これは、解糖された蛋白質のゲル浸透グロマトグラフイにより得られた分子量７ ６００と一致しており、その差異は解糖によって説明された。

１０個の最初のアミノ酸連鎖は、Ｎ一端末アミノ酸はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ：１を与 えた。そのなかで、未知の第５のアミノ酸はおそら＜Ｖａ’１で、第８のアミノ 酸はおそら＜Ｇｌｕである。

ラ　−ゼム　の ビーク３は、ガラクトシルトランスファラゼによりラクトーゼの合成を促進しな い、それが主要なホエー蛋白質、α−ラグタルブミンに関係してし１な（＼こと を、これは示している。ラクトーゼ合成活動は、ビーク５〜７に関係してお１） 、これらのビークがヤギ乳中のα−ラグトアルブミンの０＜つ力１の形を含むこ とを示している。

Ｌ」５１ユ列１漫性 （ａ）親水性 ビーク３の逆相クロマトグラフィは、それが強く親木性であることを示した。

（ｂ）分光分析 ビーク３蛋白質は、２６１　ｎｍで最大に吸収する。２８０ｎｍでの吸収に対す る、計算された分子吸光係数は５．１２のｘ１０８である。この吸光度は、他の ホエー蛋白質と高く比較され、それは、ビーク３が１Ｏ−３０ＫＤａ分画の小さ な割合だけを構成することを示す。

（ｃ）安定性 ビーク３蛋白質は、ゲルろ過グロマトグラフィにより精製され、凍結乾燥された 粉末として一２０’Ｃで、あるいは、１０ｍｍのヘベス緩衝液ｐＨ７，０の溶液 中で３７“Ｃで、２週間保存された。同じゲルろ過グロマトグラフィ法により再 分析された時、このビークの蛋白質内容の減少も低分子劣化生成物の外観のいず れの証拠もなかった。したがって、この蛋白質はそれが調製されテストされた状 態で安定しているように見える。

１ｏ　占　ロマ　ラ　−　ビー　の 等電点クロマトグラフィにかけることにより、それらの等電点（１）に基づいて く蛋白質を分離する。Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のｒＭｏｎｏ　Ｐ　ＨＲ５／２０］ カラムを使った分離は、非常に優れていて、０．０２ｐＨ単位で、ｐＩの異なる 分子を分離することができる。ＭＯＨ□　ｐＨは、単分散親木性重合体粒子（１ ０±０．５μｍ直径）のようなモノビーズに甚く、弱陰イオン交換器である。

また、様々な３次＜−Ｎ“ＨＲ，）、および４次（−Ｎ”Ｒ３）アミングループ が、その中に導入されている。

“Ｍｏｎｏ　Ｐ″はバッファ能力を持っており、それがもつ電荷量はｐＨととも に変化する。必然的に、そのイオン容量も、ｐＨとともに変化する９等電点クロ マトグラフィにかけるとき、ｐＨ傾斜は、起動緩衝液でそれを平衡させることに より、また、量を増加させるときに加えられる別の緩衝液で溶離することにより 、カラムに形成される。この手段により、より低いｐＨに溶液を急速に適合させ る。起動ｐＨでカラムに結びつけられた蛋白質は、それらのｐＩに従ってｐＨ傾 斜上の種々の点に溶離される。

ｒＭｏｎｏ　ＰＪカラムは、０．０２５Ｍのピペラジン−ＨＣｌ　ｐＨ５゜５で 最初に平衡さされた。そしてｐＨ傾斜（５，５−４，０）が、溶離によりカラム に、［ポリバッファ７４Ｊ　ｐＨ４，Ｏ（蒸留水に１／１０で希釈されて）で、 ５ｉｔｕに形成された。「ポリバッファＪ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）は、異な るｐＫａからなる、多数の両性緩衝物質を含んでいる。緩衝物質は０．２μｍフ ィルターを通してろ過された。また、それらは使用前に脱気された。ｆＬ量は０ ．７５ｍ１／ｍｉｎだった。試料（陰イオン交換カラムからビーク２．３＆４） は、０．０２５Ｍのピペラジン−ＨＣｌ　ｐＨ５，５１，０ｍｌ中でおよそ５０ −１００μｇで溶かされ、０．２μＭフィルターを通してろ過された。蛋白質ビ ークを含んでいる分画は集められ、蒸留水中で広範囲に透析され、凍結乾燥され て、−２０°Ｃで保存された。

図面の図Ａは、ビーク３を使用して得られた溶離プロフィールを示す。左手縦座 標の蛋白質濃度は、２８０ｎｍで光吸収度として、横座標の溶離された試料の累 積量に対して実線によりプロットされている。ビーク３は、３．１．３．２およ び３．３．とラベルをつけられている、主な３つの成分を含んでいた。見掛けｐ ＨはＷｈａｔｍａｎ計測記録用紙（ＣＳタイプ、ｐＨ３，８−５，５）を使用し てすいていされたが、正確なｐｒ値を反映してはいないかもしれない、しかしな がら、各ピークは、同じ累積量で一貫して溶離した０図４は典型的な溶離プロフ ィールを示す。しかし、ビークの相対的大きさは、調製によって変わることもあ る。

陰イオン交換ピーク２と４はそれぞれ、２．１．２．２．２．３および４゜１． ４．２．４．３で指定される、３つの成分を含んでいた。すべての３つのプロフ ィールを比較すると、３．１が２，１の汚染により発生することが連想させた。

ビーク３の主成分である、３．２もビーク４（つまり４．２）の“汚染物質”で あること、３．３は、ビーク４の主構成要素、４．３との汚染によって発生する かもしれないことが連想された。ビーク２．２と２．３は３．２または３．３に 対応しない位置で溶離している。

１１　ピーク３２の それらが原乳の３倍の濃度の最終濃度になるように、生物検定培地に加えられた ことを除いて、第３セクシヨンの処理が、ビーク３から等電点クロマトグラフィ にかけられた分画に対して繰り返された。結果は表２に示される。測定件数は括 弧内に示されている。

表７ 分画　ラグトーゼ合成　カゼイン合成％％抑制物質　％抑制物質 ３．１　４．５±３０．１　（４）　６．０±　９．８３．２　１９．６±１６ ．９　（４）　３２．２±１２．６３．３　（１３，７＋２８．８　（４）Ｓ　 （１２，５＋　８．７０Ｓ）Ｓラクトーゼあるいはカゼイン合成のよっな刺激は 、乳が加えられなかったコントロールの刺激を明白に超過した。

表２の結果は、抑制活動が主ピーク３．２に最も一貫して関係していることを連 想させる。

１２　占　ロマ　グラフ　にか（゛　こビー　の゛ル第４セクションでの処理が 、第１０セクシヨンで得られた、等電、慨グロマトグラフィにかけられたピーク の分画３．１．３．２、および３．３に対して繰り返された。それらはすべて、 約７６００ｄａの分子量を暗示する類似した位置で溶離した。

例又 この例は、抑制物質に対する抗体の調製、抑制物質を検知する際の抗体の使い方 、およびラクトーゼとカゼインの合成の抑制作用を抑える抗体の能力を説明する 。

ＥＬＩＳで使用するための、ウサギの抗−（ヤギピーク３蛋白質）を調製するた めに、ビーク３が、燐酸塩緩衝塩水０．５ｍｌ　ｐＨ７，６中に溶かされ、それ は、完全フロイトアジュバントでエマルジョンとして投与された。雌のニューシ ーラントホワイトウサギに、背中に沿った多数の位置に、蛋白質１００μｇを第 １皮下注射された。２８日後に、不完全フロイトアジュバントの使用したこと以 外では、上記と同じ別の皮下注射が行われた。ウサギは７および１４日後に、無 菌のメスの刃で小さなカットを作ることにより、耳端静脈から採血された。

ＥＬＩＳＡプレート（フロー研究所）が、１Ｏ−３０ＫＤａホ工−分画から調製 された債々のピーク３．４．５．６および７の１−５μｇでおおわれ、各々が燐 酸塩緩衝塩水液（ＰＢＳ）１００μＩ中に溶かされた。−晩４″Ｃで温室後、プ レートは、ＰＢＳおよび０．　１％のｒＴｗｅｅｎ２０Ｊで３回洗浄された。Ｐ ＢＳの１５０μｍ、”Ｔｗｅｅｎ２Ｑ”０．１％および５％のＢＳＡが、各々の ウェルに加えられ、プレートは、非特異的結合部位の飽和を許すために、室温で １時間置かれた。プレートは、上記のように３回洗浄され、ウサギの抗−（ヤギ ビーク３蛋白質）血清（ＰＢＳ中１　：　２００を希釈した）１００μｍが、各 々のウェルに加えられた。２時間後、４０６Ｃで、プレートは再び洗浄され、Ｐ ＢＳ＋０．１％「Ｔｗｅｅｎ２０」＋０．５％ＢＳＡ中で１　：　１０００に希 釈された、ペルオキシダーゼ結合の抗ウサギ　ＩｇＧ　血清（Ｓｃｏｔｔｉｓｈ 　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｕｎｉｔ）１００μｌが、加えら れた。プレートは、４°Ｃで２時間再び温室された。その後、上記ように、それ らは、５回洗浄され、オルシーフェニレンジアミン（ＯＰＤ）基体（１１，３８ ｍＭのＮａｚＨＰＯ＊とｐＨ６゜０の４６．４５ｍｍのクエン酸中に、０．０１ ％のＨ２Ｏ２を含む、０．４ｍｇ／ｍ１’０ＰＤ）１００μｍが、各々のウェル 加えられた１色彩は、２０分間、暗所で現像され、反応は、５０μｍ　４ＭのＨ ２ＳＯ，の付加により終了した。吸光度はＭｕｌｔｉｓｃａｎｍｉｃｒｏｔｉｔ ｒｅリーダ（フロー社）を使用して、４９２ｎｍで読まれた。抗体のみの抑制値 および抗原のみの抑制値がそれぞれのテストリーディングから取られた。

結果は、光学的密度の単位が、横座標のビーブ試料の量に対して、縦座標上にプ ロットされている第３図にグラフで示されている。各値は、２つの測定の平均を 表す。抗体がビーク３試料に強く結合していることが理解される。これは予想さ れていたことであるが、ビーク４に関しては友対の反応がある。

２つの生物的検定実験の結果は、上記の血清が培地に含まれている（任意の濃度 で）時、抑制物質によりラクトーゼとカゼインの合成の抑制が部分的に逆転する ことを示した。ラクトーゼ合成は、抗体が加えられなかった時、１９％抑制され たが、抗体が存在するときは、９％抑制された。カゼイン合成抑制は、抗体が加 えられなかった時、３９％抑制されたが、抗体が存在すとき、２１％抑制された 。

ウサギ抑制血清は、ラクトーゼ合成の抑制に対しては効果がなく、ごくわずかで はあるが、カゼイン合成の抑制を逆転させた。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　４年　５月１３日 特許庁長官　深　／Ｒ亘　殿　１ １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ９０１０１７４２ ２、発明の名称 乳分泌抑制 ３、特許出願人 住　所　イギリス国ロンドン、ニスイード６ビーユー。

ニューイントン・コーズウエイ　１０１名　称　ブリティッシュ・テクノロジー ・グループ・リミテッド４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 請求の範囲 １．　泌乳山羊による乳分泌を抑制する蛋白質において、グリコジル化された形 でゲル濾過クロマトグラフィーで計測した分子量が約７．６ＫＤａであり、以下 で始まるＮ端末アミノ酸シーケンス５ＥＱＩＤＮｏ、１を有しており山羊の乳の 中にグリコジル化された形で見いだされることを特徴とする蛋白質。

Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｘａａ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｘａａ　Ｖａｌ　 ＡｓｎただしＸａａは未知のアミノ酸を示す。

２、ポリアクリルアマイドのチューブのなかで計測された等電点が約４８である ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の蛋白質。

３、泌乳山羊による乳分泌を抑制する蛋白質において、前記蛋白質は、乳のホエ ー蛋白質の公称ｌＯ乃至３０ＫＤａ分画がアニオン交換塔で分解されたときに第 三重要ピークの中に存在する主要な蛋白質であり、その場合、前記アニオン交換 塔は、粒径が１０±０．５μであって付属−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３十基を有する 単一分散親水ポリマーの粒子によって充てんされており、かつ分解が、ｐＨ値７ ．０で酢酸ナトリウン勾配をもつビス　トリスプロパンバッファー２０ｍＭをも ちいてなされるものであり、前記蛋白質は更に、請求の範囲第１項および第２項 に記載の特徴事項のうちのすくなくとも一つを持っていることを特徴とする蛋白 質。

４、請求の範囲第３項に記載の前記第三重要ピークがクロマトフォーカス塔で分 解されたときに第二重要ピーク中に存在する主要蛋白質として定義される蛋白質 であってこの場合、付属第三（ＪＪ　十ＨＲ２）および第四（−Ｎ＋Ｒａ）アミ ン基を有する単一分散親水ポリマーの粒子によって充てんされており１．これに おいて馬は有機置換基であり、前記粒子の粒径が１０±０．５μであり、かつ分 解が、ｐＨ値５．５のピペラジン０．０２５Ｍ、およびｐＨ値４，０の両性バッ ファーをもちいてｐＨ勾配５．５無いし４．５を得るように行われることを特徴 とする請求の範囲第３項に記載の蛋白質。

５、実質的に下３己の実験アミノ酸組成を持つことを特徴とする請求の範囲第１ 項、第２項、第３項および第４項のいずれかに３己載の蛋白質。

Ａｓｘ６．　Ｔｈｒ２．　５ｅｒ４．　Ｇｌｘ７．　Ｐｒｏ４．　Ｇｌｙ７．　 Ａｌａ５Ｖａｉｌ、ｌ１ｅ２．　Ｌｅｕ４．　Ｔｙｒｌ、Ｐｈｅ２．　Ｌｙｓ３ ．　ＨｉｓｌＡｒｇ２．　Ｍｅｔ５．　Ｃｙｓｌ、Ｔｒｐ０６、グロコシル化さ れていない形の請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項および第５項のいず れかに記載の蛋白質。

７　請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項および第６項のいずれ かに記載の蛋白質に対する抗体。

８、動物の７２、乳を調整するために用いられる請求の範囲第１項、第２項、第 ３項、第４項、第５項および第６項のいずれかに記載の蛋白質あるいは当該蛋白 質にたいする抗体。

９、前記動物が山羊であることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の蛋白質あ るいは当該蛋白質にたいする抗体。

国際調査報告 １１作−ム−４１１８４Ｈ・ＰＣＴ／ＧＢ　９０１０１７４２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．泌乳山羊による乳分泌を抑制する蛋白質において、ゲル濾過クロマトグラフ ィーで計測した分子量が約７．６ＫＤａであり、以下で始まるＮ端末アミノ酸シ ーケンスＳＥＱｍＮｏ．１を有しており山羊の乳の中にグリコシル化された形で 見いだされることを特徴とする蛋白質。 【配列があります】 ただしＸａａは未知のアミノ酸を示す。 ２．ポリアクリルアマイドのチューブのなかで計測された等電点が約４．８であ ることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の蛋白質。 ３．泌乳山羊による乳分泌を抑制する蛋白質において、前記蛋白質は、乳のホエ ー蛋白質の公称１０乃至３０ＫＤａ分画がアニオン交換塔で分解されたときに第 三重要ピークの中に存在する主要な蛋白質であり、その場合、前記アニオン交換 塔は、粒径が１０±０．５μであって付属−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３＋基を有する 単一分散親水ポリマーの粒子によって充てんされており、かつ分解が、ｐＨ値７ ．０で酢酸ナトリウン勾配をもつビストリスプロパンバッファー２０ｍＭをもち いてなされるものであり、前記蛋白質は更に、請求の範囲第１項および第２項に 記載の特徴事項のうちのすくなくとも一つを持っていることを特徴とする蛋白質 。 ４．請求の範囲第３項に記載の前記第三重要ピークがクロマトフォーカス塔で分 解されたときに第二重要ピーク中に存在する主要蛋白質として定義される蛋白質 であってこの場合、付属第三（Ｎ＋ＨＲ２）および第四（Ｎ＋Ｒ３）アミン基を 有する単一分散親水ポリマーの粒子によって充てんされており、これにおいてＲ ｓは有機置換基であり、前記粒子の粒径が１０±０．５μであり、かつ分解が、 ｐＨ値５．５のピペラジン０．０２５Ｍ、およびｐＨ値４．０の両性バッファー をもちいてｐＨ勾配５．５無いし４．５を得るように行われることを特徴とする 請求の範囲第３項に記載の蛋白質。 ５．実質的に下記の実験アミノ酸組成を持つことを特徴とする請求の範囲第１項 、第２項、第３項および第４項のいずれかに記載の蛋白質。 Ａｓｘ６，Ｔｈｒ２，Ｓｅｒ４，Ｇｌｘ７，Ｐｒｏ４，Ｇｌｙ７，Ａｌａ５Ｖａ ｌ１，Ｉｌｅ２，Ｌｅｕ４，Ｔｙｒ１，Ｐｈｅ２，Ｌｙｓ３，Ｈｉｓ１Ａｒｇ２ ，Ｍｅｔ５，Ｃｙｓ１，ＴｒｐＯ６．グリコシル化されていない形の請求の範囲 第１項、第２項、第３項、第４項および第５項のいずれかに記載の蛋白質。 ７．請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項，第５項および第６項のいずれ かに記載の蛋白質に対する抗体。 ８．動物の泌乳を調整するために用いられる請求の範囲第１項、第２項、第３項 、第４項，第５項および第６項のいずれかに記載の蛋白質あるいは当該蛋白質に たいする抗体。 ９．前記動物が山羊であることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の蛋白質あ るいは当該蛋白質にたいする抗体。 シーケンスリスト （１）一般的情報 （ｉ）出願人：アディカロラインＰ． ピーカーマルコルム ワイルドコリンＪ． （ｉｉ）発明の名称：泌乳制御 （ｉｉｉ）シーケンスの数：１ （ｉｖ）連絡先 （Ａ）郵便宛先： （Ｂ）町名： （Ｃ）市： （Ｄ）州： （Ｅ）国名：ＵＳＡ （Ｆ）郵便コード： （ｖ）コンピューターによる読み出しフォーム（Ａ）媒体のタイプ：５．２５デ ィスク，記憶容量３６０Ｋｂ（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣ／ＡＴ互換機（Ｃ ）オペレーティンケシステム：ＭＳ−ＤＯＳ３．２（Ｄ）ソフトウェア：ＡＳＣ ＩＩファイルフォーマット（ｖｉ）最新の出願データ （ｖｉｉ）過去の出願データ （Ａ）出願番号：ＧＢ８９２５５９４．７（Ｂ）出願日：１９９０年１１月１３ 日（ｖｉｉ）過去の出願データ （Ａ）出願番号、ＰＣＴ／ＧＢ９０／ （Ｂ）出願日：１９９０年１１月 （ｖｉｉｉ）代理人情報 （Ａ）氏名 （Ｂ）登録番号 （Ｃ）パケット番号 （ｉｘ）通信情報 （Ａ）電話 （Ｂ）ファクシミリ （２）ＳＥＱＩＤＮＯ．に関する情報 （ｉ）シーケンスの特徴 （Ａ）長さ：１０個のアミノ酸 （Ｂ）種類；アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：リニア （ｉｉ）分子の種類：ペプチド （ｖ）フラグメントの種類：Ｎ端末フラグメント（ｉｘ）特徴： （Ｄ）他の情報 （ｘｉ）シーケンス表現：ＳＥＱＩＤＮＯ．１【配列があります】発明の詳細な 説明