JP4162898B2 - ラミニン５産生促進剤およびインテグリンα６β４産生促進剤を含む組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、皮膚基底膜の構成成分であるラミニン５の産生を促進する成分と表皮基底細胞の細胞膜に存在し、ラミニン５の受容体として機能するインテグリンα６β４の産生を促進する成分を含む組成物、およびその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、しわ、しみ、くすみ、たるみなど、皮膚の老化に伴って起こる変化には、加齢、日光曝露、環境によるストレス、精神的ストレスなどが関与することが知られている。皮膚内部のミクロの変化としては、真皮でのＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンおよびエラスチンなどの弾性繊維の減少や変性、基底膜でのＩＶ型コラーゲンやラミニンなどの減少や変性、表皮細胞のターンオーバーの異常などが起こっている。
【０００３】
基底膜はＩＶ型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質により構成される緻密な膜で、皮膚においては表皮と真皮の結合部に存在する。基底膜は表皮と真皮の結合を担い、皮膚の構造維持に重要であるとともに、表皮のターンオーバーの制御や表皮と真皮の間の情報伝達にも関与する。
【０００４】
皮膚基底膜を構成する細胞外マトリックスタンパク質の中で、特に重要な機能をもつタンパク質の一種としてラミニン５が知られている。ラミニン５（別名カリニン、エピリグリン、ナイセイン）は皮膚の基底膜に存在するラミニン分子種の一種として同定され、α３鎖、β３鎖、γ２鎖の３本のサブユニットで構成される分子量３８０〜４９０ｋＤａの糖タンパク質である（Ｃａｒｔｅｒ，Ｗ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．，６５，５９９−６１０，１９９１．，Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１４，５６７−５７６，１９９１．，Ｖｅｒｒａｎｄｏ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，９４２，４５−５６，１９８８．）。ラミニン５は表皮細胞により産生され、表皮細胞と基底膜の結合に関与するとともに、ＶＩＩ型コラーゲンと結合し、真皮と基底膜の結合にも関与する（Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１４，５６７−５７６，１９９１．，Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３８，７１９−７２８，１９９７．，Ｃｈｅｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１２，１７７−１８３，１９９９）。
【０００５】
ラミニン５遺伝子の異常が表皮・真皮間の剥離と水泡形成を特徴とする重篤な遺伝的疾患である結合型表皮水泡症（Ｈｅｒｌｉｔｚ’ｓ ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ ｂｕｌｌｏｓａ）を引き起こすことから、ラミニン５は正常な皮膚構造の維持に必要不可欠なタンパク質であることが知られている（Ａｂｅｒｄａｍ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，６，２９９−３０４，１９９４．，Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２４，３５７−３６０，１９９４．，Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，４，９５９−９６２，１９９５．）。また、ラミニン５は表皮細胞の遊走を促進させる活性をもち、かつ皮膚の創傷治癒部位でラミニン５遺伝子およびその受容体遺伝子の発現が上昇することから、創傷治癒に関与することが示唆されている（Ｖｅｒｒｎｄｏ，Ｐ．，ｅｔａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７１，５６７−５７４，１９９４．，Ｒｙａｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２２７７９−２２７８７，１９９４．）。
【０００６】
以上のようなことから、ラミニン５は、表皮と真皮の結合を担い、正常な皮膚構造の維持に重要であるとともに、皮膚が損傷を受けた場合には、表皮細胞の遊走を促進し、創傷治癒に働くと考えられる。
【０００７】
表皮細胞が基底膜の構成成分であるＩＶ型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質に接着するためには、その受容体として働くインテグリンが必要不可欠である。インテグリンはα鎖、β鎖が非共有結合で会合するヘテロダイマーで、細胞膜に発現して、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどの細胞外のリガンドと結合するとともに、細胞内ではテーリンやα−アクチニンなどの細胞骨格タンパク質と結合し、細胞と細胞外マトリックスあるいは細胞と細胞の結合に関与する。
【０００８】
現在、１６種類のα鎖、９種類のβ鎖が報告されており、これらα鎖、β鎖の組み合わせにより、リガンド特異性の異なる多様な分子が形成されている。インテグリンは細胞接着を介して、細胞増殖、細胞分化、細胞運動、アポトーシス、形態形成、免疫反応、創傷治癒、血液凝固、骨吸収などの多岐にわたる生物学的機能を担っている（Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．：Ｃｅｌｌ，６９：１１−２５，１９９２，Ｒｏｕｓｌａｔｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｅｌｌ，７７：４７７−４７８，１９９４）。
【０００９】
これまでに、ラミニン５の受容体としてインテグリンα６β４およびインテグリンα３β１が知られており、インテグリンα６β４は主に細胞接着に関与し、インテグリンα３β１は主に細胞の運動に関与することが知られている（Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１４：５６７−５７６，１９９１，Ｖｅｒｒｎｄｏ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．：Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７１：５６７−５７４，１９９４）。
【００１０】
インテグリンα６β４は、分子量１５０ｋＤａのα６鎖と２０５ｋＤａのβ４鎖のダイマーで、β４とダイマーを形成するα鎖としてはα６のみが報告されている（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．：ＥＭＢＯ Ｊ．，９：７５７−７６３，１９９０）。インテグリンα６β４は、上皮細胞、シュワン細胞、神経細胞、一部の内皮細胞などで発現しており、皮膚では表皮基底細胞の基底側に存在し、基底膜に存在するラミニン５と結合して、表皮と基底膜間の結合を担っている（Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１４：５６７−５７６，１９９１）。
【００１１】
ラミニン５遺伝子の変異と同様に、インテグリンβ４遺伝子の変異は、表皮・真皮間の剥離と水泡形成を特徴とする重篤な遺伝的疾患である先天性接合部型表皮水泡症（Ｈｅｒｌｉｔｚ’ｓ ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ ｂｕｌｌｏｓａ）を引き起こすことから、インテグリンα６β４とラミニン５との接着が正常な皮膚構造の維持に必要不可欠であることが知られている（Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，６：２９３−２９８，１９９４，Ｖｉｄａｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，１０：２２９−２３４，１９９５）。
【００１２】
インテグリンβ４遺伝子のノックアウトマウスは、先天性接合部型表皮水泡症と同様の表皮剥離がみられ、基底細胞がアポトーシスを起こしていることから、ラミニン５とインテグリンα６β４の結合は基底細胞の生存に重要であることが知られている（Ｄａｗｌｉｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３４：５５９−５７２，１９９６）。
【００１３】
ラミニン５とインテグリンα６β４の結合は、細胞増殖シグナルに関与するＲａｓ−ＭＡＰキナーゼの経路を介して、表皮細胞の増殖に関与することが知られている（Ｍａｉｎｉｅｒｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．：ＥＭＢＯ Ｊ．，１６：２３６５−２３７５，１９９７，Ｍａｉｎｉｅｒｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．：ＥＭＢＯ Ｊ．，１７：３９４０−３９５１，１９９８）。
【００１４】
以上のようなことから、インテグリンα６β４はラミニン５の受容体として、表皮と真皮の間の結合を担い、正常な皮膚構造の維持に重要であるとともに、表皮基底細胞の生存および増殖に重要な働きをする。
【００１５】
最近、頬や瞼などの露光部位では、２０歳代前半から基底膜の断裂や多重化などの皮膚基底膜の損傷が見られ、２０歳代後半から３０歳代前半に顕著に悪化することから、基底膜の損傷が皮膚老化を引き起こす重要な要因であり、精製ラミニン５やラミニン５の産生を促進する物質が基底膜の形成を促進し、基底膜ケアの有用な物質であることが示された｛Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．Ｊｐｎ．，総説，３５（１）１−７，２００１｝。また、老化に伴って表皮角化細胞のインテグリンβ４の発現が低下することから、皮膚の老化とインテグリンα６β４の発現低下に因果関係があることが示唆されていた（Ｌｅ ＶａｒｌｅｔＢ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，３：１７２−１７９，１９９８）。
【００１６】
以上のようなことから、皮膚の老化を防ぐために、基底膜の形成を促進する作用をもつ精製ラミニン５やラミニン５の産生を促進する植物抽出物や化合物を有効成分として含む組成物および表皮基底細胞を活性化する作用をもつインテグリンα６β４の産生を促進する植物抽出物を有効成分として含む組成物が開発されている（特開平１０−１４７５１５、特開平１１−３４３２２６、特開２０００−２２６３０８、特願２０００−３３１３１８、特願２００１−１５１４８５、特願２００１−３６６０５６、特願２００１−３８９００７）。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、さらに皮膚老化防止作用の高い組成物を提供することを課題とする。前述のように、ラミニン５産生促進剤またはインテグリンα６β４産生促進剤をそれぞれ単独で用いた老化防止用組成物の開発は試みられていたが、本発明では、それぞれ単独よりもより効果的な老化防止用組成物を開発することを課題とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
前述のように、ラミニン５産生促進剤またはインテグリンα６β４産生促進剤をそれぞれ単独で用いた老化防止用組成物の開発は従来から試みられていたが、ラミニン５産生促進剤およびインテグリンα６β４産生促進剤を組み合わせた老化防止用組成物の開発は試みられていなかった。
【００１９】
本発明者は、ラミニン５産生促進剤またはインテグリンα６β４産生剤をそれぞれ単独で用いた場合と双方を組み合わせた場合の光障害抑制作用について検討した。その結果、ラミニン５の産生を促進する成分とインテグリンα６β４の産生を促進する成分を組み合わせて用いることにより、より効果的に紫外線による細胞障害を抑制できることを見出し、本発明を完成した。
【００２０】
すなわち、本発明は、
１．ラミニン５の産生を促進する成分とインテグリンα６β４の産生を促進する成分を含む組成物、
２．ラミニン５の産生を促進する成分が下記（１）〜（３）
（１）リュウガン、タイセイ、ホソバタイセイ、リュウキュウアイ、ナルコユリおよびカギクルマバナルコユリの植物またはその抽出物
（２）フェニルプロパノイド類の化合物またはそれらの塩、あるいはそれらの化合物の配糖体またはそれらの塩
（３）コメヌカ油
から選ばれる１種または２種以上である上記１の組成物、
３．インテグリンα６β４の産生を促進する成分が、セイヨウキズタ、エキナセア、カボチャ、セイヨウタンポイポ、およびアンジェリカの植物またはその抽出物から選ばれる１種または２種以上である上記１または２の組成物、
４．皮膚基底膜賦活用および／または表皮基底細胞賦活用である上記１〜３のいずれかの組成物、
５．光障害抑制用である上記１〜３のいずれかの組成物、及び
６．上記１〜５のいずれかの組成物からなる皮膚外用剤、
に関する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
「ラミニン５の産生を促進する成分」は、皮膚基底膜を構成する細胞外マトリックスタンパク質の一種であるラミニン５の皮膚基底膜における存在量を増加させるものであれば良く、表皮細胞による産生を促進することにより、その量は増加する。
このような「ラミニン５の産生を促進する成分」としては、リュウガン、タイセイ、ホソバタイセイ、リュウキュウアイ、ナルコユリ、カギクルマバナルコユリの植物またはその抽出物、フェニルプロパノイド類の化合物またはそれらの塩、あるいはそれらの化合物の配糖体またはそれらの塩、コメヌカ油を挙げることができる。
「インテグリンα６β４の産生を促進する成分」は、ラミニン５の受容体として働くインテグリンα６β４の表皮基底細胞の基底側での存在量を増加させるものであれば良く、表皮細胞による産生を促進することにより、その量は増加する。
このような「インテグリンα６β４の産生を促進する成分」としては、セイヨウキズタ、エキナセア、カボチャ、セイヨウタンポポおよびアンジェリカの植物またはその抽出物を挙げることができる。
【００２２】
本発明に用いられるリュウガン（Ｅｕｐｈｏｒｉａ ｌｏｎｇａｎ （Ｌｏｕｒ．）Ｓｔｅｕｄ．）は、むくろじ科ユーフォリア属の植物である。仮種皮の部分は竜眼肉（リュウガンニク）と呼ばれ、鎮静、滋養強壮に処方され、物忘れや不眠症にも効果的で、神経の興奮を静める効力があるといわれている（「原色牧野和漢薬草大図鑑」北隆館）。
【００２３】
本発明に用いられるタイセイ（Ｉ． Ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ．）、ホソバタイセイ（Ｉｓａｔｉｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉａ Ｌ．）は、いずれもあぶらな科タイセイ属の植物である。根の部分は板藍根（バンランコン）と呼ばれ、種々の病原菌に対する抑制作用を有し、消炎、解熱、解毒、止血薬として用いられている（「原色牧野和漢薬草大図鑑」北隆館）。
【００２４】
本発明に用いられるリュウキュウアイ（Ｓｔｏｒｏｂｉｌａｎｔｈｅｓ ｆｌａｃｃｉｄｉｆｏｌｉｕｓ Ｎｅｅｓ）は、きつねのまご科イセハナビ属の植物である。この植物の根、根茎も板藍根（バンランコン）と呼ばれ、タイセイ（Ｉ． Ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ．）、ホソバタイセイ（Ｉｓａｔｉｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉａ Ｌ．）の根と同様の薬効を有する。また、葉の部分にも抗菌、解毒、解熱、消炎、止血作用があることが知られている（「原色牧野和漢薬草大図鑑」北隆館）。
【００２５】
本発明に用いられるナルコユリ（Ｐｏｌｙｇｏｎａｔｕｍ ｆｏｌｃａｔｕｍＡ． Ｇｒａｙ）、カギクルマバナルコユリ（Ｐｏｌｙｇｏｎａｔｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ Ｒｅｄｏｕｔｅ ｅｘ Ｒｅｄｏｕｔｅ）は、いずれもゆり科アマドコロ属の植物である。根茎の部分は黄精（オウセイ）と呼ばれ、種々の菌に対する抑制作用、アドレナリンによる高血糖に対する抑制作用、血圧降下作用があり、滋養強壮、糖尿病、動脈硬化症などの薬として用いられる（「原色牧野和漢薬草大図鑑」北隆館）。
【００２６】
本発明に用いられるセイヨウキズタ（Ｈｅｄｅｒａ ｈｅｌｉｘ Ｌ．）は、ウコギ科ヘデラ属の植物である。ヨーロッパからコーカサス地方に原産する。葉は神経痛、リウマチ痛、座骨神経痛を緩和するハップ剤や歯痛、百日咳用のチンキとして使用される（「ハーブの写真図鑑」レスリーブレムネス著、日本ヴォーグ社）。成分としては、ヘデリン、サポニン、フラボノイド、有機酸などを含む。洗浄作用、抗炎症作用、保湿作用、抗菌作用、痩身作用があり、化粧品に広く使用される（「化粧品ハンドブック」日光ケミカルズ株式会社）。特にニキビ、脂性肌用の洗顔料やクリーム、シャンプーなどに配合されている。
【００２７】
本発明に用いられるエキナセア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ，Ｅ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ，Ｅ．ｐａｌｌｉｄａ）は、キク科エキナセア属の植物である。北アメリカ原産で、アメリカ先住民の間で万能薬として、歯痛、喉の痛み、風邪、伝染病などの治療に約４００年前から利用されてきた。１９世紀末、ヨーロッパにも紹介され、栽培が始まった。成分としては多糖、カフェー酸誘導体、アルキルアミドなどを含む。免疫力を高め、風邪や感染症、皮膚病の治療や予防、炎症に効果があると言われている（「薬用ハーブの機能研究」健康産業新聞社）。
【００２８】
本発明に用いられるセイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）は、キク科タンポポ属の植物である。東ヨーロッパ原産で、葉は生でサラダとして、煎った根はコーヒーの代替として、花はワインの原料として用いられる。成分としてはトリテルペン、ステロール、糖類、ビタミン類、カリウムを含む。根は消化不良や便秘に効果があり、また、肝臓と胆嚢を刺激し、胆汁の分泌を増加させ、肝障害や黄疸に有効である。葉は強力な利尿作用があり、また、血液や組織の浄化作用もあり、皮膚病やリューマチの治療薬としても有効である（「ハーブ大全」小学館）。
【００２９】
本発明に用いられるアンジェリカ（Ａｎｇｅｌｉｃａ ａｒｃｈａｎｇｅｌｉｃａ Ｌ．）は、セリ科シシウド属の植物である。成分としては、アンゲリカラクトン、アンゲリシン、アンゲリカ酸、ベルガプテンや葉酸、ビタミンＢ１２などのビタミンＢ群などを含む。血行を良くし、女性ホルモンの分泌を調整する効用があり、貧血症、生理痛、生理不順、冷え性などに広く用いられる（「機能性ハーブの生理活性」常盤植物化学研究所）。
【００３０】
本発明に用いられるカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ Ｌ．）は、ウリ科カボチャ属の植物である。北アメリカ原産で、野菜としてなじみが深く、世界中で栽培されている。種子は栄養価が高く、食用にされる。成分としては、脂肪酸、リグナン、トコフェロール、微量元素であるセレンなどが含まれている。ヨーロッパでは、種子の油性の抽出物が、過敏膀胱や前立腺肥大症などの泌尿器系疾患の治療目的に用いられている（「機能性ハーブの生理活性」常盤植物化学研究所）。
【００３１】
本発明に用いられる植物は、葉、茎、芽、花、木質部、木皮部（樹皮）などの地上部、根、塊茎などの地下部、種子、樹脂などのすべての部位が使用可能である。
本発明における植物は、それら自体を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、それら自体を圧搾抽出することにより得られる搾汁、植物自体あるいはその乾燥物の水またはアルコール、エーテル、アセトンなどの有機溶媒による粗抽出物、および該粗抽出物を分配、カラムクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物画分などのすべてを含む。これらは単独で用いても良く、２種以上混合して用いても良い。
【００３２】
本発明で使用するフェニルプロパノイド類は、天然に存在する化合物群の一つであり、ベンゼン核（Ｃ６，ｐｈｅｎｙｌ）に直鎖状３炭素（Ｃ３，ｐｒｏｐａｎｅ）が結合したものである。これらの化合物は、広範な生物源から直接もしくは間接的に得ることが出来るが、化学合成品であってもよい。
本発明では、フェニルプロパノイド類として、特にカフェー酸、フェルラ酸、ケイヒ酸、ケイヒアルデヒド、オイゲノール、コニフェリルアルコール、クロロゲン酸などが好ましいが、これに限られるわけではない。
【００３３】
自然界では、維管束植物においてアミノ酸フェニルアラニン（イネ科ではチロシン）の脱アミノ化によりトランスケイヒ酸（イネ科ではｐ−クマリン酸）が生成される。トランスケイヒ酸は酸化されてｐ−クマリン酸、さらに酸化されてカフェー酸となる。カフェー酸はメチル化を受けてフェルラ酸となる。被子植物はフェルラ酸をさらに酸化して５−ヒドロキシフェルラ酸に、次にメチル化してシナピック酸とすることができるが、シダ植物や裸子植物はできない。自然界において、これら酸のフェノール性水酸基は部分的にメチル化され、そしてカルボキシル基は逐次還元されて対応するアルデヒド、アルコール、あるいはオレフィンとなる（「天然物化学」改訂第４版、三橋博ら編、南江堂）。
【００３４】
カフェー酸は下記式（１）で表され、肥満細胞からのヒスタミン遊離抑制効果や５−リポキシゲナーゼおよびロイコトリエン生成の阻害活性がある（「天然薬物辞典」奥田拓男編、廣川書店）。コーヒー豆、ノコギリソウ、オトギリソウなどに数％含まれるクロロゲン酸、ヨモギおよび同族植物の主成分の３，５−ｄｉ−Ｏ−カフェイルキナ酸、その他いわゆるカフェータンニンの構成成分として存在する。また、遊離してタバコ葉、サツマイモ、ナシ葉などの広い範囲の植物に存在する。カフェー酸は、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、無水酢酸、酢酸カリウムの混合物を加熱する（パーキン反応）ことにより得られる。また、クロロゲン酸の酸加水分解によって生成する。
【化１】
【００３５】
フェルラ酸は下記式（２）で表され、抗酸化作用、紫外線吸収能を持つことが知られている。それ自体およびその誘導体は植物の細胞壁を形成するリグニンの前駆体である。遊離状、エステル型、リグニンの形で、微量ながら広く植物に存在する（「化学大辞典」東京化学同人）。４−ヒドロキシ−３−メトキシベンズアルデヒドとマロン酸をピペリジン存在下ピリジン中で縮合脱炭酸させることにより得られる。また、コメヌカから効率的に抽出する方法が開発されている（特開平５−３３１１０１号）。
【化２】
【００３６】
ケイヒ酸は下記式（３）で表され、そのエステル類は香料および医薬品として用いられる（「天然薬物辞典」奥田拓男編、廣川書店）。通常、ケイヒ酸とはトランス形のものを指し、シス形のものはアロケイヒ酸と呼ばれる。シス形は不安定でトランス形になりやすい。カシア油、ペルーバルサム、トルーバルサムの樹脂などに遊離酸あるいはエステルとして存在する。ケイヒアルデヒドの酸化、あるいはベンズアルデヒド、無水酢酸、酢酸カリウムの混合物の加熱（パーキン反応）により得られる。
【化３】
【００３７】
ケイヒアルデヒドは下記式（４）で表され、強い特有の芳香と甘味があることから、菓子などの食品香料に用いられている（「天然薬物辞典」奥田拓男編、廣川書店）。また、医薬品、化粧品にも用いる。ケイの樹皮、葉に含まれ、ケイヒ油、カシア油の主成分で香りの本体であり、その他ミルラ油、パチョウリ油にも含まれる。ベンズアルデヒドとアセトアルデヒドをアルカリで縮合させて得られる。
【化４】
【００３８】
オイゲノールは下記式（５）で表され、バニリンの製造原料、香料、殺菌剤、防腐剤などに用いられる（「天然薬物辞典」奥田拓男編、廣川書店）。チョウジ油に多く含まれるほか、広く植物の精油中に存在するフェノール性精油成分である。グローブ油、桂葉油をアルカリ抽出することにより得られる。
【化５】
【００３９】
コニフェリルアルコールは下記式（６）で表され、針葉樹の形成層とその周辺の柔細胞、コンフリーの根、テンサイ、アスパラガスなどに配糖体のコニフェリンとして存在する（「天然薬物辞典」奥田拓男編、廣川書店）。植物体内で脱水素重合によってリグニン様の物質になる。リグニンには、抗腫瘍作用、肝カタラーゼ活性促進作用などの作用が認められている。コニフェリンに加水分解酵素エムルシンを作用させることにより得られる。
【化６】
【００４０】
クロロゲン酸は下記式（７）で表され、中枢神経興奮作用に加えて、胃液や胆汁分泌を促進する作用がある（「天然薬物辞典」奥田拓男編、廣川書店）。また、抗酸化作用（「フリーラジカルと和漢薬」奥田拓男・吉川敏一編、国際医薬出版）や癌細胞転移抑制作用（東京農工大・矢ケ崎教授ら、日本経済新聞２０００．９．４朝刊）が報告されている。コーヒー豆からはじめて単離されたが、双子葉植物の果実や葉などに広く分布し、特にナス科、キク科、セリ科などの植物にこれを多く含むものが多い。カフェー酸とキナ酸をエステル化することにより得られる。
【化７】
【００４１】
いずれの化合物も市販されており、これを用いることができる。
本発明における化合物は、それらを各種溶媒を用いて溶解した状態でも使用できる。例えば、水またはエタノール、メタノールなどのアルコール類、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール、エーテル、アセトン、酢酸エチルなどの有機溶媒を用いて溶解した状態で使用できる。これらは単独で用いても良く、２種以上混合して用いても良い。
【００４２】
本発明で使用するフェニルプロパノイド類の化合物の配糖体としては、カフェー酸の配糖体として、グルコカフェー酸｛３−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ；４’−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ｝、フェルラ酸の配糖体として、グルコフェルラ酸｛３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ；４−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ｝、オイゲノールの配糖体として、ササンクイン（オイゲノール β−プライムベロシド）｛２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−（２−ｐｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｅｎｏｌ；Ｏ−［β−Ｄ−Ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→６）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］｝、オイゲノール ジェンティオビオシド｛２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−（２−ｐｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｅｎｏｌ；Ｏ−［β−Ｄ−Ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→６）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］｝、オイゲノール ルティノシド｛２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−（２−ｐｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｅｎｏｌ；Ｏ−［α−Ｌ−Ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→６）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］｝、コニフェリルアルコールの配糖体として、コニフェリン｛３−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｏｌ；３’Ｍｅ ｅｔｈｅｒ，４’−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ｝、シトルシンＤ（イソコニフェリン）｛３−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｏｌ；３’Ｍｅ ｅｔｈｅｒ，１−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ｝、コニフェリノシド｛３−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｏｌ；３’Ｍｅ ｅｔｈｅｒ，４’−Ｏ−［β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→６）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］｝、イソコニフェリノシド｛３−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｏｌ；３’Ｍｅ ｅｔｈｅｒ，１，４’−ｄｉ−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ｝等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。また、本発明で使用するフェニルプロパノイド類の化合物またはそれらの配糖体の塩としては、例えばナトリウム塩、カルシウム塩等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００４３】
本発明で使用するコメヌカ油は、イネ種子の精米直後のコメヌカから得られる半乾性油であり、一般に市販されている。淡黄色の油状液体で、中性脂肪のほかに多量の遊離脂肪酸、ロウ分、トコフェロール、オリザノール、ステロール、微量のリン脂質、糖脂質、金属などを含む。脂肪酸の成分は、おもにオレイン酸、リノール酸、パルミチン酸である。トコフェロールやオリザノールの影響により、空気や熱に対して非常に安定である。表皮細胞や線維芽細胞などの皮膚細胞に対する毒性はほとんどなく、非常に安全性が高い。
【００４４】
コメヌカ油中のオリザノールが紫外線を吸収して皮膚を保護する効果がある。また、コレステロール低下作用もあり、舌触りが良く香味が良いので、食用油として用いられている。コメヌカ油脂肪酸はオレイン酸が多く、コメヌカ油から製造した石けんは水に溶けやすく、洗浄力がすぐれ、家庭用洗剤として使用されている。欧米では天然のサンスクリーンオイルとして使われている（「化粧品ハンドブック」日光ケミカルズ株式会社）。
【００４５】
本発明の組成物には、ラミニン５産生促進剤およびインテグリンα６β４産生促進剤が、それぞれ少なくとも１種以上含まれていれば良く、２種以上混合して用いても良い。
本発明に用いるラミニン５産生促進剤およびインテグリンα６β４産生促進剤の組成物への有効配合量は、ラミニン５産生促進剤およびインテグリンα６β４産生促進剤の調製法、製剤の形態などにより、適宜選択、決定され、特に限定されないが、それぞれ０．００１〜３０重量％が適当である。
【００４６】
ラミニン５産生促進剤およびインテグリンα６β４産生促進剤を含む本発明組成物は、表皮細胞におけるラミニン５およびインテグリンα６β４の産生を促進し、皮膚基底膜および表皮基底細胞の活性化、再生促進に有用であり、紫外線の照射により低下した皮膚基底膜および／または表皮基底細胞の働きを高めて、基底膜と基底細胞の結合力を強化し、いわゆる光老化した皮膚の再生作用を有する。
【００４７】
皮膚基底膜を構成する細胞外マトリックスタンパク種の一種であるラミニン５の産生を促進する成分およびその受容体として働くインテグリンα６β４の産生を促進する成分は、単独でも前記のような効果を有する。しかし、ラミニン５あるいはインテグリンα６β４は協調的に作用するために、例えば、紫外線暴露などにより、インテグリンα６β４の産生あるいは活性が低下している場合には、どんなにラミニン５の産生を促進しても、その受容体の量が限られているので、ある一定以上の効果は期待できない。ラミニン５の産生あるいは活性が低下している場合におけるインテグリンα６β４の産生促進についても同様である。したがって、それらの機能を十分に発揮させるために、表皮細胞におけるラミニン５の産生を促進し、皮膚基底膜を活性化すると同時に、インテグリンα６β４の産生を促進し、表皮基底細胞を活性化することで、相乗的な効果が得られる。
【００４８】
本発明の組成物には、植物油のような油脂類、高級脂肪酸、高級アルコール、シリコーン、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、防腐剤、糖類、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子のような高分子、増粘剤、粉体成分、紫外線吸収剤、紫外線遮断剤、ヒアルロン酸のような保湿剤、香料、ｐＨ調整剤、乾燥剤等を含有させることができる。また、ビタミン類、皮膚賦活剤、血行促進剤、常在菌コントロール剤、活性酸素消去剤、抗炎症剤、抗癌剤、美白剤、殺菌剤等の他の薬効成分、生理活性成分を含有させることもできる。
【００４９】
油脂類としては、例えばツバキ油、月見草油、マカデミアナッツ油、オリーブ油、ナタネ油、トウモロコシ油、ゴマ油、ホホバ油、胚芽油、小麦胚芽油、トリオクタン酸グリセリン、等の液体油脂、カカオ脂、ヤシ油、硬化ヤシ油、パーム油、パーム核油、モクロウ、モクロウ核油、硬化油、硬化ヒマシ油等の固体油脂、ミツロウ、キャンデリラロウ、綿ロウ、ヌカロウ、ラノリン、酢酸ラノリン、液状ラノリン、サトウキビロウ等のロウ類が挙げられる。
【００５０】
炭化水素類としては、流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、マイクロクリスタリンワックス等が挙げられる。
高級脂肪酸として、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）等が挙げられる。
【００５１】
高級アルコールとして、例えば、ラウリルアルコール、ステアリルアルコール、セチルアルコール、セトステアリルアルコール等の直鎖アルコール、モノステアリルグリセリンエーテル、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、オクチルドデカノール等の分枝鎖アルコール等が挙げられる。
【００５２】
シリコーンとして、例えば、鎖状ポリシロキサンのジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン等、環状ポリシロキサンのデカメチルシクロペンタシロキサン等が挙げられる。
【００５３】
アニオン界面活性剤として、例えば、ラウリン酸ナトリウム等の脂肪酸塩、ラウリル硫酸ナトリウム等の高級アルキル硫酸エステル塩、ＰＯＥラウリル硫酸トリエタノールアミン等のアルキルエーテル硫酸エステル塩、Ｎ−アシルサルコシン酸、スルホコハク酸塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩等が挙げられる。
カチオン界面活性剤として、例えば、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム等のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等が挙げられる。
両性界面活性剤として、アルキルベタイン、アミドベタイン等のベタイン系界面活性剤等が挙げられる。
非イオン界面活性剤として、例えば、ソルビタンモノオレエート等のソルビタン脂肪酸エステル類、硬化ヒマシ油誘導体が挙げられる。
【００５４】
防腐剤として、例えばメチルパラベン、エチルパラベン等を挙げることができる。
金属イオン封鎖剤として、例えばエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エデト酸、エデト酸ナトリウム塩等のエデト酸塩を挙げることができる。
【００５５】
高分子として、例えば、アラビアゴム、トラガカントガム、ガラクタン、グァーガム、カラギーナン、ペクチン、寒天、クインスシード、デキストラン、プルランカルボキシメチルデンプン、コラーゲン、カゼイン、ゼラチンメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、アルギン酸ナトリウムカルボキシビニルポリマー（ＣＡＲＢＯＰＯＬ等）等のビニル系高分子、等を挙げることができる。
【００５６】
増粘剤として、カラギーナン、トラガカントガム、クインスシード、カゼイン、デキストリン、ゼラチン、ＣＭＣ、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースカルボキシビニルポリマー、グァーガム、キサンタンガム、ベントナイト等を挙げることができる。
【００５７】
粉末成分としては、タルク、カオリン、雲母、シリカ、ゼオライト、ポリエチレン粉末、ポリスチレン粉末、セルロース粉末、無機白色顔料、無機赤色系顔料、酸化チタンコーテッドマイカ、酸化チタンコーテッドタルク、着色酸化チタンコーテッドマイカ等のパール顔料、赤色２０１号、赤色２０２号等の有機顔料を挙げることができる。
【００５８】
紫外線吸収剤としては、パラアミノ安息香酸、サリチル酸フェニル、パラメトキシケイ皮酸イソプロピル、パラメトキシケイ皮酸オクチル、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン等を挙げることができる。
紫外線遮断剤として、酸化チタン、タルク、カルミン、ベントナイト、カオリン、酸化亜鉛等を挙げることができる。
【００５９】
保湿剤として、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，２−ペンタンジオール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、キシリトール、マルチトール、マルトース、ソルビトール、ブドウ糖、果糖、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、ピロリドンカルボン酸、シクロデキストリン等が挙げられる。
【００６０】
薬効成分としては、ビタミンＡ油、レチノール等のビタミンＡ類、リボフラビン等のビタミンＢ2類、ピリドキシン塩酸塩等のＢ6類、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸モノパルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸ジパルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド等のビタミンＣ類、パントテン酸カルシウム等のパントテン酸類、ビタミンＤ2、コレカルシフェロール等のビタミンＤ類；α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、ニコチン酸ＤＬ−α−トコフェロール等のビタミンＥ類等のビタミン類を挙げることができる。プラセンタエキス、グルタチオン、ユキノシタ抽出物等の美白剤、ローヤルゼリー、ブナノキエキス等の皮膚賦活剤、カプサイシン、ジンゲロン、カンタリスチンキ、イクタモール、カフェイン、タンニン酸、γ−オリザノール等の血行促進剤、グリチルリチン酸誘導体、グリチルレチン酸誘導体、アズレン等の消炎剤、アルギニン、セリン、ロイシン、トリプトファン等のアミノ酸類、常在菌コントロール剤のマルトースショ糖縮合物、塩化リゾチーム等を挙げることができる。さらに、カミツレエキス、パセリエキス、ワイン酵母エキス、グレープフルーツエキス、スイカズラエキス、コメエキス、ブドウエキス、ホップエキス、ビワエキス、オウバクエキス、ヨクイニンエキス、センブリエキス、メリロートエキス、バーチエキス、カンゾウエキス、シャクヤクエキス、サボンソウエキス、ヘチマエキス、トウガラシエキス、レモンエキス、ゲンチアナエキス、シソエキス、アロエエキス、ローズマリーエキス、セージエキス、タイムエキス、茶エキス、海藻エキス、キューカンバーエキス、チョウジエキス、ニンジンエキス、マロニエエキス、ハマメリスエキス、クワエキス等の各種抽出物を挙げることができる。
【００６１】
本発明の組成物は、例えば水溶液、油剤、乳液、懸濁液等の液剤、ゲル、クリーム等の半固形剤、粉末、顆粒、カプセル、マイクロカプセル、固形等の固形剤の形態で適用可能である。従来から公知の方法でこれらの形態に調製し、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏、硬膏、ハップ剤、エアゾール剤、坐剤、注射剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、シロップ剤、トローチ剤等の種々の剤型とすることができる。
【００６２】
これらを身体に塗布、貼付、噴霧、飲用等により適用することができる。特にこれら剤型の中で、ローション剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤等が皮膚外用剤に適している。化粧料としては、化粧水、乳液、クリーム、パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップクリーム、乳液状又はクリーム状あるいは軟膏型のファンデーション、口紅、アイカラー、チークカラーといったメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション等の身体用化粧料等、入浴剤、口腔化粧料、毛髪化粧料とすることができる。
【００６３】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［植物抽出液の調製］
リュウガン（Ｅｕｐｈｏｒｉａ ｌｏｎｇａｎ （Ｌｏｕｒ．） Ｓｔｅｕｄ．）の仮種皮（リュウガンニク）、ホソバタイセイ（Ｉｓａｔｉｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉａ Ｌ．）の根（バンランコン）、ナルコユリ（Ｐｏｌｙｇｏｎａｔｕｍｆｏｌｃａｔｕｍ Ａ． Ｇｒａｙ）の根茎（オウセイ）、セイヨウサンザシ（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ ｏｘｙａｃａｎｔｈａ Ｌ．）の葉、コウカサイ（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ ｐｌｉｃａｔａ Ｓｔａｐｆ）の花の蕾（キンシンサイ）、セイヨウキズタ（Ｈｅｄｅｒａ ｈｅｌｉｘ Ｌ．）の葉、エキナセアプルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ Ｌ． Ｍｏｅｎｃｈ）の根、薬用カボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｅ ｐｅｐｏ Ｌ．）の種子、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｇ．）の根、アンジェリカ（Ａｎｇｅｌｉｃａ ａｒｃｈａｎｇｅｌｉｃａ Ｌ．）の根、セイヨウイラクサ（Ｕｒｔｉｃａ ｄｉｏｉｃａ Ｌ．）の根、ゲンチアナ（Ｇｅｎｔｉａｎａｌｕｔｅａ Ｌ．）の根を細切し、その各１ｋｇに９９．５％エタノール３Ｌを加え、室温で一晩浸漬した。これを濾過し、各抽出液を得た。各抽出液を濃縮したところ、その蒸発残分はそれぞれ７５ｇ、１１０ｇ、１３５ｇ、９８ｇ、１０２ｇ、６５ｇ、２３ｇ、１３５ｇ、４５ｇ、７８ｇ、５６ｇ、４３ｇであった。なお、ここで、セイヨウサンザシ（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ ｏｘｙａｃａｎｔｈａ Ｌ．）の葉、コウカサイ（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ ｐｌｉｃａｔａ Ｓｔａｐｆ）の花の蕾（キンシンサイ）セイヨウイラクサ（Ｕｒｔｉｃａ ｄｉｏｉｃａ Ｌ．）の根、ゲンチアナ（Ｇｅｎｔｉａｎａ ｌｕｔｅａ Ｌ．）の抽出液は、比較対照のために調製した。
【００６４】
［試験結果１ 植物抽出液およびフェルラ酸によるラミニン５産生促進作用の測定］
表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）および培地（ＫＧＭ）は、胎児由来正常ヒト表皮角化細胞（旭テクノグラス）およびＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂｕｌｌｅｔ Ｋｉｔ（旭テクノグラス）を用いた。細胞はＫＧＭで３７℃−５％ＣＯ2インキュベーターにて培養した。本実験には継代数が３〜５代の細胞を使用した。
ＮＨＥＫをＫＧＭで培養後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて、接着細胞を培養ディッシュから剥がした後、トリプシン中和溶液を用いてトリプシンを中和した。遠心分離により細胞を集めた後、１．２５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＫＧＭにて再懸濁した。
【００６５】
この細胞懸濁液を４ｍｌ／ウェルで６ウェルプレートに播種し、２４時間培養後、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、前記の方法により調製した各植物抽出液およびフェルラ酸（築野食品工業）を添加したＫＧＭで２４時間培養した。培養後、細胞培養上清を回収した。８００ｒｐｍ、５分間遠心して浮遊細胞を除去後、１５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心して細胞片を除去した。８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加して４℃で一晩攪拌した。２０，０００ｒｐ、３０分間遠心してタンパク質を沈降させ、上清を除去後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で４℃、一晩透析後、２０倍濃縮になるように２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加え、ウエスタンブロッティング用サンプルとして用いた。ＦＢＳは、ラミニン５の産生を促進する因子として公知の物質であり、ここでは対照として用いた（特開平１１−３４３２２６）。
【００６６】
サンプル中のタンパク質を非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により分離後、ニトロセルロース膜に転写した。転写後のニトロセルロース膜をブロッキング溶液（５％のスキムミルクを含むＰＢＳ）に浸し、室温で１時間ブロッキングした。洗浄液｛０．１％のＢＳＡおよび０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳ｝で洗浄後、一次抗体溶液｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したラミニンγ２鎖に対するモノクローナル抗体（クローンＤ４Ｂ５）｝に浸し、室温で一晩反応させた。洗浄後、二次抗体溶液（洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したビオチン化抗マウスイムノグロブリンＧ）に浸し、室温で１時間反応させた。洗浄後、酵素溶液（洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したアルカリフォスファターゼアビジンＤ）に浸し、室温で１時間反応させた。洗浄後、基質液｛ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ（ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）｝に浸し、室温で１５〜３０分間反応させた。
【００６７】
ＦＢＳおよび各植物抽出液を０．１％で処理した時の結果を図１に示す。ここでＦＢＳを０．１％で処理するとは、ＦＢＳの原液を培地量の０．１％で加えて処理することをいう。また、植物抽出液を０．１％で処理するとは、固形分濃度にして０．１重量％になるように、エタノールで１００ｍｇ／ｍｌに調製した植物抽出液を培地量の１重量％加えて処理することをいう。ここで、２本のラミニン５のバンドが見られるが、上のバンドはγ２鎖全長型ラミニン５であり、下のバンドはγ２鎖が酵素により限定分解されたγ２鎖分解型ラミニン５である。リュウガンの仮種皮（リュウガンニク）、ホソバタイセイの根（バンランコン）、ナルコユリの根茎（オウセイ）の各植物抽出液により、γ２鎖全長型およびγ２鎖分解型のラミニン５の発現が有意に促進された。一方、セイヨウサンザシの根、キンシンサイの根の抽出液で処理した場合は、ラミニン５の発現に対する促進活性は見られなかった。このことから、本発明のリュウガン、ホソバタイセイおよびナルコユリがラミニン５産生促進のために選択的に作用することが分かった。
【００６８】
ＦＢＳおよびフェルラ酸の濃度を変えて処理した時の結果を図２に示す。ここでＦＢＳを０．１０％および１．００％で処理するとは、ＦＢＳの原液を培地量の０．１０％および１．００％で加えて処理することをいう。また、フェルラ酸を０．０１％、０．１０％および１．００％で処理するとは、固形分濃度にして０．０１重量％、０．１０重量％および１．００重量％になるように、エタノールで１０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌおよび１ｇ／ｍｌに調製したフェルラ酸溶液を培地量の１重量％加えて処理することをいう。ここで、２本のラミニン５のバンドが見られるが、上のバンドはγ２鎖全長型ラミニン５であり、下のバンドはγ２鎖が酵素により限定分解されたγ２鎖分解型ラミニン５である。フェルラ酸溶液により、濃度依存的にγ２鎖全長型およびγ２鎖分解型ラミニン５の発現が促進された。また、フェルラ酸溶液を０．１％および１．０％で処理した場合、ＦＢＳを１．０％で処理した場合と同程度の活性が見られた。
【００６９】
［試験結果２ コメヌカ油によるラミニン５産生促進作用の測定］
ヒト皮膚三次元モデルは、ＴＥＳＴＳＫＩＮ（ＬＳＥ−ｈｉｇｈ）（東洋紡績）を用い、プロトコールにしたがって培養した。植物性スクワラン（花王）にＦＢＳまたはコメヌカ油（築野食品工業）を溶解し、アッセイリング内の組織上に８０μｌ添加し、２４時間培養した。ＦＢＳはラミニン５の産生を促進する公知の物質であり、ここでは対照として用いた（特開平１１−３４３２２６）。培養液で数回洗浄して薬剤を完全に除去した後、ＵＶＢを０および２４０ｍＪ／ｃｍ2で照射した。新たに薬剤を添加し、さらに２４時間培養した。組織を回収し、組織抽出用溶液｛５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１％ （Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）｝を加え、ホモジナイズした。１５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心して組織片を除去した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）にて透析した。
【００７０】
この組織抽出液を用いて、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）によりラミニン５産生促進作用を調べた。組織抽出液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で適当に希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレートに４℃で１８時間吸着させた。細胞培養上清液を除去後、ブロッキング溶液｛１％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（−）｝に浸し、３７℃で１時間ブロッキングした。洗浄液｛０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（和光純薬）を含むＰＢＳ（−）｝にて洗浄後、一次抗体溶液｛洗浄液で５ｍｇ／ｍｌに調製したラミニンγ２鎖に対するモノクローナル抗体（クローンＤ４Ｂ５）（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．，５０，７−１４，１９９８．）｝を添加し、３７℃で２時間反応させた。洗浄後、二次抗体｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したビオチン化抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）｝を添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後、酵素溶液｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したアルカリフォスファターゼアビジンＤ（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）｝を添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後、基質液｛１ｍｇ／ｍｌのｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を含む０．７５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０．３）｝を添加し、３７℃で３０分間反応後、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【００７１】
ＦＢＳを１．０％、コメヌカ油を０．１％、１．０％および３．０％で処理した時の結果を図３に示す。ここでＦＢＳを１．０％で処理するとは、ＦＢＳの原液を植物性スクワランに１．０％で加えて処理することをいう。また、コメヌカ油を０．１％、１．０％および３．０％で処理するとは、コメヌカ油の原液を植物性スクワランにそれぞれ０．１％、１．０％および３．０％で加えて処理することをいう。薬剤を無処理で、ＵＶＢを非照射の場合を１００％として評価した。その結果、コメヌカ油はＵＶＢ非照射および照射のいずれにおいても濃度依存的にラミニン５産生を促進した。尚、ＦＢＳを処理した場合も同様にラミニン５の産生を促進した。
【００７２】
［試験結果３ 表皮角化細胞におけるインテグリンα６β４産生促進作用の測定］
ＮＨＥＫをＫＧＭで１．２５×１０5／ｍｌとなるように懸濁し、４ｍｌ／ウェルで６穴プレートに播種し、２４時間培養した。前記の方法により調製した各植物抽出液およびＦＢＳを添加したＫＧＭを４ｍｌ／ウェルで処理し、さらに２４時間培養した。培養後、ＴＲＩＺＯＬ試薬（ライフテックオリエンタル）を用いて、プロトコールに従い全ＲＮＡを回収した。ＦＢＳは、インテグリンα６ｍＲＮＡおよびインテグリンβ４ｍＲＮＡの発現を促進する因子として公知の物質であり、ここでは対照として用いた。
【００７３】
回収した全ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）ｈｉｇｈ（東洋紡）により、インテグリンα６ｍＲＮＡ、インテグリンβ４ｍＲＮＡおよびＧ３ＰＤＨｍＲＮＡの発現促進活性を測定した。Ｇ３ＰＤＨ遺伝子はハウスキーピング遺伝子として知られ、全ての細胞で恒常的に発現していることから、コントロール遺伝子として広く用いられている。ＰＣＲ用プライマーとして、インテグリンα６は５’−ＧＡＡ ＣＴＧ ＴＧＴ ＧＡＡ ＣＡＴ ＣＡＧ Ａ−３’および５’−ＡＴＣ ＣＴＴ ＡＣＡ ＧＣＡ ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＧ−３’を用い、インテグリンβ４は５’−ＣＧＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＣＴＴ ＡＴＴ ＧＡＧ ＡＡＣ−３’および５’−ＧＡＧ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＴＧＴ ＧＣＴ ＴＡＧ−３’を用い、Ｇ３ＰＤＨは５’−ＡＣＣ ＡＣＡ ＧＴＣＣＡＴ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＣ−３’および５’−ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＣＴＧ ＴＡ−３’を用いた。ＰＣＲの反応条件は、インテグリンα６およびインテグリンβ４が、９４℃、７分処理後、９４℃、１分、５６℃、１分、７４℃、１分を２５回繰り返した後、７４℃、１０分処理し、４℃で保存した。一方、Ｇ３ＰＤＨは、９４℃、７分処理後、９４℃、１分、５８℃、１分、７４℃、１分を２０回繰り返した後、７４℃、１０分処理し、４℃で保存した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を電気泳動後、エチジウムブロマイドにより染色し、写真撮影した。
【００７４】
各植物抽出液を０．１％で処理した時の結果を図４に示す。ここで植物抽出液を０．１％で処理するとは、固形分濃度にして０．１重量％になるように、エタノールで１００ｍｇ／ｍｌに調製した植物抽出液を培地量の１重量％加えて処理することをいう。セイヨウキズタの葉、エキナセアプルプレアの根、薬用カボチャの種子、セイヨウタンポポの根、アンジェリカの根の各植物抽出液を処理した場合は、無処理対照に比べてインテグリンα６ｍＲＮＡおよびインテグリンβ４ｍＲＮＡの発現が有意に促進された。一方、セイヨウイラクサの根、ゲンチアナの根の抽出液で処理した場合は、インテグリンα６ｍＲＮＡおよびインテグリンβ４ｍＲＮＡの発現に対する促進活性は見られなかった。尚、Ｇ３ＰＤＨの発現は植物抽出液の処理の有無に関わらず、同程度であった。このことから、本発明のセイヨウキズタ、エキナセアプルプレア、薬用カボチャ、セイヨウタンポポ、およびアンジェリカがインテグリンα６β４産生促進のために選択的に作用することが分かった。
【００７５】
セイヨウキズタの葉の抽出液を濃度を変えて処理した時の結果を図５に示す。図５における濃度も、前記と同じで培地量に対する固形分濃度を表す。セイヨウキズタの葉の抽出液により、濃度依存的にインテグリンα６ｍＲＮＡおよびインテグリンβ４ｍＲＮＡの発現が促進された。また、セイヨウキズタの葉の抽出液を０．１％および１．０％で処理した場合、ＦＢＳを０．１％および１．０％で処理した場合と同程度の活性が見られた。尚、Ｇ３ＰＤＨの発現は植物抽出液の処理の有無に関わらず、同程度であった。
【００７６】
［試験結果５ ヒト表皮角化細胞におけるラミニン５産生促進剤およびインテグリンα６β４産生促進剤の光障害抑制作用の測定］
ＮＨＥＫをＫＧＭで培養後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて、接着細胞を培養ディッシュから剥がした後、トリプシン中和溶液を用いてトリプシンを中和した。遠心分離により細胞を集めた後、２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＫＧＭにて再懸濁した。細胞懸濁液を２４ウェルプレートに１ｍｌ／ウェルで播種し、２４時間培養した。ＵＶＢを０および７５ｍＪ／ｃｍ2で照射し、さらに２４時間培養した。ＰＢＳ（−）で洗浄し浮遊細胞を除去した後、５％グルタルアルデヒド水溶液にて室温、１５分間処理し、細胞を固定した。水道水にて洗浄後、蛍光染色液｛５μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．００１％のポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬）を含む水溶液｝を室温、暗所にて１．５時間処理した。水道水にて洗浄後、蛍光プレートリーダーを用いて、蛍光強度を測定することにより細胞生存率を評価した。
【００７７】
フェルラ酸および各植物抽出液を０．１％で処理した時の結果を図６に示す。図６における濃度も、前記と同じで培地量に対する固形分濃度を表す。薬剤を無処理で、ＵＶＢを非照射の場合を１００％として評価した。ＵＶＢ非照射の場合は、フェルラ酸および各植物抽出液をそれぞれ単独または組み合わせて処理したいずれの場合でも、無処理と同程度の細胞生存率であった。ＵＶＢを照射した場合は、無処理に比べてフェルラ酸、セイヨウキズタおよびエキナセアをそれぞれ単独で処理した場合は有意に細胞生存率が上昇したが、フェルラ酸およびセイヨウキズタまたはエキナセアを組み合わせて処理した場合は、それぞれ単独よりもより効果的に細胞生存率が上昇した。一方、セイヨウイラクサおよびゲンチアナはフェルラ酸の有無に関わらず、無処理と同程度の細胞生存率であった。よって、フェルラ酸およびセイヨウキズタまたはエキナセアの組み合わせが、光障害抑制のために選択的に作用することが分かった。
【００７８】
フェルラ酸および各植物抽出液をそれぞれ単独で０．０１％および０．１％、フェルラ酸および各植物抽出液を合わせて０．０１％および０．１％で処理した時の結果を図７に示す。図７における濃度も、前記と同じで培地量に対する固形分濃度を表す。薬剤を無処理で、ＵＶＢを非照射の場合を１００％として評価した。ＵＶＢ非照射の場合は、フェルラ酸および各植物抽出液をそれぞれ単独または組み合わせて処理したいずれの場合でも、無処理と同程度の細胞生存率であった。ＵＶＢを照射した場合において、フェルラ酸およびセイヨウキズタをそれぞれ単独で０．０１％処理した場合は無処理と同程度の細胞生存率であったが、フェルラ酸およびセイヨウキズタを合わせて０．０１％処理した場合は、細胞生存率が上昇した。同様に、フェルラ酸およびセイヨウキズタを合わせて０．１％処理した場合もフェルラ酸およびセイヨウキズタをそれぞれ単独で０．１％処理した場合に比べて、細胞生存率が上昇した。よって、フェルラ酸およびセイヨウキズタの組み合わせが、光障害抑制のために相乗的に作用することが分かった。
【００７９】
［試験結果６ ヒト皮膚三次元モデルにおけるラミニン５産生促進剤およびインテグリンα６β４産生促進剤の光障害抑制作用の測定］
ヒト皮膚三次元モデルは、ＴＥＳＴＳＫＩＮ（ＬＳＥ−ｈｉｇｈ）（東洋紡績）を用い、プロトコールにしたがって培養した。植物性スクワランにコメヌカ油および各植物抽出液を溶解し、アッセイリング内の組織上に８０μｌ添加し、２４時間培養した。培養液で数回洗浄して薬剤を完全に除去した後、ＵＶＢを０および２４０ｍＪ／ｃｍ2で照射した。新たに薬剤を添加し、さらに２４時間培養後、組織培養液を回収し、１５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心して組織片を除去した。
【００８０】
この組織培養液を用いて、細胞膜に傷害を受けた細胞から遊離される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を測定することにより、細胞毒性を測定した。ＬＤＨ活性の測定は、ＬＤＨ−細胞毒性テストキット（和光純薬）を用いて行った。ＰＢＳ（−）を用いて適当に希釈した組織培養液を９６ウェルの反応プレートに分注後、発色液を処理し、室温で２０分間反応させた。反応停止液を処理後、マイクロプレートリーダーにより５６０ｎｍの吸光度を測定し、細胞毒性を評価した。
【００８１】
コメヌカ油を１．０％、各植物抽出液を０．１％で処理した時の結果を図８に示す。図８における濃度も、前記と同じで植物性スクワランに対する固形分濃度を表す。薬剤を無処理で、ＵＶＢを非照射の場合の細胞毒性率を１００％として評価した。ＵＶＢを非照射の場合は、薬剤処理の有無に関わらず、ほぼ同程度の細胞毒性率であった。ＵＶＢを照射した場合は、無処理に比べてコメヌカ油、セイヨウキズタおよびエキナセアをそれぞれ単独で処理した場合は有意に細胞生存率が上昇したが、コメヌカ油およびセイヨウキズタまたはエキナセアを組み合わせて処理した場合は、それぞれ単独よりもより効果的に細胞生存率が上昇した。一方、セイヨウイラクサおよびゲンチアナはコメヌカ油の有無に関わらず、無処理と同程度の細胞生存率であった。よって、コメヌカ油およびセイヨウキズタまたはエキナセアの組み合わせが、光障害抑制のために選択的に作用することが分かった。
【００８２】
以下に、本発明の処方例を示す。
＜処方例１＞ クリーム
下記の処方（単位は質量％）により、クリームを製造した。
（１）ステアリルアルコール ６．０％
（２）ステアリン酸 ２．０％
（３）水添ラノリン ４．０％
（４）スクワラン ９．０％
（５）オクチルドデカノール １０．０％
（６）ＰＯＥ（２５）セチルアルコールエーテル ３．０％
（７）モノステアリン酸グリセリン ２．０％
（８）コメヌカ油 １．０％
（９）防腐剤 適量
（１０）香料 適量
（１１）セイヨウキズタ抽出液 １．０％
（１２）１，３ブチレングリコール ６．０％
（１３）ＰＥＧ １５００ ４．０％
（１４）精製水 残余
上記成分（１）〜（１０）を８０℃に加熱溶解し油相とする。成分（１１）〜（１４）を７０℃に加熱溶解し水相とする。油相に水相を徐々に加え乳化し、攪拌しながら４０℃まで冷却し、さらに３０℃まで攪拌冷却してクリームを得た。
【００８３】
＜処方例２＞ 錠剤
下記の処方（単位は質量％）により、錠剤を製造した。
コメヌカ油 １０．０％
セイヨウキズタ抽出液 １０．０％
乳糖 ６５．０％
コーンスターチ １４．０％
グァーガム １．０％
【００８４】
【発明の効果】
以上に説明したように、ラミニン５産生促進剤およびインテグリンα６β４産生促進剤を含む本発明組成物は、表皮細胞におけるラミニン５およびインテグリンα６β４の産生を促進し、皮膚基底膜と表皮基底細胞の接着を促進することにより、表皮と基底膜の構造維持および機能向上を促す。したがって、老化した皮膚、特に紫外線により障害を受けた皮膚に対して、表皮と基底膜の構造異常および機能低下を予防、防止、改善することにより、しわ、しみ、くすみ、たるみのない若々しい肌の状態を維持することができる。
【００８５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト表皮角化細胞に各植物抽出液を濃度依存的に処理した場合のラミニン５の産生を促進する作用を示す図である。
【図２】ヒト表皮角化細胞にフェルラ酸を濃度依存的に処理した場合のラミニン５の産生を促進する作用を示す図である。
【図３】ヒト皮膚三次元モデルにコメヌカ油を濃度依存的に処理した場合のラミニン５の産生を促進する作用を示す図である。
【図４】ヒト表皮角化細胞に各植物抽出液を処理した場合のインテグリンα６およびβ４の産生を促進する作用を示す図である。
【図５】ヒト表皮角化細胞にセイヨウキズタの葉の抽出液を濃度依存的に処理した場合のインテグリンα６およびβ４の産生を促進する作用を示す図である。
【図６】ヒト表皮角化細胞にフェルラ酸および各植物抽出液を処理した場合の光障害を抑制する作用を示す図である。
【図７】ヒト表皮角化細胞にフェルラ酸およびセイヨウキズタの葉の抽出液を処理した場合の光障害を抑制する作用を示す図である。
【図８】ヒト皮膚三次元モデルにコメヌカ油および各植物抽出液を処理した場合の光障害を抑制する作用を示す図である。
【発明が属する技術分野】
本発明は、皮膚基底膜の構成成分であるラミニン５の産生を促進する成分と表皮基底細胞の細胞膜に存在し、ラミニン５の受容体として機能するインテグリンα６β４の産生を促進する成分を含む組成物、およびその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、しわ、しみ、くすみ、たるみなど、皮膚の老化に伴って起こる変化には、加齢、日光曝露、環境によるストレス、精神的ストレスなどが関与することが知られている。皮膚内部のミクロの変化としては、真皮でのＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンおよびエラスチンなどの弾性繊維の減少や変性、基底膜でのＩＶ型コラーゲンやラミニンなどの減少や変性、表皮細胞のターンオーバーの異常などが起こっている。
【０００３】
基底膜はＩＶ型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質により構成される緻密な膜で、皮膚においては表皮と真皮の結合部に存在する。基底膜は表皮と真皮の結合を担い、皮膚の構造維持に重要であるとともに、表皮のターンオーバーの制御や表皮と真皮の間の情報伝達にも関与する。
【０００４】
皮膚基底膜を構成する細胞外マトリックスタンパク質の中で、特に重要な機能をもつタンパク質の一種としてラミニン５が知られている。ラミニン５（別名カリニン、エピリグリン、ナイセイン）は皮膚の基底膜に存在するラミニン分子種の一種として同定され、α３鎖、β３鎖、γ２鎖の３本のサブユニットで構成される分子量３８０〜４９０ｋＤａの糖タンパク質である（Ｃａｒｔｅｒ，Ｗ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．，６５，５９９−６１０，１９９１．，Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１４，５６７−５７６，１９９１．，Ｖｅｒｒａｎｄｏ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，９４２，４５−５６，１９８８．）。ラミニン５は表皮細胞により産生され、表皮細胞と基底膜の結合に関与するとともに、ＶＩＩ型コラーゲンと結合し、真皮と基底膜の結合にも関与する（Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１４，５６７−５７６，１９９１．，Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３８，７１９−７２８，１９９７．，Ｃｈｅｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１２，１７７−１８３，１９９９）。
【０００５】
ラミニン５遺伝子の異常が表皮・真皮間の剥離と水泡形成を特徴とする重篤な遺伝的疾患である結合型表皮水泡症（Ｈｅｒｌｉｔｚ’ｓ ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ ｂｕｌｌｏｓａ）を引き起こすことから、ラミニン５は正常な皮膚構造の維持に必要不可欠なタンパク質であることが知られている（Ａｂｅｒｄａｍ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，６，２９９−３０４，１９９４．，Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２４，３５７−３６０，１９９４．，Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，４，９５９−９６２，１９９５．）。また、ラミニン５は表皮細胞の遊走を促進させる活性をもち、かつ皮膚の創傷治癒部位でラミニン５遺伝子およびその受容体遺伝子の発現が上昇することから、創傷治癒に関与することが示唆されている（Ｖｅｒｒｎｄｏ，Ｐ．，ｅｔａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７１，５６７−５７４，１９９４．，Ｒｙａｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２２７７９−２２７８７，１９９４．）。
【０００６】
以上のようなことから、ラミニン５は、表皮と真皮の結合を担い、正常な皮膚構造の維持に重要であるとともに、皮膚が損傷を受けた場合には、表皮細胞の遊走を促進し、創傷治癒に働くと考えられる。
【０００７】
表皮細胞が基底膜の構成成分であるＩＶ型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質に接着するためには、その受容体として働くインテグリンが必要不可欠である。インテグリンはα鎖、β鎖が非共有結合で会合するヘテロダイマーで、細胞膜に発現して、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどの細胞外のリガンドと結合するとともに、細胞内ではテーリンやα−アクチニンなどの細胞骨格タンパク質と結合し、細胞と細胞外マトリックスあるいは細胞と細胞の結合に関与する。
【０００８】
現在、１６種類のα鎖、９種類のβ鎖が報告されており、これらα鎖、β鎖の組み合わせにより、リガンド特異性の異なる多様な分子が形成されている。インテグリンは細胞接着を介して、細胞増殖、細胞分化、細胞運動、アポトーシス、形態形成、免疫反応、創傷治癒、血液凝固、骨吸収などの多岐にわたる生物学的機能を担っている（Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．：Ｃｅｌｌ，６９：１１−２５，１９９２，Ｒｏｕｓｌａｔｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｅｌｌ，７７：４７７−４７８，１９９４）。
【０００９】
これまでに、ラミニン５の受容体としてインテグリンα６β４およびインテグリンα３β１が知られており、インテグリンα６β４は主に細胞接着に関与し、インテグリンα３β１は主に細胞の運動に関与することが知られている（Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１４：５６７−５７６，１９９１，Ｖｅｒｒｎｄｏ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．：Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７１：５６７−５７４，１９９４）。
【００１０】
インテグリンα６β４は、分子量１５０ｋＤａのα６鎖と２０５ｋＤａのβ４鎖のダイマーで、β４とダイマーを形成するα鎖としてはα６のみが報告されている（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．：ＥＭＢＯ Ｊ．，９：７５７−７６３，１９９０）。インテグリンα６β４は、上皮細胞、シュワン細胞、神経細胞、一部の内皮細胞などで発現しており、皮膚では表皮基底細胞の基底側に存在し、基底膜に存在するラミニン５と結合して、表皮と基底膜間の結合を担っている（Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１４：５６７−５７６，１９９１）。
【００１１】
ラミニン５遺伝子の変異と同様に、インテグリンβ４遺伝子の変異は、表皮・真皮間の剥離と水泡形成を特徴とする重篤な遺伝的疾患である先天性接合部型表皮水泡症（Ｈｅｒｌｉｔｚ’ｓ ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ ｂｕｌｌｏｓａ）を引き起こすことから、インテグリンα６β４とラミニン５との接着が正常な皮膚構造の維持に必要不可欠であることが知られている（Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，６：２９３−２９８，１９９４，Ｖｉｄａｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，１０：２２９−２３４，１９９５）。
【００１２】
インテグリンβ４遺伝子のノックアウトマウスは、先天性接合部型表皮水泡症と同様の表皮剥離がみられ、基底細胞がアポトーシスを起こしていることから、ラミニン５とインテグリンα６β４の結合は基底細胞の生存に重要であることが知られている（Ｄａｗｌｉｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３４：５５９−５７２，１９９６）。
【００１３】
ラミニン５とインテグリンα６β４の結合は、細胞増殖シグナルに関与するＲａｓ−ＭＡＰキナーゼの経路を介して、表皮細胞の増殖に関与することが知られている（Ｍａｉｎｉｅｒｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．：ＥＭＢＯ Ｊ．，１６：２３６５−２３７５，１９９７，Ｍａｉｎｉｅｒｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．：ＥＭＢＯ Ｊ．，１７：３９４０−３９５１，１９９８）。
【００１４】
以上のようなことから、インテグリンα６β４はラミニン５の受容体として、表皮と真皮の間の結合を担い、正常な皮膚構造の維持に重要であるとともに、表皮基底細胞の生存および増殖に重要な働きをする。
【００１５】
最近、頬や瞼などの露光部位では、２０歳代前半から基底膜の断裂や多重化などの皮膚基底膜の損傷が見られ、２０歳代後半から３０歳代前半に顕著に悪化することから、基底膜の損傷が皮膚老化を引き起こす重要な要因であり、精製ラミニン５やラミニン５の産生を促進する物質が基底膜の形成を促進し、基底膜ケアの有用な物質であることが示された｛Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．Ｊｐｎ．，総説，３５（１）１−７，２００１｝。また、老化に伴って表皮角化細胞のインテグリンβ４の発現が低下することから、皮膚の老化とインテグリンα６β４の発現低下に因果関係があることが示唆されていた（Ｌｅ ＶａｒｌｅｔＢ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，３：１７２−１７９，１９９８）。
【００１６】
以上のようなことから、皮膚の老化を防ぐために、基底膜の形成を促進する作用をもつ精製ラミニン５やラミニン５の産生を促進する植物抽出物や化合物を有効成分として含む組成物および表皮基底細胞を活性化する作用をもつインテグリンα６β４の産生を促進する植物抽出物を有効成分として含む組成物が開発されている（特開平１０−１４７５１５、特開平１１−３４３２２６、特開２０００−２２６３０８、特願２０００−３３１３１８、特願２００１−１５１４８５、特願２００１−３６６０５６、特願２００１−３８９００７）。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、さらに皮膚老化防止作用の高い組成物を提供することを課題とする。前述のように、ラミニン５産生促進剤またはインテグリンα６β４産生促進剤をそれぞれ単独で用いた老化防止用組成物の開発は試みられていたが、本発明では、それぞれ単独よりもより効果的な老化防止用組成物を開発することを課題とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
前述のように、ラミニン５産生促進剤またはインテグリンα６β４産生促進剤をそれぞれ単独で用いた老化防止用組成物の開発は従来から試みられていたが、ラミニン５産生促進剤およびインテグリンα６β４産生促進剤を組み合わせた老化防止用組成物の開発は試みられていなかった。
【００１９】
本発明者は、ラミニン５産生促進剤またはインテグリンα６β４産生剤をそれぞれ単独で用いた場合と双方を組み合わせた場合の光障害抑制作用について検討した。その結果、ラミニン５の産生を促進する成分とインテグリンα６β４の産生を促進する成分を組み合わせて用いることにより、より効果的に紫外線による細胞障害を抑制できることを見出し、本発明を完成した。
【００２０】
すなわち、本発明は、
１．ラミニン５の産生を促進する成分とインテグリンα６β４の産生を促進する成分を含む組成物、
２．ラミニン５の産生を促進する成分が下記（１）〜（３）
（１）リュウガン、タイセイ、ホソバタイセイ、リュウキュウアイ、ナルコユリおよびカギクルマバナルコユリの植物またはその抽出物
（２）フェニルプロパノイド類の化合物またはそれらの塩、あるいはそれらの化合物の配糖体またはそれらの塩
（３）コメヌカ油
から選ばれる１種または２種以上である上記１の組成物、
３．インテグリンα６β４の産生を促進する成分が、セイヨウキズタ、エキナセア、カボチャ、セイヨウタンポイポ、およびアンジェリカの植物またはその抽出物から選ばれる１種または２種以上である上記１または２の組成物、
４．皮膚基底膜賦活用および／または表皮基底細胞賦活用である上記１〜３のいずれかの組成物、
５．光障害抑制用である上記１〜３のいずれかの組成物、及び
６．上記１〜５のいずれかの組成物からなる皮膚外用剤、
に関する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
「ラミニン５の産生を促進する成分」は、皮膚基底膜を構成する細胞外マトリックスタンパク質の一種であるラミニン５の皮膚基底膜における存在量を増加させるものであれば良く、表皮細胞による産生を促進することにより、その量は増加する。
このような「ラミニン５の産生を促進する成分」としては、リュウガン、タイセイ、ホソバタイセイ、リュウキュウアイ、ナルコユリ、カギクルマバナルコユリの植物またはその抽出物、フェニルプロパノイド類の化合物またはそれらの塩、あるいはそれらの化合物の配糖体またはそれらの塩、コメヌカ油を挙げることができる。
「インテグリンα６β４の産生を促進する成分」は、ラミニン５の受容体として働くインテグリンα６β４の表皮基底細胞の基底側での存在量を増加させるものであれば良く、表皮細胞による産生を促進することにより、その量は増加する。
このような「インテグリンα６β４の産生を促進する成分」としては、セイヨウキズタ、エキナセア、カボチャ、セイヨウタンポポおよびアンジェリカの植物またはその抽出物を挙げることができる。
【００２２】
本発明に用いられるリュウガン（Ｅｕｐｈｏｒｉａ ｌｏｎｇａｎ （Ｌｏｕｒ．）Ｓｔｅｕｄ．）は、むくろじ科ユーフォリア属の植物である。仮種皮の部分は竜眼肉（リュウガンニク）と呼ばれ、鎮静、滋養強壮に処方され、物忘れや不眠症にも効果的で、神経の興奮を静める効力があるといわれている（「原色牧野和漢薬草大図鑑」北隆館）。
【００２３】
本発明に用いられるタイセイ（Ｉ． Ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ．）、ホソバタイセイ（Ｉｓａｔｉｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉａ Ｌ．）は、いずれもあぶらな科タイセイ属の植物である。根の部分は板藍根（バンランコン）と呼ばれ、種々の病原菌に対する抑制作用を有し、消炎、解熱、解毒、止血薬として用いられている（「原色牧野和漢薬草大図鑑」北隆館）。
【００２４】
本発明に用いられるリュウキュウアイ（Ｓｔｏｒｏｂｉｌａｎｔｈｅｓ ｆｌａｃｃｉｄｉｆｏｌｉｕｓ Ｎｅｅｓ）は、きつねのまご科イセハナビ属の植物である。この植物の根、根茎も板藍根（バンランコン）と呼ばれ、タイセイ（Ｉ． Ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ．）、ホソバタイセイ（Ｉｓａｔｉｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉａ Ｌ．）の根と同様の薬効を有する。また、葉の部分にも抗菌、解毒、解熱、消炎、止血作用があることが知られている（「原色牧野和漢薬草大図鑑」北隆館）。
【００２５】
本発明に用いられるナルコユリ（Ｐｏｌｙｇｏｎａｔｕｍ ｆｏｌｃａｔｕｍＡ． Ｇｒａｙ）、カギクルマバナルコユリ（Ｐｏｌｙｇｏｎａｔｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ Ｒｅｄｏｕｔｅ ｅｘ Ｒｅｄｏｕｔｅ）は、いずれもゆり科アマドコロ属の植物である。根茎の部分は黄精（オウセイ）と呼ばれ、種々の菌に対する抑制作用、アドレナリンによる高血糖に対する抑制作用、血圧降下作用があり、滋養強壮、糖尿病、動脈硬化症などの薬として用いられる（「原色牧野和漢薬草大図鑑」北隆館）。
【００２６】
本発明に用いられるセイヨウキズタ（Ｈｅｄｅｒａ ｈｅｌｉｘ Ｌ．）は、ウコギ科ヘデラ属の植物である。ヨーロッパからコーカサス地方に原産する。葉は神経痛、リウマチ痛、座骨神経痛を緩和するハップ剤や歯痛、百日咳用のチンキとして使用される（「ハーブの写真図鑑」レスリーブレムネス著、日本ヴォーグ社）。成分としては、ヘデリン、サポニン、フラボノイド、有機酸などを含む。洗浄作用、抗炎症作用、保湿作用、抗菌作用、痩身作用があり、化粧品に広く使用される（「化粧品ハンドブック」日光ケミカルズ株式会社）。特にニキビ、脂性肌用の洗顔料やクリーム、シャンプーなどに配合されている。
【００２７】
本発明に用いられるエキナセア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ，Ｅ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ，Ｅ．ｐａｌｌｉｄａ）は、キク科エキナセア属の植物である。北アメリカ原産で、アメリカ先住民の間で万能薬として、歯痛、喉の痛み、風邪、伝染病などの治療に約４００年前から利用されてきた。１９世紀末、ヨーロッパにも紹介され、栽培が始まった。成分としては多糖、カフェー酸誘導体、アルキルアミドなどを含む。免疫力を高め、風邪や感染症、皮膚病の治療や予防、炎症に効果があると言われている（「薬用ハーブの機能研究」健康産業新聞社）。
【００２８】
本発明に用いられるセイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）は、キク科タンポポ属の植物である。東ヨーロッパ原産で、葉は生でサラダとして、煎った根はコーヒーの代替として、花はワインの原料として用いられる。成分としてはトリテルペン、ステロール、糖類、ビタミン類、カリウムを含む。根は消化不良や便秘に効果があり、また、肝臓と胆嚢を刺激し、胆汁の分泌を増加させ、肝障害や黄疸に有効である。葉は強力な利尿作用があり、また、血液や組織の浄化作用もあり、皮膚病やリューマチの治療薬としても有効である（「ハーブ大全」小学館）。
【００２９】
本発明に用いられるアンジェリカ（Ａｎｇｅｌｉｃａ ａｒｃｈａｎｇｅｌｉｃａ Ｌ．）は、セリ科シシウド属の植物である。成分としては、アンゲリカラクトン、アンゲリシン、アンゲリカ酸、ベルガプテンや葉酸、ビタミンＢ１２などのビタミンＢ群などを含む。血行を良くし、女性ホルモンの分泌を調整する効用があり、貧血症、生理痛、生理不順、冷え性などに広く用いられる（「機能性ハーブの生理活性」常盤植物化学研究所）。
【００３０】
本発明に用いられるカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ Ｌ．）は、ウリ科カボチャ属の植物である。北アメリカ原産で、野菜としてなじみが深く、世界中で栽培されている。種子は栄養価が高く、食用にされる。成分としては、脂肪酸、リグナン、トコフェロール、微量元素であるセレンなどが含まれている。ヨーロッパでは、種子の油性の抽出物が、過敏膀胱や前立腺肥大症などの泌尿器系疾患の治療目的に用いられている（「機能性ハーブの生理活性」常盤植物化学研究所）。
【００３１】
本発明に用いられる植物は、葉、茎、芽、花、木質部、木皮部（樹皮）などの地上部、根、塊茎などの地下部、種子、樹脂などのすべての部位が使用可能である。
本発明における植物は、それら自体を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、それら自体を圧搾抽出することにより得られる搾汁、植物自体あるいはその乾燥物の水またはアルコール、エーテル、アセトンなどの有機溶媒による粗抽出物、および該粗抽出物を分配、カラムクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物画分などのすべてを含む。これらは単独で用いても良く、２種以上混合して用いても良い。
【００３２】
本発明で使用するフェニルプロパノイド類は、天然に存在する化合物群の一つであり、ベンゼン核（Ｃ６，ｐｈｅｎｙｌ）に直鎖状３炭素（Ｃ３，ｐｒｏｐａｎｅ）が結合したものである。これらの化合物は、広範な生物源から直接もしくは間接的に得ることが出来るが、化学合成品であってもよい。
本発明では、フェニルプロパノイド類として、特にカフェー酸、フェルラ酸、ケイヒ酸、ケイヒアルデヒド、オイゲノール、コニフェリルアルコール、クロロゲン酸などが好ましいが、これに限られるわけではない。
【００３３】
自然界では、維管束植物においてアミノ酸フェニルアラニン（イネ科ではチロシン）の脱アミノ化によりトランスケイヒ酸（イネ科ではｐ−クマリン酸）が生成される。トランスケイヒ酸は酸化されてｐ−クマリン酸、さらに酸化されてカフェー酸となる。カフェー酸はメチル化を受けてフェルラ酸となる。被子植物はフェルラ酸をさらに酸化して５−ヒドロキシフェルラ酸に、次にメチル化してシナピック酸とすることができるが、シダ植物や裸子植物はできない。自然界において、これら酸のフェノール性水酸基は部分的にメチル化され、そしてカルボキシル基は逐次還元されて対応するアルデヒド、アルコール、あるいはオレフィンとなる（「天然物化学」改訂第４版、三橋博ら編、南江堂）。
【００３４】
カフェー酸は下記式（１）で表され、肥満細胞からのヒスタミン遊離抑制効果や５−リポキシゲナーゼおよびロイコトリエン生成の阻害活性がある（「天然薬物辞典」奥田拓男編、廣川書店）。コーヒー豆、ノコギリソウ、オトギリソウなどに数％含まれるクロロゲン酸、ヨモギおよび同族植物の主成分の３，５−ｄｉ−Ｏ−カフェイルキナ酸、その他いわゆるカフェータンニンの構成成分として存在する。また、遊離してタバコ葉、サツマイモ、ナシ葉などの広い範囲の植物に存在する。カフェー酸は、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、無水酢酸、酢酸カリウムの混合物を加熱する（パーキン反応）ことにより得られる。また、クロロゲン酸の酸加水分解によって生成する。
【化１】
フェルラ酸は下記式（２）で表され、抗酸化作用、紫外線吸収能を持つことが知られている。それ自体およびその誘導体は植物の細胞壁を形成するリグニンの前駆体である。遊離状、エステル型、リグニンの形で、微量ながら広く植物に存在する（「化学大辞典」東京化学同人）。４−ヒドロキシ−３−メトキシベンズアルデヒドとマロン酸をピペリジン存在下ピリジン中で縮合脱炭酸させることにより得られる。また、コメヌカから効率的に抽出する方法が開発されている（特開平５−３３１１０１号）。
【化２】
ケイヒ酸は下記式（３）で表され、そのエステル類は香料および医薬品として用いられる（「天然薬物辞典」奥田拓男編、廣川書店）。通常、ケイヒ酸とはトランス形のものを指し、シス形のものはアロケイヒ酸と呼ばれる。シス形は不安定でトランス形になりやすい。カシア油、ペルーバルサム、トルーバルサムの樹脂などに遊離酸あるいはエステルとして存在する。ケイヒアルデヒドの酸化、あるいはベンズアルデヒド、無水酢酸、酢酸カリウムの混合物の加熱（パーキン反応）により得られる。
【化３】
ケイヒアルデヒドは下記式（４）で表され、強い特有の芳香と甘味があることから、菓子などの食品香料に用いられている（「天然薬物辞典」奥田拓男編、廣川書店）。また、医薬品、化粧品にも用いる。ケイの樹皮、葉に含まれ、ケイヒ油、カシア油の主成分で香りの本体であり、その他ミルラ油、パチョウリ油にも含まれる。ベンズアルデヒドとアセトアルデヒドをアルカリで縮合させて得られる。
【化４】
オイゲノールは下記式（５）で表され、バニリンの製造原料、香料、殺菌剤、防腐剤などに用いられる（「天然薬物辞典」奥田拓男編、廣川書店）。チョウジ油に多く含まれるほか、広く植物の精油中に存在するフェノール性精油成分である。グローブ油、桂葉油をアルカリ抽出することにより得られる。
【化５】
コニフェリルアルコールは下記式（６）で表され、針葉樹の形成層とその周辺の柔細胞、コンフリーの根、テンサイ、アスパラガスなどに配糖体のコニフェリンとして存在する（「天然薬物辞典」奥田拓男編、廣川書店）。植物体内で脱水素重合によってリグニン様の物質になる。リグニンには、抗腫瘍作用、肝カタラーゼ活性促進作用などの作用が認められている。コニフェリンに加水分解酵素エムルシンを作用させることにより得られる。
【化６】
クロロゲン酸は下記式（７）で表され、中枢神経興奮作用に加えて、胃液や胆汁分泌を促進する作用がある（「天然薬物辞典」奥田拓男編、廣川書店）。また、抗酸化作用（「フリーラジカルと和漢薬」奥田拓男・吉川敏一編、国際医薬出版）や癌細胞転移抑制作用（東京農工大・矢ケ崎教授ら、日本経済新聞２０００．９．４朝刊）が報告されている。コーヒー豆からはじめて単離されたが、双子葉植物の果実や葉などに広く分布し、特にナス科、キク科、セリ科などの植物にこれを多く含むものが多い。カフェー酸とキナ酸をエステル化することにより得られる。
【化７】
いずれの化合物も市販されており、これを用いることができる。
本発明における化合物は、それらを各種溶媒を用いて溶解した状態でも使用できる。例えば、水またはエタノール、メタノールなどのアルコール類、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール、エーテル、アセトン、酢酸エチルなどの有機溶媒を用いて溶解した状態で使用できる。これらは単独で用いても良く、２種以上混合して用いても良い。
【００４２】
本発明で使用するフェニルプロパノイド類の化合物の配糖体としては、カフェー酸の配糖体として、グルコカフェー酸｛３−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ；４’−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ｝、フェルラ酸の配糖体として、グルコフェルラ酸｛３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ；４−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ｝、オイゲノールの配糖体として、ササンクイン（オイゲノール β−プライムベロシド）｛２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−（２−ｐｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｅｎｏｌ；Ｏ−［β−Ｄ−Ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→６）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］｝、オイゲノール ジェンティオビオシド｛２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−（２−ｐｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｅｎｏｌ；Ｏ−［β−Ｄ−Ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→６）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］｝、オイゲノール ルティノシド｛２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−（２−ｐｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｅｎｏｌ；Ｏ−［α−Ｌ−Ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→６）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］｝、コニフェリルアルコールの配糖体として、コニフェリン｛３−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｏｌ；３’Ｍｅ ｅｔｈｅｒ，４’−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ｝、シトルシンＤ（イソコニフェリン）｛３−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｏｌ；３’Ｍｅ ｅｔｈｅｒ，１−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ｝、コニフェリノシド｛３−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｏｌ；３’Ｍｅ ｅｔｈｅｒ，４’−Ｏ−［β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→６）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］｝、イソコニフェリノシド｛３−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｏｌ；３’Ｍｅ ｅｔｈｅｒ，１，４’−ｄｉ−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ｝等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。また、本発明で使用するフェニルプロパノイド類の化合物またはそれらの配糖体の塩としては、例えばナトリウム塩、カルシウム塩等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００４３】
本発明で使用するコメヌカ油は、イネ種子の精米直後のコメヌカから得られる半乾性油であり、一般に市販されている。淡黄色の油状液体で、中性脂肪のほかに多量の遊離脂肪酸、ロウ分、トコフェロール、オリザノール、ステロール、微量のリン脂質、糖脂質、金属などを含む。脂肪酸の成分は、おもにオレイン酸、リノール酸、パルミチン酸である。トコフェロールやオリザノールの影響により、空気や熱に対して非常に安定である。表皮細胞や線維芽細胞などの皮膚細胞に対する毒性はほとんどなく、非常に安全性が高い。
【００４４】
コメヌカ油中のオリザノールが紫外線を吸収して皮膚を保護する効果がある。また、コレステロール低下作用もあり、舌触りが良く香味が良いので、食用油として用いられている。コメヌカ油脂肪酸はオレイン酸が多く、コメヌカ油から製造した石けんは水に溶けやすく、洗浄力がすぐれ、家庭用洗剤として使用されている。欧米では天然のサンスクリーンオイルとして使われている（「化粧品ハンドブック」日光ケミカルズ株式会社）。
【００４５】
本発明の組成物には、ラミニン５産生促進剤およびインテグリンα６β４産生促進剤が、それぞれ少なくとも１種以上含まれていれば良く、２種以上混合して用いても良い。
本発明に用いるラミニン５産生促進剤およびインテグリンα６β４産生促進剤の組成物への有効配合量は、ラミニン５産生促進剤およびインテグリンα６β４産生促進剤の調製法、製剤の形態などにより、適宜選択、決定され、特に限定されないが、それぞれ０．００１〜３０重量％が適当である。
【００４６】
ラミニン５産生促進剤およびインテグリンα６β４産生促進剤を含む本発明組成物は、表皮細胞におけるラミニン５およびインテグリンα６β４の産生を促進し、皮膚基底膜および表皮基底細胞の活性化、再生促進に有用であり、紫外線の照射により低下した皮膚基底膜および／または表皮基底細胞の働きを高めて、基底膜と基底細胞の結合力を強化し、いわゆる光老化した皮膚の再生作用を有する。
【００４７】
皮膚基底膜を構成する細胞外マトリックスタンパク種の一種であるラミニン５の産生を促進する成分およびその受容体として働くインテグリンα６β４の産生を促進する成分は、単独でも前記のような効果を有する。しかし、ラミニン５あるいはインテグリンα６β４は協調的に作用するために、例えば、紫外線暴露などにより、インテグリンα６β４の産生あるいは活性が低下している場合には、どんなにラミニン５の産生を促進しても、その受容体の量が限られているので、ある一定以上の効果は期待できない。ラミニン５の産生あるいは活性が低下している場合におけるインテグリンα６β４の産生促進についても同様である。したがって、それらの機能を十分に発揮させるために、表皮細胞におけるラミニン５の産生を促進し、皮膚基底膜を活性化すると同時に、インテグリンα６β４の産生を促進し、表皮基底細胞を活性化することで、相乗的な効果が得られる。
【００４８】
本発明の組成物には、植物油のような油脂類、高級脂肪酸、高級アルコール、シリコーン、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、防腐剤、糖類、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子のような高分子、増粘剤、粉体成分、紫外線吸収剤、紫外線遮断剤、ヒアルロン酸のような保湿剤、香料、ｐＨ調整剤、乾燥剤等を含有させることができる。また、ビタミン類、皮膚賦活剤、血行促進剤、常在菌コントロール剤、活性酸素消去剤、抗炎症剤、抗癌剤、美白剤、殺菌剤等の他の薬効成分、生理活性成分を含有させることもできる。
【００４９】
油脂類としては、例えばツバキ油、月見草油、マカデミアナッツ油、オリーブ油、ナタネ油、トウモロコシ油、ゴマ油、ホホバ油、胚芽油、小麦胚芽油、トリオクタン酸グリセリン、等の液体油脂、カカオ脂、ヤシ油、硬化ヤシ油、パーム油、パーム核油、モクロウ、モクロウ核油、硬化油、硬化ヒマシ油等の固体油脂、ミツロウ、キャンデリラロウ、綿ロウ、ヌカロウ、ラノリン、酢酸ラノリン、液状ラノリン、サトウキビロウ等のロウ類が挙げられる。
【００５０】
炭化水素類としては、流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、マイクロクリスタリンワックス等が挙げられる。
高級脂肪酸として、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）等が挙げられる。
【００５１】
高級アルコールとして、例えば、ラウリルアルコール、ステアリルアルコール、セチルアルコール、セトステアリルアルコール等の直鎖アルコール、モノステアリルグリセリンエーテル、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、オクチルドデカノール等の分枝鎖アルコール等が挙げられる。
【００５２】
シリコーンとして、例えば、鎖状ポリシロキサンのジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン等、環状ポリシロキサンのデカメチルシクロペンタシロキサン等が挙げられる。
【００５３】
アニオン界面活性剤として、例えば、ラウリン酸ナトリウム等の脂肪酸塩、ラウリル硫酸ナトリウム等の高級アルキル硫酸エステル塩、ＰＯＥラウリル硫酸トリエタノールアミン等のアルキルエーテル硫酸エステル塩、Ｎ−アシルサルコシン酸、スルホコハク酸塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩等が挙げられる。
カチオン界面活性剤として、例えば、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム等のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等が挙げられる。
両性界面活性剤として、アルキルベタイン、アミドベタイン等のベタイン系界面活性剤等が挙げられる。
非イオン界面活性剤として、例えば、ソルビタンモノオレエート等のソルビタン脂肪酸エステル類、硬化ヒマシ油誘導体が挙げられる。
【００５４】
防腐剤として、例えばメチルパラベン、エチルパラベン等を挙げることができる。
金属イオン封鎖剤として、例えばエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エデト酸、エデト酸ナトリウム塩等のエデト酸塩を挙げることができる。
【００５５】
高分子として、例えば、アラビアゴム、トラガカントガム、ガラクタン、グァーガム、カラギーナン、ペクチン、寒天、クインスシード、デキストラン、プルランカルボキシメチルデンプン、コラーゲン、カゼイン、ゼラチンメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、アルギン酸ナトリウムカルボキシビニルポリマー（ＣＡＲＢＯＰＯＬ等）等のビニル系高分子、等を挙げることができる。
【００５６】
増粘剤として、カラギーナン、トラガカントガム、クインスシード、カゼイン、デキストリン、ゼラチン、ＣＭＣ、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースカルボキシビニルポリマー、グァーガム、キサンタンガム、ベントナイト等を挙げることができる。
【００５７】
粉末成分としては、タルク、カオリン、雲母、シリカ、ゼオライト、ポリエチレン粉末、ポリスチレン粉末、セルロース粉末、無機白色顔料、無機赤色系顔料、酸化チタンコーテッドマイカ、酸化チタンコーテッドタルク、着色酸化チタンコーテッドマイカ等のパール顔料、赤色２０１号、赤色２０２号等の有機顔料を挙げることができる。
【００５８】
紫外線吸収剤としては、パラアミノ安息香酸、サリチル酸フェニル、パラメトキシケイ皮酸イソプロピル、パラメトキシケイ皮酸オクチル、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン等を挙げることができる。
紫外線遮断剤として、酸化チタン、タルク、カルミン、ベントナイト、カオリン、酸化亜鉛等を挙げることができる。
【００５９】
保湿剤として、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，２−ペンタンジオール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、キシリトール、マルチトール、マルトース、ソルビトール、ブドウ糖、果糖、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、ピロリドンカルボン酸、シクロデキストリン等が挙げられる。
【００６０】
薬効成分としては、ビタミンＡ油、レチノール等のビタミンＡ類、リボフラビン等のビタミンＢ2類、ピリドキシン塩酸塩等のＢ6類、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸モノパルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸ジパルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド等のビタミンＣ類、パントテン酸カルシウム等のパントテン酸類、ビタミンＤ2、コレカルシフェロール等のビタミンＤ類；α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、ニコチン酸ＤＬ−α−トコフェロール等のビタミンＥ類等のビタミン類を挙げることができる。プラセンタエキス、グルタチオン、ユキノシタ抽出物等の美白剤、ローヤルゼリー、ブナノキエキス等の皮膚賦活剤、カプサイシン、ジンゲロン、カンタリスチンキ、イクタモール、カフェイン、タンニン酸、γ−オリザノール等の血行促進剤、グリチルリチン酸誘導体、グリチルレチン酸誘導体、アズレン等の消炎剤、アルギニン、セリン、ロイシン、トリプトファン等のアミノ酸類、常在菌コントロール剤のマルトースショ糖縮合物、塩化リゾチーム等を挙げることができる。さらに、カミツレエキス、パセリエキス、ワイン酵母エキス、グレープフルーツエキス、スイカズラエキス、コメエキス、ブドウエキス、ホップエキス、ビワエキス、オウバクエキス、ヨクイニンエキス、センブリエキス、メリロートエキス、バーチエキス、カンゾウエキス、シャクヤクエキス、サボンソウエキス、ヘチマエキス、トウガラシエキス、レモンエキス、ゲンチアナエキス、シソエキス、アロエエキス、ローズマリーエキス、セージエキス、タイムエキス、茶エキス、海藻エキス、キューカンバーエキス、チョウジエキス、ニンジンエキス、マロニエエキス、ハマメリスエキス、クワエキス等の各種抽出物を挙げることができる。
【００６１】
本発明の組成物は、例えば水溶液、油剤、乳液、懸濁液等の液剤、ゲル、クリーム等の半固形剤、粉末、顆粒、カプセル、マイクロカプセル、固形等の固形剤の形態で適用可能である。従来から公知の方法でこれらの形態に調製し、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏、硬膏、ハップ剤、エアゾール剤、坐剤、注射剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、シロップ剤、トローチ剤等の種々の剤型とすることができる。
【００６２】
これらを身体に塗布、貼付、噴霧、飲用等により適用することができる。特にこれら剤型の中で、ローション剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤等が皮膚外用剤に適している。化粧料としては、化粧水、乳液、クリーム、パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップクリーム、乳液状又はクリーム状あるいは軟膏型のファンデーション、口紅、アイカラー、チークカラーといったメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション等の身体用化粧料等、入浴剤、口腔化粧料、毛髪化粧料とすることができる。
【００６３】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［植物抽出液の調製］
リュウガン（Ｅｕｐｈｏｒｉａ ｌｏｎｇａｎ （Ｌｏｕｒ．） Ｓｔｅｕｄ．）の仮種皮（リュウガンニク）、ホソバタイセイ（Ｉｓａｔｉｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉａ Ｌ．）の根（バンランコン）、ナルコユリ（Ｐｏｌｙｇｏｎａｔｕｍｆｏｌｃａｔｕｍ Ａ． Ｇｒａｙ）の根茎（オウセイ）、セイヨウサンザシ（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ ｏｘｙａｃａｎｔｈａ Ｌ．）の葉、コウカサイ（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ ｐｌｉｃａｔａ Ｓｔａｐｆ）の花の蕾（キンシンサイ）、セイヨウキズタ（Ｈｅｄｅｒａ ｈｅｌｉｘ Ｌ．）の葉、エキナセアプルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ Ｌ． Ｍｏｅｎｃｈ）の根、薬用カボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｅ ｐｅｐｏ Ｌ．）の種子、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｇ．）の根、アンジェリカ（Ａｎｇｅｌｉｃａ ａｒｃｈａｎｇｅｌｉｃａ Ｌ．）の根、セイヨウイラクサ（Ｕｒｔｉｃａ ｄｉｏｉｃａ Ｌ．）の根、ゲンチアナ（Ｇｅｎｔｉａｎａｌｕｔｅａ Ｌ．）の根を細切し、その各１ｋｇに９９．５％エタノール３Ｌを加え、室温で一晩浸漬した。これを濾過し、各抽出液を得た。各抽出液を濃縮したところ、その蒸発残分はそれぞれ７５ｇ、１１０ｇ、１３５ｇ、９８ｇ、１０２ｇ、６５ｇ、２３ｇ、１３５ｇ、４５ｇ、７８ｇ、５６ｇ、４３ｇであった。なお、ここで、セイヨウサンザシ（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ ｏｘｙａｃａｎｔｈａ Ｌ．）の葉、コウカサイ（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ ｐｌｉｃａｔａ Ｓｔａｐｆ）の花の蕾（キンシンサイ）セイヨウイラクサ（Ｕｒｔｉｃａ ｄｉｏｉｃａ Ｌ．）の根、ゲンチアナ（Ｇｅｎｔｉａｎａ ｌｕｔｅａ Ｌ．）の抽出液は、比較対照のために調製した。
【００６４】
［試験結果１ 植物抽出液およびフェルラ酸によるラミニン５産生促進作用の測定］
表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）および培地（ＫＧＭ）は、胎児由来正常ヒト表皮角化細胞（旭テクノグラス）およびＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂｕｌｌｅｔ Ｋｉｔ（旭テクノグラス）を用いた。細胞はＫＧＭで３７℃−５％ＣＯ2インキュベーターにて培養した。本実験には継代数が３〜５代の細胞を使用した。
ＮＨＥＫをＫＧＭで培養後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて、接着細胞を培養ディッシュから剥がした後、トリプシン中和溶液を用いてトリプシンを中和した。遠心分離により細胞を集めた後、１．２５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＫＧＭにて再懸濁した。
【００６５】
この細胞懸濁液を４ｍｌ／ウェルで６ウェルプレートに播種し、２４時間培養後、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、前記の方法により調製した各植物抽出液およびフェルラ酸（築野食品工業）を添加したＫＧＭで２４時間培養した。培養後、細胞培養上清を回収した。８００ｒｐｍ、５分間遠心して浮遊細胞を除去後、１５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心して細胞片を除去した。８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加して４℃で一晩攪拌した。２０，０００ｒｐ、３０分間遠心してタンパク質を沈降させ、上清を除去後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で４℃、一晩透析後、２０倍濃縮になるように２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加え、ウエスタンブロッティング用サンプルとして用いた。ＦＢＳは、ラミニン５の産生を促進する因子として公知の物質であり、ここでは対照として用いた（特開平１１−３４３２２６）。
【００６６】
サンプル中のタンパク質を非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により分離後、ニトロセルロース膜に転写した。転写後のニトロセルロース膜をブロッキング溶液（５％のスキムミルクを含むＰＢＳ）に浸し、室温で１時間ブロッキングした。洗浄液｛０．１％のＢＳＡおよび０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳ｝で洗浄後、一次抗体溶液｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したラミニンγ２鎖に対するモノクローナル抗体（クローンＤ４Ｂ５）｝に浸し、室温で一晩反応させた。洗浄後、二次抗体溶液（洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したビオチン化抗マウスイムノグロブリンＧ）に浸し、室温で１時間反応させた。洗浄後、酵素溶液（洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したアルカリフォスファターゼアビジンＤ）に浸し、室温で１時間反応させた。洗浄後、基質液｛ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ（ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）｝に浸し、室温で１５〜３０分間反応させた。
【００６７】
ＦＢＳおよび各植物抽出液を０．１％で処理した時の結果を図１に示す。ここでＦＢＳを０．１％で処理するとは、ＦＢＳの原液を培地量の０．１％で加えて処理することをいう。また、植物抽出液を０．１％で処理するとは、固形分濃度にして０．１重量％になるように、エタノールで１００ｍｇ／ｍｌに調製した植物抽出液を培地量の１重量％加えて処理することをいう。ここで、２本のラミニン５のバンドが見られるが、上のバンドはγ２鎖全長型ラミニン５であり、下のバンドはγ２鎖が酵素により限定分解されたγ２鎖分解型ラミニン５である。リュウガンの仮種皮（リュウガンニク）、ホソバタイセイの根（バンランコン）、ナルコユリの根茎（オウセイ）の各植物抽出液により、γ２鎖全長型およびγ２鎖分解型のラミニン５の発現が有意に促進された。一方、セイヨウサンザシの根、キンシンサイの根の抽出液で処理した場合は、ラミニン５の発現に対する促進活性は見られなかった。このことから、本発明のリュウガン、ホソバタイセイおよびナルコユリがラミニン５産生促進のために選択的に作用することが分かった。
【００６８】
ＦＢＳおよびフェルラ酸の濃度を変えて処理した時の結果を図２に示す。ここでＦＢＳを０．１０％および１．００％で処理するとは、ＦＢＳの原液を培地量の０．１０％および１．００％で加えて処理することをいう。また、フェルラ酸を０．０１％、０．１０％および１．００％で処理するとは、固形分濃度にして０．０１重量％、０．１０重量％および１．００重量％になるように、エタノールで１０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌおよび１ｇ／ｍｌに調製したフェルラ酸溶液を培地量の１重量％加えて処理することをいう。ここで、２本のラミニン５のバンドが見られるが、上のバンドはγ２鎖全長型ラミニン５であり、下のバンドはγ２鎖が酵素により限定分解されたγ２鎖分解型ラミニン５である。フェルラ酸溶液により、濃度依存的にγ２鎖全長型およびγ２鎖分解型ラミニン５の発現が促進された。また、フェルラ酸溶液を０．１％および１．０％で処理した場合、ＦＢＳを１．０％で処理した場合と同程度の活性が見られた。
【００６９】
［試験結果２ コメヌカ油によるラミニン５産生促進作用の測定］
ヒト皮膚三次元モデルは、ＴＥＳＴＳＫＩＮ（ＬＳＥ−ｈｉｇｈ）（東洋紡績）を用い、プロトコールにしたがって培養した。植物性スクワラン（花王）にＦＢＳまたはコメヌカ油（築野食品工業）を溶解し、アッセイリング内の組織上に８０μｌ添加し、２４時間培養した。ＦＢＳはラミニン５の産生を促進する公知の物質であり、ここでは対照として用いた（特開平１１−３４３２２６）。培養液で数回洗浄して薬剤を完全に除去した後、ＵＶＢを０および２４０ｍＪ／ｃｍ2で照射した。新たに薬剤を添加し、さらに２４時間培養した。組織を回収し、組織抽出用溶液｛５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１％ （Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）｝を加え、ホモジナイズした。１５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心して組織片を除去した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）にて透析した。
【００７０】
この組織抽出液を用いて、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）によりラミニン５産生促進作用を調べた。組織抽出液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で適当に希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレートに４℃で１８時間吸着させた。細胞培養上清液を除去後、ブロッキング溶液｛１％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（−）｝に浸し、３７℃で１時間ブロッキングした。洗浄液｛０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（和光純薬）を含むＰＢＳ（−）｝にて洗浄後、一次抗体溶液｛洗浄液で５ｍｇ／ｍｌに調製したラミニンγ２鎖に対するモノクローナル抗体（クローンＤ４Ｂ５）（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．，５０，７−１４，１９９８．）｝を添加し、３７℃で２時間反応させた。洗浄後、二次抗体｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したビオチン化抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）｝を添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後、酵素溶液｛洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したアルカリフォスファターゼアビジンＤ（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）｝を添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後、基質液｛１ｍｇ／ｍｌのｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を含む０．７５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０．３）｝を添加し、３７℃で３０分間反応後、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【００７１】
ＦＢＳを１．０％、コメヌカ油を０．１％、１．０％および３．０％で処理した時の結果を図３に示す。ここでＦＢＳを１．０％で処理するとは、ＦＢＳの原液を植物性スクワランに１．０％で加えて処理することをいう。また、コメヌカ油を０．１％、１．０％および３．０％で処理するとは、コメヌカ油の原液を植物性スクワランにそれぞれ０．１％、１．０％および３．０％で加えて処理することをいう。薬剤を無処理で、ＵＶＢを非照射の場合を１００％として評価した。その結果、コメヌカ油はＵＶＢ非照射および照射のいずれにおいても濃度依存的にラミニン５産生を促進した。尚、ＦＢＳを処理した場合も同様にラミニン５の産生を促進した。
【００７２】
［試験結果３ 表皮角化細胞におけるインテグリンα６β４産生促進作用の測定］
ＮＨＥＫをＫＧＭで１．２５×１０5／ｍｌとなるように懸濁し、４ｍｌ／ウェルで６穴プレートに播種し、２４時間培養した。前記の方法により調製した各植物抽出液およびＦＢＳを添加したＫＧＭを４ｍｌ／ウェルで処理し、さらに２４時間培養した。培養後、ＴＲＩＺＯＬ試薬（ライフテックオリエンタル）を用いて、プロトコールに従い全ＲＮＡを回収した。ＦＢＳは、インテグリンα６ｍＲＮＡおよびインテグリンβ４ｍＲＮＡの発現を促進する因子として公知の物質であり、ここでは対照として用いた。
【００７３】
回収した全ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）ｈｉｇｈ（東洋紡）により、インテグリンα６ｍＲＮＡ、インテグリンβ４ｍＲＮＡおよびＧ３ＰＤＨｍＲＮＡの発現促進活性を測定した。Ｇ３ＰＤＨ遺伝子はハウスキーピング遺伝子として知られ、全ての細胞で恒常的に発現していることから、コントロール遺伝子として広く用いられている。ＰＣＲ用プライマーとして、インテグリンα６は５’−ＧＡＡ ＣＴＧ ＴＧＴ ＧＡＡ ＣＡＴ ＣＡＧ Ａ−３’および５’−ＡＴＣ ＣＴＴ ＡＣＡ ＧＣＡ ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＧ−３’を用い、インテグリンβ４は５’−ＣＧＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＣＴＴ ＡＴＴ ＧＡＧ ＡＡＣ−３’および５’−ＧＡＧ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＴＧＴ ＧＣＴ ＴＡＧ−３’を用い、Ｇ３ＰＤＨは５’−ＡＣＣ ＡＣＡ ＧＴＣＣＡＴ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＣ−３’および５’−ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＣＴＧ ＴＡ−３’を用いた。ＰＣＲの反応条件は、インテグリンα６およびインテグリンβ４が、９４℃、７分処理後、９４℃、１分、５６℃、１分、７４℃、１分を２５回繰り返した後、７４℃、１０分処理し、４℃で保存した。一方、Ｇ３ＰＤＨは、９４℃、７分処理後、９４℃、１分、５８℃、１分、７４℃、１分を２０回繰り返した後、７４℃、１０分処理し、４℃で保存した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を電気泳動後、エチジウムブロマイドにより染色し、写真撮影した。
【００７４】
各植物抽出液を０．１％で処理した時の結果を図４に示す。ここで植物抽出液を０．１％で処理するとは、固形分濃度にして０．１重量％になるように、エタノールで１００ｍｇ／ｍｌに調製した植物抽出液を培地量の１重量％加えて処理することをいう。セイヨウキズタの葉、エキナセアプルプレアの根、薬用カボチャの種子、セイヨウタンポポの根、アンジェリカの根の各植物抽出液を処理した場合は、無処理対照に比べてインテグリンα６ｍＲＮＡおよびインテグリンβ４ｍＲＮＡの発現が有意に促進された。一方、セイヨウイラクサの根、ゲンチアナの根の抽出液で処理した場合は、インテグリンα６ｍＲＮＡおよびインテグリンβ４ｍＲＮＡの発現に対する促進活性は見られなかった。尚、Ｇ３ＰＤＨの発現は植物抽出液の処理の有無に関わらず、同程度であった。このことから、本発明のセイヨウキズタ、エキナセアプルプレア、薬用カボチャ、セイヨウタンポポ、およびアンジェリカがインテグリンα６β４産生促進のために選択的に作用することが分かった。
【００７５】
セイヨウキズタの葉の抽出液を濃度を変えて処理した時の結果を図５に示す。図５における濃度も、前記と同じで培地量に対する固形分濃度を表す。セイヨウキズタの葉の抽出液により、濃度依存的にインテグリンα６ｍＲＮＡおよびインテグリンβ４ｍＲＮＡの発現が促進された。また、セイヨウキズタの葉の抽出液を０．１％および１．０％で処理した場合、ＦＢＳを０．１％および１．０％で処理した場合と同程度の活性が見られた。尚、Ｇ３ＰＤＨの発現は植物抽出液の処理の有無に関わらず、同程度であった。
【００７６】
［試験結果５ ヒト表皮角化細胞におけるラミニン５産生促進剤およびインテグリンα６β４産生促進剤の光障害抑制作用の測定］
ＮＨＥＫをＫＧＭで培養後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて、接着細胞を培養ディッシュから剥がした後、トリプシン中和溶液を用いてトリプシンを中和した。遠心分離により細胞を集めた後、２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＫＧＭにて再懸濁した。細胞懸濁液を２４ウェルプレートに１ｍｌ／ウェルで播種し、２４時間培養した。ＵＶＢを０および７５ｍＪ／ｃｍ2で照射し、さらに２４時間培養した。ＰＢＳ（−）で洗浄し浮遊細胞を除去した後、５％グルタルアルデヒド水溶液にて室温、１５分間処理し、細胞を固定した。水道水にて洗浄後、蛍光染色液｛５μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．００１％のポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬）を含む水溶液｝を室温、暗所にて１．５時間処理した。水道水にて洗浄後、蛍光プレートリーダーを用いて、蛍光強度を測定することにより細胞生存率を評価した。
【００７７】
フェルラ酸および各植物抽出液を０．１％で処理した時の結果を図６に示す。図６における濃度も、前記と同じで培地量に対する固形分濃度を表す。薬剤を無処理で、ＵＶＢを非照射の場合を１００％として評価した。ＵＶＢ非照射の場合は、フェルラ酸および各植物抽出液をそれぞれ単独または組み合わせて処理したいずれの場合でも、無処理と同程度の細胞生存率であった。ＵＶＢを照射した場合は、無処理に比べてフェルラ酸、セイヨウキズタおよびエキナセアをそれぞれ単独で処理した場合は有意に細胞生存率が上昇したが、フェルラ酸およびセイヨウキズタまたはエキナセアを組み合わせて処理した場合は、それぞれ単独よりもより効果的に細胞生存率が上昇した。一方、セイヨウイラクサおよびゲンチアナはフェルラ酸の有無に関わらず、無処理と同程度の細胞生存率であった。よって、フェルラ酸およびセイヨウキズタまたはエキナセアの組み合わせが、光障害抑制のために選択的に作用することが分かった。
【００７８】
フェルラ酸および各植物抽出液をそれぞれ単独で０．０１％および０．１％、フェルラ酸および各植物抽出液を合わせて０．０１％および０．１％で処理した時の結果を図７に示す。図７における濃度も、前記と同じで培地量に対する固形分濃度を表す。薬剤を無処理で、ＵＶＢを非照射の場合を１００％として評価した。ＵＶＢ非照射の場合は、フェルラ酸および各植物抽出液をそれぞれ単独または組み合わせて処理したいずれの場合でも、無処理と同程度の細胞生存率であった。ＵＶＢを照射した場合において、フェルラ酸およびセイヨウキズタをそれぞれ単独で０．０１％処理した場合は無処理と同程度の細胞生存率であったが、フェルラ酸およびセイヨウキズタを合わせて０．０１％処理した場合は、細胞生存率が上昇した。同様に、フェルラ酸およびセイヨウキズタを合わせて０．１％処理した場合もフェルラ酸およびセイヨウキズタをそれぞれ単独で０．１％処理した場合に比べて、細胞生存率が上昇した。よって、フェルラ酸およびセイヨウキズタの組み合わせが、光障害抑制のために相乗的に作用することが分かった。
【００７９】
［試験結果６ ヒト皮膚三次元モデルにおけるラミニン５産生促進剤およびインテグリンα６β４産生促進剤の光障害抑制作用の測定］
ヒト皮膚三次元モデルは、ＴＥＳＴＳＫＩＮ（ＬＳＥ−ｈｉｇｈ）（東洋紡績）を用い、プロトコールにしたがって培養した。植物性スクワランにコメヌカ油および各植物抽出液を溶解し、アッセイリング内の組織上に８０μｌ添加し、２４時間培養した。培養液で数回洗浄して薬剤を完全に除去した後、ＵＶＢを０および２４０ｍＪ／ｃｍ2で照射した。新たに薬剤を添加し、さらに２４時間培養後、組織培養液を回収し、１５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心して組織片を除去した。
【００８０】
この組織培養液を用いて、細胞膜に傷害を受けた細胞から遊離される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を測定することにより、細胞毒性を測定した。ＬＤＨ活性の測定は、ＬＤＨ−細胞毒性テストキット（和光純薬）を用いて行った。ＰＢＳ（−）を用いて適当に希釈した組織培養液を９６ウェルの反応プレートに分注後、発色液を処理し、室温で２０分間反応させた。反応停止液を処理後、マイクロプレートリーダーにより５６０ｎｍの吸光度を測定し、細胞毒性を評価した。
【００８１】
コメヌカ油を１．０％、各植物抽出液を０．１％で処理した時の結果を図８に示す。図８における濃度も、前記と同じで植物性スクワランに対する固形分濃度を表す。薬剤を無処理で、ＵＶＢを非照射の場合の細胞毒性率を１００％として評価した。ＵＶＢを非照射の場合は、薬剤処理の有無に関わらず、ほぼ同程度の細胞毒性率であった。ＵＶＢを照射した場合は、無処理に比べてコメヌカ油、セイヨウキズタおよびエキナセアをそれぞれ単独で処理した場合は有意に細胞生存率が上昇したが、コメヌカ油およびセイヨウキズタまたはエキナセアを組み合わせて処理した場合は、それぞれ単独よりもより効果的に細胞生存率が上昇した。一方、セイヨウイラクサおよびゲンチアナはコメヌカ油の有無に関わらず、無処理と同程度の細胞生存率であった。よって、コメヌカ油およびセイヨウキズタまたはエキナセアの組み合わせが、光障害抑制のために選択的に作用することが分かった。
【００８２】
以下に、本発明の処方例を示す。
＜処方例１＞ クリーム
下記の処方（単位は質量％）により、クリームを製造した。
（１）ステアリルアルコール ６．０％
（２）ステアリン酸 ２．０％
（３）水添ラノリン ４．０％
（４）スクワラン ９．０％
（５）オクチルドデカノール １０．０％
（６）ＰＯＥ（２５）セチルアルコールエーテル ３．０％
（７）モノステアリン酸グリセリン ２．０％
（８）コメヌカ油 １．０％
（９）防腐剤 適量
（１０）香料 適量
（１１）セイヨウキズタ抽出液 １．０％
（１２）１，３ブチレングリコール ６．０％
（１３）ＰＥＧ １５００ ４．０％
（１４）精製水 残余
上記成分（１）〜（１０）を８０℃に加熱溶解し油相とする。成分（１１）〜（１４）を７０℃に加熱溶解し水相とする。油相に水相を徐々に加え乳化し、攪拌しながら４０℃まで冷却し、さらに３０℃まで攪拌冷却してクリームを得た。
【００８３】
＜処方例２＞ 錠剤
下記の処方（単位は質量％）により、錠剤を製造した。
コメヌカ油 １０．０％
セイヨウキズタ抽出液 １０．０％
乳糖 ６５．０％
コーンスターチ １４．０％
グァーガム １．０％
【００８４】
【発明の効果】
以上に説明したように、ラミニン５産生促進剤およびインテグリンα６β４産生促進剤を含む本発明組成物は、表皮細胞におけるラミニン５およびインテグリンα６β４の産生を促進し、皮膚基底膜と表皮基底細胞の接着を促進することにより、表皮と基底膜の構造維持および機能向上を促す。したがって、老化した皮膚、特に紫外線により障害を受けた皮膚に対して、表皮と基底膜の構造異常および機能低下を予防、防止、改善することにより、しわ、しみ、くすみ、たるみのない若々しい肌の状態を維持することができる。
【００８５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト表皮角化細胞に各植物抽出液を濃度依存的に処理した場合のラミニン５の産生を促進する作用を示す図である。
【図２】ヒト表皮角化細胞にフェルラ酸を濃度依存的に処理した場合のラミニン５の産生を促進する作用を示す図である。
【図３】ヒト皮膚三次元モデルにコメヌカ油を濃度依存的に処理した場合のラミニン５の産生を促進する作用を示す図である。
【図４】ヒト表皮角化細胞に各植物抽出液を処理した場合のインテグリンα６およびβ４の産生を促進する作用を示す図である。
【図５】ヒト表皮角化細胞にセイヨウキズタの葉の抽出液を濃度依存的に処理した場合のインテグリンα６およびβ４の産生を促進する作用を示す図である。
【図６】ヒト表皮角化細胞にフェルラ酸および各植物抽出液を処理した場合の光障害を抑制する作用を示す図である。
【図７】ヒト表皮角化細胞にフェルラ酸およびセイヨウキズタの葉の抽出液を処理した場合の光障害を抑制する作用を示す図である。
【図８】ヒト皮膚三次元モデルにコメヌカ油および各植物抽出液を処理した場合の光障害を抑制する作用を示す図である。
Claims (2)
- フェルラ酸とセイヨウキズタあるいはその抽出物とを含む皮膚の光障害抑制用組成物。
- 皮膚外用剤である請求項1記載の組成物。
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