JP4099430B2

JP4099430B2 - グルタチオンアナログおよびグルタチオン模擬物を含むパラログパネル

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Publication number: JP4099430B2
Application number: JP2003174058A
Authority: JP
Inventors: エム．コーバーローレンス; エイチ．リトルマシュー
Original assignee: Telik Inc
Current assignee: Telik Inc
Priority date: 1993-09-24
Filing date: 2003-06-18
Publication date: 2008-06-11
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Also published as: JP2004059586A; WO1995008563A1; AU693807B2; AU7842194A; DE69424678T2; PT720620E; JP4025248B2; EP0720620B1; EP0720620A1; DK0720620T3; CA2171453A1; CA2171453C; US5786336A; DE69424678D1; JP2004002442A; GR3033230T3; JP3503641B2; ATE193302T1; ES2148348T3; JPH09506336A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルタチオンの新規なアナログであるトリペプチド化合物に関する。本発明はまた、多様な特性を有するグルタチオンアナログであり、そしてグルタチオントランスフェラーゼ(GST)の特徴付けおよびGSTの溶液相インヒビターとして有用であるトリペプチドのパネルに関係する。
【０００２】
【従来の技術】
グルタチオン(GSH)は、還元型で、以下の式のトリペプチドである：γ-Glu-Cys-Gly。還元型グルタチオンは、細胞内におけるレドックス条件の維持に中心的な役割を有し、そしてまた多数のメカニズムにより外来物質の解毒を促進するグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)の必須基質である。メカニズムはトキシンの求電子的な部分の、例えばグルタチオンへのカップリングの触媒作用を含み、これによりトキシンをより浄化に感受性にする。第二のメカニズムは、基質としてグルタチオンも含み、グルタチオンの酸化と同時に生じる過酸化物の還元に存在する。
【０００３】
Adang, A.E.P.ら、Biochem J (1990) 269:47-54は、異なる濃度で種々のGSTイソ酵素と相互作用するGSHのトリペプチドアナログを記載した。これらのアナログは、少なくとも一つのグリシン、システイン、またはγ−グルタミン残基が他のアミノ酸残基によって置換されているGSHの改変された形態である。
【０００４】
別の改変形態は、例えば、ラット肝臓のグリオキサラーゼII酵素におけるトリペプチドGSHアナログの効果を研究したPrincipato,G.B.ら、Enzyme (1989) 41:175-180により開示された。このグループにより用いたトリペプチドは、式γ-Glu-ρ-クロロフェニルカルボニルメチル-Cys-Serであった。Morris,D., Biochem J (1960) 76:349-353は、γ-Glu-ベンジル-Cys-Valの合成を記載した。３つのGSHアミノ酸のうち１つだけ置換している多数のGSHトリペプチドアナログは報告され、そして市販されている。
【０００５】
以下に記載の本発明は、新規なグルタチオントリペプチドアナログに関し、それは、クロマトグラフィー支持体上でアフィニティーリガンドとして、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼの種々のイソ酵素を特徴付けるために使用するパネルのメンバーとして有用である。グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)は、特異的結合能、基質およびインヒビター特異性、ならびに組織分布が異なる多数のイソ酵素の形態で存在する。従って、特性における違いをともなうGSTイソ酵素の特定のコンプルメント(complement)は、腫瘍組織のような特定の組織または細胞型に特有である。GSTが、トキシン物質に対するその防御に関連する組織または細胞の全体にわたる代謝の中心であるので、細胞または組織に対するGSTのコンプルメントの特徴は、腫瘍細胞に所望されるような細胞または組織の破壊、または正常組織の場合代謝機能の促進のいずれかのための方針の設計において重要である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
種々のGSTイソ酵素は、４つの遺伝子ファミリー中の少なくとも15の公知の遺伝子によりコードされるモノマーの一対の組合せにより形成される２量体タンパク質であり、数ダースの異なる２量体を生じることが理論的に可能であり、同じ遺伝子ファミリー由来のモノマーの選択的な２量体化でさえも可能にする。これらの組合せの可能性から生じる変異性に加えて、GSTイソ酵素サブユニットはヒト集団で多形性あり、そしてファミリーの縦列反復メンバー間での遺伝子変換事象のためにさらなる変異に供されると考えられた。翻訳後修飾がこの変異性にさらに加わる。各細胞または組織が１または数種のこれらの理論的に可能な酵素を含み得るので、GSTコンプルメントの決定は、大変重要である。
【０００７】
本発明は、吸着体（sorbent）および溶液相インヒビターとして有用である新規なグルタチオンアナログ、ならびにそれらを含むパネルを提供することにより、個々のGST酵素またはそのセットを特徴付けおよび操作するための改良された方法を提供する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、グルタチオンS-トランスフェラーゼイソ酵素を特徴付けるのに、細胞および組織のGSTコンプルメントを測定するのに、および治療用途に有用な試薬に関する。本発明の化合物は、系統的に改変した形態の還元型グルタチオン、および標的酵素に関して多様な性質を有するこのようなアナログを含むパネルである。本発明の化合物はまた、クロマトグラフィーアフィニティーリガンド、結合試薬、および酵素インヒビターとしても有用である。
【０００９】
本発明のトリペプチドのエステルは、特に、治療的および診断的状況において有用である。このアミドもまた、薬理学的性質または生理学的作用を改変し得る部分に誘導体化できる。従って、１つの局面において、本発明は、下式の化合物に関する：
【００１０】
【化２】

およびそのアルキル型（１-10Ｃ）、アルケニル型（１-10Ｃ）、およびアリールアルキル型（７-12Ｃ）エステル、アミド、およびそれらの混合エステル／アミド；
ここで、Ｚは、Ｓ、Ｏ、およびＣからなる群から選択され；
ｎは、１、２、または３であり；
ここで、ＺがＯまたはＳであり、かつｎが１である場合、Ｘはモノ置換またはジ置換または非置換ヒドロカルビル（１-20Ｃ）部分であって、任意に１個または２個の非隣接ヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、またはＮ）を含有し、そしてここで、該置換は、ハロ、-NO、-NO₂、-NR₂、OR、およびSRからなる群から選択され、ここで各Ｒは独立してＨまたは低級アルキル（１-４Ｃ）であり；
ここで、ＺがＳであり、かつｎが２である場合、１つのＸは、上記の定義通りであり、そして他のＸは低級アルキル（１-４Ｃ）であり；そして
ここで、ＺがＣであり、かつｎが３である場合、１つのＸは、上記の定義通りであり、そして他の２つのＸは、独立して、Ｈまたは低級アルキル（１-４Ｃ）である；
Y-COは、γ-Glu、β-Asp、Glu、Asp、γ-Glu-Gly、β-Asp-Gly、Glu-Gly、およびAsp-Glyからなる群から選択され、そして
AA_cは、式(１)の化合物の残りの部分にペプチド結合によりカップリングされるアミノ酸である。
【００１１】
別の局面において、本発明は、上記の式(１)の化合物のシクロアミド形態に関する。ここで、ＺがＳであり、かつｎが２である場合、１つのＸはまたＨであり得る。
【００１２】
また別の局面において、本発明は、ヒトグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）酵素を精製または特徴付けする方法に関する。この方法は、酵素を含むと思われる試料を、上記の式(１)の化合物をカップリングさせた固体支持体と、ヒトGSTがこの固体支持体に吸着される条件下で接触させる工程、この固体支持体を試料から分離する工程、およびヒトGSTを固体支持体から溶出する工程を包含する。本発明の方法の１つの好ましい実施態様において、支持体は、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）システムの使用に適している。
【００１３】
また他の局面において、本発明は、試料中のGST酵素の存在または非存在を検出する、そして必要に応じてクラスにより特徴付けする方法に関する。この方法は、試料を上記の式(１)の化合物で処理する工程、および試料中に含まれる任意のGSTと式(１)の化合物との間の複合体の存在または非存在を検出する工程を包含する。
【００１４】
本発明はまた、少なくとも５つの異なった式(１)のトリペプチドグルタチオンアナログ（あるいはそのエステル、塩、アミド、混合エステル／アミド、またはそれらのシクロアミド形態）を含む、パネルを包含し、ここでパネル中の化合物は、多様な特性を有する。これらのパネルは、クロマトグラフィー支持体パネルとして構成され、そして細胞のGSTコンプルメントを特徴付けるために用いられ得る。
【００１５】
本発明はまた、式(１)の化合物に関し、ここでＸはモノ-、ジ-、またはトリ置換された単環式または二環式アリール（１-20Ｃ）、好ましくはベンジルであり、ここで置換基はR'、ハロ、-NO、-NO₂、-NH₂、OR、およびSRからなる群から選択され、ここで、ＲはＨまたはアルキル（１-６Ｃ）であり、そしてR'は、アルキル（１-６Ｃ）、アルケニル（１-６Ｃ）またはアルキニル（１-６Ｃ）である。
【００１６】
本発明はまた、種々のGSTイソ酵素のための本発明のトリペプチドグルタチオンアナログの選択性を利用する方法およびプロトコルに関する。非標的細胞と比較して標的細胞中のGSTイソ酵素レベルを考慮すると、適切なグルタチオンアナログは、選択的細胞毒性効果を及ぼすか、または化学療法剤の効力を選択的に増すように選択され得る。さらに、本発明のアナログは、哺乳類被験体における骨髄を刺激または強化し得る。細胞内効果を及ぼすために、本発明の化合物は、好ましくは、ジアミドまたはジエステルあるいはそれらのハイブリッドとして供給されることがさらに見出されている。
【００１７】
別の局面において、本発明は、腫瘍細胞における化学療法剤の効力を増す方法に関する。この方法は、上記腫瘍細胞に、上記化学療法剤と共に、効力を増す量の上記の式(１)の化合物のジエステルまたはジアミド、あるいはアミド、エステル、またはそれらのハイブリッドアミド／エステルを投与する工程を包含する。
【００１８】
また別の局面において、本発明は、非標的細胞と比較して標的細胞に細胞毒性効果を及ぼす方法に関する。この方法は、GSTイソ酵素を同定する工程であって、このGSTイソ酵素のレベルは非標的細胞と比較して上記標的細胞において高められている、工程；
選択的に上記イソ酵素を不活性化する、式(１)の化合物を選択する工程；および上記非標的細胞と比較して上記標的細胞に対して毒性の量で、上記選択された化合物、あるいはそれらのアミド、エステル、またはハイブリッドアミド／エステルを上記標的細胞に投与する工程を包含する。
【００１９】
さらに別の局面において、本発明は、被験体の骨髄における顆粒球マクロファージ(GM)前駆体の産生を刺激する方法に関する。この方法は、上記被験体に有効量の式(１)の化合物、あるいはそれらのアミド、エステル、またはハイブリッドアミド／エステルを投与する工程を包含する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明は、クロマトグラフィーのリガンドおよびGSTインヒビターとして個々に有用な化合物、ならびに多様な特性を有する関連化合物のパネルに関し、例えば、GST酵素のプロフィールの測定、および未知の試料中のGSTコンプルメントの測定に有用である。本発明の化合物は、系統的に改変された形態の還元型グルタチオン、および標的酵素に関して異なる特性を有するアナログを含むパネルである。
【００２１】
GSHの既存のトリペプチドアナログは、異なる濃度で種々のGSTイソ酵素と相互作用し、グリシン、システイン、またはγ−グルタミン残基の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換される改変形態のGSHである。例えば、Adang,A.E.P.ら、Biochem J (1990) 269:47-54参照。GSHトリペプチドおよび多数の他の可能性のあるものにおいて各アミノ酸に対して置換される種々の非標準アミノ酸が与えられて、システインスルフヒドリルに連結され得る種々の基質と組み合わされる場合、GSTインヒビターとして数万のGSHアナログを意図することが可能である。
【００２２】
以下の以前に記載されたパラログ方針(米国特許第4,963,263号および第5,133,866号、これらの開示は、参考として本明細書中に援用される)に続き、この潜在的なセットの系統的なサンプリングが調製された。従って、潜在的な多様性の代表的なサンプリングは、いくつかの哺乳動物種(主にラット)由来のGSTへの結合に関する広範な複数のパラメーターと交差して、共存のバリエーションを生じるモノマー選択を通して達成される。強調されたパラメーターは、疎水性、サイズ、および電気陰性度を含む。特性のバリエーションは、主にＣ末端およびスルフヒドリル位置で作出された。
【００２３】
アフィニティークロマトグラフィーにより試験される場合、これらの多様な吸着体のいくつかは、Mannervik, B.ら、Proc Natl Acad Sci (1985) 82:7202-7206に提案された以下のクラス分けに従って特定の１つのクラスまたは複数のクラスの哺乳動物GSTイソ酵素を選択的に結合する：α(例えば、ヒトαおよびA1-1、ラット1-1および2-2)、μ(ヒトμ、M1a-1a、ラット3-3および4-4)、π(ヒトπおよびP1-1、ラット7-7)および、さらに最近提案されたクラスθ(ラット5-5)。GST酵素活性の阻害について試験する場合、いくつかの吸着体はまたGSTイソ酵素クラスの選択的または特異的インヒビターとしても作用する。従って、本発明の化合物、パネル、および方法は、高められたレベルの特定のGSTイソ酵素を有する細胞を標的する薬剤の設計に新規な方針を与える。
【００２４】
本発明の化合物はまた、化学療法剤の毒性を強化するが、同時に、骨髄の保護効果を強化するように見える。特に、本発明の化合物の投与は、顆粒球マクロファージ(GM)前駆体の生産を促進することが確立された。この効果のために、腫瘍細胞に対する化学療法剤の毒性が強められるだけでなく、正常細胞が化学療法剤に対してより良好に保護される。さらに、本発明の化合物は、貧血症のような種々の骨髄関連欠乏症の処置に有用である。
【００２５】
種々のGSTイソ酵素に対する選択性を示す試薬が選択される化合物は、１組のトリペプチドグルタチオンアナログである。これらの化合物は、以下に示すように、種々のイソ酵素に対する選択の範囲を提供する。これにより、このクラスの適切なメンバーが、イソ酵素のクロマトグラフィー分離、GST操作における選択的な検索剤、および直接的な細胞障害性効果に関してか、または他の化学療法剤の強化によるかのいずれかにより特定の細胞を標的する手順における選択的な活性成分に対して有用となる。
【００２６】
本発明の化合物
本発明の新規な化合物は、式（１）の部分を含み、ここで１つのＸはモノ置換またはジ置換または非置換のヒドロカルビル(1-20C)部分であって任意に１個または２個の非隣接ヘテロ原子(Ｏ、Ｓ、またはＮ)を含有し、そして他方のＸは存在しないか、または低級アルキル(1-4C)である。好ましい実施態様では、ｎは１であり、そしてＸは非置換ヒドロカルビルである。Ｘについての好ましい実施態様は、メチル、プロピル、ヘキシル、オクチル、ベンジル、ナフチル、およびトリチルを含む。シクロアミド形態では、ＸはまたＨであり得る。
【００２７】
本明細書において、「ヒドロカルビル」は、１〜20個のＣを含む、直鎖または分枝鎖または環状の、飽和または不飽和の、脂肪族または芳香族のヒドロカルビル残基を意味する。１〜20個のＣに加えて、構造的に現実性があれば、ヒドロカルビルはまた、１個または２個の非隣接のヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、またはＮである）を含み得る。従って、そのように修飾されたヒドロカルビル基は、エーテル、ジエーテル、チオエーテル、またはジチオエーテル、あるいは２級または３級のアミン、またはジアミンであり得る。このような置換基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、３級ブチル、ヘキシル、オクチル、ノニル、2,3-ジメチルオクチル、ドデシル、9,9-ジメチルウンデシル、アリル、2-ブテニル、イソブテニル、シクロヘキシル、シクロペンチル、シクロへプチル、フェニル、ベンジル、4-メチルベンジル、トリフェニルメチル、メトキシエチル、エチルチオエチル、ジエチルアミノプロピルなどが挙げられる。また、Ｘとして適切なヒドロカルビル基としては、ナフチルおよび複素環式の関連の基などを包含する二環式アリール（１〜20Ｃ）部分がある。
【００２８】
さらに、ヒドロカルビル、または１個または２個のヘテロ原子を含むヒドロカルビルは、任意に、１個または２個の置換基で置換され得る。これらの置換基は、ハロ(すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード)またはヒドロキシまたはスルフヒドリル、および／またはアルキルオキシまたはアルキルチオ(例えば、メチルチオ、ブチルチオ、プロポキシ、またはエトキシ）、および／または-ＮＯ、-ＮＯ_２、または-ＮＨ_２、-ＮＨ(アルキル)または-Ｎ(アルキル)(アルキル)であり得る。
【００２９】
原子価の規則に適合して、ＺがＯのとき、ｎは１でなければならない；ＺがＳのとき、ｎは１であり得る(またはＳが正の電荷を有するときには２であり得る）；そしてＺがＣのとき、ｎは３でなければならない。一個のＸのみが、上記の複雑性を許容される。ｎが２のとき、第２のＸは低級アルキルである；ｎが３のとき、第２および第３のＸは、各々独立して、Ｈまたは低級アルキル(１〜４Ｃ)である。
【００３０】
AA_Cは、任意の、遺伝子にコードされるアミノ酸であり得る。AA_Cはまた、ヒドロキシプロリン(HP)、4-アミノ酪酸(4ABu)、β-アラニン(β-alaまたはβA)、フェニルグリシン(PGまたはφG)などのような、遺伝子によってコードされないアミノ酸残基であり得る。AA_Cの好ましい実施態様としては、グリシン、フェニルグリシン、β-アラニン、アラニン、およびフェニルアラニンが挙げられる。AA_Cは、ペプチド結合を通じて、式(1)の化合物の残りの部分に結合している。
【００３１】
本発明の化合物において、Glyをフェニルグリシンで置き換えると、その部位の疎水性および嵩高さが増大し、その結果、πクラスのイソ酵素(例えば、ラット7-7)に対する特異性が高くなる。Gly部位におけるAlaおよびβ-Alaの使用によって、μクラスのイソ酵素(例えば、ラット3-3および4-4)に対する特異性が高い吸着体が生産される。Alaからβ-Alaへのシフトは、骨格の長さを増加させる変更であり、その結果、μクラスの異なるイソ酵素で、結合に差がでる。
【００３２】
Ｘが置換されたベンジルである本発明の化合物に関して、式(1)の遊離酸または塩のいずれの形態であっても、あるいはエステル形態、アミド形態、またはシクロアミド形態のいずれの形態としても、ヒトGSTの種々のサブタイプに対する特異性は、ベンジル部分のパラ置換基を変えることによって制御し得る。t-ブチルまたはメチルあるいはベンジルのような疎水性のパラ置換基を含むＸの実施態様は、GST-M1a-1aのようなヒトGSTのμ(M1)クラスに優先的に結合する。パラ位におけるニトロまたはクロロのような電子吸引性置換基は、π(P1-1)酵素に優先的に結合する。ハメットのσ/メタ値をイソ酵素結合のlog分率に対してプロットすると直線の相関が示されるが、σ/パラ値を用いると明確な相関は現れない。ある種の立体的な嵩高さはGSTへの結合に一般的に必要であるように思われる。非置換またはフッ素置換基のみを有するベンジル置換基は、あまり結合しない。
【００３３】
Ｘが非置換のヒドロカルビル(１〜20Ｃ）部分である本発明の化合物に関して、式(1)の遊離酸または塩のいずれの形態であっても、あるいはエステル形態、アミド形態、またはシクロアミド形態のいずれの形態としても、ヒトGSTの種々のサブタイプに対する特異性は、Cys部分のイオウ原子上の置換基の疎水性（例えばn-アルキル付加物の長さ)を変えることによって制御し得る。一般に、GSTについての結合強度はアルキル基の鎖長につれて増加するが、鎖長の増加につれてイソ酵素の選択性の変化が生じる。３個または４個の原子を有するＳ−アルキル鎖を含むＸの実施態様は、ヒトGSTのμクラス、特にGST-M1a-1aを優先的に阻害する。５個から８個の炭素を含むアルキル基の範囲においては、αおよびμクラスのヒトGSTは、ほぼ同程度阻害され、そしてヒトのπクラスのイソ酵素と比較して選択的に阻害される。最後に、Ｓ−ノニルおよびＳ−デシルのGSH誘導体については、３つのクラス全てからのヒトGSTが、ほぼ同程度阻害される。
【００３４】
本発明の化合物は、アルキルエステル、アルケニルエステル、またはアリールアルキルエステル、あるいはアルキルタイプアミド、アルケニルタイプアミド、またはアリールアルキルタイプアミドを包含し得、あるいはアミド環式形態であり得る。遊離カルボキシルのアルキルタイプエステルは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、t-ブタノール、n-ヘキサノールなどのような直鎖および分枝鎖および環状のアルキルアルコール(１〜10Ｃ)のエステルである。アルキルタイプアルコールの炭素鎖は１個または２個の非隣接のヘテロ原子(すなわち、Ｎ、Ｏ、またはＳ)で区切られていてもよい。例えば、アルキルタイプアルコールには、N,N-ジメチルエタノールアミンおよび2-(1-ヒドロキシ-2-エチル)-4,4,6-トリメチルテトラヒドロ-1,3-オキサジンが包含される。適切なアルキルタイプ（１〜10Ｃ）アミドは、メチルアミン、エチルアミン、n-プロピルアミン、イソペンチルアミン、およびイソヘキシルアミンなどのような直鎖または分枝鎖または環状の１級アルキルアミンのアミドである。これらの炭素鎖もまた、１個または２個の非隣接のヘテロ原子(すなわち、Ｎ、Ｏ、またはＳ)で区切られていてもよい。アルケニルタイプのエステルおよびアミドは、少なくとも１個の二重結合を有する対応のアミンから調製される。アリールアルキルタイプのエステルは７個〜12個のＣを含み得、そしてベンジル、2-フェニルエチル、2-フェニルプロピルなどのようなフェニル−低級アルキル誘導体を包含する。フェニル基は、非置換であり得、あるいは本発明の化合物の性質にあまり影響を及ぼさないメチル、クロロなどのような１〜２個の置換基で置換され得る。この炭化水素鎖もまた、１個または２個のヘテロ原子で区切られていてもよく、そして複素環式芳香族系もまた包含され得る。これらのエステルおよびアミドは、式(1)の基質化合物中の任意のアルコールまたはアミノ官能基を適切に保護して、通常の方法を用いて調製される。
【００３５】
この化合物は、モノエステルまたはジエステルあるいはモノアミドまたはジアミド（あるいはAA_Cの選択に応じて、トリエステルまたはトリアミド)のいずれとして調製されてもよいことに留意すべきである。従って、本発明は、カルボキシル基のうち１個のみがエステル化されているエステル、２個のカルボキシル基がエステル化されているエステル、またはすべてのカルボキシル基(２個より多い場合）がエステル化されているエステルを包含する。同様の実施態様が、対応のアミドにも適用できる。さらに、この化合物は、１個のカルボキシルがエステルであり他方がアミドである混合エステル／アミドとして調製され得る。
【００３６】
本発明の化合物の塩は、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのような無機塩基、またはカフェインまたはピペリジンのような有機塩基から形成されて遊離カルボキシル基の塩基性塩を形成し得、あるいは、有機酸または無機酸から形成されて遊離アミノ基の酸付加塩を与え得る。従って、この塩は水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどのような無機塩基の塩、またはトリメチルアミン、ピリジン、ピリミジン、リジン、カフェインなどのような有機塩基の塩であり得る。酸付加塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などのような無機酸から形成され得、あるいは酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸などのような有機酸から形成され得る。
【００３７】
塩は、標準的なプロトコルで、適切な塩基または酸で約０℃から約100℃までの温度（好ましくは室温）において、水単独中で、または水と相溶性の不活性な有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、またはジオキサン）を水と組み合わせた中で、処理することによって、形成される。
【００３８】
式(1)の化合物の環状形態は、基質化合物に含まれる遊離のアミノ基と遊離のカルボキシル基とを架橋することによって調製される。環状化合物の形成は、常法に従い、ジシクロヘキシルカルボジイミドのような脱水剤を用いて、当該分野で本質的に公知の手段によって処理することによって行われる。必要があれば適切な保護を行う。
【００３９】
式(1)の化合物の大部分の実施態様において、シクロアミドはＹ上のアミノ末端に存在する遊離のアミノ基と、AA_Cで表されるカルボキシル末端のカルボキシル基との間で形成される。しかし、AA_Cが側鎖アミノ基を含むような限定された実施態様(例えばAA_Cがリジンであるような実施態様）においては、AA_Cの側鎖のアミンとＹの側鎖のカルボキシルを用いて、別の形態のシクロアミド化合物もまた調製され得る。当該分野で公知のように、適切な保護基を用いて直接シクロアミド化が行われ得る。
【００４０】
本発明の化合物は、Y-CO、ｎ、Ｘ、Ｚ、およびAA_Cの内容を示すことによって、さらに特徴付けられ得る。「Y-CO」の種々の実施態様には、γ-Glu、β-Asp、Glu、Asp、γ-Glu-Gly、β-Asp-Gly、Glu-Gly、およびAsp-Glyが包含され、これらは、１文字アミノ酸コードでは、それぞれ、γE、βD、E、D、γE-G、βD-G、E-G、およびD-Gとして表し得る。Ｘによって示される種々の置換基は標準的な略号によって表記され得、本発明の化合物のトリペプチドアナログへのその導入は、ｎ＝１かつＺがＯのときC(O)(X)、またはＺがＳのときC(X)、またはｎ＝２のとき(ＺはＳでなければならない）C(X)(X)、またはｎ＝３のとき（ＺはＣでなければならない）C(X)(X)(X)によって表される。しかし、ＸがＨのとき、ＨまたはＨ_２で表して表記することは絶対にしない。ｎが２に等しい式(1)の化合物においては、システイン残基のイオウは正の電荷を有し、そしてスルホニウムイオンとして存在する。
【００４１】
ＺがＯの化合物としては、例えば、γ-グルタミル-(o-ヘキシル)セリニル-グリシン、γ-グルタミル-(o-オクチル)セリニル-グリシンなどが挙げられる。ＺがＣの化合物としては、例えば、γ-グルタミル-ヒスチジニル-グリシン、γ-グルタミル-(π-ベンジル)ヒスチジニル-グリシン、およびγ-グルタミル-α-アミノオクタノイル-グリシンなどが挙げられる。ＺがＯまたはＣの化合物は、Ｚ位にＳを含む化合物よりも酸化に対してより抵抗性である。
【００４２】
AA_Cについての表記もまた、標準的な１文字アミノ酸略号または遺伝子でコードされないアミノ酸についての他の適切な略号で行われ得る。
【００４３】
従って、この表記を用いると、式(1)の適切な化合物には：
【００４４】
【化３】

など、ならびに環状形態またはエステル化／アミド化形態が包含される。
【００４５】
本発明の化合物の特徴
本発明の化合物は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)のようなグルタチオンを基質として利用する酵素の、溶液相または固定化インヒビターとして有用である。このような阻害は、分析および治療の両方の状況において所望され得る。
【００４６】
治療剤としては、エステル化された本発明の化合物が最も有用である。このような親水性の低い形態によって、細胞膜の透過が最も達成されるからである。従って、適切なアミドまたはエステル／アミドハイブリッドもまた使用され得る。特に好ましいエステルはベンジルエステルおよびベンジルエステルの誘導体である。エチルエステルもまた好ましい。
【００４７】
しかし、細胞内効果は、本発明の化合物の非エステル化形態の生成に依存すると考えられている。
【００４８】
本発明の化合物はジカルボン酸であるので、ジエステルが好ましい形態である。いくつかの例では、代謝はモノエステルを通じて進行するようである。とはいえ、活性形態は細胞内では非エステル化形態であると考えられる。しかし、Welner,W.P.ら、Proc Natl Acad Sci USA (1984) 81:4732-4735；Anderson,M.E.ら、ArchBiochem Biophys (1985) 239:538-548；Tsan, M.-F.ら、J App Physiol(1989) 66:1029-1034に記載されているように、グルタチオン自体の取込みはエステル化によって阻害されるようである。おそらく、これはグルタチオンそれ自体についてのアミノ酸取込みチャンネルの使用に起因すると思われる。他方、Lo,T.W.Cら、Biochem Pharmacol (1992) 44:2357-2363は、グリオキサラーゼインヒビターのジエチルエステルが腫瘍細胞に透過し得ることを見いだした。
【００４９】
従って、細胞培養におけるインビトロでの使用、例えばスクリーニングアッセイでの使用のためには、好ましい本発明の化合物はエステル化形態である。このことは、無血清培地中の2×10⁵細胞/mlをジエチルエステルに４時間曝した後のHT-29細胞に対する毒性に関して、ジカルボン酸形態の場合とは対照的に劇的に示される。この特徴を例証するために、４種のモデル化合物が使用された。これらの４種の化合物は以下の通りである：
1)γ-グルタミル-S(オクチル）-システイニル-グリシン（略号「オクチルG」）は、ジカルボン酸形態の場合、IC₅₀＞200μMである；ジエチルエステルについてはIC₅₀は22μMである；
2)γ-グルタミル-S(ヘキシル）システイニル-R(-)-フェニルグリシン（略号「ヘキシルPG」）はジカルボン酸形態では、IC₅₀＞200μMであるが、ジエチルエステルはIC₅₀が24μMである；
3)γ-グルタミル-S(ベンジル)システイニル-R(-)-フェニルグリシン(略号「ベンジルPG」）もまた遊離の酸形態ではIC₅₀＞200μMであるが、ジエチルエステルはIC₅₀が47μMである；
4)γ-グルタミル-S(ナフチル）システイニル-グリシン（略号「ナフチルG」）はIC₅₀＞200μMであるが、ジエチルエステルはIC₅₀が40μMである。
【００５０】
上記のIC₅₀の値は上述のように測定され、そして細胞は、後述の実施例11に記載される改変されたクローン原性(clonogenic)アッセイを用いてアッセイされた。
【００５１】
さらに、エステルもアミドも両方とも、本発明の化合物を、治療剤、診断薬、および固体支持体へのカップリングのためのリガンドとしてのその適応性に影響を与えるような様式で改変するための機会を提供する。エステル基またはアミド基は、細胞透過性を増強するに有用な疎水性部分のようなさらなるリガンド、他の基質との結合を容易にする反応性基、および抗体またはそのフラグメント、免疫原性を増大させるキャリアなどのようなさらなるリガンドを含み得る。さらに、この化合物は、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にするキレート剤のような置換基、またはペプチドの溶解性を変化させるかあるいは薬物動態に影響を与える置換基(例えば、ポリエチレングリコールの付加）を導入することによって改変され得る。
【００５２】
従って、式(1)の化合物のエステルまたはアミドは、種々の状況において、遊離酸または塩の形態とは異なる利点を提供する。
【００５３】
式(1)の化合物のシクロアミド形態は、標的GST間の特異性および選択性を増大させるという利点を提供する。環状形態は、一般に、開環鎖状形態よりもクロマトグラフィーのリガンドとして優れている。さらに、これらの阻害特性はこの特徴によって調節される。
【００５４】
Ｘの実施態様として置換されたベンジルを含む本発明の化合物は、種々のGSTに対するこの化合物の選択性を系統的に制御する機会を提供するという点で利点を有している。例えば、本明細書の実施例８に示されるように、ヒトGSTのμグループおよびπグループ間の結合特異性は、本発明のある種の化合物のCys残基のイオウ原子に結合したベンジル部分上のパラ置換基の性質によって制御される。結合特異性とS-ベンジルCys部分のパラ置換基のσ(メタ)値との間には相関がある。
【００５５】
上記の４種の好適な化合物は、GSTイソ酵素に関して明らかな選択性を示す。これらの化合物はいずれも、グルタチオンレダクターゼ（ここでGSSG還元はNADPHの消失によって測定される）またはγ-グルタミルトランスペプチダーゼ（ここでグルタミルp-ニトロアニリン(p-nitroanaline)由来のグルタミルのグリシルグリシンへの転位が評価される）のいずれをもあまり阻害しないことを示した。これらのテストにおいて、４種の化合物すべて（ならびにエタクリン酸）が１mMを超えるIC₅₀を有していた。しかし、これらの４種の各化合物がGSTイソ酵素を阻害する能力に関してはかなりの差異が見いだされた。GSTイソ酵素であるP1-1、A1-1、M1a-1a、およびM2-2をこれらの化合物に関してテストすると、選択性の差異が明らかになる。ベンジルPGおよびヘキシルPGは他の３種のイソ酵素と比べてP1-1を選択的に阻害したが、ヘキシルPGはA1-1に関してかなりの阻害を示した。従って、ベンジルPGはP1-1に関してのKiがわずか0.4μMであることを示したが、残りのA1-1、M1a-1a、およびM2-2に関しての対応するKi値はそれぞれ、20、25、および31μMであった。ヘキシルPGはP1-1に関してKiが0.85μMと測定されたが、残りの酵素については、順に、Ki値は、それぞれ5.8、41、および97であった。
【００５６】
他方、ナフチルGはM1a-1aに関してのKiはわずか0.1μMであることを示したが、P1-1、A1-1、およびM2-2についての値は、それぞれ1.2、4.2、および1.5μMであった。オクチルGは明らかにA1-1について選択的であり、M1a-1aについては1.2μMでありP1-1については1.9μMであるのに比べて、Ki値は0.27μMであった。３種すべてのイソ酵素に関するエタクリン酸についてのKi値を比較すると、P1-1について4.0μM；A1-1について2.0μM；およびM1a-1aについて3.0μMである。
【００５７】
従って、ベンジルPGおよびヘキシルPGは、テストされた他のイソ酵素を除外して、特にP1-1のインヒビターとして有効である。ナフチルGはM1a-1aについて選択的であり、そしてオクチルGはA1-1について選択的である。
【００５８】
従って、本発明の種々の化合物の中から、所望の標的GSTについて選択的なアナログを見いだし得ることが明らかである。以下の実施例において反映されているように、その結果、化学療法剤の性質およびその関連する解毒機構ならびに標的細胞のGSTコンプルメントに応じた治療プロトコルを設計する能力が得られる。
【００５９】
クロマトグラフィーリガンドおよび分析試薬としての使用
本発明の化合物はまた、個々に、診断的なクロマトグラフィー支持体およびクロマトグラフィーツールとして有用である。これらの化合物を、特徴付けおよび精製のためのアフィニティークロマトグラフィー、ならびに診断的アッセイに使用することはヒトGSTの場合には特に重要である。本発明の化合物のパネルは組織内のGSTコンプルメントを測定するために最も便利であるが、個々の化合物は、一般的にGSTの存在を検出するため、またはヒトにおいて特定のタイプのGSTの存在を検出するために有用であり得、同様に特定のタイプのヒトGSTの精製のためにも有用であり得る。従って、後述の実施例８に示されるように、本発明の種々の化合物は、ヒトGSTのμ(M1)およびπ(P1)クラス、ならびに種々のラットイソ酵素に結合する傾向が異なる。さらに、実施例９に示されるように、本発明の化合物は特定のヒトGSTの選択的な溶液相での阻害も示す。大部分の場合、本発明の各化合物について、アフィニティークロマトグラフィーおよび阻害の研究は、同様の酵素特異性を示す。
【００６０】
本発明の化合物、または遊離酸または塩としての式(1)の化合物単独は、リガンドの選択に依存して、ヒトGSTを総体的に精製および特徴付けるためのクロマトグラフィーのリガンド、ヒトのGSTのクラスの精製および同定のためのクロマトグラフィーのリガンド、あるいは個別のヒトGST酵素の精製または分離のためのクロマトグラフィーのリガンドとして使用され得る。
【００６１】
クロマトグラフィーの支持体上のアフィニティーリガンドとして使用するためには、式(1)を含む化合物は、標準的なカップリング技法を用いて、セファロース(Sepharose)、ポリアクリルアミド、シリカなどのような適切な固体マトリックスにカップリングされる。本発明の非環式形態の化合物は、少なくともアミノおよびカルボキシル官能基を含む。この官能基は、適切なリンカーに誘導体化され得、あるいは直接支持体にカップリングされる。固体支持体の性質に応じて、アフィニティーリガンドのカップリングは、直接的な共有結合を使用し得、あるいはホモまたはヘテロ二官能性リンカー（例えば、PierceChemical Company(Rockford, IL)から入手可能）の使用を必要とし得る。アフィニティーリガンドをより接近しやすいものとするために、アフィニティーリガンドを支持体の表面から遠ざけることもまた所望され得る。このように遠ざけることは、一般に理解できるようにスペーサーアームを用いて達成され得る。さらに、支持体は、特に、その支持体が生物学的試料のクロマトグラフィーのために使用される場合、所望されない相互作用を最小にするために、例えばヒト血清アルブミンのような不活性物質で処理され得る。
【００６２】
誘導体化されたクロマトグラフィー支持体は、固体支持体に１種を超えるこのようなリガンドをカップリングさせることによって、式(1)の構造を含む化合物の多様性の利点を享受し得る。さらに、クロマトグラフィー用途において、本発明の化合物の組み合わせが使用され得る。このクロマトグラフィー用途において、アフィニティーリガンドとして作用する１種またはそれ以上の化合物と、アフィニティーリガンドと競合するために使用される１種またはそれ以上の化合物との間でのバランスがとられ、クロマトグラフィーによる分離または特徴付けに供される物質の溶離がもたらされる。後述の実施例10に例示されるように、クロマトグラフィー技法に供される部分に対する異なるアフィニティーを有する物質が、リガンドおよび溶離剤として使用される。
【００６３】
式(1)を含む化合物に誘導体化されたクロマトグラフィー支持体は、次いで、このリガンドがアフィニティーを有するヒトGSTまたは他の酵素、グルタチオンを基質として使用する他の酵素、グルタチオンと反応する抗体、またはこのリガンドに対して中程度のアフィニティーで結合する他の部分の、分取分離のために使用され得る。本発明の化合物にカップリングしたクロマトグラフィー支持体はまた、診断において使用され、グルタチオンと構造的に類似した物質を含むと推定される生物学的試料または他の試料中の物質の存在、非存在、量、または性質を測定し得る。例えば、後述の実施例10に例示されるように、新規なHPLC法において本発明の化合物を用いるアフィニティークロマトグラフィーは、GSTイソ酵素を、二量体の生物活性形態で、肝臓のようなヒトの組織から単離および分離するために使用され得る。
【００６４】
このような分離または分析に有用な、式(1)の構造を含む適切な化合物は、分析物または分取が所望される物質の性質から明らかであり得、あるいはこの化合物の多様なパネルを調製し、そして最も効果的なアフィニティーリガンドについてこのパネルをスクリーニングすることによって容易に決定され得る。
【００６５】
式(1)の構造を含む化合物はまた、ヒトGSTの存在または非存在を一般的に検出するため、あるいは特定のクラスまたはそのイソ酵素を検出するためにも使用され得る。このようなアッセイのためのプロトコルはイムノアッセイで用いられるプロトコルと似ている。特異的な結合パートナーが関与し、ここでアッセイの特異性が結合の特異性に依存するような任意のアッセイに対して、このようなプロトコルは一般に適用可能である。従って、このようなアッセイにおいて、式(1)の構造を含む化合物は、分析物（この場合、対応するGST）に対して特異的な抗体または他の免疫反応剤としての役割を果たす。このようなプロトコルとしては、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、直接結合アッセイなどが挙げられ、これは、「免疫複合体」（この場合、GSTと式(1)の構造を含む化合物との複合体）の形成についての多様な検出手段を伴う。このような検出手段としては、蛍光タグ、酵素標識、放射性標識、およびこれらの組合せが挙げられる。
【００６６】
パネル
本発明のパネルは、少なくとも５種の多様な式(1)のグルタチオンのトリペプチドアナログで構築され、ここでＸ、AA_C、およびＹは上で定義された通りであるが、ＸはＨであってもよい。このパネルは、特性が最大限に多様である場合に、最も有用である。この多様性は、Ｙ、AA_C、およびＸの性質を変えることによって供給され得る。一般に、例えば、異なる疎水性のＸ置換基を使用することによって、ある範囲のこのような疎水性特性が得られ得る。Ｘはまた、得られる化合物のハメット定数（σ/メタおよびσ/パラ）の多様性のバリエーションのために便利な置換基である。AA_Cのバリエーションから得られる多様性はいくぶん重要性が低い。Ｙのバリエーションによって提供される多様性はその構造が限られていることによって限定される。
【００６７】
ハメット定数は、置換基が安息香酸のイオン化定数に与える電子的影響を示すことで得られる値に類似した値を意味する。この初期の研究の結果、異なる置換基の多くの列に対して数値が割り当てられた。種々の置換基についてのこのような値の表が、例えばRitche,C.D.ら、Prog Phys Org Chem (1964) 2:323によって与えられている。
【００６８】
本発明のアナログのシリーズの構築は、このパラメーターを、例えば、Ｘの実施態様としてはベンジル基を用い、これをさらに別の置換基（例えば、ニトロ、クロロ、メトキシ、またはメチル）でパラ位を置換することによって、系統的に変化させることによって成し得る。
【００６９】
パネルのメンバーである式(1)の化合物の立体的な性質およびその結果得られる特性はまた、パネルの１種またはそれ以上のメンバーの環化によって制御され得る。
【００７０】
例えば、適切な２次元パネルを形成する本発明のグルタチオンアナログトリペプチドの２次元マトリックスは、AA_C成分を小さい疎水性残基から、大きい疎水性残基、正に荷電した残基、中性残基、および最終的には負に荷電した残基へと変化させる（このようにして、最後の３つのアナログは誘起電子効果に影響を与える）ことによって構築され得る。同様に、Ｘ置換基を、第２の次元において同様の範囲で、小さい疎水性基から、大きい疎水性基、正に荷電した基、中性基、負に荷電した基へと変化させ得る。得られるマトリックスは、例えば、吸着体として使用するに適した化合物を決定するために使用される適切なパネルを提供する。
【００７１】
Ｘの特に有用な実施態様は、置換ベンジルであり、ここでパラ置換基の疎水性と電子供与性または電子吸引性のバリエーションは、所定のクラスのヒトGSTに対する結合能力と系統的に相関する。
【００７２】
本発明のパネルの使用
このパネルは、（所望されない細胞または組織に比べて）正常な細胞または組織に生じるグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST)イソ酵素の異なるコンプルメントを測定するために有用である。「GSTコンプルメント」とは、このような細胞または組織に存在するGSTイソ酵素のレベルのパターンを意味し、あるいはこのようなGSTの発現レベルの誘導または抑制が操作され得るような様式で遺伝的にプログラムされているものを意味する。上記の背景の項で説明しているように、GSTは少なくとも７個が周知であるサブユニットから形成されるホモ二量体またはヘテロ二量体である。さらに、これらのイソ酵素は大まかにクラス分けされているとはいえ、各クラス内の個々のメンバーは遺伝的バリエーションに依存して個体ごとに異なり得る。この種々のイソ酵素の特性は、測定可能な一連のパラメータ（基質特異性、阻害され易さ、特定の試薬への結合、および発現の誘導可能性(inducibility)を包含する）に関して異なっている。
【００７３】
GST プロフィールを測定するための本発明のパネルの使用 -- 背景
おそらく、未知の組織試料のGSTイソ酵素コンプルメントを測定するための最も理解し易いアプローチは、既に測定されたかあるいは測定され得る反応性プロフィールを有するすべてのGSTイソ酵素のリファレンスセットを仮定することである。従って、例えば、任意の分離技法（例えば、高分離能クロマトグラフィーフォーカシングに類似した）を用いた分離能が充分高い分離を仮定すると、溶出パターンは、一連の既知の酵素に対して参照される。既知のイソ酵素を分離しそして特徴付ける別の方法は、特定のイソ酵素に対して調製された抗体（例えばいくつかのGSTヒトイソタイプに対して樹立された抗体）の使用を伴い、そして候補となる組織におけるこれらのイソタイプのGST含量を評価するために使用され得る（Howie,A.F.ら、Carcinogenesis(1990) 11:451-458；Beckett,G.J. Clinica Chimica Acta (1984) 141:267-273)。ゲル電気泳動による分離もまた使用され得る。未変性条件下における電気泳動後のGSTバンドの位置は、例えば、Ricci,G.ら、AnalBiochem (1984) 143:226-230の方法によって決定され得る。クロマトグラフィーによる分離の結果得られる種々のイソ酵素の位置は、1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼン(CDNB)のような、すべてのイソ酵素に共通の基質を用いて検出され得る。実際、種々の組織におけるCDNBによってアッセイされる活性の分布は、Pickett,C.B.、およびLu,A.Y.H.、AnnRev Biochem (1989) 58:743-764によって行われている。
【００７４】
これらのイソ酵素が各々、個々のイソ酵素を活性を維持したまま単離することができる分離技法の後に反応性プロフィール（この反応性プロフィールは予め測定されている）を有しているのであれば、目的とする細胞および組織中のGSTイソ酵素の分布のパターンを得るためのこれらの直接的な分離法の使用は、このような細胞および組織についてのGSTコンプルメントを得るために用いられ得、これは治療法の設計に有用であり得る。このような反応性プロフィールは、有効な基質である物質、有効なインヒビターである物質、およびGST活性の有効なインデューサーまたはアクチベーターである基質を考慮に入れる。一旦、GSTイソ酵素が溶出パターンまたは電気泳動ゲルにおける位置によって同定および定量されると、処置プロトコルを予想または設計するために、例えば、既知のそして予め単離されたイソ酵素の反応性プロフィールに対する参照が行われる。
【００７５】
この方法は、容易に理解できるが、コンプルメントに含まれる可能性のある候補であるGSTイソ酵素の数が多いため、そしてGSTイソ酵素のレパートリーがそれ自体変異しやすいため、実際的ではない。従って、入手可能なGSTイソ酵素の集団における多型性の結果、例えば溶出パターンにおける移動度は変わらないが、基質特異性または阻害パターンが変化したタンパク質（またはその逆）となりやすい。いずれの場合でも、溶出パターンにおける位置をリファレンス特性のセットとマッチングした結果は、間違いやすい結果を与える。
【００７６】
複数の分離技法を使用することによって、いくぶん改善された結果が得られ得る。複数の分離系において移動度が影響されないということは、単独の場合に比べて可能性が低いからである。このような系は単純な仮想系によって一般に説明される。この仮想系において、第１の吸着体であるP1は、その溶出パターンにおいて４本のイソ酵素ピークを生じ、そして第２の吸着体であるP2では５本のピークが得られる。もし、基質特異性パターン（例えば基質Ａ、Ｂ、およびＣについて）によって、P1からの所定のピーク（例えば、1.2で示される）が、吸着体P2上で分離される特定のピーク（ピーク2.4）と実質的に同じ基質プロフィールであることが示唆されるならば、吸着体P1において1.2にピークを与え、そして吸着体P2において2.4ピークを与える組織試料は、ピーク1.2およびピーク2.4を形成するイソ酵素と同じ反応性プロフィール（Ａ、Ｂ、およびＣに対する）を有する可能性が高い。
【００７７】
この仮想系によって説明される技法は、本発明の新規なグルタチオントリペプチドアナログまたはこのような新規なトリペプチドと別のアナログまたは多様な特性を有する類似のグルタチオンアナログのパネルとの組合せをアフィニティー吸着体として用いて、適用され得る。有効な特徴付けを行うためには、少なくとも２つ、好ましくは３つ、そしてより好ましくは５つのこのようなアナログを使用すべきであると考えられる。パネルのメンバーは、コンプルメント中の種々のGSTイソ酵素の中での識別を確実にするに充分な多様な特性を有しているべきである。
【００７８】
この分離技法が酵素活性を保持するならば、可能性のある薬剤に対する各酵素の反応性を直接的に測定し得る。しかし、当該分野における未変性分離は、分離能の欠如、または構造の変化に対する過敏性のいずれかの影響を被り、その結果、ピーク同定は、治療の有効なガイダンスとしては問題が多すぎるものとなる。例えば、イオン交換クロマトグラフィーは個々のGSTイソ酵素の精製のための工程して使用し得るが、分析ツールとしては分離能不充分または不適切である。IEFは当該分野で使用可能な別の技法であるが、インビボまたはインビトロでのタンパク質の翻訳後修飾に起因する多数の異物(extraneous)ピークを生じる傾向にあり、そしてこのような構造変化と機能的バリエーションとの間の必要なつながりが存在しない。
【００７９】
このように、従来技術の方法を用いて個々のイソ酵素を分離し、そしてこれらのそれぞれについてすべての可能性のある化学療法薬剤に対する活性プロフィールを測定することによる細胞または組織中のGSTコンプルメントの活性プロフィールの測定は、手間がかかるが、しかし本発明の新規なGSHアナログトリペプチドの有用性によって改善される。本発明の化合物は、GST酵素を変性することを必要としない分離を可能にする。
【００８０】
最も効率的なアプローチは、GSTイソ酵素コンプルメントのプロフィールの利点を利用し、これは特異的結合活性および反応性の特性を同時に測定する。これらのプロフィールは、調査特性プロフィール(surveyof characteristics profiles)、すなわち「SC」プロフィールを意味し、SCプロフィール（これは基質特異性における情報、特異的インデューサーに対する応答における誘導など、ならびにさらなる結合特性または電気泳動移動度の特性を包含する）のリファレンスセットの測定を可能にする。コンピューターを用いた方法をこれらのプロフィールの比較に適用することによって、治療的モジュレーターおよび付随するプロトコルの設計のために必要とされる情報、および提案されたプロトコルが成功するか失敗するかを予想するために必要とされる情報が、従来技術の方法よりも相当に多数の検体について得られ得る。このような多数の検体についての情報は、治療の適切なガイドを提供するために必要とされる。これらのパラメータの中でも、SCプロフィールを得るために使用され得るパラメータは、本発明のトリペプチドGSHアナログのパネルのメンバーに結合する能力、またはこのようなパネルメンバーが活性に及ぼす影響である。
【００８１】
細胞および組織の未知試料のGSTコンプルメントを測定するためのこのアプローチにおいて、パターン認識技法の利点が利用される。このアプローチに関連して、本明細書においてSCプロフィールと呼ばれるものが、種々のGSTイソ酵素と特異的かつ識別的に反応する試薬のパネルに関して一般に測定される。これは、交差反応イムノアッセイによって得られるプロフィールの測定と類似しており、そして候補であるGSTイソ酵素またはイソ酵素混合物の試薬パネルに対する反応性の任意のパターンを参照する。従って、SCプロフィールは、種々の基質についての代謝回転速度；種々のインヒビターについてのインヒビター濃度の有効レベル；特定の宿主細胞についてGSTイソ酵素のための遺伝子の発現を誘導するために必要とされるインデューサーのレベル；インヒビターまたは基質の存在下または非存在下における電気泳動での移動度；パラログまたは他のアフィニティーカラムからの溶出時間；または実際には、抗体パネルに対する古典的な結合パターンに関して測定され得る。個々のGSTイソ酵素またはイソ酵素混合物について種々の濃度レベルで得られるSCプロフィールは、本明細書で記載される種々の方法で操作され得、未知試料のSCプロフィールを比較し得るリファレンスセットを提供する。
【００８２】
一般に、SCプロフィールは、「情報チャンネル」の各パネルについての値を提供する。ここで各情報チャンネルは、GSTコンプルメントまたはGST標準の特性（例えば、抗体への結合アフィニティー、基質アフィニティー、溶出時間など）を記述する。この情報チャンネルの少なくともいくつかは、GSTの濃度と共に変化する値に関連すべきである。
【００８３】
細胞または組織についてのGSTコンプルメントの測定は、それ自体、診断および試料の特徴付けに有用である。さらに、所望されない組織を弱体化しまたは破壊するための戦略の実施態様の設計に使用するためには、正常組織と所望されない組織との間の活性の差異を測定し得るように、SCプロフィールはGST活性に関連する情報を提供しなければならない。従って、所望されない組織のSCプロフィールは、リファレンス標準と容易に比較可能でなければならない。このリファレンス標準は、治療的モジュレーターの設計および薬剤またはプロドラッグの選択の補助となる反応性パターンに、少なくともある程度基づいていなければならない。この用途のためには、リファレンスプロフィールの少なくとも一部は、基質代謝回転速度のデータ、阻害のデータ、またはイソ酵素産生レベルの誘導に関連するデータ、あるいはインサイチュでのGSTイソ酵素の操作を可能にする任意の他の反応性を基礎としていなければならない。本発明のパネルは活性におけるこのような効果を測定するために用いられ得る。本発明の新規化合物を使用したクロマトグラフィー分離（これは活性の保持を許容する）と、これらの標準についての反応性に影響する試薬に関するSCプロフィールの調製との組合せは、必要とされるデータを得るための１つのアプローチである。
【００８４】
リファレンス標準および未知試料のSCプロフィールは、「特異的に反応性の試薬」のパネルに関して測定され得る。これらの試薬は、パラログ、基質、インヒビター、インデューサー、抗体を包含する種々の物質、ならびにゲル電気泳動またはアフィニティークロマトグラフィー（ここで反応性の程度は電気泳動の移動度または溶出時間として測定される）のような実際は技法である「試薬(reagent)」を包含する。このように、「特異的に反応性の試薬」は化学反応をもたらす試薬に限定されず、この試薬に関して試料について得るべき特有のパラメータを与える任意の試薬または技法を包含する。
【００８５】
もちろん、本発明のアナログのパネルは、結合剤、クロマトグラフィー支持体として、または溶液中での酵素作用のインヒビターとしてのいずれかとしての「特異的に反応性の試薬」として、使用され得る。GSTによって触媒される酵素反応を阻害する、このパネルのメンバーとしてのこれらの化合物の比較能力は、（このトリペプチドアナログをアフィニティーリガンドとして含むカラムからの溶出パターンのように）特有のSCプロフィールとして使用され得る。
【００８６】
リファレンス SC プロフィールの測定
後述するように、ある種の目的のためのリファレンス標準は、特定の被験体の正常組織から直接的に調製され得る。特有の反応性パターンを有する既に単離された種々のGSTイソ酵素についてのSCプロフィールのデータバンクを提供することもまた有用である。これらの反応性パターンと所望されない組織のバイオプシー試料からの反応性パターンとをマッチングすることによって、治療的モジュレーターの適切な設計およびプロドラッグまたはトキシンの選択が成され得る。
【００８７】
米国特許第4,963,263号および同第5,133,866号（これらの開示は本明細書中に参考として援用される）は、密接に関連した物質のクロマトグラフィー分離に有用なパラログアフィニティー試薬のパネルを記載している。本発明のパネルは同様に多様である。本発明のGSHトリペプチドアナログを用いるパラログタイプのパネルは、種々のGSTイソ酵素を精製された形態で（ここで各場合において、天然のイソ酵素の活性を保持しながら）分離するための、アフィニティー支持体の調製に便利に用いられ得る。従来技術の逆相HPLC法またはウェスタンブロット法とは異なり、本発明の化合物に対する親和性に基づくクロマトグラフィーを用いて調製される分離されたイソ酵素は、天然に生じるイソ酵素と実質的に正確に類似の様子で挙動する。次いで、このような精製されたイソ酵素の各々について、基質または他の活性に影響する試薬（本発明の化合物によって代表されるような）の反応性に関するSCプロフィールを構築し得る。次に、これらの精製されたイソ酵素に特有の多数のSCプロフィールの有用なデータバンクを、所望されない組織から得られる試料と比較するために、数学的にまたはコンピューターでアクセス可能なフォームで保持および保存し得る。
【００８８】
トリペプチドグルタチオンアナログのパネル（そのメンバーのうち少なくとも１個は、式(1)の構造を含む）は、リファレンスセットのためのSCプロフィールを提供する情報チャンネルのコレクションのための基礎として使用され得る。既知のイソ酵素特異的基質のパネルのメンバーに対する複合体化(conjugation)またはパネルのメンバーの吸着体に対する直接的な複合体化は、結合特性の系統的な多様化をさらに増大させる。アフィニティーカラムのように適切な配置の本発明のパネルを用いて、標準のプロフィールおよび未知試料のプロフィールを得て、そして比較することができる。従って、特に有用なのは、式(1)を含む少なくとも１個のアナログを含む多様なトリペプチドアナログのパネルである。ここでＸはモノ置換またはジ置換あるいは非置換のヒドロカルビル（１〜20Ｃ）部分であり、このヒドロカルビル部分は任意に１個または２個の非隣接ヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、またはＮ）を含み、そしてここで上記の置換基はハロ、ＮＯ、ＮＯ_２、ＮＲ_２、ＯＲ、およびＳＲからなる群から選択され、ここでＲはＨまたは低級アルキル（１〜４Ｃ）であり、そして
AA_Cは式(1)の化合物の残りの部分にペプチド結合を通じてカップリングしたアミノ酸である。
【００８９】
GST コンプルメントの測定
一般に、細胞または組織の「未知」試料のGSTコンプルメントの測定のためには、２つの異なるアプローチが行われ得る。第１に、上記のように、当該分野で現在実施されている一般的な技法を用いて、試料中に含まれる個々のイソ酵素はアフィニティー支持体を用いて分離され得、そしてそれらの活性のパターンについて個別にテストされ得る。試料からの個々のイソ酵素を得ることができ、そして次に、個別に、その基質特異性、インヒビター特異性について評価され得、そしてそのイソ酵素の活性または産生を誘導する物質を同定するために評価され得る。
【００９０】
第２のもっと手間の少ないアプローチにおいては、パターン認識技法が使用され、個々の被験体について、所望されない組織および正常組織のいずれかまたは両方の試料に関して、これらのパターンを上記のようにして調製されたリファレンスセットに対してパターンマッチングすることによって、瞬時の読み出し(readout)が得られる。このアプローチにおいては、必要とされる試料の容量はより少なく、分離は必要ではない。この方法はまた、GST活性についての組織化学的染色を用いた組織切片に対して適用される場合にも有用である。
【００９１】
第１のアプローチに関して、Vos,R.M.E.ら、Biochem Pharmacol (1988) 37:1077-1082によって使用された分離方法の改変が使用され得る。この方法において、完全なラット肝臓に由来の細胞質ゾル画分を、１グループとしてのGSTについてのアフィニティー試薬として使用されるS-ヘキシルGSHセファロースのアフィニティーカラムに供した。溶出されたGST混合物を濃縮し、そしてmono-PHR5/20カラム(Pharmacia FPLC システム)上でクロマトフォーカシングによって分離した。個々のイソ酵素を別々の画分として採取し、そして分析した。溶出プロフィールにおける位置、サブユニット分子量、および1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼン（これは既知のGSTのほとんどに対する基質である）に対する比活性によって、画分を同定した。
【００９２】
本発明の化合物の中から選択されるパラログをアフィニティーリガンドとして使用することによって、より穏和な条件を使用することができ、そしてより活性な形態のGSTイソ酵素を回収することができる。次に、これらを基質特異性などについてテストする。
【００９３】
上記のように、種々のGSTイソ酵素に特有の溶出パターンを提供するVosの技法のような任意の分離技法を単に使用し、そして未知のGSTコンプルメントの細胞または組織についての溶出パターンを予め設定された(preset)溶出パターンとマッチングさせて、未知試料中のGSTコンプルメントの性質を測定することの可能性が、考慮される。しかし、このアプローチの１つの問題点は、GSTの遺伝的変異可能性（geneticmutability)にある。そのため、推論される特性を維持し、その結果、同様の反応性パターンを有することが保証される、信頼性のあるマッチングを行うことは困難である。イソ酵素の遺伝的変異可能性、ならびに翻訳後修飾に対するその感受性は、どの特定の場合でも、基質特異性、阻害パターンなど、ならびに結合、および物理特性(例えば、pI)に深い影響を与える可能性が高い。反応性の変化と物理特性または結合の変化との間に相関が存在するという保証はない。実際、このような効果は相関していない蓋然性がある。上記のように、この問題は、複数のアフィニティー試薬（これもまた本発明の化合物によって提供される）の使用によって軽減され得る。
【００９４】
パターンマッチングアプローチにおいて、もっと信頼性のあるアッセイは、未知試料の反応性のプロフィールをリファレンスのSCプロフィールと比較することによって行われる。このアプローチを分析物の組成の決定に適用することは、一般的に、1991年4月2日に出願された係属中の出願番号07/678,049号に記載されており、この開示は、本明細書中に参考として援用される。この出願に記載されている技法によれば、既知の分析物の組成の試料から得られるプロフィールの所定のプロットを、テストすべき試料のSCプロフィールを比較し得るリファレンスとして使用する。一般に、２〜10、好ましくは４〜６の異なる特異的に反応性の試薬のパネルを最初に用いて、既知組成の試料のプロフィールを提供する。この参考の適用においては、特別な結合アッセイが使用された。ここで、結合剤のパネルと交差する候補の分析物による交差反応性が存在し、そして既知の結合パートナーの種々の分析物による結合についての阻害値の測定によってプロフィールが得られた。次に、このプロフィールのコレクションを、未知試料の対応するSCプロフィールとの読み取り可能な比較を与える多くの技法のうちの任意の技法によって数学的に処理する。
【００９５】
本発明の治療方法を実施するために必要とされるGSTコンプルメントの測定に使用するために、単離されたGSTイソ酵素または既知の組成のその混合物のいずれか、または両方を用いて、類似のSCプロフィールを測定し得る。特異的に反応性の試薬は、パネルとして、少なくとも１つの、好ましくは３つの、そしてより好ましくは５つの、式(1)のGSHアナログを含まなければならず、所望であれば別の試薬も含む。このような別の試薬は、代謝回転速度が測定される一連の既知の基質を含み得る。適切な基質の候補としては、例えば、エタクリン酸、ブロモスルホフタレイン、クメンヒドロペルオキシド、BCNU、クロラムブシル、トランス-スチルベンオキシドなどが挙げられる。
【００９６】
種々のレベルでGSTイソ酵素と相互作用するインヒビターもまた、SCプロフィールを提供するパネルのメンバーである特異的に反応性の試薬としての使用のために利用可能である。これらのインヒビターとしては、例えば、ピリプロスト(piriprost)、チバクロンブルー、およびヘマチンが挙げられる。種々のイソ酵素と特異的に免疫反応性である抗体、ならびにパラログタイプのアフィニティー試薬が用いられる。このプロフィールが治療方針の設計の基礎を提供するためのものである場合、パネルのメンバーのうちの少なくともいくつかは、GSTの酵素活性を説明するものでなければならない。
【００９７】
SCプロフィールを得るための別の技法は、Takeo,K.ら、JImmunol (1978) 121:2305-2310によって記載された方法と類似している。このアプローチにおいて、個々のタンパク質についての種々の結合剤の存在下における識別的な(differential)電気泳動によって、移動度の値の測定が可能となる。Takeoによって記載された特定の適用において、ポリアクリルアミドゲル電気泳動でデキストラン特異的骨髄腫タンパク質の測定が行われ、これはデキストランを分離ゲルに添加した場合に遅延を示し、この遅延はハプテンであるイソマルトースオリゴ糖の添加によって逆転され得た。このアプローチの使用において、例えば遅延剤(retardingagent)選択に依存する一連の移動度が既知の組成について得られ得る。本発明の新規化合物またはパネルを遅延剤または移動剤(mobilizing agent)として使用して、この技法を適用し得る。
【００９８】
バイオプシーのGSTコンプルメントを測定するための１つの好ましい方法において、Mannervik,B.ら、ProcNatl Acad Sci (1985) 82:7202-7206によって研究された既知のGST基質を用いてHPLCカラムのシリーズが構築される。これらの基質はカラムの支持体に直接結合され、あるいはAdang,A.E.Pら、Biochem J (1990) 269:47-54に記載されたGSHアナログの変種(variant)に付加される。基質と式(1)のGSHアナログとの可能な種々の組合せの結果得られる50〜100種の異なるカラムのシリーズが、吸着体の候補のシリーズを表す。これらの吸着体を、既知のGSTイソ酵素の混合物の分離に各々使用することによってテストして、特性の多様性が最大である吸着体を選択する。次いて、識別能力が最も高い４つまたは５つのカラムを、未知試料および標準におけるSCプロフィールを測定するためのパネルのメンバーとして選択する。
【００９９】
従って、個別の各吸着体における溶出パターンとして分離を表示するよりむしろ、各吸着体に対する吸着能力がイソ酵素のSCプロフィールにおける情報チャンネルを表すようにデータを再配列する。インデューサー、アクチベーター、基質、およびインヒビターに関する反応性パターンもまた、各イソ酵素について測定され、そして情報チャンネルとして使用される。既知の各イソ酵素についての完全なプロフィールを、次に、リファレンスセットのメンバーとして使用する。リファレンスセットのさらなるメンバーを、正常組織由来の試料を使用し、そして情報チャンネルの同じセットに割り当てられた値を評価することによって決定する。次いで、未知の所望されない組織由来のバイオプシー試料の対応するプロフィールを、このリファレンスセットに対して比較する。
【０１００】
既知の組成についてのプロフィールを、同様にして測定される未知試料のプロフィールとの比較のために、コンピューターでアクセス可能なフォームに保存する。従って、未知試料のGSTコンプルメントを測定するためのキットが提供され得る。このキットは、リファレンスプロフィールを測定するために使用されるテストパネルメンバーと共に、未知試料のSCプロフィールの測定のための指示を含む。リファレンスプロフィールにアクセスするための適切なソフトウェアもまた含まれ得る。GSTコンプルメントは、テストされる試料の特徴付けのために使用され得、そして適切な場合には、治療法の設計のために使用され得る。
【０１０１】
疾患組織について、治療のために適切な方針が選択され得る。このコンプルメントを評価して、標準的な治療プロトコルを所望されない細胞または組織に適用した場合、その治療プロトコルは成功するかどうかを決定し得、あるいはこのコンプルメントは、別のプロトコルの設計（トキシンまたはプロドラッグの選択、および治療的モジュレーターを使用するか否かを包含する）のために使用し得る。
【０１０２】
トリペプチドアナログの合成
本発明のトリペプチドアナログまたは別のパネルの追加のトリペプチドアナログメンバーは、当該分野で一般に公知の手段を用いて合成され得るが、これら一般的な方法を所望のトリペプチドに適用可能にする改変を用いて合成され得る。固相合成手法が用いられ得るが、液相ペプチド合成の方が、これらの短鎖ペプチドには優れているようである。固相合成に対して独自に開発されたFmoc試薬は、溶液相法に適用されて、100mg量のトリペプチドアナログを生成し得る。
【０１０３】
溶液相Fmoc化学法を用いて合成された中間生成物の保護ジペプチドおよびトリペプチドは、シリカゲルのクロマトグラフィーによって単離され、そして弱塩基により脱保護され、これにより酸に不安定なチオ複合体(thioconjugate)の合成を可能にする(Iselin,B.ら、Helv Chem Acta (1955) 38：1508〜1516)。アナログが精製および回収され得るか、あるいは粗生成物の混合物が直接に固体支持体にカップリングされ、アフィニティ誘導体化(affinity-derivatizedsupport)を提供し得る(Sundburg, L.ら, J Chromatog (1974) 90：87〜98)。
【０１０４】
C末端アミノ酸AA_ｃのエステルが入手不可能であるそれらの状況下では、このエステルは、N-Fmoc保護アミノ酸を合成することにより生成され(Atherton,E.ら,「固相ペプチド合成」 IRL Press, Oxford, England (1989), 47〜61頁)、次いで濃硫酸の存在下で所望のアルコールで処理することによってエステル化される(Benoiton,L. Can J Chem (1962) 40：570〜572)。エステル化されていない物質は、弱塩基で抽出することにより除去され、そして所望のN-Fmocアミノ酸エステルは、エバポレーションによって単離される。
【０１０５】
硫黄の官能性を付与されたFmocシステイン誘導体は、pH 9でFmoc-OSuでシステインを処理、次いで混合物を適切なアルキル化剤で処理することによりワンポット法で生成される。
【０１０６】
合成は、以下の反応スキーム１に示すように行われる。
【０１０７】
【化４】

【０１０８】
【化５】

システイン誘導体とC末端アミノ酸とのカップリングは、水溶性カルボジイミドEDC(Sheehan, J.ら, J Org Chem(1961) 26：2525〜2528)およびHOBT(Konig, W.ら, Chem Ber (1970) 103：788〜798)(所望しないラセミ化を妨げ、反応速度を上げるために添加される)を含むDMF液を用いて行われる。カップリング終了(通常、室温で約１時間)後、混合物は真空に減圧され、そしてKHCO_３溶液中に注がれる(JohnHughes, 私信(private communication))。この工程では、DMFおよびEDCおよびEDC尿素の大部分ならびにカップリングしなかったFmoc-システイン誘導体が抽出される。その結果、液体をデカントすることによりゴム状残渣が得られる。この粗生成物のジペプチドは、EtOAcに溶解され、そして１N塩酸および水で洗浄して、残りのカップリングしていないC-末端アミノ酸エステルならびに、残留EDCおよびEDC尿素を除去する。溶液が濃縮され、そしてジペプチドがクロマトグラフィーによって精製される。
【０１０９】
次に、回収されたジペプチドは、25%ピペリジンを含むDMF液で30分間処理されて、Fmoc基を除去する。 Fmocの除去により得られたジベンゾフルベンまたはそのピペリジン付加物は、次のカップリングの結果に影響を及ぼさないはずである(Atherton,E.ら, J Chem Soc Perkin Trans (1981) 1：538〜546)。しかし、過剰のピペリジンは除去する必要があり、それは、脱ブロックされた物質において、もはやピペリジンの臭気が検出されなくなるまでDMFとの共エバポレーション(co-evaporation)を繰り返すことにより行われる。次に、第二のカップリングは、グルタミン酸誘導体を用いて行い、続いてジペプチドの合成と同様の操作を行う。
【０１１０】
Fmocグルタミン酸α-ベンジルエステルは、市販のグルタミン酸α-ベンジルエステルから好収率および好純度で作られる。Fmocグルタミン酸α-tertブチルエステル(これも市販されている)もまた用いられ得るが、この場合は、操作において別の酸処理工程を必要とする。この工程では、保護されたトリペプチドのいくつかに溶解性の問題があり、そして純度の落ちる部分的に脱保護された生成物がしばしば得られる。
【０１１１】
グルタミン酸誘導体とジペプチドとのカップリングおよび操作によって生成された物質は、数種のクロマトグラフ的に可動な成分を含有する。最終カラムから最初に溶出する物質が蛍光性であれば、その物質がジベンゾフルベンであることが示唆される。推定の所望生成物が、次に別のUV-吸収物質と共に溶出するが、この物質は、おそらくジベンゾフルベンのピペリジン付加物である。同様の生成物が、最終操作の間、脱ブロックされたトリペプチドから生成および分離されるので、これらの不純物はこの段階では除去されない。
【０１１２】
保護されたトリペプチド(および不純物)は、一旦単離されると、真空下で乾燥され、そして0.25N NaOHを含む3：1のエタノール：水で18時間処理される。これにより、Fmocおよびエステルの保護基が除去される。t-ブチル基で保護されたグルタミン酸が用いられる場合、この塩基処理の前に3NHClを含むエタノール／水(3/1, v/v)を用いて３時間処理してt-ブチル基を除去する。酸は、ロータリーエバポレーションならびにエタノールおよび水を用いた共エバポレーションによって除去され、そして上記と同様の塩基処理を行って、残りの保護基を除去する。一晩、塩基処理した後、水を添加し、そしてヘキサンで抽出して、脱保護に伴う有機副生成物を除去する。ペプチドの水溶液は、酸性にされ、固体にした。ペプチドをエタノールに溶解し、そしてろ過することにより、その塩を除去する。これを泡状になるまでエバポレートし、そして一晩高真空下に置く。
【０１１３】
この化合物は、HPLC、TLCおよびFAB質量分析装置によって分析される。大抵の場合、TLC分析は、良好な結果を示すが、HPLCの結果は、部分的に、用いた分析条件がより疎水的(S-アルキル、C-末端バリン、β-アラニンおよび4ABu)なペプチドのいくつかに対して最適化されていないので、入り混じっている。
【０１１４】
塩基を用いた最終の脱保護の間に、少量であるがラセミ化が起こり得る(特に、フェニルグリシンアナログの場合に)(Bodansky, M.ら,「ペプチド合成の実用的方法」Springer Verlag,Berlin (1984)。このラセミ化の程度は、Adang, A.らによって以前に用いられたナトリウム-アンモニア条件で起こる場合よりは、低いものである(BiochemJ (1989) 264：721〜724)。
【０１１５】
上述の技術を用いて、表１のアナログを調製した。
【０１１６】
【表１】

^ａ標準的な一文字AA略記で表し、ここで、Me＝メチル、Pr＝n-プロピル、Hx＝n-ヘキシル、Bz＝ベンジル、Trt＝トリチル(トリフェニルメチル)である。
^ｂ脱保護された生成物のモル数を、用いたFmoc-システイン誘導体のモル数で割る。
^ｃ EtOAc/ピリジン/HOAc/水(5/5/3/1)で溶出させ、ニンヒドリンでスプレーして肉眼で見えるようにしたシリカプレート上のTLCR_ｆ値。
^ｄ観察された分子質量(AMU)。通常は、分子重量＋１である。チオグリセロールまたはニトロベンジルアルコールマトリックス。
^ｅ膨潤した樹脂容量(水)１mL当たりのペプチドのマイクロモル数。
^ｆナトリウム付加物、M＋22。
^ｇ分子イオンおよびナトリウム付加物から水を差し引いた値；MH^＋−18。
【０１１７】
さらに、これらの化合物のシクロアミド形およびそれらのエチルエステルおよびベンジルエステルを含む式(1)の他の化合物が調製される。
【０１１８】
【実施例】
以下の実施例は、本発明を実証するものであり、本発明を限定するものではない。
【０１１９】
（実施例１：9-フルオレニルメトキシカルボニル-4-アミノ酪酸エチルエステルの合成）
45g(0.1339M、0.94当量)のFmoc-Osuを、14.75g(0.143M、1当量)の4-アミノ酪酸(4-ABu)および20gのNa_２CO_３を含む300mlの脱イオン化水および200mLのテトラヒドロフラン(THF)の溶液にゆっくりと加えた。pHをモニターし、そしてさらにNa_２CO_３を加えてpHを８より上に維持した。反応液を２時間撹拌し、次いで濃塩酸で酸性にした。得られた混濁懸濁液を600mLの酢酸エチル(EtOAc)で抽出し、その後得られた有機層を300mLの0.5NNaOHでさらに抽出した。水層を、20mLの濃塩酸を含む500mlの氷水に速やかに注いだ。得られた白色懸濁液を、300mLのEtOAcで抽出し、50gのNa₂SO₄で乾燥させ、そしてエバポレートして、35g(収率76%)のFmoc-4-ABu(白色粉末)を得た。これを500mLの無水エタノールに溶解し、そして40mLの濃H_２SO_４を加えた。４時間後、溶液は、半固体状の白色塊となった。これを2Lの水に注ぎ、そしてろ過した。この白色物質を500mLのEtOAcに溶解し、そして200mLの0.5NNaOHで一回抽出し、乾燥させ、そしてエバポレートして、30g(収率79%)の全量化合物を得た。R_ｆ 0.71(20% MeOHを含むCH_２Cl_２)、mp83〜86°。元素分析C_２１H_２３NO_４についての計算値：C,71.37；H, 6.56；N, 3.96、
測定値: C,71.42；H, 6.67；N, 3.72。
【０１２０】
（実施例２：9-フルオレニルメトキシカルボニルフェニルグリシンエチルエステルの合成）
同様の合成手順に従って、20gのフェニルグリシンから33.7g(収率68%)のFmoc-フェニルグリシンを得た。19gのこの生成物を10g(収率57%)の目的生成物に変換した。R_ｆ0.95(同様のTLC系)。mp 130〜133°。
元素分析 C_２５H_２３NO_４についての計算値：C,74.80；H, 5.77；N, 3.49、
測定値: C,74.72；H, 5.91；N, 3.20。
【０１２１】
（実施例３：9-フルオレニルメトキシカルボニルアスパラギン酸ジメチルエステルの合成）
45g(0.134M、0.96当量)のFmoc-Osuを、20g(0.15M、1当量)のアスパラギン酸および20gのNa_２CO_３を溶解した400mLの水および200mLのジオキサンの溶液に加えた。この混合物を、少量のNa_２CO_３を加えることによりpHを約９に維持しながら、２時間撹拌した。次いで、白濁した混合物を、40mLの濃塩酸を含む500mLの氷水に注いだ。白色固体を500mLのEtOAcで抽出し、そしてこれを500mLのヘキサンと混合させた。混合物を一晩冷却し、そして翌日まで撹拌して、ろ過および空気乾燥により38g(収率71%)のFmoc-アスパラギン酸(結晶)を得た。10g(0.28M)のこの生成物を200mLのメタノールに溶解し、そして20mLの濃H_２SO_４を加えた。この溶液を一晩放置した。この混合物を１Lの水中に注ぎ、そしてろ過した。得られた白色固体を乾燥させ、そしてEtOAcに再溶解させた。ヘキサンをゆっくりと加え、そして冷却して、9g(収率83%)の目的生成物(白色針状結晶)を得た。mp78〜80°、[a]_ｄ＝−13.9°。
元素分析 C_２１H_２１NO_４についての計算値：C,65.78, H, 5.52, N, 3.65、
測定値：C,66.18, H, 5.68, N, 3.69。
【０１２２】
（実施例４：9-フルオレニルメトキシカルボニル-S-ヘキシルシステインの合成）
Ａ. 20g(0.127M、1当量)のシステインハイドロクロライドおよび20gのNa_２CO_３を、アルゴンガス気流下で800mlの水に溶解した。200mLのCH_３CNを加え、次いで42g(0.122M、0.96当量)のFmoc-Osuを、5g分のNa_２CO_３を加えることによりpHを約９に維持しながら、少量ずつ加えた。反応液をさらに２時間撹拌し、そして18.6mL(26.8ｇ、0.126M、0.99当量)の1-ヨードヘキサンを200mLのCH_３CN溶液として加えた。その反応液をさらに２時間撹拌し、そして１Lの氷水および50mLの濃塩酸に注いだ。白色の混合物を600mLのEtOAcで抽出し、そして得られた有機層を、2500mL分の1NKOHで何回かに分けて抽出した。これらの各々を、500mLの水および30mLの濃塩酸の溶液のいくつかに分けたものに直ちに滴下し、次いで得られた混濁混合物を500mlのEtOAcでそれぞれ抽出した。これらをそれぞれNa₂SO₄で乾燥し、そしてエバポレートした。総収量は24.6g(45%)であった。二番目の画分(3.5g)を放置して結晶を得た。mp101〜103°、R_ｆ=0.57、[a]_ｄ＝−14.3°。
元素分析 C_２１H_２３NO_４Sについての計算値：C,65.42, H, 6.01, N, 3.63、
測定値：C, 65.53, H, 5.74, N, 2.91。
【０１２３】
Ｂ. さらに、S-官能性Fmocシステイン誘導体を項目Ａに記載のように調製した。
【０１２４】
（実施例５：Fmoc-グルタミン酸α-ベンジルエステルの合成）
25g(0.105M)のグルタミン酸α-ベンジルエステルおよび25gのNa_２CO_３を400mLの水に溶かし、そして200mLのTHFを加えた。34g(0.101M、0.96当量)Fmoc-OSuを撹拌しながら少量ずつ加え、そして必要なだけNa_２CO_３をさらに加えることによりpHを約９に維持した。１時間後、反応液を500mLの水中に注ぎ、そして濃塩酸で酸性にした。白色懸濁液をEtOAcで抽出し、Na_２SO_４で乾燥し、そしてエバポレートして固形物を得た。これを500mLの温EtOAcに溶解し、そして300mLのヘキサンを加えた。一晩冷却し、回収し、そして空気乾燥して、38.7g(収率83%)の白色結晶を得た。mp110〜112°、[a]_ｄ＝−13.8°、M/e(分解強度)：
【０１２５】
【化６】

元素分析 C_２７H_２５NO_６：C,70.57, H, 5.48, N, 3.05、
測定値：C,69.71, H, 5.58, N, 2.88。
【０１２６】
（実施例６：γ-グルタミルS-ベンジルシステイニル β-アラニンの合成）
1.5g(9.76mmol、1当量)のβ-アラニンエチルエステルハイドロクロライドを50mLのDMFに加え、そして1.8mLのDIPEAを加えた。3.5g(8.1mM、0.83当量)のFmoc-S-ベンジルシステインを加え、そして溶液をかき混ぜながら溶解させた。次に、2gのEDACおよび250mgのHOBTを加え、そしてかき混ぜながら固体を溶解させた。混合物を１時間放置し、次いで真空下で約5mL容量のモービル油になるまで濃縮した。これに、100mLの10%w/v KHCO_３水溶液を加え、そして混合物を振り混ぜ、そしてろ過により液体を除去した。残渣を100mLのEtOAcに溶解し、50mLの1NHCl、50mLの水で順次洗浄し、そしてNa_２SO_４で乾燥した。溶液をろ過し、そして真空下で濃縮して泡状物を得た、これをCH_２Cl_２中で充填されたシリカゲルの2×6cm吸着床を用いてクロマトグラフ分離した。最初のUV吸収物質が現れるまでカラムを溶出させ、次いで100mL容量に対して1%メタノール刻みで3%メタノールまで勾配をかけた。強いUV吸収バンドが、3%メタノールを２回分流した後に溶出した；TLCによりこれらの純度をチェックし、そしてプールし、そして真空下でエバポレートして、4.6ｇ(収率83%)のFmoc-Cys(S-ベンジル)-β-アラニンエチルエステルを得た。このうち半分(4mmol)を30mLのDMFおよび10mLのピペリジンの混合液に溶解し、そして30分間放置した。溶液を真空下で固体にし、そしてそのプロセスを50mLのDMFで２度繰り返し行った。得られた白色固体を、高真空下に１時間置いた後、50mLのDMFに溶解させた。２番目のカップリング工程では、1.6g(3.5mmol、0.9当量)のFmoc-グルタミン酸(α)ベンジルエステル(v)を加え、続いて0.8g(4.2mmol、1.05当量)のEDACおよび200mg(1.4mmol)のHOBTを加えた。混合物を１時間放置し、そして真空下で約5mL容量まで濃縮した。これを100mLの10%KHCO_３水溶液に注ぎ、そして振り混ぜた。液体を除去し、そして残渣を100mLの酢酸エチルに溶解させた。有機層を50mLの1NHCl、50mLの水で順次洗浄し、そしてNa₂SO₄で乾燥させた。これをタール状にし、そして保護されたジペプチドと同様の方法でクロマトグラフ分離した。1.2g(収率42%)の保護されたトリペプチドが得られた。この物質を30mLの無水エタノールに溶解し、そして10mLの1NNaOH水溶液を加えた。混合物を18時間放置し、そして40mLの水および40mLのヘキサンの入った分液ロートに注いだ。層を振り混ぜ、分離させ、そしてさらに40mLのヘキサンで水相を洗浄した。水層のpHを、濃塩酸を数滴加えることにより約３に調整し、そして混濁溶液を真空下で固体にし、そして高真空下に数時間置いた。残渣を無水エタノールで20mLずつ２回に分けて洗浄した。エタノール-NaClスラリーをろ過し、そして透明となった溶液をタール状になるまでエバポレートした。得られた物質の重量は、620mg(保護されたトリペプチドからの収率89%、Fmoc-Cys(ベンジル)-OHからの収率19%)であった。TLCプレートを酢酸エチル/ピリジン/水/酢酸(5/5/3/1、v/v)溶液で展開させ、そしてニンヒドリンスプレーおよび加熱により視覚化させた(Stewart,J.ら、「固相ペプチド合成」(1984) pp.53〜124、Pierce Chemical Co.,Rockford、IL)、R_ｆ 0.66。HPLC分析により、UV吸収物質の面積積分により74%の純度を示した(図１)。高速原子衝撃質量分析法(FABMS)により、434.2M/eにイオンピークを示した。これは、トリペプチド一ナトリウム塩と一致した。他のより高い質量ピークも存在したが、これは、不完全に被保護されたペプチドに一部由来するものであった。
【０１２７】
市販の遊離のアミノC-末端アミノ酸エステルの代わりに、Fmocの保護されたC-末端アミノ酸エステルを用いた場合では、この物質を、上記の保護されたジペプチドを脱ブロックするのに用いた方法と同様の方法を用いて脱ブロックし、次いで上記のようなカップリング反応を用いてカップリングを進行させた。
【０１２８】
（実施例７：セファロース樹脂への誘導体化）
0.66gのエポキシセファロース(Sepharose)^ＴＭ6B(Pharmacia)を10mLの水で15分間膨潤させ、次いで15mL用ガラスロート内で10mLの水で２回すすいだ。100〜500mgの粗トリペプチドを含む5mLエタノールおよび10mL水の溶液を、多円錐キャップ付きの20mL用シンチレーションバイアルに入れて、6NNaOHでpH11〜12に調整した。すすいだ樹脂を加え、そして37°の水浴中で一晩緩やかにかき回した。翌日、pHをチェックし、そして必要に応じて6N NaOHを加えてpH11〜12まで戻した。かき混ぜた翌日、樹脂をろ過し(ペプチド含有液体を濃塩酸で酸性にし、エバポレートし、そして蓄えておいた)、そして10mLの水で３回すすいだ。官能性を付与していないエポキシ基を、約0.1mLのエタノールアミンを含む10mLの水に樹脂を１時間浸すことによりキャップ(cap)化した。次いで、樹脂を10mLの水で３回すすぎ、そして試料を分析用に取り出した。残留物を、10mLの0.1MNaOAc、0.5M NaCl緩衝溶液(pH4.0)、続いて10mLの0.1M トリス(tris)クロライド、0.5M NaCl緩衝溶液(pH8.0)ですすいだ。樹脂をこのpH8の緩衝液中に４℃で保存した。
【０１２９】
（実施例８：アフィニティ吸着体としての本発明化合物の使用）
式(１)の一連の化合物を構築した(ここで、YCOはγ-Glu、AA_ｃはGly、およびXはパラ位にニトロ、クロロ、メトキシおよびメチルの置換基を有するベンジルである)。関連するアナログを、上記のようにセファロース樹脂に誘導体化し、そして３つの組換えヒトGST酵素の分離にアフィニティ吸着体として使用した。HPLCを用いて、支持体(support)に結合した酵素の相対量を測定した。
【０１３０】
その結果を表２に示す。
【０１３１】
【表２】

πおよびμイソ酵素のパーセンテージをそのσ(メタ)値に対してプロットした場合、良好な線形相関が得られた。しかし、σ(パラ)値を用いた場合では、良い結果は得られなかった。σ(メタ)値は、純粋な誘起効果の尺度である；しかし、σ(パラ)値は、置換基が、結合箇所の隣の環内原子に部分電荷を配置し得る共鳴効果に依存する。
【０１３２】
様々な本発明化合物上でラット肝臓細胞質ゾルのGSTイソ酵素をアフィニティ精製した後の、溶出画分に含まれるタンパク質およびGST(CDNB-複合体化)活性の回収率を表３に示す。
【０１３３】
【表３】

従来のS-L-GSHおよびHxGSH吸着体は、高い結合性および広いイソ酵素認識性を示した。新規な吸着体は、より少ない量のGSTイソ酵素を保持したが、新規な吸着体のうち３つのタンパク質回収率は、従来の吸着体のタンパク質回収率の半分より少ないものであった。
【０１３４】
HxGSHと比較して、新規吸着体は、CDNB複合体化活性とタンパク質回収率との直接の対応関係を示さなかった。例えば、γE-C(Bz)-βA吸着体およびγE-C(Bz)-A吸着体は、HxGSHの場合には33%および16%のタンパク質回収率を与えたが、CDNB複合体化活性は、溶出リガンドの阻害性に対する補正後、はるかに高かった(それぞれ、52%および33%)。それに対して、γE-C(Cu)-G吸着体によるタンパク質回収率は、ほんのわずかしか減少せず、一方、活性は50%減少した。異なるGSTイソ酵素が、CDNBに対して固有の特異的な活性を示すことは周知である。タンパク質回収率と活性回収率との間の不一致は、各々の吸着体の溶出画分中のイソ酵素組成の差異に起因していた。この仮説は、その溶出物画分のSDS/PAGEおよび逆相HPLC分析によって支持された。
【０１３５】
表３に載せた吸着体から溶出した画分を、SDS/PAGE、続いて銀染色法によって分析した。S-L-GSH吸着体およびHxGSH吸着体は、以前観察されたラットの肝臓GSTサブユニットの電気泳動バンドのパターンに対応するタンパク質と結合した。新規吸着体は、異なるバンドパターンを示した。例えば、上記のγE-C(Bz)-βA溶出物は、推定μ-クラスイソ酵素を非常に豊富に含むバンドを示した。π-クラスGST7-7は、ラット肝臓細胞質ゾルにおいて低レベルで見出されるので、より高レベルのイソ酵素を発現することが知られている他のラット組織もまた、試験した。γE-C(Hx)-φG吸着体から溶出したラット腎細胞質ゾルのタンパク質由来のGSTゲルパターンは、ラットGSTサブユニット７と同じ分子移動度を有するタンパク質がこの溶出物特有の成分であることを示し、そしてこのことは、この吸着体がπ-選択的試薬であることを示した。
【０１３６】
別のGSH依存性酵素であるグリオキサラーゼＩの分子移動度と類似の分子移動度を有するタンパク質もまた、γE-C(Bz)-AおよびγE-C(Bz)-βAからの溶出物に存在したが、他の吸着体からの溶出物では、検出されなかった。これらの実験では、HxGSHは、以前にグリオキサラーゼＩと結合することを示したが、検出可能なレベルのGSH依存性酵素を示さなかった。グリオキサラーゼＩは、金属依存性酵素であることが知られており、そして緩衝液中にEDTAが存在すると、結合活性が妨げられ得る。
【０１３７】
アフィニティ溶出したタンパク質のSDS/PAGEにより見られた高純度で適切な大きさのタンパク質は、観察されたバンドが確かにGSTであることを示唆した。高分解能条件に置いて、異なる吸着体からの溶出物中のGSTイソ酵素の逆相HPLC分析により、この結論の独自の確証が得られた。精製されたGST標準品と比較すると、新規の吸着体から溶出したイソ酵素は公知のGSTイソ酵素に対応することが示された。これらの手順は、次のことを示した：GSTのサブユニット３は14分で、サブユニット４は17分で、サブユニット７は18分で、サブユニット２は23分で、サブユニット６は25分で、サブユニット1aおよび1bは37分および40分で、およびサブユニット８は42分で各々溶出した。サブユニット３、４および６は、μ-クラスイソ酵素であり、サブユニット1a、1b、２および８は、α-クラスイソ酵素であり、そしてサブユニット７は、π-クラスイソ酵素である。予想されるように、S-L-GSHおよびHxGSH吸着体は、5-5を除いて全てのθ(theta)-クラスのイソ酵素と結合した。
【０１３８】
イソ酵素２の割合を増加させたγE-C(Cu)-Gは、ある程度まで、全てのイソ酵素となおも結合した。これに対して、他の吸着体は、イソ酵素との結合においては非常に選択的であった。例えば、γE-C(Bz)-βAは、μ-クラスのイソ酵素３および４と選択的に結合したが、これは、SDS/PAGEの結果を確認するものである。
【０１３９】
ラット細胞質ゾルのGSTイソ酵素に対する様々な新規吸着体の特異性を表４に要約する。リガンドのいくらかの構造的な改変は、いかなるイソ酵素とも効果的には結合しない吸着体を生成した；これらのうちいくつかを十分に記載する。
【０１４０】
【表４】

^＊略号は、以下を除いて,上記の表１および本文中と同様である。Cu=クミル(α,α-ジメチルベンジル)およびφG=フェニルグリシン。
【０１４１】
前記のH-部位(疎水性ポケット)をプローブするために、Cys残基を系統的に改変すると、イソ酵素に対して結合し得るリガンドが得られた。Adangら(1990)は、Cys部分に結合する基の系統的改変を施したアナログについては調べなかった。この基の改変は、いくつかの場合には、タンパク質回収率のレベルおよびイソ酵素結合の特異性に効果がある。例えば、α-クラス基質であるクメンヒドロペルオキシドの構造と類似した構造にグルタチオンのS-結合部分を改変すると、α-クラスのイソ酵素2-2に対して特異的な吸着体が得られた。Alaが末端アミノ酸として用いられた場合、Cys上のプロピルおよびベンジル部分は共に、μ-クラスイソ酵素に対して特異的な吸着体を生じた(表４)。プロピル吸着体は、ベンジル吸着体と比較して、より多くのGSTタンパク質を保持したが、一部には、これはプロピル吸着体が、イソ酵素３および４の両方を捕らえたためである。このプロピル吸着体は、イソ酵素４に対して高い特異性を有する。末端アミノ酸としてHisを用いた場合、プロピル部分はμ-クラスに対して高い選択性を得たが、一方、ベンジル部分は全てに対して結合能を示さなくなった。これらの吸着体とは対照的に、Val置換吸着体およびAsp置換吸着体のCys部分の改変は、低結合性に対して何の効果もなかった。従って、Cys置換基は、末端アミノ酸によって決定されるような吸着体の全体的な特異性を改変する場合に重要であり得る。
【０１４２】
（実施例９：溶液相インヒビターとしての本発明化合物の使用）
スクリーニングのストラテジー
系統的に多様化した一連の本発明のペプチドアナログを、ヒトグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)のイソ酵素特異的インヒビターとして試験した。最良のインヒビターの効力は、活性部位にてグルタチオンとの競合阻害を示すカイネティクスを有する0.5〜20マイクロモルの範囲にある。低効力および高効力の両方での３つの組換え体GST由来のイソ酵素の間で観察された特異性は、無視できるものから高いものまでわたった(次に最も高感度なイソ酵素より少なくとも20倍)。
【０１４３】
これらの化合物を、最初に、これらの化合物が酵素活性を阻害するかどうか検証するために、分光光度的に検証可能な基質としてCDNBを用いて、３つの組換えヒトGST(各主要なイソ酵素クラス由来の１つ)に対して1-mMの濃度でスクリーニングした。化合物の広範囲なスペクトルの迅速な試験を可能にするために、この段階で用いたパラログ(paralog)は、粗合成試料であり、そして試験前に純度の決定をしなかったが、大抵の場合、目的の合成化合物は有力種であり、全量の約50%を示す。ごくわずかな1-mM濃度は、純度100%という仮定に基づいていた。表５は、一連の51個のGSHパラログアナログについてのこれらの阻害試験の結果を示す。
【０１４４】
【表５】

略語は、以下を除いて、上記の表１および本文中の記号と同様である：Conc. ＝濃度；ND＝検出されず；IC_５０＝活性の50%減を引き起こすインヒビター濃度；Bu＝ブチル；t-Bu＝tert-ブチル；Cu＝クミル(α,α-ジメチルベンジル)；IMe＝ヨードメチル；γE-α-アミノオクタノイック-G(化合物8)＝硫黄を有さないアナログにより置換されたC(Hx)を有するγE-C(Hx)-G；G-γE-C(オクチル)-G(化合物14)＝γE-C(オクチル)-GのN-末端の追加のG；環状(cyclic)＝トリペプチドが共有結合(ペプチド結合)したNおよびC末端；γE-G-C(Hx)-φG(化合物44)＝追加のGをγE-C(Hx)-φG中のGとCとの間に挿入する。
【０１４５】
表５において、パラログをヒトGSTイソ酵素選択性によりグループ化し、そして各々の選択性クラス内では、効力の減少に従ってパラログをランク付けする。P1-1およびM1a-1aイソ酵素に対して強い選択性を示したパラログは、この調査で明確に同定されたが、A1-1に対する新しい選択的インヒビターの中で、前述の選択的インヒビターを越えるものはなかった。1-mM濃度での阻害試験を越えてスクリーニングを進めるための１組の基準は、以下の通りであった：あらゆるGSTイソ酵素に対して＞90%の阻害または一対のイソ酵素の間の阻害における＞6倍の差異。最初の基準を満たすこれらのパラログに対するIC_５０値もまた表５に表す。
【０１４６】
GSTイソ酵素へのパラログの結合のより正確な尺度は、K_ｉ値を決定するためのGSH競合実験によって得られる。このような試験を10-μM〜100-μMの範囲でIC_５０効力を有するこれらの化合物またはイソ酵素間で＞５倍の選択性を示す化合物について行い、そしてこのために＞90%の純度を有する化合物を調製した。パラログによる阻害が競合的である場合は、インヒビターの存在下および非存在下でのGSHに対するK_ｍ値は、パラログとGSTイソ酵素との間のK_ｉ値、すなわち解離定数を決定するために用いられ得る。IC_５０値は、1mMGSHにおいておよそ50%の阻害を生じるのに適切なインヒビターの濃度を確立するのに用いた。様々なパラログとのGSH競合実験において得られたデータを、へインズ-ウールフ(Hanes-Woolf)プロットにおいてプロットした。へインズ-ウールフ(Hanes-Woolf)プロットにおいて阻害された状態および阻害されてない状態の平行線は、パラログがGST-活性部位と相互作用することを示す。パラログおよびGSTの大部分の組み合わせについて、厳密な平行関係が得られた。この全ての一連の実験において、GSHのみに対して得られたK_ｍ値は、0.4mMと0.6mMとの間の範囲にあり、これは、最も効力のあるパラログに対して記録されたK_ｍ値よりも約10〜100オーダー弱い大きさであった。
【０１４７】
表６は、この注目の化合物のサブセットに対するK_ｉ値を示す。
【０１４８】
【表６】

これらの化合物の大部分は、本来のスクリーニング試験よりもこれらの研究の方がより高い効力を発現したが、これは、GSH競合実験に対して用いた新しい調製物が、少なくとも90%の純度であったからである。さらに、K_ｉと比較して、IC_５０の算数的定義もまた寄与する：これらの値は、GSHおよびCDNBの両方の濃度が０に近づいたときにのみ等しく、それは、本標準プロトコルの場合ではなかった。特異性に関して、いくつかの場合において相対的優先が変化するが、より正確な決定は、一般に予備データと一致した。
【０１４９】
定量的な構造／活性相関
標準的な医化学の手法の後、これらの化合物の定量的な構造／活性相関(QSAR)の傾向を調査した。この目的のために、一連のGSHのn-アルキル誘導体を試験した。この特徴の詳細な調査の結果を表７に要約した。
【０１５０】
【表７】

これらの結果は、第一に、化合物の阻害効力がn-アルキル基の鎖長に従って増加すること、そして第二に、このパラメーターは、イソ酵素選択性に規則的な傾向を生じないことを示す。表５に示したパラログ化合物に対して得られた結果は、表７に示したGSHのn-アルキル誘導体の集合に対して得られた結果に比べて阻害パターンに非常に大きな多様性を著しく示す。
【０１５１】
多くの小さな有機分子もまた、GST活性を阻害することが以前報告されてきた(Mannervik, B.ら、CRC Crit Rev Biochem（1988）23：283〜337)が、単離したヒトイソ酵素に関する特徴を注意深く述べた報告はごくわずかである。根本的に異なるペプチドベースの構造を有するこれらの構造の比較をすることは、より詳細なQSAR研究に対して有用であることが期待されたので、このような化合物の試験もまた行った。これらの化合物のいくつかは、ペプチドベースの化合物とほぼ同等の効力および選択性を示した。結果を表８に要約する。
【０１５２】
【表８】

阻害データの図形解析
多次元阻害データ(各軸は、組換え体GSTの１つについての阻害の程度を表す)を、ピルエット(Pirouette)における主成分アルゴリズム(principal-componentalgorithm)、すなわちInfometrix, Inc(Seattle, Wash)により、化学データに対して開発された多変量統計解析ソフトウェアパッケージによりIBM互換性パーソナルコンピューター(PC)で解析した。主成分とは、最大関連固有値を有する共分散マトリックスの固有ベクトルである。このように、主成分は、以下の２つの条件を満足させる原軸から誘導された合成パラメーターを表す：(1)主成分は、独立(直交)次元であり、そして(2)主成分は、データセットにおける分散の最大部分を占める。その結果、主成分により定義された平面へのデータの投影は、最大ばらつき(maximalscatter)の次元に沿ってデータを広げることによって、映像の鮮明度を最大にする。このような投影において、同時に接近する点は、高次元の原空間における相関を正確に示す。100倍の特異性要因および0.1-μMK_ｉ値を有する仮定の理想的化合物を表す目的の値もまた、プロットされる。このより正確な値が入手可能な場合には、この解析のために、阻害効力は、log(1/IC_５０)、またはlog(1/K_ｉ)として定義された。
【０１５３】
図１は、表５、７、および８のIC_５０データを表６のK_ｉデータと組み合わせた図形分析を表す。このプロットを決定するために、まず、阻害特性を３次元空間においてプロットした。３次元空間の軸は、３つの組換えイソ酵素の各々についての阻害の程度を表す。次に、データ分布の主成分を決定した(Massart、D.L.ら、Chemometrics: a textbook (1988)、Elsevier、Amsterdam)。簡単に言えば、主成分は、複合係数(compositefactor)あり、この複合係数は、原軸から誘導され、そしてばらつきを最大にするために選ばれた軸に沿って点をプロットすることにより、多変量データの集合において相関を示すために数学的に最適化される。示されたプロットは、第二、第三の主成分によって定義された平面へのデータの投影である。第一の主成分は、効力を大きく表す次元であり、そしてこの性質のばらつきは、表に十分に示される。図１に対する第二および第三の主成分を選択することは、特異性の係数を強調し、そしてその特異性の係数は特性の等しく重要な局面であると考えられる。このような多変量プロットは、試験される試薬の特性(効力および選択性)の便利な検査を可能にする。100倍の特異性および0.1-μMK_ｉとして定義された目的の性質もまた、プロットに示される。
【０１５４】
図１に示されるインヒビターの効力および選択性の多変量解析は、いくつかの他の興味ある特徴をも強調している。第一にそれは、ベンジル／pheglyパラログ(化合物4、表5)は、P1-1特異的インヒビターの目的にかなり近づいていることを示す。第二に、ベンジル／β-Ala(化合物30)、4-メチルベンジル/β-Ala(化合物29)、そして環状ベンジル／phegly(化合物31)パラログは、M1a-1a酵素に対して最も選択的であるが、P1-1酵素に対して達成されるほど目的に近づいていない。第三に、新規のA1-1選択的パラログをこの調査において見出すことは全くできなかった。
【０１５５】
小さい有機分子の分析は、様々な効力および特異性もまたこのクラスの化学構造から入手可能であることを示す。しかし、このような化合物の中で最も効果的な化合物の多くは、極めて疎水性のある染料であり、従ってこれらは、一般にタンパク質との高いバックグラウンド結合により、臨床的には有用ではないようである。これらのインヒビターが競合インヒビターであるかどうかを直接決定するために、これらのインヒビターとの競合実験はまだ行われたことがないが、本明細書中に記述した化合物から入手可能なものより大きな効力と選択性とを達成するという希望を持って、それらをGSH誘導体へ変換するために研究を続けている。
【０１５６】
より効果的なインヒビターの設計において、図１に要約するように、多変量統計学によるデータ解析は、構造的傾向を定義するためには、特に有用であるべきである。最後に、この方法により視覚化された実験的に観察された傾向は、GSTの構造的データ(Ｘ線結晶解析、高分解能核磁気共鳴(NMR)、および部位特異性突然変異誘発を用いた研究など)と比較して有用な見解を与えるべきである。
【０１５７】
薬理学的意義
腫瘍中のGST活性の多様性は、定性的にも定量的にも腫瘍に対して優先的に、存在している化学療法剤を標的とするための重要な治療上の機会を表す。しかし、同様の多様性は、効力のみでは利用するには十分でないという点において、薬理化学者に対して主要な課題を与える；密接に関連した酵素群の中にも選択性が求められている。本発明のパラログアプローチは、このような課題に十分適している。本研究において実証したように、粗リガンドは初期プローブとして有用である(表５)。しかし、阻害特性の信頼できる評価が、約50mgの精製化合物について要求される(表６)。従って、系統的なサンプリングは、適度なレベルまで特徴付けの研究を制限するためには、極めて有用なストラテジーである。
【０１５８】
さらに、サンプル化によって得られた構造の範囲は、QSARに直接寄与し、そして酵素-構造相関の研究は、イソ酵素選択性および効力の原因となる特徴を同定することを目的とした。例えば、M1a-1aイソ酵素に対する最も選択的なインヒビターの１つを除いた全ては、パラログのGSH部分におけるC-末端アミノ酸としてβ-アラニンを有する。P1-1イソ酵素に対して最も選択的なインヒビターの両方は、GSH部分のC-末端アミノ酸としてフェニルグリシンを有する。
【０１５９】
この研究において得られた最良のインヒビターは、以前研究されたインヒビターであるヘキシルGSH (GSTイソ酵素のアフィニティ精製に用いられる標準リガンドである)と同様の効力範囲を示す。これらのインヒビターの効力もまた、エタクリン酸(化学療法を増強するための薬物として臨床試験中である)の効力と同等またはそれより高く、そしてこの観察は、これらの新規インヒビターが、化学療法の増強作用に対しても有用であり得ることを示唆している。例えば、P1-1の優先的発現が、腫瘍の範囲内で報告され、従って、P1-1選択的インヒビターであるベンジル／phegly(化合物４)に基づいた増強剤は、癌治療に有用であり得る。
【０１６０】
K_ｉ値が決定された(表６)このスクリーニングにより同定されたパラログの中の全ては、それらが、効果のためにGSTイソ酵素の活性部位に対して標的とされ、従ってそれらが、CDNB以外の基質に対してGSTの活性に影響を及ぼすべきであることを示すGSTとの競合阻害を示した。様々なアルキル化剤は、GSTに対する基質であり、そしてイソ酵素は、これらの基質に対する特異性に有意に異なる。従って、個々の腫瘍において特定のイソ酵素の特異的発現(differentialexpression)は、治療の応答性における多様性の原因であり得る。この問題は以下のようにして、本発明の適切なパラログの適用によって克服され得る。第一に、個々の腫瘍のGSTイソ酵素コンプルメントを決定し、これにより少なくとも特定の腫瘍の主要GSTイソ酵素を最も受けにくい受容可能な細胞毒性薬剤を同定し、そして第二に、どんなGST活性がその薬物に対して依然存在しても、そのGST活性の阻害により、選択された薬物の最大の相乗作用を与えるパラログインヒビターを提供する。
【０１６１】
例えば、細胞毒性薬剤を増強するために、生細胞におけるGSTイソ酵素活性を阻害するには、本実施例で同定したインヒビターは、上記および以下の実施例１１で実証するように、細胞膜の透過性を増強するために本発明による改変を必要とする。
【０１６２】
（実施例１０：ヒト肝臓GSTのHPLCアフィニティクロマトグラフィにおける本発明化合物の使用）
本実施例では、新しいHPLCアフィニティ支持体を用いてグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)のイソ酵素(例えば、ヒト肝臓における)を迅速に決定する方法について記述する。肝臓細胞質ゾルを、イソ酵素に特異的なアフィニティーリガンド(S-オクチルグルタチオン)と共有結合した支持体を含むHPLCカラム(0.46×5cm)上に直接注入する。共存する細胞質ゾルタンパク質は、洗浄工程で除去される。イソ酵素は、移動相内の別のアフィニティリガンドの線形勾配をかけて溶出される。アフィニティリガンド勾配と一致すると、塩勾配(0〜200mM塩化ナトリウム)がかけられる。この方法により、イソ酵素を、酵素学的に活性なホモダイマーおよびヘテロダイマーに分画する。分画されたイソ酵素の単量体および二量体の組成を、SDS-PAGE、ELISAおよび逆相クロマトグラフィーによって決定する。１つの肝臓の３つのαクラスのイソ酵素サブユニット(これは３つのヘテロダイマーおよび２つのホモダイマーを形成する)が検出される。５つの肝臓を分析し、そしてホモダイマーA1-1は、主要なグルタチオンS-トランスフェラーゼのイソ酵素であることが見出される。少量のπおよびμクラスのイソ酵素もまた、検出される。この非変性高性能アフィニティクロマトグラフィー法は、グルタチオンS-トランスフェラーゼの他のアフィニティ分析法と比較すると、分析時間を十分の一(afactor of ten)に短縮する。
【０１６３】
二量体で活性型である同類のグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)の分離に利用可能なクロマトグラフィー法の１つは、定組成(isocratic)溶出および／または逆リガンドを有する勾配溶出を用いたアフィニティクロマトグラフィーである。この方法は、アフィニティクロマトグラフィーによる細胞質ゾル由来のGSTの精製と個々のGSTの分離とを組み合わせている。GSTのホモダイマーおよびヘテロダイマーの分割は、アガロースに結合したアフィニティリガンドとしてのS-ヘキシルグルタチオンまたはグルタチオンのいずれかを用いるこの技術を用いて成し遂げられた。アガロースゲルに固有である大きな粒径およびゆっくりした流速によって、これらの研究に対する分画時間は、約25時間であり(Hayes,J.D.ら(編)、Glutathione S-Transferases and Drug Resistance、TaylorおよびFrancis、London、1989、p.17)、これは、この技術がGSTのルーチン分析には使用されない理由を説明している。アフィニティリガンドとして固定化グルタチオンを含むHPLCカラムは、GSTの予備精製法として述べられているが(LeCreta、F.P.ら、JChromatog (1988) 434：83〜93)、個々のイソ酵素を分離するための試みはなされていない。
【０１６４】
本発明のこの新規HPLC法は、分析用HPLCカラムに充填したHPLC粒子に共有結合したGSTアフィニティリガンド(例えば、S-オクチルグルタチオン)を有する固定相を使用している。
【０１６５】
アフィニティマトリックス：アフィニティマトリックスの合成は、SundbergおよびPorathの一般手法に従う(J Chromatogr(1974)90：87)。HEMA(ヒドロキシエチルメタクリレート)BIO1000、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル、および2mg/mlの水素化ホウ素ナトリウムを含む0.6 M水酸化ナトリウム(0.03/1/1、w/v/v)を一晩混合した。粒子をろ過し、そして水、エチルアルコール、およびアセトンで順次洗浄した。3.5mlの0.5M炭酸ナトリウムに溶解したS-オクチルグルタチオン(75mg)を700mgの乾燥粒子に添加した。懸濁液を約90時間混合した。ろ過した後、(i)１M塩化ナトリウム、0.1Mリン酸ナトリウム(pH 9)、(ii)１M塩化ナトリウム、0.1M酢酸ナトリウム(pH 4.5)、(iii)水、(iv)エチルアルコール、および(V)アセトンで粒子を洗浄した。
【０１６６】
HPLC カラムの充填：アフィニティ物質(650mg)を20mlの水でスラリーにし、そして高圧で0.46×5cmのステンレス鋼カラム(Supelco Co., Bellefonte、PA)に充填した。カラムフリット(column frit)は、CTFEリング(Upchurch Scientific、Oak Harbor,WA)に入れた2μm(平均孔直径)チタンであった。Haskell(Burbank、CA)DSTV-122液体ポンプを、充填工程の間、展開溶媒(水)を供給するために用いた。カラムを50mlの水を用いて2000psiで充填し、次いで50mlの水を用いて4000psiで充填した。
【０１６７】
本明細書中に記載された新規HPLC充填物上で分離を行うことによって、GST分析時間がかなり節約された。肝臓試料を２時間分析したが、これは、セファロース-6Bベースのアフィニティ支持体を用いた同様の分離よりも10倍以上の速さである。洗浄および溶出工程は、HPLC法を用いると時間的に非常に短縮される。５つのヒト肝臓の分析において(表9、下記)、1.5ml/分で洗浄工程行うことによってHPLCマトリックスの圧力安定性が有利に図られた。少なくとも２ml/分の流速が、GSTイソ酵素に結合する親和性の損失のないこの系において、耐容とされ得る。
【０１６８】
本明細書中に記載されたGSTイソ酵素の高分解能アフィニティ分離は、２つの濃度勾配を同時に適用することに依存した。一方の勾配は、グルタチオンパラログ(例えば、TER106(すなわち、γE-C(Bz)-βA))、またはS-ブチルグルタチオンのいずれかの線形的に増加する濃度から構成されていた。これらは両方ともGSTの公知の競合インヒビターである(上記の実施例９を参照のこと)。装填(loading)工程では、アフィニティリガンドを有するGST複合体が、固定相と共有結合した。競合インヒビター(TER106またはS-ブチルグルタチオン)の濃度が溶出工程の間増加するにつれて、GSTは、次第に移動相に分配され、最後に溶離する。
【０１６９】
GSTの混合物の溶出の順序は、固定化アフィニティリガンドおよび移動相中の競合インヒビターの両方に対すてそれらの親和性の複合関数である。例えば、２つの異なる溶出リガンドを用いてGST溶出プロフィールにおける差違を比較した場合、溶出順序の変化が観察される。TER106を用いる溶出と比較して、S-ブチルグルタチオンを用いる溶出は、μクラスイソ酵素を、αクラスピークに対してブロードでより長い保持ピークにシフトした。さらに、S-ブチルグルタチオン溶出は、TER106溶出で分割されたAx-yおよびAy-yの共溶出となった。S-ブチルグルタチオンに対するTER106の濃度の２倍が、同様のクロマトグラフを生成するのに必要とされたが、これはイソ酵素の親和性の差違を反映した。
【０１７０】
第２の勾配は、リガンド勾配と同じように適用される塩勾配であった。この勾配がなければ、最初の３つのピークが共溶出した。従って、この分離は、アフィニティ勾配および塩勾配の両方に依存した。その塩勾配は、タンパク質と、固定相結合アフィニティリガンドであるS-オクチルグルタチオン(pH6.0で正味の負電荷を有することが期待された)との間のイオン相互作用を克服するために作用し得る。
【０１７１】
アフィニティカラムからアフィニティリガンドと共に溶出したCDNB複合体化活性の回収率は、３つの肝臓に対して平均76%であり、一方、全活性の平均収率(アフィニティリガンド溶出した活性＋保持されなかった活性)は、83%であった。本明細書中に記載されたアフィニティカラムからのCDNB複合体化活性の収率を、他のシステムを用いた以前の報告に記載された収率と比較した。
【０１７２】
３つの肝臓に対する保持されなかった活性の割合は、3%〜13%と様々であった。保持されなかった活性の画分が、カラムの飽和のようなシステムの問題によるものではないことを立証するために、同じ肝臓(L005N)由来の細胞質ゾルの部分を、５回連続してクロマトグラフィーにかけて処理した。保持されなかった活性の画分は、平均2.7%(高い活性のもので3.5%、低い活性のもので2.3%)であった。このことより、異なる肝臓試料の保持されなかった活性の変動は、肝臓試料の特性によるものであると結論づけられた。
【０１７３】
主要なピークにおけるGSTイソ酵素の同一性は、SDS-PAGE電気泳動、ELISAおよび逆相HPLCによって同定された。肝臓L006Nは、３つの型のαサブユニットを含んでいると思われる。肝臓L006から単離されたGSTの逆相クロマトグラムは、A1の後に溶出する２つのピークを示す。これらのその後溶出するタンパク質は、仮にサブユニットAxおよびAyと名付けたが、これは、さらなるサブユニット分析に基づいていた。
【０１７４】
ヒト肝臓の分析について、S-ブチルグルタチオンが、溶出リガンドとして選ばれたが、これは、S-ブチルグルタチオンがαクラスからμクラスGSTを分離したからである。さらに、L006N以外の肝臓は、A1のみを有するか、またはある場合には、A1とAxあるいはAyサブユニットの１つのみとを有し、その結果、TER106によって与えられるαクラスダイマーの完全分離を必要としなかった。５つのヒト肝臓を、アフィニティクロマトグラフィーによってGSTの二量体含量に対して分析し、そして逆相クロマトグラフィーによって単量体含量に対して分析した(表9)。
【０１７５】
【表９】

^１アフィニティクロマトグラフィーの緩衝液；A、10 mM リン酸ナトリウム(pH 6.0)；B、Aに200 mM塩化ナトリウムを加えたもの；C、Bに20 mM S-ブチルグルタチオンを加えたもの。条件：0〜5分、A、0.1ml/分；5〜21分、B、1.5 ml/分；21〜34分、A、1 ml/分；34〜35分、A、0.1 ml/分；35〜155、0〜42% C、0.1 ml/分。
【０１７６】
^２記号：＋、全ピーク面積の10%より大きい場合；少量(minor)、全ピーク面積の10%より小さい；−、検出されず。
【０１７７】
アフィニティカラムに注入した細胞質ゾルの量は、約20mgの肝臓と等価であった。以前の報告において、ヒト肝臓中のGSTの主要な形態は、A1単量体およびA1-1二量体であった。これは、本明細書中で試験された５つの肝臓の場合であった。AxまたはAyサブユニットが、かなりの量で検出された場合、対応するヘテロダイマーもまた見出された。かなりの量の単量体Ayを有するL007Nに対しては、ホモダイマーAy-yおよびヘテロダイマーA1-yの両方ならびにA1-1が検出された。Axを有するがAyはごく少量しか含まないヒト肝臓L005Nは、A1-xおよびA1-1を示したが、Ax-xは、L006Nの場合と同様に全く検出されなかった。少量のP1は、５つの全ての試料において逆相分析によって検出され、そしてまた５つの肝臓のうち４つにおいてアフィニティ分析によって検出された。以前の調査もまた、πがヒト肝臓中の少量成分であることを示している。少量のμクラスGSTは、逆相法により検出された。μクラスが、全GST内容物のごく少量部分を構成する場合、アフィニティクロマトグラフィーにおける小さなピーク形状により、μクラスの検出は困難である。
【０１７８】
HPLC技術を用いたこの新しいアフィニティクロマトグラフィーシステムは、組織のGST二量体含量の分析に対する従来のソフトゲルアフィニティシステムに比べて著しい利点を有している。分析時間は十分の一に減少する。さらに、このアフィニティシステムに対する感度はより大きい。なぜなら、従来のソフトゲルを用いた場合では、ピーク容量が50〜100ミリリットルであったのに比べて、HPLCアフィニティに対するピーク容量がほんの約0.5ミリリットルであるからである。この技術はまた、試料の洗浄および分析の両工程を組合わせて１工程にできるという利点も有している。逆相HPLC、等電点クロマトグラフィーまたは電気泳動のような他の技術は、最終分析前にGSTをバッチ精製するために別のアフィニティ工程を必要とする。
【０１７９】
溶出液中の逆リガンドの勾配を用いたアフィニティクロマトグラフィーは、強力な分離技術である。溶出液中の生体特異的リガンドの違いによって、クロマトグラフィー分離は異なる選択性を示す。観察された異なる選択性は、様々なイソ酵素に関連してリガンド間に存在する結合定数の特有のセットによる。これは、逆リガンドとしてTER106またはS-ブチルグルタチオンを用いた溶出プロフィールを比較したときのGSTの場合である。本発明化合物の多数および他のリガンドはGSTと相互作用し、そしてこれらのいかなるものも通常の分離を展開させて特有の分離を与え得る。特に、本明細書中に報告した分析法は、注目の特定のGSTの予備単離に対して容易にスケールアップし得る。
【０１８０】
（実施例１１：ヒト細胞中の細胞毒性薬剤の相乗作用における本発明化合物の使用）
本実施例は、本発明化合物を含むGSTインヒビターによる癌化学療法に現在用いられる細胞毒性薬剤のヒト腫瘍細胞における相乗作用、ならびに、これらの化合物のエステル形の増強された細胞内効力を記載している。
【０１８１】
HT-29（ヒト結腸アデノカルチノーマ)細胞をDr．RobertoCeriani (Cancer Research Fund of Contra Costa County、Walnut Creek、CA)から入手し、そして他に指定しなければ対数成長期に用いた。クロラムブシル(CMB)をSigma(St.Louis、MO)から入手し、100%エタノールに溶解した。全てのGSTインヒビターを、使用する直前に、エタノール、DMSO、または水に溶解した。培養培地に加えた同量の溶媒はベヒクルコントロールとして役割を果たした。
【０１８２】
細胞毒性に対する改変されたクローン原性アッセイでは、ベヒクルまたはインヒビターの存在下、細胞を無血清培地中に2×10^５細胞／mlで懸濁させた。インヒビターは、ベヒクル処理した細胞と比較した場合、≧90%生存となる濃度で使用した。細胞を２時間培養し、次いで様々な用量のCMBを加えた。次の２時間培養の終わりに、細胞を血清含有培地で7.5-10×10^３/mlに希釈し、そしてMicrotestIIIマイクロタイタープレートにおいて、200μｌ/ウェルにて４つに分けてプレート接種した。
【０１８３】
プレートを６日間培養し、そして改変メチレンブルー法によりアッセイを行った。簡単に言えば、1.25%グルタルアルデヒドを含むPBS液で細胞を固定し、次いで蒸留水に溶かした0.05%メチレンブルーにより染色した。プレートを蒸留水で数回洗浄して、保持されていない染料を除去し、そして保持された染料を0.03NHCl中に再可溶化した。プレートを、Molecular Devices Vmax plate reader(Molecular Devices、RedwoodCity、CA)において650nmで読み取った。IC₅₀値(細胞の生存を50%減少させるインヒビター濃度)を、インヒビターの存在下または非存在下で薬物に対して用量-応答曲線から決定した。用量改変係数(dosemodification factor)(DMF)(細胞毒性の相乗作用の尺度)は、インヒビター処理をしていないCMBのIC_５０値を、インヒビター処理をしたCMBのIC_５０値で割ることによって、各々のインヒビターに対して計算した。
【０１８４】
HT29細胞培養におけるいくつかのGSTインヒビターの相乗作用試験の結果を表10に要約する。
【０１８５】
【表１０】

^ａ前記の表５、実施例９における化合物の番号。
^ｂ試験用量は、毒性曲線から決定し、そしてアナログは、アナログのみの存在下で≧90%生存が生じる用量で使用した。
^ｃ用量改変係数：値は、２〜３つの実験の平均±S.D.である。
【０１８６】
表10〜12の結果は、実施例９、表５に示すように、GSHのインヒビターであるとわかったいくつかのGSHアナログもまた、様々なGSTの基質であるCMBによる培養ヒト腫瘍細胞の死滅を増強することを示す。さらに、表10に示すように、この相乗作用は、GSTインヒビターの取り込みを増加させるように設計されたエステル化によって大きく増大する。従って、100μMのγE-C(Bz)-φG(化合物４、表５)は、CMBにより細胞死滅を増大せず、50%細胞死滅に必要なCMB濃度を1.08のDMF減少させた。これに対して、ほんの12.5μMの化合物４のジエチルエステルは、CMB細胞毒性を1.65分の１に増大させた。
【０１８７】
P1-1の優先的発現は、ヒト腫瘍の領域で報告されてきた。本研究において、試験したいくつかのGSTインヒビターのCMB相乗作用の効力は、表11に示すように、ヒトπ-クラスGSTイソ酵素であるP1-1のインヒビターとしての効力と直接に相関した。
【０１８８】
【表１１】

^ａ前記の表５、実施例９における化合物の番号。
【０１８９】
^ｂジエチルエステルの用量改変係数：値は、２〜３つの実験の平均±S.D.である。
【０１９０】
クロラムブシルおよびHT-29細胞の相乗作用に対して、式(１)の化合物をエステル化またはアミド化した場合の効果もまた、決定した。用量改変係数は、関連濃度のγE-C(Bz)-φGのジエチルエステル、ジアミド、およびエステル／アミドに対して決定した。ジエステルは、12.5μMでクロラムブシル毒性の1.65±0.04改変を示した；ジアミドは、一度の実験ではあるが、200μMで1.0改変を示した；エステル／アミドハイブリッドは、50μM濃度で1.45±0.16改変を示した。ジエチルエステルおよびエステル／アミドハイブリッドに対する結果は、３つの実験の平均±SDとして示す。
【０１９１】
オクチルGおよびベンジルPGを、３つの細胞株を用いた標準的なクローン原性アッセイにおいて試験した：HT-29のサブクローンであるHT4-1；卵巣癌腫であるSKOV-3、およびSKOV-3のビンブラスチン耐性変異体であるVLB 。３つの化学療法剤、クロラムブシル、アドリアマイシンおよびマイトマイシンCを毒性薬剤として用いた。これらのアッセイでは、細胞を、ジエチルエステルとしての本発明化合物の存在下、６-ウェルプレートにおいて２mlの培地で300細胞／ウェルにてプレート接種した。コントロールと比較した場合、85%より多い生存を生じる濃度の化合物を使用した。細胞を付着させるために、１〜２時間培養した後、様々な用量の化学療法剤を加えた。少なくとも３つのレプリケートウェルを、各々の試験条件に対してプレート接種し、そしてプレートを２週間培養した。コロニーを95%エタノールで固定し、そしてコロニーを計数するために、クリスタルバイオレットで染色した。IC_５０値は、本発明化合物の存在下または非存在下における化学療法剤に対して決定し、そして用量改変係数は、本発明化合物を有しない薬物のIC_５０値を、本発明化合物を有する薬物のIC_５０値で割ることにより計算された。各々のプロトコールで得られた改変係数を表12に示す。
【０１９２】
【表１２】

^ａ用量改変係数。
^ｂアナログの毒性によるデータはない。
^ｃ試験用量は左記リストと異なっていた。
^ｄ未測定。
【０１９３】
表に示すように、25μMのベンジルPGのジエチルエステルの存在下で、クロラムブシルを薬物対HT4-1細胞として用いた場合、有意な改変が得られた。25μMの同化合物の存在下で、アドリアマイシンで処理した場合にもVLB細胞において有意な改変が達成された。
【０１９４】
図2aは、クロラムブシルの様々な投与量に対する結果および25μMのベンジルPGのジエチルエステルの改変効果を表す。白ヌキ四角(□)は、クロラムブシルのみを表し、黒塗丸(●)は、本発明化合物の存在下でのクロラムブシルを表す。図2aに示すように、本発明化合物を加えた場合、生存率が著しく減少する。図2bは、ジエチルエステルが、細胞を透過するのに必要であることを確認するものである。HT4-1細胞を、ベンジルPG(黒塗四角■)またはそのジエチルエステル(黒塗丸●)のどちらかの存在下で、生存について試験した。エステル化されていないジエチルGは、これらの細胞に実質上効果を示さないが、一方、ジエチルエステルは、明らかに毒性がある。
【０１９５】
（実施例１２：本発明化合物の代謝効果）
毒性に関連してHT-29細胞に対する本発明化合物の代謝効果を、MolecularDevices、Inc.,Menlo Park, CAにより製造され、そしてMcConnell,H.M.ら．Science(1992) 257：1906〜1912およびWada、H.G.ら．AATEX(1992) 1：154〜164によって記載されたサイトセンサーマイクロフィジオメーター(CytosenserMicrophysiometer)を用いて試験した。培養培地のpH変化を細胞代謝の関数として測定する。細胞じゅうを流れる少容量の液体の酸性化率は、反応チャンバーの生細胞数と相関する；酸性化率の減少は、生存細胞数の減少を反映している。
【０１９６】
この例では、HT-29細胞を10%ウシ胎児血清を含む培地中に4×10^５細胞／チャンバーにてプレート接種した。16〜18時間後、血清レベルを１％まで下げ、そして細胞をさらに18時間維持した。次に、細胞をエタクリン酸(50μM)、ベンジルPGのジエチルエステル(20μM)またはベヒクル(0.1%エタノール)のいずれかに４時間曝した。次に、培地を無血清低緩衝能培地で置き換え、そしてマイクロフィジオメーター分析を開始した。チャンバーの半分を100μMクロラムブシルに曝し、そしてもう半分をベヒクル(0.1%エタノール)に曝した。酸性化率を16時間モニターし、データを基準(100%)の酸性化率のパーセンテージとして表す。
【０１９７】
結果を図３に示す。フェニルPGのジエチルエステルまたはエタクリン酸のみのいずれも、酸性化率に対してあまり効果を示さなかった；しかし、エタクリン酸前処理およびベンジルPGジエチルエステルによる前処理は、クロラムブシルの効果を増強した。図において、白抜き記号は、クロラムブシルの未添加を表す、黒塗り記号はクロラムブシルの添加を表す；四角はベヒクルによる前処理を表し、三角はエタクリン酸による前処理を表し、そして丸は、ベンジルPGジエチルエステルによる前処理を表す。
【０１９８】
（実施例１３：様々な細胞株のGST分析）
前述の分析に用いた細胞株のGSTプロフィールを以下のように行った：細胞を採集し、無血清培地で二度洗浄し、無カルシウム-マグネシウムPBSで一度洗浄し、次いでペレットをスナップ凍結し、そして−80℃で保存した。凍結した細胞を、Castro、V.M.ら、BiochemJ (1993) 292：371〜377に記載されるように、10mMのリン酸ナトリウム(pH 7.0)；0.16MのKCl、100μMのPefablocSC(Central Chem, Inc.,Stamford, CT)、1μMのロイペプチン(Sigma)、2mMのEDTA、および2mMのジチオ-3-イトール(dithio-3-itol)中で、ホモジナイズした。GSTを心収縮性(systolic)の画分からHPLCカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって単離した。J.T.Baker 7105-00 Wide-PoreオクチルHPLCカラム(25cm×4.6mm、VWR Scientific)によるGSTの逆相分析、タンパク質決定、およびCDNB複合体化活性の決定を、Castro、V.M.ら、BiochemJ (1993)292：371〜377に記載されるように行った。結果を表13に示す。
【０１９９】
【表１３】

^ａ値は、ピーク面積＝mV-秒/mg 細胞質ゾルタンパク質として表される。
^ｂ値は、mOD/分/mg 細胞質ゾルタンパク質として表される。
^ｃエタクリン酸に対する野生型感受性を保持するHT-29サブクローン。
^ｄ SKOV-3のビンブラスチン耐性サブクローン。
【０２００】
その結果は、全ての細胞株が、主要GSTイソ酵素としてP1-1を発現することを示す。SKOV-3およびVLB細胞もまた中程度レベルのA2-2を発現するが、このイソ酵素は、HT-29細胞で痕跡量にのみ見られた。それは、HT4-1細胞では検出不能であった。非常に低レベルのMT2-2が、HT-29およびSKOV-3において検出された。33kDおよび27kDタンパク質(それぞれエノイルCo-AイソメラーゼおよびGST-M3として同定された)もまた、これらの細胞中に見出される。
【０２０１】
（実施例１４：骨髄顆粒球マクロファージ(GM)前駆体の刺激）
本発明化合物はまた、細胞を透過し得るためにエステル化された場合、哺乳動物の被験体に投与された場合の骨随のGM前駆体の生成を刺激する。実証的なアッセイでは、３匹のB6D2F_１マウスを、腹腔内投与により様々な用量のベンジルPGで処置した。大腿骨の骨随を24時間後に採集し、そしてEast、C.J.ら．CancerChemother Pharmacol (1992) 31：123〜126の方法によって、GM-CFUに対するアッセイを行った。用量-依存の様式で、90mg/kgのベンジルPGの投与量までコロニー数の増加があった。これらの結果を図４に示す。90mg/kgにおいて、コントロールに対する約140/10^４有核細胞のコロニーと比較して、50より多い細胞の約275コロニー／10^４有核細胞が得られた。
【０２０２】
（実施例１５：インビボにおけるメルファラン(Melphalan)毒性の相乗作用）雄性scidマウスに、ドナーマウスからHT4-1腫瘍を皮下に移植した。腫瘍が約100mm^３に達したとき、マウスを６つの処置グループに無作為に分け、７日間以下のように処置した：
１．5mg/kgメルファラン；
２．10mg/kgエタクリン酸；
３．60mg/kgベンジル-PGのジエチルエステル；
４．5mg/kgメルファラン＋10mg/kgエタクリン酸；
５．5mg/kgメルファラン＋60mg/kgベンジル-PGのジエチルエステル；
６．ベヒクルのみ。
【０２０３】
マウスの体重変化をモニターし、そして腫瘍容量をカリパス(calipers)を用いた測定により決定した。腫瘍の増殖は、メルファラン＋エタクリン酸のグループを除いた全てのグループに対して、平均腫瘍サイズが1500mm^３に達するまでモニターした。このグループは、72日後においてさえもこの容量に達しなかった。
【０２０４】
結果は、コントロール腫瘍容量(すなわち、ベヒクルのみを投与したグループにおいて)のパーセンテージとして、実験において腫瘍容量によって計算した。メルファランのみが投与されたグループ１において、腫瘍は、コントロールの容量の約75%であった。ベンジル-PGのジエチルエステルがメルファランと一緒に投与された場合のグループ５においては、腫瘍容量平均は、コントロールの約55%であった。メルファランとエタクリン酸とを組み合わせて投与したグループ４においては、その容量は、コントロールの約35%であった。従って、エタクリン酸およびベンジル-PGのジエチルエステルの両方は、メルファランの効果を増強する。(容量測定は、コントロール腫瘍が1500mm^３に達した時点で行った。）
【０２０５】
【発明の効果】
吸着体（sorbent）および溶液相インヒビターとして有用である新規なグルタチオンアナログ、ならびにそれらを含むパネルを提供することにより、個々のGST酵素またはそのセットを特徴付けおよび操作するための改良された方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 GSTインヒビターの多変量解析を示す図。インヒビターの質は、３つの各組換えヒトGSTイソ酵素(A1-1、M1a-1a、およびP1-1)に対する有効性をプロットすること、および分配の主成分により定義される平面上に点を投影することにより目視化される。各イソ酵素の理想的なインヒビターの標的値は、イソ酵素名でラベルした円により記される；理想的なインヒビターの基準は、100倍の特異性およびK_i=0.1μMである。実施例９に示される３つのファミリーの化合物が比較される：表５からのパラログの選択(番号)、表７からの一連のn-アルキルGSHアナログ(太字のC_n)、および表７からの小有機分子の選択(斜字)。明確にするために、特定のデータはプロットしておらず、すなわち低特異性の化合物のそれらは、プロットの中心で密集する。
【図２】本発明の化合物の作用を示す図。図２ａは、ジエステル形態が細胞透過性を助けることを示す；図２ｂは、ベンジル-PGのジエチルエステル(γE-C(Bz)-φG、以下を参照のこと)のクロラムブシルの強化における効果を示すグラフである。
【図３】 HT-29細胞におけるクロラムブシル毒性に対するエタクリン酸およびベンジル-PGの効果を示す図。
【図４】ベンジル-PGの投与によりGM前駆体の刺激の用量-応答関係を示す図。

Claims

化学療法剤の効力を増し、または顆粒球マクロファージ前駆体の生成を増すための薬学的組成物であって、γ−グルタミル−Ｓ（ベンジル）システイニル−Ｒ（−）−フェニルグリシンのアルキル型（１ -10 Ｃ）、アルケニル型（１ -10 Ｃ）、またはアリールアルキル型（７ -12 Ｃ）のジエステル、またはその塩である化合物を含む、組成物。
前記化合物が、γ−グルタミル−Ｓ（ベンジル）システイニル−Ｒ（−）−フェニルグリシンのジエステル、またはその塩である、請求項１に記載の組成物。
前記塩が、γ−グルタミル−Ｓ（ベンジル）システイニル−Ｒ（−）−フェニルグリシンのジエステルの塩酸塩である、請求項２に記載の組成物。
化学療法剤の効力を増すための請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
顆粒球マクロファージ前駆体の生成を増すための請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
癌の処置のための治療を受ける被験体における顆粒球マクロファージ前駆体の生成を増すための請求項５に記載の組成物。