JP3503641B2 - グルタチオンアナログおよびグルタチオン模擬物を含むパラログパネル - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、グルタチオンの新規なアナログであるトリ
ペプチド化合物に関する。本発明はまた、多様な特性を
有するグルタチオンアナログであり、そしてグルタチオ
ントランスフェラーゼ（GST）の特徴付けおよびGSTの溶
液相インヒビターとして有用であるトリペプチドのパネ
ルに関係する。

技術背景 グルタチオン（GSH）は、還元型で、以下の式のトリ
ペプチドである：γ−Glu−Cys−Gly。還元型グルタチ
オンは、細胞内におけるレドックス条件の維持に中心的
な役割を有し、そしてまた多数のメカニズムにより外来
物質の解毒を促進するグルタチオンＳ−トランスフェラ
ーゼ（GST）の必須基質である。メカニズムはトキシン
の求電子的な部分の、例えばグルタチオンへのカップリ
ングの触媒作用を含み、これによりトキシンをより浄化
に感受性にする。第二のメガニズムは、基質としてグル
タチオンも含み、グルタチオンの酸化と同時に生じる過
酸化物の還元に存在する。

Adang,A.E.P.ら、Biochem J（1990）269:47−54は、
異なる濃度で種々のGSTイソ酵素と相互作用するGSHのト
リペプチドアナログを記載した。これらのアナログは、
少なくとも一つのグリシン、システイン、またはγ−グ
ルタミン残基が他のアミノ酸残基によって置換されてい
るGSHの改変された形態である。

別の改変形態は、例えば、ラット肝臓のグリオキサラ
ーゼII酵素におけるトリペプチドGSHアナログの効果を
研究したPrincipato,G.B.ら、Enzyme（1989）41:175−1
80により開示された。このグループにより用いたトリペ
プチドは、式γGlu−ρ−クロロフェニルカルボニルメ
チル−Cys−Serであった。Morris,D.,Biochem J（196
0）76:349−353は、γ−Glu−ベンジル−Cys−Valの合
成を記載した。３つのGSHアミノ酸のうち１つだけ置換
している多数のGSHトリペプチドアナログは報告され、
そして市販されている。

以下に記載の本発明は、新規なグルタチオントリペプ
チドアナログに関し、それは、クロマトグラフィー支持
体上でアフィニティーリガンドとして、およびグルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼの種々のイソ酵素を特徴
付けるために使用するパネルのメンバーとして有用であ
る。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）
は、特異的結合能、基質およびインヒビター特異性、な
らびに組織分布が異なる多数のイソ酵素の形態で存在す
る。従って、特性における違いをともなうGSTイソ酵素
の特定のコンプルメント（complement）は、腫瘍組織の
ような特定の組織または細胞型に特有である。GSTが、
トキシン物質に対するその防御に関連する組織または細
胞の全体にわたる代謝の中心であるので、細胞または組
織に対するGSTのコンプルメントの特徴は、腫瘍細胞に
所望されるような細胞または組織の破壊、または正常組
織の場合代謝機能の促進のいずれかのための方針の設計
において重要である。

種々のGSTイソ酵素は、４つの遺伝子ファミリー中の
少なくとも15の公知の遺伝子によりコードされるモノマ
ーの一対の組合せにより形成される２量体タンパク質で
あり、数ダースの異なる２量体を生じることが理論的に
可能であり、同じ遺伝子ファミリー由来のモノマーの選
択的な２量体化でさえも可能にする。これらの組合せの
可能性から生じる変異性に加えて、GSTイソ酵素サブユ
ニットはヒト集団で多形性であり、そしてファミリーの
縦列反復メンバー間での遺伝子変換事象のためにさらな
る変異に供されると考えられた。翻訳後修飾がこの変異
性にさらに加わる。各細胞または組織が１または数種の
これらの理論的に可能な酵素を含み得るので、GSTコン
プルメントの決定は、大変重要である。

本発明は、吸着体（sorbent）および溶液相インヒビ
ターとして有用である新規なグルタチオンアナログ、な
らびにそれらを含むパネルを提供することにより、個々
のGST酵素またはそのセットを特徴付けおよび操作する
ための改良された方法を提供する。

発明の開示 本発明は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼイソ
酵素を特徴付けるのに、細胞および組織のGSTコンプル
メントを測定するのに、および治療用途に有用な試薬に
関する。本発明の化合物は、系統的に改変した形態の還
元型グルタチオン、および標的酵素に関して多様な性質
を有するこのようなアナログを含むパネルである。本発
明の化合物はまた、クロマトグラフィーアフィニティー
リガンド、結合試薬、および酵素インヒビターとしても
有用である。

本発明のトリペプチドのエステルは、特に、治療的お
よび診断的状況において有用である。このアミドもま
た、薬理学的性質または生理学的作用を改変し得る部分
に誘導体化できる。従って、１つの局面において、本発
明は、下式の化合物に関する： およびそのアルキル型（１−10C）、アルケニル型
（１−10C）、およびアリールアルキル型（７−12C）エ
ステル、アミド、およびそれらの混合エステル／アミ
ド； ここで、Ｚは、Ｓ、Ｏ、およびＣからなる群から選択
され； ｎは、１、２、または３であり； ここで、ＺがＯまたはＳであり、かつｎが１である場
合、Ｘはモノ置換またはジ置換または非置換ヒドロカル
ビル（１−20C）部分であって、任意に１個または２個
の非隣接ヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、またはＮ）を含有し、そ
してここで、該置換は、ハロ、−NO、−NO₂、−NR₂、O
R、およびSRからなる群から選択され、ここで各Ｒは独
立してＨまたは低級アルキル（１−4C）であり； ここで、ＺがＳであり、かつｎが２である場合、１つ
のＸは、上記の定義通りであり、そして他のＸは低級ア
ルキル（１−4C）であり；そして ここで、ＺがＣであり、かつｎが３である場合、１つ
のＸは、上記の定義通りであり、そして他の２つのＸ
は、独立して、Ｈまたは低級アルキル（１−4C）であ
る； Ｙ−COは、γ−Glu、β−Asp、Glu、Asp、γ−Glu−G
ly、β−Asp−Gly、Glu−Gly、およびAsp−Glyからなる
群から選択され、そして AA_cは、式（１）の化合物の残りの部分にペプチド結
合によりカップリングされるアミノ酸である。

別の局面において、本発明は、上記の式（１）の化合
物のシクロアミド形態に関する。ここで、ＺがＳであ
り、かつｎが２である場合、１つのＸはまたＨであり得
る。

また別の局面において、本発明は、ヒトグルタチオン
−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）酵素を精製または特
徴付けする方法に関する。この方法は、酵素を含むと思
われる試料を、上記の式（１）の化合物をカップリング
させた固体支持体と、ヒトGSTがこの固体支持体に吸着
される条件下で接触させる工程、この固体支持体を試料
から分離する工程、およびヒトGSTを固体支持体から溶
出する工程を包含する。本発明の方法の１つの好ましい
実施態様において、支持体は、高性能液体クロマトグラ
フィー（HPLC）システムの使用に適している。

また他の局面において、本発明は、試料中のGST酵素
の存在または非存在を検出する、そして必要に応じてク
ラスにより特徴付けする方法に関する。この方法は、試
料を上記の式（１）の化合物で処理する工程、および試
料中に含まれる任意のGSTと式（１）の化合物との間の
複合体の存在または非存在を検出する工程を包含する。

本発明はまた、少なくとも５つの異なった式（１）の
トリペプチドグルタチオンアナログ（あるいはそのエス
テル、塩、アミド、混合エステル／アミド、またはそれ
らのシクロアミド形態）を含む、パネルを包含し、ここ
でパネル中の化合物は、多様な特性を有する。これらの
パネルは、クロマトグラフィー支持体パネルとして構成
され、そして細胞のGSTコンプルメントを特徴付けるた
めに用いられ得る。

本発明はまた、式（１）の化合物に関し、ここでＸは
モノ−、ジ−、またはトリ置換された単環式または二環
式アリール（１−20C）、好ましくはベンジルであり、
ここで置換基はR'、ハロ、−NO、−NO₂、−NH₂、OR、お
よびSRからなる群から選択され、ここで、ＲはＨまたは
アルキル（１−6C）であり、そしてR'は、アルキル（１
−6C）、アルケニル（１−6C）またはアルキニル（１−
6C）である。

本発明はまた、種々のGSTイソ酵素のための本発明の
トリペプチドグルタチオンアナログの選択性を利用する
方法およびプロトコルに関する。非標的細胞と比較して
標的細胞中のGSTイソ酵素レベルを考慮すると、適切な
グルタチオンアナログは、選択的細胞毒性効果を及ぼす
か、または化学療法剤の効力を選択的に増すように選択
され得る。さらに、本発明のアナログは、哺乳類被験体
における骨髄を刺激または強化し得る。細胞内効果を及
ぼすために、本発明の化合物は、好ましくは、ジアミド
またはジエステルあるいはそれらのハイブリッドとして
供給されることがさらに見出されている。

別の局面において、本発明は、腫瘍細胞における化学
療法剤の効力を増す方法に関する。この方法は、上記腫
瘍細胞に、上記化学療法剤と共に、効力を増す量の上記
の式（１）の化合物のジエステルまたはジアミド、ある
いはアミド、エステル、またはそれらのハイブリッドア
ミド／エステルを投与する工程を包含する。

また別の局面において、本発明は、非標的細胞と比較
して標的細胞に細胞毒性効果を及ぼす方法に関する。こ
の方法は、GSTイソ酵素を同定する工程であって、このG
STイソ酵素のレベルは非標的細胞と比較して上記標的細
胞において高められている、工程； 選択的に上記イソ酵素を不活性化する、式（１）の化
合物を選択する工程；および 上記非標的細胞と比較して上記標的細胞に対して毒性
の量で、上記選択された化合物、あるいはそれらのアミ
ド、エステル、またはハイブリッドアミド／エステルを
上記標的細胞に投与する工程を包含する。

さらに別の局面において、本発明は、被験体の骨髄に
おける顆粒球マクロファージ（GM）前駆体の産生を刺激
する方法に関する。この方法は、上記被験体に有効量の
式（１）の化合物、あるいはそれらのアミド、エステ
ル、またはハイブリッドアミド／エステルを投与する工
程を包含する。

図面の簡単な説明 図１。GSTインヒビターの多変量解析。インヒビター
の質は、３つの各組換えヒトGSTイソ酵素（A1−１、M1a
−1a、およびP1−１）に対する有効性をプロットするこ
と、および分配の主成分により定義される平面上に点を
投影することにより目視化される。各イソ酵素の理想的
なインヒビターの標的値は、イソ酵素名でラベルした円
により記される；理想的なインヒビターの基準は、100
倍の特異性およびK_i＝0.1μＭである。実施例９に示さ
れる３つのファミリーの化合物が比較される：表５から
のパラログの選択（番号）、表７からの一連のｎ−アル
キルGSHアナログ（太字のC_n）、および表７からの小有
機分子の選択（斜字）。明確にするために、特定のデー
タはプロットしておらず、すなわち低特異性の化合物の
それらは、プロットの中心で密集する。

図2aは、ジエステル形態が細胞透過性を助けることを
示す；図2bは、ベンジル−PGのジエチルエステル（γＥ
−Ｃ（Bz）−φＧ、以下を参照のこと）のクロラムブシ
ルの強化における効果を示すグラフである。

図３は、HT−29細胞におけるクロラムブシル毒性に対
するエタクリン酸およびベンジル−PGの効果を示す。

図４は、ベンジル−PGの投与によりGM前駆体の刺激の
用量−応答関係を示す。

発明の実施様式 本発明は、クロマトグラフィーのリガンドおよびGST
インヒビターとして個々に有用な化合物、ならびに多様
な特性を有する関連化合物のパネルに関し、例えば、GS
T酵素のプロフィールの測定、および未知の試料中のGST
コンプルメントの測定に有用である。本発明の化合物
は、系統的に改変された形態の還元型グルタチオン、お
よび標的酵素に関して異なる特性を有するアナログを含
むパネルである。

GSHの既存のトリペプチドアナログは、異なる濃度で
種々のGSTイソ酵素と相互作用し、グリシン、システイ
ン、またはγ−グルタミン残基の少なくとも１つが他の
アミノ酸残基に置換される改変形態のGSHである。例え
ば、Adang,A.E.P.ら、Biochem J（1990）269:47−54参
照。GSHトリペプチドおよび多数の他の可能性のあるも
のにおいて各アミノ酸に対して置換される種々の非標準
アミノ酸が与えられて、システインスルフヒドリルに連
結され得る種々の基質と組み合わされる場合、GSTイン
ヒビターとして数万のGSHアナログを意図することが可
能である。

以下の以前に記載されたパラログ方針（米国特許第4,
963,263号および第5,133,866号、これらの開示は、参考
として本明細書中に援用される）に続き、この潜在的な
セットの系統的なサンプリングが調製された。従って、
潜在的な多様性の代表的なサンプリングは、いくつかの
哺乳動物種（主にラット）由来のGSTへの結合に関する
広範な複数のパラメーターと交差して、共存のバリエー
ションを生じるモノマー選択を通して達成される。強調
されたパラメーターは、疎水性、サイズ、および電気陰
性度を含む。特性のバリエーションは、主にＣ末端およ
びスルフヒドリル位置で作出された。

アフィニティークロマトグラフィーにより試験される
場合、これらの多様な吸着体のいくつかは、Mannervik,
B.ら、Proc Natl Acad Sci（1985）82:7202−7206に提
案された以下のクラス分けに従って特定の１つのクラス
または複数のクラスの哺乳動物GSTイソ酵素を選択的に
結合する：α（例えば、ヒトαおよびA1−１、ラット１
−１および２−２）、μ（ヒトμ、M1a−1a、ラット３
−３および４−４）、π（ヒトπおよびP1−１、ラット
７−７）および、さらに最近提案されたクラスθ（ラッ
ト５−５）。GST酵素活性の阻害について試験する場
合、いくつかの吸着体はまたGSTイソ酵素クラスの選択
的または特異的インヒビターとしても作用する。従っ
て、本発明の化合物、パネル、および方法は、高められ
たレベルの特定のGSTイソ酵素を有する細胞を標的する
薬剤の設計に新規な方針を与える。

本発明の化合物はまた、化学療法剤の毒性の強化する
が、同時に、骨髄の保護効果を強化するように見える。
特に、本発明の化合物の投与は、顆粒球マクロファージ
（GM）前駆体の生産を促進することが確立された。この
効果のために、腫瘍細胞に対する化学療法剤の毒性が強
められるだけでなく、正常細胞が化学療法剤と比較して
より良好に保護される。さらに、本発明の化合物は、貧
血症のような種々の骨髄関連欠乏症の処置に有用であ
る。

種々のGSTイソ酵素に対する選択性を示す試薬が選択
される化合物は、１組のトリペプチドグルタチオンアナ
ログである。これらの化合物は、以下に示すように、種
々のイソ酵素に対する選択の範囲を提供する。これによ
り、このクラスの適切なメンバーが、イソ酵素のクロマ
トグラフィー分離、GST操作における選択的な検索剤、
および直接的な細胞障害性効果に関してか、または他の
化学療法剤の強化によるかのいずれかにより特定の細胞
を標的する手順における選択的な活性成分に対して有用
となる。

本発明の化合物 本発明の新規な化合物は、式（１）の部分を含み、こ
こで１つのＸはモノ置換またはジ置換または非置換のヒ
ドロカルビル（１−20C）部分であって任意に１個また
は２個の非隣接ヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、またはＮ）を含有
し、そして他方のＸは存在しないか、または低級アルキ
ル（１−4C）である。好ましい実施態様では、ｎは１で
あり、そしてＸは非置換ヒドロカルビルである。Ｘにつ
いての好ましい実施態様は、メチル、プロピル、ヘキシ
ル、オクチル、ベンジル、ナフチル、およびトリチルを
含む。シクロアミド形態では、ＸはまたＨであり得る。

本明細書において、「ヒドロカルビル」は、１〜20個
のＣを含む、直鎖または分枝鎖または環状の、飽和また
は不飽和の、脂肪族または芳香族のヒドロカルビル残基
を意味する。１〜20個のＣに加えて、構造的に現実性が
あれば、ヒドロカルビルはまた、１個または２個の非隣
接のヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、またはＮである）を含み得
る。従って、そのように修飾されたヒドロカルビル基
は、エーテル、ジエーテル、チオエーテル、またはジチ
オエーテル、あるいは２級または３級のアミン、または
ジアミンであり得る。このような置換基の例としては、
メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、３
級ブチル、ヘキシル、オクチル、ノニル、2,3−ジメチ
ルオクチル、ドデシル、9,9−ジメチルウンデシル、ア
リル、２−ブテニル、イソブテニル、シクロヘキシル、
シクロペンチル、シクロヘプチル、フェニル、ベンジ
ル、４−メチルベンジル、トリフェニルメチル、メトキ
シエチル、エチルチオエチル、ジエチルアミノプロピル
などが挙げられる。また、Ｘとして適切なヒドロカルビ
ル基としては、ナフチルおよび複素環式の関連の基など
を包含する二環式アリール（１〜20C）部分がある。

さらに、ヒドロカルビル、または１個または２個のヘ
テロ原子を含むヒドロカルビルは、任意に、１個または
２個の置換基で置換され得る。これらの置換基は、ハロ
（すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨー
ド）またはヒドロキシまたはスルフヒドリル、および／
またはアルキルオキシまたはアルキルチオ（例えば、メ
チルチオ、ブチルチオ、プロポキシ、またはエトキ
シ）、および／または−NO、−NO₂、または−NH₂、−NH
（アルキル）または−Ｎ（アルキル）（アルキル）であ
り得る。

原子価の規則に適合して、ＺがＯのとき、ｎは１でな
ければならない;ZがＳのとき、ｎは１であり得る（また
はＳが正の電荷を有するときには２であり得る）；そし
てＺがＣのとき、ｎは３でなければならない。一個のＸ
のみが、上記の複雑性を許容される。ｎが２のとき、第
２のＸは低級アルキルである;nが３のとき、第２および
第３のＸは、各々独立して、Ｈまたは低級アルキル（１
〜4C）である。

AA_cは、任意の、遺伝子にコードされるアミノ酸であ
り得る。AA_cはまた、ヒドロキシプロリン（HP）、４−
アミノ酪酸（4ABu）、β−アラニン（β−alaまたはβ
Ａ）、フェニルグリシン（PGまたはφＧ）などのよう
な、遺伝子によってコードされないアミノ酸残基であり
得る。AA_cの好ましい実施態様としては、グリシン、フ
ェニルグリシン、β−アラニン、アラニン、およびフェ
ニルアラニンが挙げられる。AA_cは、ペプチド結合を通
じて、式（１）の化合物の残りの部分に結合している。

本発明の化合物において、Glyをフェニルグリシンで
置き換えると、その部位の疎水性および嵩高さが増大
し、その結果、πクラスのイソ酵素（例えば、ラット７
−７）に対する特異性が高くなる。Gly部位におけるA1a
およびβ−A1aの使用によって、μクラスのイソ酵素
（例えば、ラット３−３および４−４）に対する特異性
が高い吸着体が生産される。A1aからβ−A1aへのシフト
は、骨格の長さを増加させる変更であり、その結果、μ
クラスの異なるイソ酵素で、結合に差がでる。

Ｘが置換されたベンジルである本発明の化合物に関し
て、式（１）の遊離酸または塩のいずれの形態であって
も、あるいはエステル形態、アミド形態、またはシクロ
アミド形態のいずれの形態としても、ヒトGSTの種々の
サブタイプに対する特異性は、ベンジル部分のパラ置換
基を変えることによって制御し得る。ｔ−ブチルまたは
メチルあるいはベンジルのような疎水性のパラ置換基を
含むＸの実施態様は、GST−M1a−1aのようなヒトGSTの
μ（M1）クラスに優先的に結合する。パラ位におけるニ
トロまたはクロロのような電子吸引性置換基は、π（P1
−１）酵素に優先的に結合する。ハメットのσ／メタ値
をイソ酵素結合のlog分率に対してプロットすると直線
の相関が示されるが、σ／パラ値を用いると明確な相関
は現れない。ある種の立体的な嵩高さはGSTへの結合に
一般的に必要であるように思われる。非置換またはフッ
素置換基のみを有するベンジル置換基は、あまり結合し
ない。

Ｘが非置換のヒドロカルビル（１〜20C）部分である
本発明の化合物に関して、式（１）の遊離酸または塩の
いずれの形態であっても、あるいはエステル形態、アミ
ド形態、またはシクロアミド形態のいずれの形態として
も、ヒトGSTの種々のサブタイプに対する特異性は、Cys
部分のイオウ原子上の置換基の疎水性（例えばｎ−アル
キル付加物の長さ）を変えることによって制御し得る。
一般に、GSTについての結合強度はアルキル基の鎖長に
つれて増加するが、鎖長の増加につれてイソ酵素の選択
性の変化が生じる。３個または４個の原子を有するＳ−
アルキル鎖を含むＸの実施態様は、ヒトGSTのμクラ
ス、特にGST−M1a−1aを優先的に阻害する。５個から８
個の炭素を含むアルキル基の範囲においては、αおよび
μクラスのヒトGSTは、ほぼ同程度阻害され、そしてヒ
トのπクラスのイソ酵素と比較して選択的に阻害され
る。最後に、Ｓ−ノニルおよびＳ−デシルのGSH誘導体
については、３つのクラス全てからのヒトGSTが、ほぼ
同程度阻害される。

本発明の化合物は、アルキルエステル、アルケニルエ
ステル、またはアリールアルキルエステル、あるいはア
ルキルタイプアミド、アルケニルタイプアミド、または
アリールアルキルタイプアミドを包含し得、あるいはア
ミド環式形態であり得る。遊離カルボキシルのアルキル
タイプエステルは、メタノール、エタノール、イソプロ
パノール、ｔ−ブタノール、ｎ−ヘキサノールなどのよ
うな直鎖および分枝鎖および環状のアルキルアルコール
（１〜10C）のエステルである。アルキルタイプアルコ
ールの炭素鎖は１個または２個の非隣接のヘテロ原子
（すなわち、Ｎ、Ｏ、またはＳ）で区切られていてもよ
い。例えば、アルキルタイプアルコールには、N,N−ジ
メチルエタノールアミンおよび２−（１−ヒドロキシ−
２−エチル）−4,4,6−トリメチルテトラヒドロ−1,3−
オキサジンが包含される。適切なアルキルタイプ（１〜
10C）アミドは、メチルアミン、エチルアミン、ｎ−プ
ロピルアミン、イソペンチルアミン、およびイソヘキシ
ルアミンなどのような直鎖または分枝鎖または環状の１
級アルキルアミンのアミドである。これらの炭素鎖もま
た、１個または２個の非隣接のヘテロ原子（すなわち、
Ｎ、Ｏ、またはＳ）で区切られていてもよい。アルケニ
ルタイプのエステルおよびアミドは、少なくとも１個の
二重結合を有する対応のアミンから調製される。アリー
ルアルキルタイプのエステルは７個〜12個のＣを含み
得、そしてベンジル、２−フェニルエチル、２−フェニ
ルプロピルなどのようなフェニル−低級アルキル誘導体
を包含する。フェニル基は、非置換であり得、あるいは
本発明の化合物の性質にあまり影響を及ぼさないメチ
ル、クロロなどのような１〜２個の置換基で置換され得
る。この炭化水素鎖もまた、１個または２個のヘテロ原
子で区切られていてもよく、そして複素環式芳香族系も
また包含され得る。これらのエステルおよびアミドは、
式（１）の基質化合物中の任意のアルコールまたはアミ
ノ官能基を適切に保護して、通常の方法を用いて調製さ
れる。

この化合物は、モノエステルまたはジエステルあるい
はモノアミドまたはジアミド（あるいはAA_cの選択に応
じて、トリエステルまたはトリアミド）のいずれとして
調製されてもよいことに留意すべきである。従って、本
発明は、カルボキシル基のうち１個のみがエステル化さ
れているエステル、２個のカルボキシル基がエステル化
されているエステル、またはすべてのカルボキシル基
（２個より多い場合）がエステル化されているエステル
を包含する。同様の実施態様が、対応のアミドにも適用
できる。さらに、この化合物は、１個のカルボキシルが
エステルであり他方がアミドである混合エステル／アミ
ドとして調製され得る。

本発明の化合物の塩は、水酸化ナトリウムまたは水酸
化カリウムのような無機塩基、またはカフェインまたは
ピペリジンのような有機塩基から形成されて遊離カルボ
キシル基の塩基性塩を形成し得、あるいは、有機酸また
は無機酸から形成されて遊離アミノ基の酸付加塩を与え
得る。従って、この塩は水酸化ナトリウム、水酸化カル
シウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなど
のような無機塩基の塩、またはトリメチルアミン、ピリ
ジン、ピリミジン、リジン、カフェインなどのような有
機塩基の塩であり得る。酸付加塩は、塩酸、臭化水素
酸、硫酸、リン酸などのような無機酸から形成され得、
あるいは酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン
酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、安息香
酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸などのような有
機酸から形成され得る。

塩は、標準的なプロトコルで、適切な塩基または酸で
約０℃から約100までの温度（好ましくは室温）におい
て、水単独中で、または水と相溶性の不活性な有機溶媒
（例えば、メタノール、エタノール、またはジオキサ
ン）を水と組み合わせた中で、処理することによって、
形成される。

式（１）の化合物の環状形態は、基質化合物に含まれ
る遊離のアミノ基と遊離のカルボキシル基とを架橋する
ことによって調製される。環状化合物の形成は、常法に
従い、ジシクロヘキシルカルボジイミドのような脱水剤
を用いて、当該分野で本質的に公知の手段によって処理
することによって行われる。必要があれば適切な保護を
行う。

式（１）の化合物の大部分の実施態様において、シク
ロアミドはＹ上のアミノ末端に存在する遊離のアミノ基
と、AA_cで表されるカルボキシル末端のカルボキシル基
との間で形成される。しかし、AA_cが側鎖アミノ基を含
むような限定された実施態様（例えばAA_cがリジンであ
るような実施態様）においては、AA_cの側鎖のアミンと
Ｙの側鎖のカルボキシルを用いて、別の形態のシクロア
ミド化合物もまた調製され得る。当該分野で公知のよう
に、適切な保護基を用いて直接シクロアミド化が行われ
得る。

本発明の化合物は、Ｙ−CO、ｎ、Ｘ、Ｚ、およびAA_c
の内容を示すことによって、さらに特徴付けられ得る。
「Ｙ−CO」の種々の実施態様には、γ−Glu、β−Asp、
Glu、Asp、γ−Glu−Gly、β−Asp−Gly、Glu−Gly、お
よびAsp−Glyが包含され、これらは、１文字アミノ酸コ
ードでは、それぞれ、γＥ、βＤ、Ｅ、Ｄ、γＥ−Ｇ、
βＤ−Ｇ、Ｅ−Ｇ、およびＤ−Ｇとして表し得る。Ｘに
よって示される種々の置換基は標準的な略号によって表
記され得、本発明の化合物のトリペプチドアナログへの
その導入は、ｎ＝１かつＺがＯのときＣ（Ｏ）（Ｘ）、
またはＺがＳのときＣ（Ｘ）、またはｎ＝２のとき（Ｚ
はＳでなければならない）Ｃ（Ｘ）（Ｘ）、またはｎ＝
３のとき（ＺはＣでなければならない）Ｃ（Ｘ）（Ｘ）
（Ｘ）によって表される。しかし、ＸがＨのとき、Ｈま
たはH₂で表して表記することは絶対にしない。ｎが２に
等しい式（１）の化合物においては、システイン残基の
イオウは正の電荷を有し、そしてスルホニウムイオンと
して存在する。

ＺがＯの化合物としては、例えば、γ−グルタミル−
（ｏ−ヘキシル）セリニル−グリシン、γ−グルタミル
−（ｏ−オクチル）セリニル−グリシンなどが挙げられ
る。ＺがＣの化合物としては、例えば、γ−グルタミル
−ヒスチジニル−グリシン、γ−グルタミル−（π−ベ
ンジル）ヒスチジニル−グリシン、およびγ−グルタミ
ル−α−アミノオクタノイル−グリシンなどが挙げられ
る。ＺがＯまたはＣの化合物は、Ｚ位にＳを含む化合物
よりも酸化に対してより抵抗性である。

AA_cについての表記もまた、標準的な１文字アミノ酸
略号または遺伝子でコードされないアミノ酸についての
他の適切な略号で行われ得る。

従って、この表記を用いると、式（１）の適切な化合
物には： γＥ−Ｃ（Bz）（Me）−G,βＤ−CH₂（Trt）−A,γＥ
−Ｃ（ｐ−ClBz）−G,E−Ｃ（Pr）（Me）−V,γＥ−CH
（Me）（ｐ−NO₂Bz）−PG,γＤ−Ｃ（Hx）−PG,γＥ−
Ｃ（ｐ−MeBz）−V,E−Ｇ−Ｃ（Bz）（Et）−4ABu,γＥ
−Ｃ（Ｏ）（ｐ−BuBz）−βA,D−Ｇ−Ｃ（Hx）−F,γ
Ｅ−Ｃ（ｐ−MeOBz）−βA,γＥ−Ｃ（Hx）（Me）−N,
γＥ−Ｃ（Ｏ）（ｐ−EtSBz）−PG,γＥ−Ｃ（Ｏ）（Tr
t）−N,γＥ−Ｃ（ｐ−Me₂N−Bz）−βA,γＥ−Ｃ（ｏ
−BuBz）−PG など、ならびに環状形態またはエステル化／アミド化形
態が包含される。

本発明の化合物の特徴 本発明の化合物は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ（GST）のようなグルタチオンを基質として利用
する酵素の、溶液相または固定化インヒビターとして有
用である。このような阻害は、分析および治療の両方の
状況において所望され得る。

治療剤としては、エステル化された本発明の化合物が
最も有用である。このような親水性の低い形態によっ
て、細胞膜の透過が最も達成されるからである。従っ
て、適切なアミドまたはエステル／アミドハイブリッド
もまた使用され得る。特に好ましいエステルはベンジル
エステルおよびベンジルエステルの誘導体である。エチ
ルエステルもまた好ましい。

しかし、細胞内効果は、本発明の化合物の非エステル
化形態の生成に依存すると考えられている。

本発明の化合物はジカルボン酸であるので、ジエステ
ルが好ましい形態である。いくつかの例では、代謝はモ
ノエステルを通じて進行するようである。とはいえ、活
性形態は細胞内では非エステル化形態であると考えられ
る。しかし、Welner,W.P.ら、Proc Natl Acad Sci USA
（1984）81:4732−4735;Anderson,M.E.ら、Arch Bioche
m Biophys（1985）239:538−548;Tsan,M.−F.ら、J App
Physiol（1989）66:1029−1034に記載されているよう
に、グルタチオン自体の取込みはエステル化によって阻
害されるようである。おそらく、これはグルタチオンそ
れ自体についてのアミノ酸取込みチャンネルの使用に起
因すると思われる。他方、Lo,T.W.Cら、Biochem Pharma
col（1992）44:2357−2363は、グリオキサラーゼインヒ
ビターのジエチルエステルが腫瘍細胞に透過し得ること
を見いだした。

従って、細胞培養におけるインビトロでの使用、例え
ばスクリーニングアッセイでの使用のためには、好まし
い本発明の化合物はエステル化形態である。このこと
は、無血清培地中の２×10⁵細胞/mlをジエチルエステル
に４時間曝した後のHT−29細胞に対する毒性に関して、
ジカルボン酸形態の場合とは対照的に劇的に示される。
この特徴を例証するために、４種のモデル化合物が使用
された。これらの４種の化合物は以下の通りである： １）γ−グルタミル−Ｓ（オクチル）−システイニル−
グリシン（略号「オクチルＧ」）は、ジカルボン酸形態
の場合、IC₅₀＞200μＭである；ジエチルエステルにつ
いてはIC₅₀は22μＭである； ２）γ−グルタミル−Ｓ（ヘキシル）システイニル−Ｒ
（−）−フェニルグリシン（略号「ヘキシルPG」）はジ
カルボン酸形態では、IC₅₀＞200μＭであるが、ジエチ
ルエステルはIC₅₀が24μＭである； ３）γ−グルタミル−Ｓ（ベンジル）システイニル−Ｒ
（−）−フェニルグリシン（略号「ベンジルPG」）もま
た遊離の酸形態ではIC₅₀＞200μＭであるが、ジエチル
エステルはIC₅₀が47μＭである； ４）γ−グルタミル−Ｓ（ナフチル）システイニル−グ
リシン（略号「ナフチルＧ」）はIC₅₀＞200μＭである
が、ジエチルエステルはIC₅₀が40μＭである。

上記のIC₅₀の値は上述のように測定され、そして細胞
は、後述の実施例11に記載される改変されたクローン原
性（clonogenic）アッセイを用いてアッセイされた。

さらに、エステルもアミドも両方とも、本発明の化合
物を、治療剤、診断薬、および固体支持体へのカップリ
ングのためのリガンドとしてのその適応性に影響を与え
るような様式で改変するための機会を提供する。エステ
ル基またはアミド基は、細胞透過性を増強するに有用な
疎水性部分のようなさらなるリガンド、他の基質との結
合を容易にする反応性基、および抗体またはそのフラグ
メント、免疫原性を増大させるキャリアなどのようなさ
らなるリガンドを含み得る。さらに、この化合物は、固
定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによ
る精製を容易にするキレート剤のような置換基、または
ペプチドの溶解性を変化させるかあるいは薬物動態に影
響を与える置換基（例えば、ポリエチレングリコールの
付加）を導入することによって改変され得る。

従って、式（１）の化合物のエステルまたはアミド
は、種々の状況において、遊離酸または塩の形態とは異
なる利点を提供する。

式（１）の化合物のシクロアミド形態は、標的GST間
の特異性および選択性を増大させるという利点を提供す
る。環状形態は、一般に、開環鎖状形態よりもクロマト
グラフィーのリガンドとして優れている。さらに、これ
らの阻害特性はこの特徴によって調節される。

Ｘの実施態様として置換されたベンジルを含む本発明
の化合物は、種々のGSTに対するこの化合物の選択性を
系統的に制御する機会を提供するという点で利点を有し
ている。例えば、本明細書の実施例８に示されるよう
に、ヒトGSTのμグループおよびπグループ間の結合特
異性は、本発明のある種の化合物のCys残基のイオウ原
子に結合したベンジル部分上のパラ置換基の性質によっ
て制御される。結合特異性とＳ−ベンジルCys部分のパ
ラ置換基のσ（メタ）値との間には相関がある。

上記の４種の好適な化合物は、GSTイソ酵素に関して
明らかな選択性を示す。これらの化合物はいずれも、グ
ルタチオンレダクターゼ（ここでGSSG還元はNADPHの消
失によって測定される）またはγ−グルタミルトランス
ペプチダーゼ（ここでグルタミルｐ−ニトロアニリン
（ｐ−nitroanaline）由来のグルタミルのグリシルグリ
シンへの転位が評価される）のいずれをもあまり阻害し
ないことを示した。これらのテストにおいて、４種の化
合物すべて（ならびにエタクリン酸）が1mMを超えるIC
₅₀を有していた。しかし、これらの４種の各化合物がGS
Tイソ酵素を阻害する能力に関してはかなりの差異が見
いだされた。GSTイソ酵素であるP1−１、A1−１、M1a−
1a、およびM2−２をこれらの化合物に関してテストする
と、選択性の差異が明らかになる。ベンジルPGおよびヘ
キシルPGは他の３種のイソ酵素と比べてP1−１を選択的
に阻害したが、ヘキシルPGはA1−１に関してかなりの阻
害を示した。従って、ベンジルPGはP1−１に関してのKi
がわずか0.4μＭであることを示したが、残りのA1−
１、M1a−1a、およびM2−２に関しての対応するKi値は
それぞれ、20、25、および31μＭであった。ヘキシルPG
はP1−１に関してKiが0.85μＭと測定されたが、残りの
酵素については、順に、Ki値は、それぞれ5.8、41、お
よび97であった。

他方、ナフチルＧはM1a−1aに関してのKiはわずか0.1
μＭであることを示したが、P1−１、A1−１、およびM2
−２についての値は、それぞれ1.2、4.2、および1.5μ
Ｍであった。オクチルＧは明らかにA1−１について選択
的であり、M1a−1aについて1.2μＭでありP1−１につい
ては1.9μＭであるのに比べて、Ki値は0.27μＭであっ
た。３種すべてのイソ酵素に関するエタクリン酸につい
てのKi値を比較すると、P1−１について4.0μM;A1−１
について2.0μM;およびM1a−1aについて3.0μＭであ
る。

従って、ベンジルPGおよびヘキシルPGは、テストされ
た他のイソ酵素を除外して、特にP1−１のインヒビター
として有効である。ナフチルＧはM1a−1aについて選択
的であり、そしてオクチルＧはA1−１について選択的で
ある。

従って、本発明の種々の化合物の中から、所望の標的
GSTについて選択的なアナログを見いだし得ることが明
らかである。以下の実施例において反映されているよう
に、その結果、化学療法剤の性質およびその関連する解
毒機構ならびに標的細胞のGSTコンプルメントに応じた
治療プロトコルを設計する能力が得られる。

クロマトグラフィーリガンドおよび分析試薬としての使
用 本発明の化合物はまた、個々に、診断的なクロマトグ
ラフィー支持体およびクロマトグラフィーツールとして
有用である。これらの化合物を、特徴付けおよび精製の
ためのアフィニティークロマトグラフィー、ならびに診
断的アッセイに使用することはヒトGSTの場合には特に
重要である。本発明の化合物のパネルは組織内のGSTコ
ンプルメントを測定するために最も便利であるが、個々
の化合物は、一般的にGSTの存在を検出するため、また
はヒトにおいて特定のタイプのGSTの存在を検出するた
めに有用であり得、同様に特定のタイプのヒトGSTの精
製のためにも有用であり得る。従って、後述の実施例８
に示されるように、本発明の種々の化合物は、ヒトGST
のμ（M1）およびπ（P1）クラス、ならびに種々のラッ
トイソ酵素に結合する傾向が異なる。さらに、実施例９
に示されるように、本発明の化合物は特定のヒトGSTの
選択的な溶液相での阻害も示す。大部分の場合、本発明
の各化合物について、アフィニティークロマトグラフィ
ーおよび阻害の研究は、同様の酵素特異性を示す。

本発明の化合物、または遊離酸または塩としての式
（１）の化合物単独は、リガンドの選択に依存して、ヒ
トGSTを総体的に精製および特徴付けるためのクロマト
グラフィーのリガンド、ヒトのGSTのクラスの精製およ
び同定のためのクロマトグラフィーのリガンド、あるい
は個別のヒトGST酵素の精製または分離のためのクロマ
トグラフィーのリガンドとして使用され得る。

クロマトグラフィーの支持体上のアフィニティーリガ
ンドとして使用するためには、式（１）を含む化合物
は、標準的なカップリング技法を用いて、セファロース
（Sepharose）、ポリアクリルアミド、シリカなどのよ
うな適切な固体マトリックスにカップリングされる。本
発明の非環式形態の化合物は、少なくともアミノおよび
カルボキシル官能基を含む。この官能基は、適切なリン
カーに誘導体化され得、あるいは直接支持体にカップリ
ングされる。固体支持体の性質に応じて、アフィニティ
ーリガンドのカップリングは、直接的な共有結合を使用
し得、あるいはホモまたはヘテロ二官能性リンカー（例
えば、Pierce Chemical Company（Rockford,IL）から入
手可能）の使用を必要とし得る。アフィニティーリガン
ドをより接近しやすいものとするために、アフィニティ
ーリガンドを支持体の表面から遠ざけることもまた所望
され得る。このように遠ざけることは、一般に理解でき
るようにスペーサーアームを用いて達成され得る。さら
に、支持体は、特に、その支持体が生物学的試料のクロ
マトグラフィーのために使用される場合、所望されない
相互作用を最小にするために、例えばヒト血清アルブミ
ンのような不活性物質で処理され得る。

誘導体化されたクロマトグラフィー支持体は、固体支
持体に１種を超えるこのようなリガンドをカップリング
させることによって、式（１）の構造を含む化合物の多
様性の利点を享受し得る。さらに、クロマトグラフィー
用途において、本発明の化合物の組み合わせが使用され
得る。このクロマトグラフィー用途において、アフィニ
ティーリガンドとして作用する１種またはそれ以上の化
合物と、アフィニティーリガンドと競合するために使用
される１種またはそれ以上の化合物との間でのバランス
がとられ、クロマトグラフィーによる分離または特徴付
けに供される物質の溶離がもたらされる。後述の実施例
10に例示されるように、クロマトグラフィー技法に供さ
れる部分に対する異なるアフィニティーを有する物質
が、リガンドおよび溶離剤として使用される。

式（１）を含む化合物に誘導体化されたクロマトグラ
フィー支持体は、次いで、このリガンドがアフィニティ
ーを有するヒトGSTまたは他の酵素、グルタチオンを基
質として使用する他の酵素、グルタチオンと反応する抗
体、またはこのリガンドに対して中程度のアフィニティ
ーで結合する他の部分の、分取分離のために使用され得
る。本発明の化合物にカップリングしたクロマトグラフ
ィー支持体はまた、診断において使用され、グルタチオ
ンと構造的に類似した物質を含むと推定される生物学的
試料または他の試料中の物質の存在、非存在、量、また
は性質を測定し得る、例えば、後述の実施例10に例示さ
れるように、新規なHPLC法において本発明の化合物を用
いるアフィニティークロマトグラフィーは、GSTイソ酵
素を、二量体の生物活性形態で、肝臓のようなヒトの組
織から単離および分離するために使用され得る。

このような分離または分析に有用な、式（１）の構造
を含む適切な化合物は、分析物または分取が所望される
物質の性質から明らかであり得、あるいはこの化合物の
多様なパネルを調製し、そして最も効果的なアフィニテ
ィーリガンドについてこのパネルをスクリーニングする
ことによって容易に決定され得る。

式（１）の構造を含む化合物はまた、ヒトGSTの存在
または非存在を一般的に検出するため、あるいは特定の
クラスまたはそのイソ酵素を検出するためにも使用され
得る。このようなアッセイのためのプロトコルはイムノ
アッセイで用いられるプロトコルと似ている。特異的な
結合パートナーが関与し、ここでアッセイの特異性が結
合の特異性に依存するような任意のアッセイに対して、
このようなプロトコルは一般に適用可能である。従っ
て、このようなアッセイにおいて、式（１）の構造を含
む化合物は、分析物（この場合、対応するGST）に対し
て特異的な抗体または他の免疫反応剤としての役割を果
たす。このようなプロトコルとしては、サンドイッチア
ッセイ、競合アッセイ、直接結合アッセイなどが挙げら
れ、これは、「免疫複合体」（この場合、GSTと式
（１）の構造を含む化合物との複合体）の形成について
の多様な検出手段を伴う。このような検出手段として
は、蛍光タグ、酵素標識、放射性標識、およびこれらの
組合せが挙げられる。

パネル 本発明のパネルは、少なくとも５種の多様な式（１）
のグルタチオンのトリペプチドアナログで構築され、こ
こでＸ、AA_c、およびＹは上で定義された通りである
が、ＸはＨであってもよい。このパネルは、特性が最大
限に多様である場合に、最も有用である。この多様性
は、Ｙ、AA_c、およびＸの性質を変えることによって供
給され得る。一般に、例えば、異なる疎水性のＸ置換基
を使用することによって、ある範囲のこのような疎水性
特性が得られ得る。Ｘはまた、得られる化合物のハメッ
ト定数（σ／メタおよびσ／パラ）の多様性のバリエー
ションのために便利な置換基である。AA_cのバリエーシ
ョンから得られる多様性はいくぶん重要性が低い。Ｙの
バリエーションによって提供される多様性はその構造が
限られていることによって限定される。

ハメット定数は、置換基が安息香酸のイオン化定数に
与える電子的影響を示すことで得られる値に類似した値
を意味する。この初期の研究の結果、異なる置換基の多
くの列に対して数値が割り当てられた。種々の置換基に
ついてこのような値の表が、例えばRitche,C.D.ら、Pro
g Phys Org Chem（1964）２:323によって与えられてい
る。

本発明のアナログのシリーズの構築は、このパラメー
ターを、例えば、Ｘの実施態様としてはベンジル基を用
い、これをさらに別の置換基（例えば、ニトロ、クロ
ロ、メトキシ、またはメチル）でパラ位を置換すること
によって、系統的に変化させることによって成し得る。

パネルのメンバーである式（１）の化合物の立体的な
性質およびその結果得られる特性はまた、パネルの１種
またはそれ以上のメンバーの環化によって制御され得
る。

例えば、適切な２次元パネルを形成する本発明のグル
タチオンアナログトリペプチドの２次元マトリックス
は、AA_c成分を小さい疎水性残基から、大きい疎水性残
基、正に荷電した残基、中性残基、および最終的には負
に荷電した残基へと変化させる（このようにして、最後
の３つのアナログは誘起電子効果に影響を与える）こと
によって構築され得る。同様に、Ｘ置換基を、第２の次
元において同様の範囲で、小さい疎水性基から、大きい
疎水性基、正に荷電した基、中性基、負に荷電した基へ
と変化させ得る。得られるマトリックスは、例えば、吸
着体として使用するに適した化合物を決定するために使
用される適切なパネルを提供する。

Ｘの特に有用な実施態様は、置換ベンジルであり、こ
こでパラ置換基の疎水性と電子供与性または電子吸引性
のバリエーションは、所定のクラスのヒトGSTに対する
結合能力と系統的に相関する。

本発明のパネルの使用 このパネルは、（所望されない細胞または組織に比べ
て）正常な細胞または組織に生じるグルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ（GST）イソ酵素の異なるコンプル
メントを測定するために有用である。「GSTコンプルメ
ント」とは、このような細胞または組織に存在するGST
イソ酵素のレベルのパターンを意味し、あるいはこのよ
うなGSTの発現レベルの誘導または抑制が操作され得る
ような様式で遺伝的にプログラムされているものを意味
する。上記の背景の項で説明しているように、GSTは少
なくとも７個が周知であるサブユニットから形成される
ホモ二量体またはヘテロ二量体である。さらに、これら
のイソ酵素は大まかにクラス分けされているとはいえ、
各クラス内の個々のメンバーは遺伝的バリエーションに
依存して個体ごとに異なり得る。この種々のイソ酵素の
特性は、測定可能な一連のパラメータ（基質特異性、阻
害され易さ、特定の試薬への結合、および発現の誘導可
能性（inducibility）を包含する）に関して異なってい
る。

GSTプロフィールを測定するための本発明のパネルの使
用−−背景 おそらく、未知の組織試料のGSTイソ酵素コンプルメ
ントを測定するための最も理解し易いアプローチは、既
に測定されたかあるいは測定され得る反応性プロフィー
ルを有するすべてのGSTイソ酵素のリファレンスセット
を仮定することである。従って、例えば、任意の分離技
法（例えば、高分離能クロマトグラフィーフォーカシン
グに類似した）を用いた分離能が充分高い分離を仮定す
ると、溶出パターンは、一連の既知の酵素に対して参照
される。既知のイソ酵素を分離しそして特徴付ける別の
方法は、特定のイソ酵素に対して調製された抗体（例え
ばいくつかのGSTヒトイソタイプに対して樹立された抗
体）の使用を伴い、そして候補となる組織におけるこれ
らのイソタイプのGST含量を評価するために使用され得
る（Howie,A.F.ら、Carcinogenesis（1990）11:451−45
8;Beckett,G.J.Clinica Chimica Acta（1984）141:267
−273）。ゲル電気泳動による分離もまた使用され得
る。未変性条件下における電気泳動後のGSTバンドの位
置は、例えば、Ricci,G.ら、Anal Biochem（1984）143:
226−230の方法によって決定され得る。クロマトグラフ
ィーによる分離の結果得られる種々のイソ酵素の位置
は、１−クロロ−2,4−ジニトロベンゼン（CDNB）のよ
うな、すべてのイソ酵素に共通の基質を用いて検出され
得る。実際、種々の組織におけるCDNBによってアッセイ
される活性の分布は、Pickett,C.B.、およびLu,A.Y.
H.、Ann Rev Biochem（1989）58;743−764によって行わ
れている。

これらのイソ酵素が各々、個々のイソ酵素を活性を維
持したまま単離することができる分離技法の後に反応性
プロフィール（この反応性プロフィールは予め測定され
ている）を有しているのであれば、目的とする細胞およ
び組織中のGSTイソ酵素の分布のパターンを得るための
これらの直接的な分離法の使用は、このような細胞およ
び組織についてのGSTコンプルメントを得るために用い
られ得、これは治療法の設計に有用であり得る。このよ
うな反応性プロフィールは、有効な基質である物質、有
効なインヒビターである物質、およびGST活性の有効な
インデューサーまたはアクチベーターである基質を考慮
に入れる。一旦、GSTイソ酵素が溶出パターンまたは電
気泳動ゲルにおける位置によって同定および定量される
と、処置プロトコルを予想または設計するために、例え
ば、既知のそして予め単離されたイソ酵素の反応性プロ
フィールに対する参照が行われる。

この方法は、容易に理解できるが、コンプルメントに
含まれる可能性のある候補であるGSTイソ酵素の数が多
いため、そしてGSTイソ酵素のレパートリーがそれ自体
変異しやすいため、実際的ではない。従って、入手可能
なGSTイソ酵素の集団における多型性の結果、例えば溶
出パターンにおける移動度は変わらないが、基質特異性
または阻害パターンが変化したタンパク質（またはその
逆）となりやすい。いずれの場合でも、溶出パターンに
おける位置をリファレンス特性のセットとマッチングし
た結果は、間違いやすい結果を与える。

複数の分離技法を使用することによって、いくぶん改
善された結果が得られ得る。複数の分離系において移動
度が影響されないということは、単独の場合に比べて可
能性が低いからである。このような系は単純な仮想系に
よって一般に説明される。この仮想系において、第１の
吸着体であるP1は、その溶出パターンにおいて４本のイ
ソ酵素ピークを生じ、そして第２の吸着体であるP2では
５本のピークが得られる。もし、基質特異性パターン
（例えば基質Ａ、Ｂ、およびＣについて）によって、P1
からの所定のピーク（例えば、1.2で示される）が、吸
着体P2上で分離される特定のピーク（ピーク2.4）と実
質的に同じ基質プロフィールであることが示唆されるな
らば、吸着体P1において1.2にピークを与え、そして吸
着体P2において2.4ピークを与える組織試料は、ピーク
1.2およびピーク2.4を形成するイソ酵素と同じ反応性プ
ロフィール（Ａ、Ｂ、およびＣに対する）を有する可能
性が高い。

この仮想系によって説明される技法は、本発明の新規
なグルタキオントリペプチドアナログまたはこのような
新規なトリペプチドと別のアナログまたは多様な特性を
有する類似のグルタチオンアナログのパネルとの組合せ
をアフィニティー吸着体として用いて、適用され得る。
有効な特徴付けを行うためには、少なくとも２つ、好ま
しくは３つ、そしてより好ましくは５つのこのようなア
ナログを使用すべきであると考えられる。パネルのメン
バーは、コンプルメント中の種々のGSTイソ酵素の中で
の識別を確実にするに充分な多様な特性を有しているべ
きである。

この分離技法が酵素活性を保持するならば、可能性の
ある薬剤に対する各酵素の反応性を直接的に測定し得
る。しかし、当該分野における未変性分離は、分離能の
欠如、または構造の変化に対する過敏性のいずれかの影
響を被り、その結果、ピーク同定は、治療の有効なガイ
ダンスとしては問題が多すぎるものとなる。例えば、イ
オン交換クロマトグラフィーは個々のGSTイソ酵素の精
製のための工程して使用し得るが、分析ツールとしては
分離能不充分または不適切である。IEFは当該分野で使
用可能な別の技法であるが、インビボまたはインビトロ
でのタンパク質の翻訳後修飾に起因する多数の異物（ex
traneous）ピークを生じる傾向にあり、そしてこのよう
な構造変化と機能的バリエーションとの間の必要なつな
がりが存在しない。

このように、従来技術の方法を用いて個々のイソ酵素
を分離し、そしてこれらのそれぞれについてすべての可
能性のある化学療法薬剤に対する活性プロフィールを測
定することによる細胞または組織中のGSTコンプルメン
トの活性プロフィールの測定は、手間がかかるが、しか
し本発明の新規なGSHアナログトリペプチドの有用性に
よって改善される。本発明の化合物は、GST酵素を変性
することを必要としない分離を可能にする。

最も効率的なアプローチは、GSTイソ酵素コンプルメ
ントのプロフィールの利点を利用し、これは特異的結合
活性および反応性の特性を同時に測定する。これらのプ
ロフィールは、調査特性プロフィール（survey of char
acteristics profiles）、すなわち「SC」プロフィール
を意味し、SCプロフィール（これは基質特異性における
情報、特異的インデューサーに対する応答における誘導
など、ならびにさらなる結合特性または電気泳動移動度
の特性を包含する）のリファレンスセットの測定を可能
にする。コンピューターを用いた方法をこれらのプロフ
ィールの比較に適用することによって、治療的モジュレ
ーターおよび付随するプロトコルの設計のために必要と
される情報、および提案されたプロトコルが成功するか
失敗するかを予想するために必要とされる情報が、従来
技術の方法よりも相当に多数の検体について得られ得
る。このような多数の検体についての情報は、治療の適
切なガイドを提供するために必要とされる。これらのパ
ラメータの中でも、SCプロフィールを得るために使用さ
れ得るパラメータは、本発明のトリペプチドGSHアナロ
グのパネルのメンバーに結合する能力、またはこのよう
なパネルメンバーが活性に及ぼす影響である。

細胞および組織の未知試料のGSTコンプルメントを測
定するためのこのアプローチにおいて、パターン認識技
法の利点が利用される。このアプローチに関連して、本
明細書においてSCプロフィールと呼ばれるものが、種々
のGSTイソ酵素と特異的かつ識別的に反応する試薬のパ
ネルに関して一般に測定される。これは、交差反応イム
ノアッセイによって得られるプロフィールの測定と類似
しており、そして候補であるGSTイソ酵素またはイソ酵
素混合物の試薬パネルに対する反応性の任意のパターン
を参照する。従って、SCプロフィールは、種々の基質に
ついての代謝回転速度；種々のインヒビターについての
インヒビター濃度の有効レベル；特定の宿主細胞につい
てGSTイソ酵素のための遺伝子の発現を誘導するために
必要とされるインデューサーのレベル；インヒビターま
たは基質の存在下または非存在下における電気泳動での
移動度；パラログまたは他のアフィニティーカラムから
の溶出時間；または実際には、抗体パネルに対する古典
的な結合パターンに関して測定され得る。個々のGSTイ
ソ酵素またはイソ酵素混合物について種々の濃度レベル
で得られるSCプロフィールは、本明細書で記載される種
々の方法で操作され得、未知試料のSCプロフィールを比
較し得るリファレンスセットを提供する。

一般に、SCプロフィールは、「情報チャンネル」の各
パネルについての値を提供する。ここで各情報チャンネ
ルは、GSTコンプルメントまたはGST標準の特性（例え
ば、抗体への結合アフィニティー、基質アフィニティ
ー、溶出時間など）を記述する。この情報チャンネルの
少なくともいくつかは、GSTの濃度と共に変化する値に
関連すべきである。

細胞または組織についてのGSTコンプルメントの測定
は、それ自体、診断および試料の特徴付けに有用であ
る。さらに、所望されない組織を弱体化しまたは破壊す
るための戦略の実施態様の設計に使用するためには、正
常組織と所望されない組織との間の活性の差異を測定し
得るように、SCプロフィールはGST活性に関連する情報
を提供しなければならない。従って、所望されない組織
のSCプロフィールは、リファレンス標準と容易に比較可
能でなければならない。このリファレンス標準は、治療
的モジュレーターの設計および薬剤またはプロドラッグ
の選択の補助となる反応性パターンに、少なくともある
程度基づいていなければならない。この用途のために
は、リファレンスプロフィールの少なくとも一部は、基
質代謝回転速度のデータ、阻害のデータ、またはイソ酵
素産生レベルの誘導に関連するデータ、あるいはインサ
イチュでのGSTイソ酵素の操作を可能にする任意の他の
反応性を基礎としていなければならない。本発明のパネ
ルは活性におけるこのような効果を測定するために用い
られ得る。本発明の新規化合物を使用したクロマトグラ
フィー分離（これは活性の保持を許容する）と、これら
の標準についての反応性に影響する試薬に関するSCプロ
フィールの調製との組合せは、必要とされるデータを得
るための１つのアプローチである。

リファレンス標準および未知試料のSCプロフィール
は、「特異的に反応性の試薬」のパネルに関して測定さ
れ得る。これらの試薬は、パラログ、基質、インヒビタ
ー、インデューサー、抗体を包含する種々の物質、なら
びにゲル電気泳動またはアフィニティークロマトグラフ
ィー（ここで反応性の程度は電気泳動の移動度または溶
出時間として測定される）のような実際は技法である
「試薬（reagent）」を包含する。このように、「特異
的に反応性の試薬」は化学反応をもたらす試薬に限定さ
れず、この試薬に関して試料について得るべき特有のパ
ラメータを与える任意の試薬または技法を包含する。

もちろん、本発明のアナログのパネルは、結合剤、ク
ロマトグラフィー支持体として、または溶液中での酵素
作用のインヒビターとしてのいずれかとしての「特異的
に反応性の試薬」として、使用され得る。GSTによって
触媒される酵素反応を阻害する、このパネルのメンバー
としてのこれらの化合物の比較能力は、（このトリペプ
チドアナログをアフィニティーリガンドとして含むカラ
ムからの溶出パターンのように）特有のSCプロフィール
として使用され得る。

リファレンスSCプロフィールの測定 後述するように、ある種の目的のためのリファレンス
標準は、特定の被験体の正常組織から直接的に調製され
得る。特有の反応性パターンを有する既に単離された種
々のGSTイソ酵素についてのSCプロフィールのデータバ
ンクを提供することもまた有用である。これらの反応性
パターンと所望されない組織のバイオプシー試料からの
反応性パターンとをマッチングすることによって、治療
的モジュレーターの適切な設計およびプロドラッグまた
はトキシンの選択が成され得る。

米国特許第4,963,263号および同第5,133,866号（これ
らの開示は本明細書中に参考として援用される）は、密
接に関連した物質のクロマトグラフィー分離に有用なパ
ラログアフィニティー試薬のパネルを記載している。本
発明のパネルは同様に多様である。本発明のGSHトリペ
プチドアナログを用いるパラログタイプのパネルは、種
々のGSTイソ酵素を精製された形態で（ここで各場合に
おいて、天然のイソ酵素の活性を保持しながら）分離す
るための、アフィニティー支持体の調製に便利に用いら
れ得る。従来技術の逆相HPLC法またはウェスタンブロッ
ト法とは異なり、本発明の化合物に対する親和性に基づ
くクロマトグラフィーを用いて調製される分離されたイ
ソ酵素は、天然に生じるイソ酵素と実質的に正確に類似
の様子で挙動する。次いで、このような精製されたイソ
酵素の各々について、基質または他の活性に影響する試
薬（本発明の化合物によって代表されるような）の反応
性に関するSCプロフィールを構築し得る。次に、これら
の精製されたイソ酵素に特有の多数のSCプロフィールの
有用なデータバンクを、所望されない組織から得られる
試料と比較するために、数学的にまたはコンピューター
でアクセス可能なフォームで保持および保存し得る。

トリペプチドグルタチオンアナログのパネル（そのメ
ンバーのうち少なくとも１個は、式（１）の構造を含
む）は、リファレンスセットのためのSCプロフィールを
提供する情報チャンネルのコレクションのための基礎と
して使用され得る。既知のイソ酵素特異的基質のパネル
のメンバーに対する複合体化（conjugation）またはパ
ネルのメンバーの吸着体に対する直接的な複合体化は、
結合特性の系統的な多様化をさらに増大させる。アフィ
ニティーカラムのように適切な配置の本発明のパネルを
用いて、標準のプロフィールおよび未知試料のプロフィ
ールを得て、そして比較することができる。従って、特
に有用なのは、式（１）を含む少なくとも１個のアナロ
グを含む多様なトリペプチドアナログのパネルである。
ここでＸはモノ置換またはジ置換あるいは非置換のヒド
ロカルビル（１〜20C）部分であり、このヒドロカルビ
ル部分は任意に１個または２個の非隣接ヘテロ原子
（Ｏ、Ｓ、またはＮ）を含み、そしてここで上記の置換
基はハロ、NO、NO₂、NR₂、OR、およびSRからなる群から
選択され、ここでＲはＨまたは低級アルキル（１〜4C）
であり、そして AA_cは式（１）の化合物の残りの部分にペプチド結合
を通じてカップリングしたアミノ酸である。

GSTコンプルメントの測定 一般に、細胞または組織の「未知」試料のGSTコンプ
ルメントの測定のためには、２つの異なるアプローチが
行われ得る。第１に、上記のように、当該分野で現在実
施されている一般的な技法を用いて、試料中に含まれる
個々のイソ酵素はアフィニティー支持体を用いて分離さ
れ得、そしてそれらの活性のパターンについて個別にテ
ストされ得る。試料からの個々のイソ酵素を得ることが
でき、そして次に、個別に、その基質特異性、インヒビ
ター特異性について評価され得、そしてそのイソ酵素の
活性または産生を誘導する物質を同定するために評価さ
れ得る。

第２のもっと手間の少ないアプローチにおいては、パ
ターン認識技法が使用され、個々の被験体について、所
望されない組織および正常組織のいずれかまたは両方の
試料に関して、これらのパターンを上記のようにして調
製されたリファレンスセットに対してパターンマッチン
グすることによって、瞬時の読み出し（readout）が得
られる。このアプローチにおいては、必要とされる試料
の容量はより少なく、分離は必要ではない。この方法は
また、GST活性についての組織化学的染色を用いた組織
切片に対して適用される場合にも有用である。

第１のアプローチに関して、Vos,R.M.E.ら、Biochem
Pharmacol（1988）37:1077−1082によって使用された分
離方法の改変が使用され得る。この方法において、完全
なラット肝臓に由来の細胞質ゾル画分を、１グループと
してのGSTについてのアフィニティー試薬として使用さ
れるＳ−ヘキシルGSHセファロースのアフィニティーカ
ラムに供した。溶出されたGST混合物を濃縮し、そしてm
ono−PHR 5/20カラム（Pharmacia FPLCシステム）上で
クロマトフォーカシングによって分離した。個々のイソ
酵素を別々の画分として採取し、そして分析した。溶出
プロフィールにおける位置、サブユニット分子量、およ
び１−クロロ−2,4−ジニトロベンゼン（これは既知のG
STのほとんどに対する基質である）に対する比活性によ
って、画分を同定した。

本発明の化合物の中から選択されるパラログをアフィ
ニティーリガンドとして使用することによって、より緩
和な条件を使用することができ、そしてより活性な形態
のGSTイソ酵素を回収することができる。次に、これら
を基質特異性などについてテストする。

上記のように、種々のGSTイソ酵素に特有の溶出パタ
ーンを提供するVosの技法のような任意の分離技法を単
に使用し、そして未知のGSTコンプルメントの細胞また
は組織についての溶出パターンを予め設定された（pres
et）溶出パターンとマッチングさせて、未知試料中のGS
Tコンプルメントの性質を測定することの可能性が、考
慮される。しかし、このアプローチの１つの問題点は、
GSTの遺伝的変異可能性（genetic mutability）にあ
る。そのため、推論される特性を維持し、その結果、同
様の反応性パターンを有することが保証される、信頼性
のあるマッチングを行うことは困難である。イソ酵素の
遺伝的変異可能性、ならびに翻訳後修飾に対するその感
受性は、どの特定の場合でも、基質特異性、阻害パター
ンなど、ならびに結合、および物理特性（例えば、pI）
に深い影響を与える可能性が高い。反応性の変化と物理
特性または結合の変化との間に相関が存在するという保
証はない。実際、このような効果は相関していない蓋然
性がある。上記のように、この問題は、複数のアフィニ
ティー試薬（これもまた本発明の化合物によって提供さ
れる）の使用によって軽減され得る。

パターンマッチングアプローチにおいて、もっと信頼
性のあるアッセイは、未知試料の反応性のプロフィール
をリファレンスのSCプロフィールと比較することによっ
て行われる。このアプローチを分析物の組成の決定に適
用することは、一般的に、1991年４月２日に出願された
係属中の出願番号07/678,049号に記載されており、この
開示は、本明細書中に参考として援用される。この出願
に記載されている技法によれば、既知の分析物の組成の
試料から得られるプロフィールの所定のプロットを、テ
ストすべき試料のSCプロフィールを比較し得るリファレ
ンスとして使用する。一般に、２〜10、好ましくは４〜
６の異なる特異的に反応性の試薬のパネルを最初に用い
て、既知組成の試料のプロフィールを提供する。この参
考の適用においては、特別な結合アッセイが使用され
た。ここで、結合剤のパネルと交差する候補の分析物に
よる交差反応性が存在し、そして既知の結合パートナー
の種々の分析物による結合についての阻害値の測定によ
ってプロフィールが得られた。次に、このプロフィール
のコレクションを、未知試料の対応するSCプロフィール
との読み取り可能な比較を与える多くの技法のうちの任
意の技法によって数学的に処理する。

本発明の治療方法を実施するために必要とされるGST
コンプルメントの測定に使用するために、単離されたGS
Tイソ酵素または既知の組成のその混合物のいずれか、
または両方を用いて、類似のSCプロフィールを測定し得
る。特異的に反応性の試薬は、パネルとして、少なくと
も１つの、好ましくは３つの、そしてより好ましくは５
つの、式（１）のGSHアナログを含まなければならず、
所望であれば別の試薬も含む。このような別の試薬は、
代謝回転速度が測定される一連の既知の基質を含み得
る。適切な基質の候補としては、例えば、エタクリン
酸、ブロモスルホフタレイン、クメンヒドロペルオキシ
ド、BCNU、クロラムブシル、トランス−スチルベンオキ
シドなどが挙げられる。

種々のレベルでGSTイソ酵素と相互作用するインヒビ
ターもまた、SCプロフィールを提供するパネルのメンバ
ーである特異的に反応性の試薬としての使用のために利
用可能である。これらのインヒビターとしては、例え
ば、ピリプロスト（piriprost）、チバクロンブルー、
およびヘマチンが挙げられる。種々のイソ酵素と特異的
に免疫反応性である抗体、ならびにパラログタイプのア
フィニティー試薬が用いられる。このプロフィールが治
療方針の設計の基礎を提供するためのものである場合、
パネルのメンバーのうちの少なくともいくつかは、GST
の酵素活性を説明するものでなければならない。

SCプロフィールを得るための別の技法は、Takeo,K.
ら、J Immunol（1978）121:2305−2310によって記載さ
れた方法と類似している。このアプローチにおいて、個
々のタンパク質についての種々の結合剤の存在下におけ
る識別的な（differential）電気泳動によって、移動度
の値の測定が可能となる。Takeoによって記載された特
定の適用において、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
デキストラン特異的骨髄腫タンパク質の測定が行われ、
これはデキストランを分離ゲルに添加した場合に遅延を
示し、この遅延はハプテンであるイソマルトースオリゴ
糖の添加によって逆転され得た。このアプローチの使用
において、例えば遅延剤（retarding agent）選択に依
存する一連の移動度が既知の組成について得られ得る。
本発明の新規化合物またはパネルを遅延剤または移動剤
（mobilizing agent）として使用して、この技法を適用
し得る。

バイオプシーのGSTコンプルメントを測定するための
１つの好ましい方法において、Mannervik,B.ら、Proc N
atl Acad Sci（1985）82:7202−7206によって研究され
た既知のGST基質を用いてHPLCカラムのシリーズが構築
される。これらの基質はカラムの支持体に直接結合さ
れ、あるいはAdang,A.E.Pら、Biochem J（1990）269:47
−54に記載されたGSHアナログの変種（variant）に付加
される。基質と式（１）のGSHアナログとの可能な種々
の組合せの結果得られる50〜100種の異なるカラムのシ
リーズが、吸着体の候補のシリーズを表す。これらの吸
着体を、既知のGSTイソ酵素の混合物の分離に各々使用
することによってテストして、特性の多様性が最大であ
る吸着体を選択する。次いて、識別能力が最も高い４つ
または５つのカラムを、未知試料および標準におけるSC
プロフィールを測定するためのパネルのメンバーとして
選択する。

従って、個別の各吸着体における溶出パターンとして
分離を表示するよりむしろ、各吸着体に対する吸着能力
がイソ酵素のSCプロフィールにおける情報チャンネルを
表すようにデータを再配列する。インデューサー、アク
チベーター、基質、およびインヒビターに関する反応性
パターンもまた、各イソ酵素について測定され、そして
情報チャンネルとして使用される。既知の各イソ酵素に
ついての完全なプロフィールを、次に、リファレンスセ
ットのメンバーとして使用する。リファレンスセットの
さらなるメンバーを、正常組織由来の試料を使用し、そ
して情報チャンネルの同じセットに割り当てられた値を
評価することによって決定する。次いで、未知の所望さ
れない組織由来のバイオプシー試料の対応するプロフィ
ールを、このリファレンスセットに対して比較する。

既知の組成についてのプロフィールを、同様にして測
定される未知試料のプロフィールとの比較のために、コ
ンピューターでアクセス可能なフォームに保存する。従
って、未知試料のGSTコンプルメントを測定するための
キットが提供され得る。このキットは、リファレンスプ
ロフィールを測定するために使用されるテストパネルメ
ンバーと共に、未知試料のSCプロフィールの測定のため
の指示を含む。リファレンスプロフィールにアクセスす
るための適切なソフトウェアもまた含まれ得る。GSTコ
ンプルメントは、テストされる試料の特徴付けのために
使用され得、そして適切な場合には、治療法の設計のた
めに使用され得る。

疾患組織について、治療のために適切な方針が選択さ
れ得る。このコンプルメントを評価して、標準的な治療
プロトコルを所望されない細胞または組織に適用した場
合、その治療プロトコルは成功するかどうかを決定し
得、あるいはこのコンプルメントは、別のプロトコルの
設計（トキシンまたはプロドラッグの選択、および治療
的モジュレーターを使用するか否かを包含する）のため
に使用し得る。

トリペプチドアナログの合成 本発明のトリペプチドアナログまたは別のパネルの追
加のトリペプチドアナログメンバーは、当該分野で一般
に公知の手段を用いて合成され得るが、これら一般的な
方法を所望のトリペプチドに適用可能にする改変を用い
て合成され得る。固相合成手法が用いられ得るが、液相
ペプチド合成の方が、これらの短鎖ペプチドには優れて
いるようである。固相合成に対して独自に開発されたFm
oc試薬は、溶液相法に適用されて、100mg量のトリペプ
チドアナログを生成し得る。

溶液相Fmoc化学法を用いて合成された中間生成物の保
護ジペプチドおよびトリペプチドは、シリカゲルのクロ
マトグラフィーによって単離され、そして弱塩基により
脱保護され、これにより酸に不安定なチオ複合体（thio
conjugate）の合成を可能にする（Iselin,B.ら、Helv C
hem Acta（1955）38:1508〜1516）。アナログが精製お
よび回収され得るか、あるいは粗生成物の混合物が直接
に固体支持体にカップリングされ、アフィニティ誘導体
化（affinity−derivatized support）を提供し得る（S
undburg,L.ら,J Chromatog（1974）90:87〜98）。

Ｃ末端アミノ酸AA_cのエステルが入手可能であるそれ
らの状況下では、このエステルは、Ｎ−Fmoc保護アミノ
酸を合成することにより生成され（Atherton,E.ら，
「固相ペプチド合成」IRL Press,Oxford,England（198
9）,47〜61頁）、次いで濃硫酸の存在下で所望のアルコ
ールで処理することによってエステル化される（Benoit
on,L.Can J Chem（1962）40:570〜572）。エステル化さ
れていない物質は、弱塩基で抽出することにより除去さ
れ、そして所望のＮ−Fmocアミノ酸エステルは、エバポ
レーションによって単離される。

硫黄の官能性を付与されたFmocシステイン誘導体は、
pH9でFmoc−OSuでシステインを処理、次いで混合物を適
切なアルキル化剤で処理することによりワンポット法で
生成される。

合成は、反応スキーム１に示すように行われる。

システイン誘導体とＣ末端アミノ酸とのカップリング
は、水溶性カルボジイミドEDC（Sheehan,J.ら,J Org Ch
em（1961）26:2525〜2528）およびHOBT（Konig,W.ら,Ch
em Ber（1970）103:788〜798）（所望しないラセミ化を
妨げ、反応速度を上げるために添加される）を含むDMF
液を用いて行われる。カップリング終了（通常、室温で
約１時間）後、混合物は真空に減圧され、そしてKHCO₃
溶液中に注がれる（John Hughes,私信（private commun
ication））。この工程では、DMFおよびEDCおよびEDC尿
素の大部分ならびにカップリングしなかったFmoc−シス
テイン誘導体が抽出される。その結果、液体をデカント
することによりゴム状残渣が得られる。この粗生成物の
ジペプチドは、EtOAcに溶解され、そして1N塩酸および
水で洗浄して、残りのカップリングしていないＣ−末端
アミノ酸エステルならびに、残留EDC尿素を除去する。
溶液が濃縮され、そしてジペプチドがクロマトグラフィ
ーによって精製される。

次に、回収されたジペプチドは、25％ピペリジンを含
むDMF液で30分間処理されて、Fmoc基を除去する。Fmoc
の除去により得られたジベンゾフルベンまたはそのピペ
リジン付加物は、次のカップリングの結果に影響を及ぼ
さないはずである（Atherton,E.ら,J Chem Soc Perkin
Trans（1981）１:538〜546）。しかし、過剰のピペリジ
ンは除去する必要があり、それは、脱ブロックされた物
質において、もはやピペリジンの臭気が検出されなくな
るまでDMFとの共エバポレーション（co−evaporation）
を繰り返すことにより行われる。次に、第二のカップリ
ングは、グルタミン酸誘導体を用いて行い、続いてジペ
プチドの合成と同様の操作を行う。

Fmocグルタミン酸α−ベンジルエステルは、市販のグ
ルタミン酸α−ベンジルエステルから好収率および好純
度で作られる。Fmocグルタミン酸α−tertブチルエステ
ル（これも市販されている）もまた用いられ得るが、こ
の場合は、操作において別の酸処理工程を必要とする。
この工程では、保護されたトリペプチドのいくつかに溶
解性の問題があり、そして純度の落ちる部分的に脱保護
された生成物がしばしば得られる。

グルタミン酸誘導体とジペプチドとのカップリングお
よび操作によって生成された物質は、数種のクロマトグ
ラフ的に可動な成分を含有する。最終カラムから最初に
溶出する物質が蛍光性であれば、その物質がジベンゾフ
ルベンであることが示唆される。推定の所望生成物が、
次に別のUV−吸収物質と共に溶出するが、この物質は、
おそらくジベンゾフルベンのピペリジン付加物である。
同様の生成物が、最終操作の間、脱ブロックされたトリ
ペプチドから生成および分離されるので、これらの不純
物はこの段階では除去されない。

保護されたトリペプチド（および不純物）は、一旦単
離されると、真空下で乾燥され、そして0.25N NaOHを含
む3:1のエタノール：水で18時間処理される。これによ
り、Fmocおよびエステルの保護基が除去される。ｔ−ブ
チル基で保護されたグルタミン酸が用いられる場合、こ
の塩基処理の前に3N HClを含むエタノール／水（3/1,v/
v）を用いて３時間処理してｔ−ブチル基を除去する。
酸は、ロータリーエバポレーションならびにエタノール
および水を用いた共エバポレーションによって除去さ
れ、そして上記と同様の塩基処理を行って、残りの保護
基を除去する。一晩、塩基処理した後、水を添加し、そ
してヘキサンで抽出して、脱保護に伴う有機副生成物を
除去する。ペプチドの水溶液は、酸性にされ、固体にし
た。ペプチドをエタノールに溶解し、そしてろ過するこ
とにより、その塩を除去する。これを泡状になるまでエ
バポレートし、そして一晩高真空下に置く。

この化合物は、HPLC、TLCおよびFAB質量分析装置によ
って分析される。大抵の場合、TLC分析は、良好な結果
を示すが、HPLCの結果は、部分的に、用いた分析条件が
より疎水的（Ｓ−アルキル、Ｃ−末端バリン、β−アラ
ニンおよび4ABu）なペプチドのいくつかに対して最適化
されていないので、入り混じっている。

塩基を用いた最終の脱保護の間に、少量であるがラセ
ミ化が起こり得る（特に、フェニルグリシンアナログの
場合に）（Bodansky,M.ら，「ペプチド合成の実用的方
法」Springer Verlag,Berlin（1984）。このラセミ化の
程度は、Adang,A.らによって以前に用いられたナトリウ
ム−アンモニア条件で起こる場合よりは、低いものであ
る（Biochem J（1989）264:721〜724）。

上述の技術を用いて、表１のアナログを調製した。

さらに、これらの化合物のシクロアミド形およびそれ
らのエチルエステルおよびベンジルエステルを含む式
（１）の他の化合物が調製される。

以下の実施例は、本発明を実証するものであり、本発
明を限定するものではない。

実施例１ ９−フルオレニルメトキシカルボニル−４−アミノ酪酸
エチルエステルの合成 45g（0.1339M、0.94当量）のFmoc−Osuを、14.75g
（0.143M、１当量）の４−アミノ酪酸（４−ABu）およ
び20gのNa₂CO₃を含む300mlの脱イオン化水および200mL
のテトラヒドロフラン（THF）の溶液にゆっくりと加え
た。pHをモニターし、そしてさらにNa₂CO₃を加えてpHを
８より上に維持した。反応液を２時間撹拌し、次いで濃
塩酸で酸性にした。得られた混濁懸濁液を600mLの酢酸
エチル（EtOAc）で抽出し、その後得られた有機層を300
mLの0.5N NaOHでさらに抽出した。水層を、20mLの濃塩
酸を含む500mlの氷水に速やかに注いだ。得られた白色
懸濁液を、300mLのEtOAcで抽出し、50gのNa₂SO₄で乾燥
させ、そしてエバポレートして、35g（収率76％）のFmo
c−４−ABu（白色粉末）を得た。これを500mLの無水エ
タノールに溶解し、そして40mLの濃H₂SO₄を加えた。４
時間後、溶液は、半固体状の白色塊となった。これを2L
の水に注ぎ、そしてろ過した。この白色物質を500mLのE
tOAcに溶解し、そして200mLの0.5N NaOHで一回抽出し、
乾燥させ、そしてエバポレートして、30g（収率79％）
の全量化合物を得た。R_f0.71（20％ MeOHを含むCH₂C
l₂）、mp 83〜86゜。

元素分析C₂₁H₂₃NO₄についての計算値:C,71.37;H,6.56;
N,3.96、 測定値:C,71.42;H,6.67;N,3.72。

実施例２ ９−フルオレニルメトキシカルボニルフェニルグリシン
エチルエステルの合成 同様の合成手順に従って、20gのフェニルグリシンか
ら33.7g（収率68％）のFmoc−フェニルグリシンを得
た。19gのこの生成物を10g（収率57％）の目的生成物に
変換した。R_f0.95（同様のTLC系）。mp 130〜133゜。

元素分析C₂₅H₂₃NO₄についての計算値:C,74.80;H,5.77;
N,3.49、 測定値:C,74.72;H,5.91;N,3.20。

実施例３ ９−フルオレニルメトキシカルボニルアスパラギン酸ジ
メチルエステルの合成 45g（0.134M、0.96当量）のFmoc−Osuを、20g（0.15
M、１当量）のアスパラギン酸および20gのNa₂CO₃を溶解
した400mLの水および200mLのジオキサンの溶液に加え
た。この混合物を、少量のNa₂CO₃を加えることによりpH
を約９に維持しながら、２時間撹拌した。次いで、白濁
した混合物を、40mLの濃塩酸を含む500mLの氷水に注い
だ。白色固体を500mLのEtOAcで抽出し、そしてこれを50
0mLのヘキサンと混合させた。混合物を一晩冷却し、そ
して翌日まで撹拌して、ろ過および空気乾燥により38g
（収率71％）のFmoc−アスパラギン酸（結晶）を得た。
10g（0.28M）のこの生成物を200mLのメタノールに溶解
し、そして20mLの濃H₂SO₄を加えた。この溶液を一晩放
置した。この混合物を1Lの水中に注ぎ、そしてろ過し
た。得られた白色固体を乾燥させ、そしてEtOAcに再溶
解させた。ヘキサンをゆっくりと加え、そして冷却し
て、9g（収率83％）の目的生成物（白色針状結晶）を得
た。mp78〜80゜、［ａ］_ｄ＝−13.9゜。

元素分析C₂₁H₂₁NO₄についての計算値:C,65.78,H,5.52,
N,3.65、 測定値:C,66.18,H,5.68,N,3.69。

実施例４ ９−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−ヘキシルシ
ステインの合成 A.20g（0.127M、１当量）のシステインハイドロクロラ
イドおよび20gのNa₂CO₃を、アルゴンガス気流下で800ml
の水に溶解した。200mLのCH₃CNを加え、次いで42g（0.1
22M、0.96当量）のFmoc−Osuを、5g分のNa₂CO₃を加える
ことによりpHを約９に維持しながら、少量ずつ加えた。
反応液をさらに２時間撹拌し、そして18.6mL（26.8g、
0.126M、0.99当量）の１−ヨードヘキサンを200mLのCH₃
CN溶液として加えた。その反応液をさらに２時間撹拌
し、そして1Lの氷水および50mLの濃塩酸に注いだ。白色
の混合物を600mLのEtOAcで抽出し、そして得られた有機
層を、2500mL分の1N KOHで何回かに分けて抽出した。こ
れらの各々を、500mLの水および30mLの濃塩酸の溶液の
いくつかに分けたものに直ちに滴下し、次いで得られた
混濁混合物を500mlのEtOAcでそれぞれ抽出した。これら
をそれぞれNa₂SO₄で乾燥し、そしてエバポレートした。
総収量は24.6g（45％）であった。二番目の画分（3.5
g）を放置して結晶を得た。mp101〜103゜、R_f＝0.57、
［ａ］_ｄ＝−14.3゜。

元素分析C₂₁H₂₃NO₄Sについての計算値:C,65.42,H,6.01,
N,3.63、 測定値:C,65.53,H,5.74,N,2.91。

B.さらに、Ｓ−官能性Fmocシステイン誘導体を項目Ａに
記載のように調製した。

実施例５ Fmoc−グルタミン酸α−ベンジルエステルの合成 25g（0.105M）のグルタミン酸α−ベンジルエステル
および25gのNa₂CO₃を400mLの水に溶かし、そして200mL
のTHFを加えた。34g（0.101M、0.96当量）Fmoc−OSuを
撹拌しながら少量ずつ加え、そして必要なだけNa₂CO₃を
さらに加えることによりpHを約９に維持した。１時間
後、反応液を500mLの水中に注ぎ、そして濃塩酸で酸性
にした。白色懸濁液をEtOAcで抽出し、Na₂SO₄で乾燥
し、そしてエバポレートして固形物を得た。これを500m
Lの温EtOAcに溶解し、そして300mLのヘキサンを加え
た。一晩冷却し、回収し、そして空気乾燥して、38.7g
（収率83％）の白色結晶を得た。mp110〜112゜、［ａ］
_ｄ＝−13.8゜、M/e（分解強度）： 460.2（19）,363.4（８）,345.4（19）,307.2（10）,28
9.2（12）,238.2（12）,191.2（10）,178.2（89）,165.
1（23）,154.1（57）,136.1（48）.¹H NMR（400mHz）,P
PM:1.9（m,1H）,2.2（m,1H）,2.4（M,2H）,4.1（t,1
H）,4.4（d,2H）,4.43（m,1H）,5.1（s,2H）,5.6（d,1
H）,7.3（m,9H）,7.5（d,2H）,7.7（d,2H）,9.4−9.6
（ブロード s,1H）.¹³C（100mHz）,PPM:27.5,30.0,47.
3,53.5,67.3,67.7,120.2,125.0,127.3,128.5,128.8,12
9.2,135.2,141.5,143.6,143.9,156.3,171.4,177.8. 元素分析C₂₇H₂₅NO₆:C,70.57;H,5.48,N,3.05、 測定値:C,69.71,H,5.58,N,2.88。

実施例６ γ−グルタミルＳ−ベンジルシステイニル β−アラニ
ンの合成 1.5g（9.76mmol、１当量）のβ−アラニンエチルエス
テルハイドロクロライドを50mLのDMFに加え、そして1.8
mLのDIPEAを加えた。3.5g（8.1mM、0.83当量）のFmoc−
Ｓ−ベンジルシステインを加え、そして溶液をかき混ぜ
ながら溶解させた。次に、2gのEDACおよび250mgのHOBT
を加え、そしてかき混ぜながら固体を溶解させた。混合
物を１時間放置し、次いで真空下で約5mL容量のモービ
ル油になるまで濃縮した。これに、100mLの10％ w/v KH
CO₃水溶液を加え、そして混合物を振り混ぜ、そしてろ
過により液体を除去した。残渣を100mLのEtOAcに溶解
し、50mLの1N HCl、50mLの水で順次洗浄し、そしてNa₂S
O₄で乾燥した。溶液をろ過し、そして真空下で濃縮して
泡状物を得た、これをCH₂Cl₂中で充填されたシリカゲル
の２×6cm吸着床を用いてクロマトグラフ分離した。最
初のUV吸収物質が現れるまでカラムを溶出させ、次いで
100mL容量に対して１％メタノール刻みで３％メタノー
ルまで勾配をかけた。強いUV吸収バンドが、３％メタノ
ールを２回分流した後に溶出した;TLCによりこれらの純
度をチェックし、そしてプールし、そして真空下でエバ
ポレートして、4.6g（収率83％）のFmoc−Cys（Ｓ−ベ
ンジル）−β−アラニンエチルエステルを得た。このう
ち半分（4mmol）を30mLのDMFおよび10mLのピペリジンの
混合液に溶解し、そして30分間放置した。溶液を真空下
で固体にし、そしてそのプロセスを50mLのDMFで２度繰
り返し行った。得られた白色固体を、高真空下に１時間
置いた後、50mLのDMFに溶解させた。２番目のカップリ
ング工程では、1.6g（3.5mmol、0.9当量）のFmoc−グル
タミン酸（α）ベンジルエステル（ｖ）を加え、続いて
0.8g（4.2mmol、1.05当量）のEDACおよび200mg（1.4mmo
l）のHOBTを加えた。混合物を１時間放置し、そして真
空下で約5mL容量まで濃縮した。これを100mLの10％KHCO
₃水溶液に注ぎ、そして振り混ぜた。液体を除去し、そ
して残渣を100mLの酢酸エチルに溶解させた。有機層を5
0mLの1N HCl、50mLの水で順次洗浄し、そしてNa₂SO₄で
乾燥させた。これをタール状にし、そして保護されたジ
ペプチドと同様の方法でクロマトグラフ分離した。1.2g
（収率42％）の保護されたトリペプチドが得られた。こ
の物質を30mLの無水エタノールに溶解し、そして10mLの
1N NaOH水溶液を加えた。混合物を18時間放置し、そし
て40mLの水および40mLのヘキサンの入った分液ロートに
注いだ。層を振り混ぜ、分離させ、そしてさらに40mLの
ヘキサンで水相を洗浄した。水層のpHを、濃塩酸を数滴
加えることにより約３に調整し、そして混濁溶液を真空
下で固体にし、そして高真空下に数時間置いた。残渣を
無水エタノールで20mLずつ２回に分けて洗浄した。エタ
ノール−NaClスラリーをろ過し、そして透明となった溶
液をタール状になるまでエバポレートした。得られた物
質の重量は、620mg（保護されたトリペプチドからの収
率89％、Fmoc−Cys（ベンジル）−OHからの収率19％）
であった。TLCプレートを酢酸エチル／ピリジン／水／
酢酸（5/5/3/1、v/v）溶液で展開させ、そしてニンヒド
リンスプレーおよび加熱により視覚化させた（Stewart,
J.ら、「固相ペプチド合成」（1984）pp.53〜124、Pier
ce Chemical Co.,Rockford、IL）、R_f0.66。HPLC分析に
より、UV吸収物質の面積積分により74％の純度を示した
（図１）。高速原子衝撃質量分析法（FABMS）により、4
34.2M/eにイオンピークを示した。これは、トリペプチ
ド一ナトリウム塩と一致した。他のより高い質量ピーク
も存在したが、これは、不完全に被保護されたペプチド
に一部由来するものであった。

市販の遊離のアミノＣ−末端アミノ酸エステルの代わ
りに、Fmocの保護されたＣ−末端アミノ酸エステルを用
いた場合では、この物質を、上記の保護されたジペプチ
ドを脱ブロックするのに用いた方法と同様の方法を用い
て脱ブロックし、次いで上記のようなカップリング反応
を用いてカップリングを進行させた。

実施例７ セファロース樹脂への誘導体化 0.66gのエポキシセファロース（Sepharose）^TM6B（Ph
armacia）を10mLの水で15分間膨潤させ、次いで15mL用
ガラスロート内で10mLの水で２回すすいだ。100〜500mg
の粗トリペプチドを含む5mLエタノールおよび10mL水の
溶液を、多円錐キャップ付きの20mL用シンチレーション
バイアルに入れて、6N NaOHでpH11〜12に調整した。す
すいだ樹脂を加え、そして37゜の水浴中で一晩緩やかに
かき回した。翌日、pHをチェックし、そして必要に応じ
て6N NaOHを加えてpH11〜12まで戻した。かき混ぜた翌
日、樹脂をろ過し（ペプチド含有液体を濃塩酸で酸性に
し、エバポレートし、そして蓄えておいた）、そして10
mLの水で３回すすいだ。官能性を付与していないエポキ
シ基を、約0.1mLのエタノールアミンを含む10mLの水に
樹脂を１時間浸すことによりキャップ（cap）化した。
次いで、樹脂を10mLの水で３回すすぎ、そして試料を分
析用に取り出した。残留物を、10mLの0.1M NaOAc、0.5M
NaCl緩衝溶液（pH4.0）、続いて10mLの0.1Mトリス（tr
is）クロライド、0.5M NaCl緩衝溶液（pH8.0）ですすい
だ。樹脂をこのpH8の緩衝液中に４℃で保存した。

実施例８ アフィニティ吸着体としての本発明化合物の使用 式（１）の一連の化合物を構築した（ここで、YCOは
γ−Glu、AA_cはGly、およびＸはパラ位にニトロ、クロ
ロ、メトキシおよびメチルの置換基を有するベンジルで
ある）。関連するアナログを、上記のようにセファロー
ス樹脂に誘導体化し、そして３つの組変えヒトGST酵素
の分離にアフィニティ吸着体として使用した。HPLCを用
いて、支持体（support）に結合した酵素の相対量を測
定した。

その結果を表２に示す。

πおよびμイソ酵素のパーセンテージをそのσ（メ
タ）値に対してプロットした場合、良好な線形相関が得
られた。しかし、σ（パラ）値を用いた場合では、良い
結果は得られなかった。σ（メタ）値は、純粋な誘起効
果の尺度である；しかし、σ（パラ）値は、置換基が、
結合箇所の隣の環内原子に部分電荷を配置し得る共鳴効
果に依存する。

様々な本発明化合物上でラット肝臓細胞質ゾルのGST
イソ酵素をアフィニティ精製した後の、溶出画分に含ま
れるタンパク質およびGST（CDNB−複合体化）活性の回
収率を表３に示す。

従来のＳ−Ｌ−GSHおよびHxGSH吸着体は、高い結合性
および広いイソ酵素認識性を示した。新規な吸着体は、
より少ない量のGSTイソ酵素を保持したが、新規な吸着
体のうち３つのタンパク質回収率は、従来の吸着体のタ
ンパク質回収率の半分より少ないものであった。

HxGSHと比較して、新規吸着体は、CDNB複合体化活性
とタンパク質回収率との直接の対応関係を示さなかっ
た。例えば、γＥ−Ｃ（Bz）−βＡ吸着体およびγＥ−
Ｃ（Bz）−Ａ吸着体は、HxGSHの場合には33％および16
％のタンパク質回収率を与えたが、CDNB複合体化活性
は、溶出リガンドの阻害性に対する補正後、はるかに高
かった（それぞれ、52％および33％）。それに対して、
γＥ−Ｃ（Cu）−Ｇ吸着体によるタンパク質回収率は、
ほんのわずかしか減少せず、一方、活性は50％減少し
た。異なるGSTイソ酵素が、CDNBに対して固有の特異的
な活性を示すことは周知である。タンパク質回収率と活
性回収率との間の不一致は、各々の吸着体の溶出画分中
のイソ酵素組成の差異に起因していた。この仮説は、そ
の溶出物画分のSDS/PAGEおよび逆相HPLC分析によって支
持された。

表３に載せた吸着体から溶出した画分を、SDS/PAGE、
続いて銀染色法によって分析した。Ｓ−Ｌ−GSH吸着体
およびHxGSH吸着体は、以前観察されたラットの肝臓GST
サブユニットの電気泳動バンドのパターンに対応するタ
ンパク質と結合した。新規吸着体は、異なるバンドパタ
ーンを示した。例えば、上記のγＥ−Ｃ（Bz）−βＡ溶
出物は、推定μ−クラスイソ酵素を非常に豊富に含むバ
ンドを示した。π−クラスGST 7−７は、ラット肝臓細
胞質ゾルにおいて低レベルで見出されるので、より高レ
ベルのイソ酵素を発現することが知られている他のラッ
ト組織もまた、試験した。γＥ−Ｃ（Hx）−φＧ吸着体
から溶出したラット腎細胞質ゾルのタンパク質由来のGS
Tゲルパターンは、ラットGSTサブユニット７と同じ分子
移動度を有するタンパク質がこの溶出物特有の成分であ
ることを示し、そしてこのことは、この吸着体がπ−選
択的試薬であることを示した。

別のGSH依存性酵素であるグリオキサラーゼＩの分子
移動度と類似の分子移動度を有するタンパク質もまた、
γＥ−Ｃ（Bz）−ＡおよびγＥ−Ｃ（Bz）−βＡからの
溶出物に存在したが、他の吸着体からの溶出物では、検
出されなかった。これらの実験では、HxGSHは、以前に
グリオキサラーゼＩと結合することを示したが、検出可
能なレベルのGSH依存性酵素を示さなかった。グリオキ
サラーゼＩは、金属依存性酵素であることが知られてお
り、そして緩衝液中にEDTAが存在すると、結合活性が妨
げられ得る。

アフィニティ溶出したタンパク質のSDS/PAGEにより見
られた高純度で適切な大きさのタンパク質は、観察され
たバンドが確かにGSTであることを示唆した。高分解能
条件に置いて、異なる吸着体からの溶出物中のGSTイソ
酵素の逆相HPLC分析により、この結論の独自の確証が得
られた。精製されたGST標準品と比較すると、新規の吸
着体から溶出したイソ酵素は公知のGSTイソ酵素に対応
することが示された。これらの手順は、次のことを示し
た:GSTのサブユニット３は14分で、サブユニット４は17
分で、サブユニット７は18分で、サブユニット２は23分
で、サブユニット６は25分で、サブユニット1aおよび1b
は37分および40分で、およびサブユニット８は42分で各
々溶出した。サブユニット３、４および６は、μ−クラ
スイソ酵素であり、サブユニット1a、1b、２および８
は、α−クラスイソ酵素であり、そしてサブユニット７
は、π−クラスイソ酵素である。予想されるように、Ｓ
−Ｌ−GSHおよびHxGSH吸着体は、５−５を除いて全ての
θ（theta）−クラスのイソ酵素と結合した。

イソ酵素２の割合を増加させたγＥ−Ｃ（Cu）−Ｇ
は、ある程度まで、全てのイソ酵素となおも結合した。
これに対して、他の吸着体は、イソ酵素との結合におい
ては非常に選択的であった。例えば、γＥ−Ｃ（Bz）−
βＡは、μ−クラスのイソ酵素３および４と選択的に結
合したが、これは、SDS/PAGEの結果を確認するものであ
る。

ラット細胞質ゾルのGSTイソ酵素に対する様々な新規
吸着体の特異性を表４に要約する。リガンドのいくらか
の構造的な改変は、いかなるイソ酵素とも効果的には結
合しない吸着体を生成した；これらのうちいくつかを十
分に記載する。

前記のＨ−部位（疎水性ポケット）をプローブするた
めに、Cys残基を系統的に改変すると、イソ酵素に対し
て結合し得るリガンドが得られた。Adangら（1990）
は、Cys部分に結合する基の系統的改変を施したアナロ
グについては調べなかった。この基の改変は、いくつか
の場合には、タンパク質回収率のレベルおよびイソ酵素
結合の特異性に効果がある。例えば、α−クラス基質で
あるクメンヒドロペルオキシドの構造と類似した構造に
グルタチオンのＳ−結合部分を改変すると、α−クラス
のイソ酵素２−２に対して特異的な吸着体が得られた。
A1aが末端アミノ酸として用いられた場合、Cys上のプロ
ピルおよびベンジル部分は共に、μ−クラスイソ酵素に
対して特異的な吸着体を生じた（表４）。プロピル吸着
体は、ベンジル吸着体と比較して、より多くのGSTタン
パク質を保持したが、一部には、これはプロピル吸着体
が、イソ酵素３および４の両方を捕らえたためである。
このプロピル吸着体は、イソ酵素４に対して高い特異性
を有する。末端アミノ酸としてHisを用いた場合、プロ
ピル部分はμ−クラスに対して高い選択性を得たが、一
方、ベンジル部分は全てに対して結合能を示さなくなっ
た。これらの吸着体とは対照的に、Val置換吸着体およ
びAsp置換吸着体のCys部分の改変は、低結合性に対して
何の効果もなかった。従って、Cys置換基は、末端アミ
ノ酸によって決定されるような吸着体の全体的な特異性
を改変する場合に重要であり得る。

実施例９ 溶液相インヒビターとしての本発明化合物の使用スクリ
ーニングのストラテジー 系統的に多様化した一連の本発明のペプチドアナログ
を、ヒトグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GS
T）のイソ酵素特異的インヒビターとして試験した。最
良のインヒビターの効力は、活性部位にてグルタチオン
との競合阻害を示すカイネティクスを有する0.5〜20マ
イクロモルの範囲にある。低効力および高効力の両方で
の３つの組換え体GST由来のイソ酵素の間で観察された
特異性は、無視できるものから高いものまでわたった
（次に最も高感度なイソ酵素より少なくとも20倍）。

これらの化合物を、最初に、これらの化合物が酵素活
性を阻害するかどうか検証するために、分光光度的に検
証可能な基質としてCDNBを用いて、３つの組換えヒトGS
T（各主要なイソ酵素クラス由来の１つ）に対して１−m
Mの濃度でスクリーニングした。化合物の広範囲なスペ
クトルの迅速な試験を可能にするために、この段階で用
いたパラログ（paralog）は、粗合成試料であり、そし
て試験前に純度の決定をしなかったが、大抵の場合、目
的の合成化合物は有力種であり、全量の約50％を示す。
ごくわずかな１−mM濃度は、純度100％という仮定に基
づいていた。表５は、一連の51個のGSHパラログアナロ
グについてのこれらの阻害試験の結果を示す。

略語は、以下を除いて、上記の表１および本文中の記号
と同様である:Conc.＝濃度;ND＝検出されず;IC₅₀＝活性
の50％減を引き起こすインヒビター濃度;Bu＝ブチル;t
−Bu＝tert−ブチル;Cu＝クミル（α，α−ジメチルベ
ンジル）;IMe＝ヨードメチル；γＥ−α−アミノオクタ
ノイック−Ｇ（化合物８）＝硫黄を有さないアナログに
より置換された（CHx）を有するγＥ−Ｃ（Hx）−G;G−
γＥ−Ｃ（オクチル）−Ｇ（化合物14）＝γＥ−Ｃ（オ
クチル）−ＧのＮ−末端の追加のG;環状（cyclic）＝ト
リペプチドが共有結合（ペプチド結合）したＮおよびＣ
末端；γＥ−Ｇ−Ｃ（Hx）−φＧ（化合物44）＝追加の
ＧをγＥ−Ｃ（Hx）−φＧ中のＧとＣとの間に挿入す
る。

表５において、パラログをヒトGSTイソ酵素選択性に
よりグループ化し、そして各々の選択性クラス内では、
効力の減少に従ってパラログをランク付けする。P1−１
およびM1a−1aイソ酵素に対して強い選択性を示したパ
ラログは、この調査で明確に同定されたが、A1−１に対
する新しい選択的インヒビターの中で、前述の選択的イ
ンヒビターを越えるものはなかった。１−mM濃度での阻
害試験を越えてスクリーニングを進めるための１組の基
準は、以下の通りであった：あらゆるGSTイソ酵素に対
して＞90％の阻害または一対のイソ酵素の間の阻害にお
ける＞６倍の差異。最初の基準を満たすこれらのパラロ
グに対するIC₅₀値もまた表５に示す。

GSTイソ酵素へのパラログの結合のより正確な尺度
は、K_i値を決定するためのGSH競合実験によって得られ
る。このような試験を10−μＭ〜100−μＭの範囲でIC
₅₀効力を有するこれらの化合物またはイソ酵素間で＞５
倍の選択性を示す化合物について行い、そしてこのため
に＞90％の純度を有する化合物を調製した。パラログに
よる阻害が競合的である場合は、インヒビターの存在お
よび非存在下でのGSHに対するK_m値は、パラログとGSTイ
ソ酵素との間のK_i値、すなわち解離定数を決定するため
に用いられ得る。IC₅₀値は、1mM GSHにおいておよそ50
％の阻害を生じるのに適切なインヒビターの濃度を確立
するのに用いた。様々なパラログとのGSH競合実験にお
いて得られたデータを、ヘインズ−ウールフ（Hanes−W
oolf）プロットにおいてプロットした。ヘインズ−ウー
ルフ（Hanes−Woolf）プロットにおいて阻害された状態
および阻害されてない状態の平行線は、パラログがGST
−活性部位と相互作用することを示す。パラログおよび
GSTの大部分の組み合わせについて、厳密な平行関係が
得られた。この全ての一連の実験において、GSHのみに
対して得られたK_m値は、0.4mMと0.6mMとの間の範囲にあ
り、これは、最も効力のあるパラログに対して記録され
たK_m値よりも約10〜100オーダー弱い大きさであった。

表６は、この注目の化合物のサブセットに対するK_i値
を示す。

これらの化合物の大部分は、本来のスクリーニング試
験よりもこれらの研究の方がより高い効力を発現した
が、これは、GSH競合実験に対して用いた新しい調製物
が、少なくとも90％の純度であったからである。さら
に、K_iと比較して、IC₅₀の算数的定義もまた寄与する：
これらの値は、GSHおよびCDNBの両方の濃度が０に近づ
いたときにのみ等しく、それは、本標準プロトコルの場
合ではなかった。特異性に関して、いくつかの場合にお
いて相対的優先が変化するが、より正確な決定は、一般
に予備データと一致した。

定量的な構造／活性相関 標準的な医化学の手法の後、これらの化合物の定量的
な構造／活性相関（QSAR）の傾向を調査した。この目的
のために、一連のGSHのｎ−アルキル誘導体を試験し
た。この特徴の詳細な調査の結果を表７に要約した。

これらの結果は、第一に、化合物の阻害効力がｎ−ア
ルキル基の鎖長に従って増加すること、そして第二に、
このパラメーターは、イソ酵素選択性に規則的な傾向を
生じないことを示す。表５に示したパラログ化合物に対
して得られた結果は、表７に示したGSHのｎ−アルキル
誘導体の集合に対して得られた結果に比べて阻害パター
ンに非常に大きな多様性を著しく示す。

多くの小さな有機分子もまた、GST活性を阻害するこ
とが以前報告されてきた（Mannervik,B.ら、CRC Crit R
ev Biochem（1988）23:283〜337）が、単離したヒトイ
ソ酵素に関する特徴を注意深く述べた報告はごくわずか
である。根本的に異なるペプチドベースの構造を有する
これらの構造の比較をすることは、より詳細なQSAR研究
に対して有用であることが期待されたので、このような
化合物の試験もまた行った。これらの化合物のいくつか
は、ペプチドベースの化合物とほぼ同等の効力および選
択性を示した。結果を表８に要約する。

阻害データの図形解析 多次元阻害データ（各軸は、組換え体GSTの１つにつ
いての阻害の程度を表す）を、ピルエット（Pirouett
e）における主成分アルゴリズム（principal−componen
t algorithm）、すなわちInfometrix,Inc（Seattle,Was
h）により、化学データに対して開発された多変量統計
解析ソフトウェアパッケージによりIBM互換性パーソナ
ルコンピューター（PC）で解析した。主成分とは、最大
関連固有値を有する共分散マトリックスの固有ベクトル
である。このように、主成分は、以下の２つの条件を満
足させる原軸から誘導された合成パラメーターを表す：
（１）主成分は、独立（直交）次元であり、そして
（２）主成分は、データセットにおける分散の最大部分
を占める。その結果、主成分により定義された平面への
データの投影は、最大ばらつき（maximal scatter）の
次元に沿ってデータを広げることによって、映像の鮮明
度を最大にする。このような投影において、同時に接近
する点は、高次元の原空間における相関を正確に示す。
100倍の特異性要因および0.1−μM K_i値を有する仮定の
理想的化合物を表す目的の値もまた、プロットされる。
このより正確な値が入手可能な場合には、この解析のた
めに、阻害効力は、log（1/IC₅₀）、またはlog（1/K_i）
として定義された。

図１は、表５、７、および８のIC₅₀データを表６のK_i
データと組み合わせた図形分析を表す。このプロットを
決定するために、まず、阻害特性を３次元空間において
プロットした。３次元空間の軸は、３つの組換えイソ酵
素の各々についての阻害の程度を表す。次に、データ分
布の主成分を決定した（Massart、D.L.ら、Chemometric
s:a textbook（1988）、Elsevier、Amsterdam）。簡単
に言えば、主成分は、複合係数（composite factor）で
あり、この複合係数は、原軸から誘導され、そしてばら
つきを最大にするために選ばれた軸に沿って点をプロッ
トすることにより、多変量データの集合において相関を
示すために数学的に最適化される。示されたプロット
は、第二、第三の主成分によって定義された平面へのデ
ータの投影である。第一の主成分は、効力を大きく表す
次元であり、そしてこの性質のばらつきは、表に十分に
示される。図１に対する第二および第三の主成分を選択
することは、特異性の係数を強調し、そしてその特異性
の係数は特性の等しく重要な局面であると考えられる。
このような多変量プロットは、試験される試薬の特性
（効力および選択性）の便利な検査を可能にする。100
倍の特異性および0.1−μM K_iとして定義された目的の
性質もまた、プロットに示される。

図１に示されるインヒビターの効力および選択性の多
変量解析は、いくつかの他の興味ある特徴をも強調して
いる。第一にそれは、ベンジル/pheglyパラログ（化合
物４、表５）は、P1−１特異的インヒビターの目的にか
なり近づいていることを示す。第二に、ベンジル／β−
A1a（化合物30）、４−メチルベンジル／β−A1a（化合
物29）、そして環状ベンジル/phegly（化合物31）パラ
ログは、M1a−1a酵素に対して最も選択的であるが、P1
−１酵素に対して達成されるほど目的に近づいていな
い。第三に、新規のA1−１選択的パラログをこの調査に
おいて見出すことは全くできなかった。

小さい有機分子の分析は、様々な効力および特異性も
またこのクラスの化学構造から入手可能であることを示
す。しかし、このような化合物の中で最も効果的な化合
物の多くは、極めて疎水性のある染料であり、従ってこ
れらは、一般にタンパク質との高いバックグラウンド結
合により、臨床的には有用ではないようである。これら
のインヒビターが競合インヒビターであるかどうかを直
接決定するために、これらのインヒビターとの競合実験
はまだ行われたことがないが、本明細書中に記述した化
合物から入手可能なものより大きな効力と選択性とを達
成するという希望を持って、それらをGSH誘導体へ変換
するために研究を続けている。

より効果的なインヒビターの設計において、図１に要
約するように、多変量統計学によるデータ解析は、構造
的傾向を定義するためには、特に有用であるべきであ
る。最後に、この方法により視覚化された実験的に観察
された傾向は、GSTの構造的データ（Ｘ線結晶解析、高
分解能核磁気共鳴（NMR）、および部位特異性突然変異
誘発を用いた研究など）と比較して有用な見解を与える
べきである。

薬理学的意義 腫瘍中のGST活性の多様性は、定性的にも定量的にも
腫瘍に対して優先的に、存在している化学療法剤を標的
とするための重要な治療上の機会を表す。しかし、同様
の多様性は、効力のみでは利用するには十分でないとい
う点において、薬理化学者に対して主要な課題を与え
る；密接に関連した酵素群の中にも選択性が求められて
いる。本発明のパラログアプローチは、このような課題
に十分適している。本研究において実証したように、粗
リガンドは初期プローブとして有用である（表５）。し
かし、阻害特性の信頼できる評価が、約50mgの精製化合
物について要求される（表６）。従って、系統的なサン
プリングは、適度なレベルまで特徴付けの研究を制限す
るためには、極めて有用なストラテジーである。

さらに、サンプル化によって得られた構造の範囲は、
QSARに直接寄与し、そして酵素−構造相関の研究は、イ
ソ酵素選択性および効力の原因となる特徴を同定するこ
とを目的とした。例えば、M1a−1aイソ酵素に対する最
も選択的なインヒビターの１つを除いた全ては、パラロ
グのGSH部分におけるＣ−末端アミノ酸としてβ−アラ
ニンを有する。P1−１イソ酵素に対して最も選択的なイ
ンヒビターの両方は、GSH部分のＣ−末端アミノ酸とし
てフェニルグリシンを有する。

この研究において得られた最良のインヒビターは、以
前研究されたインヒビターであるヘキシルGSH（GSTイソ
酵素のアフィニティ精製に用いられる標準リガンドであ
る）と同様の効力範囲を示す。これらのインヒビターの
効力もまた、エタクリン酸（化学療法を増強するための
薬物として臨床試験中である）の効力と同等またはそれ
より高く、そしてこの観察は、これらの新規インヒビタ
ーが、化学療法の増強作用に対しても有用であり得るこ
とを示唆している。例えば、P1−１の優先的発現が、腫
瘍の範囲内で報告され、従って、P1−１選択的インヒビ
ターであるベンジル/phegly（化合物４）に基づいた増
強剤は、癌治療に有用であり得る。

K_i値が決定された（表６）このスクリーニングにより
同定されたパラログの中の全ては、それらが、効果のた
めにGSTイソ酵素の活性部位に対して標的とされ、従っ
てそれらが、CDNB以外の基質に対してGSTの活性に影響
を及ぼすべきであることを示すGSTとの競合阻害を示し
た。様々なアルキル化剤は、GSTに対する基質であり、
そしてイソ酵素は、これらの基質に対する特異性に有意
に異なる。従って、個々の腫瘍において特定のイソ酵素
の特異的発現（differential expression）は、治療の
応答性における多様性の原因であり得る。この問題は以
下のようにして、本発明の適切なパラログの適用によっ
て克服され得る。第一に、個々の腫瘍のGSTイソ酵素コ
ンプルメントを決定し、これにより少なくとも特定の腫
瘍の主要GSTイソ酵素を最も受けにくい受容可能な細胞
毒性薬剤を同定し、そして第二に、どんなGST活性がそ
の薬物に対して依然存在しても、そのGST活性の阻害に
より、選択された薬物の最大の相乗作用を与えるパラロ
グインヒビターを提供する。

例えば、細胞毒性薬剤を増強するために、生細胞にお
けるGSTイソ酵素活性を阻害するには、本実施例で同定
したインヒビターは、上記および以下の実施例11で実証
するように、細胞膜の透過性を増強するために本発明に
よる改変を必要とする。

実施例10 ヒト肝臓GSTのHPLCアフィニティクロマトグラフィにお
ける本発明化合物の使用 本実施例では、新しいHPLCアフィニティ支持体を用い
てグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST）のイソ
酵素（例えば、ヒト肝臓における）を迅速に決定する方
法について記述する。肝臓細胞質ゾルを、イソ酵素に特
異的なアフィニティーリガンド（Ｓ−オクチルグルタチ
オン）と共有結合した支持体を含むHPLCカラム（0.46×
5cm）上に直接注入する。共存する細胞質ゾルタンパク
質は、洗浄工程で除去される。イソ酵素は、移動相内の
別のアフィニティリガンドの線形勾配をかけて溶出され
る。アフィニティリガンド勾配と一致すると、塩勾配
（０〜200mM塩化ナトリウム）がかけられる。この方法
により、イソ酵素を、酵素学的に活性なホモダイマーお
よびヘテロダイマーに分画する。分画されたイソ酵素の
単量体および二量体の組成を、SDS−PAGE、ELISAおよび
逆相クロマトグラフィーによって決定する。１つの肝臓
の３つのαクラスのイソ酵素サブユニット（これは３つ
のヘテロダイマーおよび２つのホモダイマーを形成す
る）が検出される。５つの肝臓を分析し、そしてホモダ
イマーA1−１は、主要なグルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼのイソ酵素であることが見出される。少量のπお
よびμクラスのイソ酵素もまた、検出される。この非変
性高性能アフィニティクロマトグラフィー法は、グルタ
チオンＳ−トランスフェラーゼの他のアフィニティ分析
法と比較すると、分析時間を十分の一（a factor of te
n）に短縮する。

二量体で活性型である同類のグルタチオンＳ−トラン
スフェラーゼ（GST）の分離に利用可能なクロマトグラ
フィー法の１つは、定組成（isocratic）溶出および／
または逆リガンドを有する勾配溶出を用いたアフィニテ
ィクロマトグラフィーである。この方法は、アフィニテ
ィクロマトグラフィーによる細胞質ゾル由来のGSTの精
製と個々のGSTの分離とを組み合わせている。GSTのホモ
ダイマーおよびヘテロダイマーの分割は、アガロースに
結合したアフィニティリカンドとしてのＳ−ヘキシルグ
ルタチオンまたはグルタチオンのいずれかを用いるこの
技術を用いて成し遂げられた。アガロースゲルに固有で
ある大きな粒径およびゆっくりした流速によって、これ
らの研究に対する分画時間は、約25時間であり（Hayes,
J.D.ら（編）、Glutathione S−Transferases and Drug
Resistance、TaylorおよびFrancis、London、1989、p.
17）、これは、この技術がGSTのルーチン分析には使用
されない理由を説明している。アフィニティリガンドと
して固定化グルタチオンを含むHPLCカラムは、GSTの予
備精製法として述べられているが（LeCreta、F.P.ら、J
Chromatog（1988）434:83〜93）、個々のイソ酵素を分
離するための試みはなされてない。

本発明のこの新規HPLC法は、分析用HPLCカラムに充填
したHPLC粒子に共有結合したGSTアフィニティリガンド
（例えば、Ｓ−オクチルグルタチオン）を有する固定相
を使用している。

アフィニティマトリックス：アフィニティマトリック
スの合成は、SundbergおよびPorathの一般手法に従う
（J Chromatogr（1974）90:87）。HEMA（ヒドロキシエ
チルメタクリレート）BIO 1000、1,4−ブタンジオール
ジグリシジルエーテル、および2mg/mlの水素化ホウ素ナ
トリウムを含む0.6M水酸化ナトリウム（0.03/1/1、w/v/
v）を一晩混合した。粒子をろ過し、そして水、エチル
アルコール、およびアセトンで順次洗浄した。3.5mlの
0.5M炭酸ナトリウムに溶解したＳ−オクチルグルタチオ
ン（75mg）を700mgの乾燥粒子に添加した。懸濁液を約9
0時間混合した。ろ過した後、（ｉ）1M塩化ナトリウ
ム、0.1Mリン酸ナトリウム（pH9）、（ii）1M塩化ナト
リウム、0.1M酢酸ナトリウム（pH4.5）、（iii）水、
（iv）エチルアルコール、および（Ｖ）アセトンで粒子
を洗浄した。

HPLCカラムの充填：アフィニティ物質（650mg）を20m
lの水でスラリーにし、そして高圧で0.46×5cmのステン
レス鋼カラム（Supelco Co.,Bellefonte、PA）に充填し
た。カラムフリット（column frit）は、CTFEリング（U
pchurch Scientific、Oak Harbor,WA）に入れた２μｍ
（平均孔直径）チタンであった。Haskell（Burbank、C
A）DSTV−122液体ポンプを、充填工程の間、展開溶媒
（水）を供給するために用いた。カラムを50mlの水を用
いて2000psiで充填し、次いで50mlの水を用いて4000psi
で充填した。

本明細書中に記載された新規HPLC充填物上で分離を行
うことによって、GST分析時間がかなり節約された。肝
臓試料を２時間分析したが、これは、セファロース−6B
ベースのアフィニティ支持体を用いた同様の分離よりも
10倍以上の速さである。洗浄および溶出工程は、HPLC法
を用いると時間的に非常に短縮される。５つのヒト肝臓
の分析において（表９、下記）、1.5ml/分で洗浄工程行
うことによってHPLCマトリックスの圧力安定性が有利に
図られた。少なくとも2ml/分の流速が、GSTイソ酵素に
結合する親和性の損失のないこの系において、耐容とさ
れ得る。

本明細書中に記載されたGSTイソ酵素の高分解能アフ
ィニティ分離は、２つの濃度勾配を同時に適用すること
に依存した。一方の勾配は、グルタチオンパラログ（例
えば、TER106（すなわち、γＥ−Ｃ（Bz）−βＡ））、
またはＳ−ブチルグルタチオンのいずれかの線形的に増
加する濃度から構成されていた。これらは両方ともGST
の公知の競合インヒビターである（上記の実施例９を参
照のこと）。装填（loading）工程では、アフィニティ
リガンドを有するGST複合体が、固定相と共有結合し
た。競合インヒビター（TER106またはＳ−ブチルグルタ
チオン）の濃度が溶出工程の間増加するにつれて、GST
は、次第に移動相に分配され、最後に溶離する。

GSTの混合物の溶出の順序は、固定化アフィニティリ
ガンドおよび移動相中の競合インヒビターの両方に対す
てそれらの親和性の複合関数である。例えば、２つの異
なる溶出リガンドを用いてGST溶出プロフィールにおけ
る差違を比較した場合、溶出順序の変化が観察される。
TER106を用いる溶出と比較して、Ｓ−ブチルグルタチオ
ンを用いる溶出は、μクラスイソ酵素を、αクラスピー
クに対してブロードでより長い保持ピークにシフトし
た。さらに、Ｓ−ブチルグルタチオン溶出は、TER106溶
出で分割されたAx−ｙおよびAy−ｙの共溶出となった。
Ｓ−ブチルグルタチオンに対するTER106の濃度の２倍
が、同様のクロマトグラフを生成するのに必要とされた
が、これはイソ酵素の親和性の差違を反映した。

第２の勾配は、リガンド勾配と同じように適用される
塩勾配であった。この勾配がなければ、最初の３つのピ
ークが共溶出した。従って、この分離は、アフィニティ
勾配および塩勾配の両方に依存した。その塩勾配は、タ
ンパク質と、固定相結合アフィニティリガンドであるＳ
−オクチルグルタチオン（pH6.0で正味の負電荷を有す
ることが期待された）との間のイオン相互作用を克服す
るために作用し得る。

アフィニティカラムからアフィニティリガンドと共に
溶出したCDNB複合体化活性の回収率は、３つの肝臓に対
して平均76％であり、一方、全活性の平均収率（アフィ
ニティリガンド溶出した活性＋保持されなかった活性）
は、83％であった。本明細書中に記載されたアフィニテ
ィカラムからのCDNB複合体化活性の収率を、他のシステ
ムを用いた以前の報告に記載された収率と比較した。

３つの肝臓に対する保持されなかった活性の割合は、
３％〜13％と様々であった。保持されなかった活性の画
分が、カラムの飽和のようなシステムの問題によるもの
ではないことを立証するために、同じ肝臓（L005N）由
来の細胞質ゾルの部分を、５回連続してクロマトグラフ
ィーにかけて処理した。保持されなかった活性の画分
は、平均2.7％（高い活性のもので3.5％、低い活性のも
ので2.3％）であった。このことより、異なる肝臓試料
の保持されなかった活性の変動は、肝臓試料の特性によ
るものであると結論づけられた。

主要なピークにおけるGSTイソ酵素の同一性は、SDS−
PAGE電気泳動、ELISAおよび逆相HPLCによって同定され
た。肝臓L006Nは、３つの型のαサブユニットを含んで
いると思われる。肝臓L006から単離されたGSTの逆相ク
ロマトグラムは、A1の後に溶出する２つのピークを示
す。これらのその後溶出するタンパク質は、仮にサブユ
ニットAxおよびAyと名付けたが、これは、さらなるサブ
ユニット分析に基づいていた。

ヒト肝臓の分析について、Ｓ−ブチルグルタチオン
が、溶出リガンドとして選ばれたが、これは、Ｓ−ブチ
ルグルタチオンがαクラスからμクラスGSTを分離した
からである。さらに、L006N以外の肝臓は、A1のみを有
するか、またはある場合には、A1とAxあるいはAyサブユ
ニットの１つのみとを有し、その結果、TER106によって
与えられるαクラスダイマーの完全分離を必要としなか
った。５つのヒト肝臓を、アフィニティクロマトグラフ
ィーによってGSTの二量体含量に対して分析し、そして
逆相クロマトグラフィーによって単量体含量に対して分
析した（表９）。

アフィニティカラムに注入した細胞質ゾルの量は、約
20mgの肝臓と等価であった、以前の報告において、ヒト
肝臓中のGSTの主要な形態は、A1単量体およびA1−１二
量体であった。これは、本明細書中で試験された５つの
肝臓の場合であった。AxまたはAyサブユニットが、かな
りの量で検出された場合、対応するヘテロダイマーもま
た見出された。かなりの量の単量体Ayを有するL007Nに
対しては、ホモダイマーAy−ｙおよびヘテロダイマーA1
−ｙの両方ならびにA1−１が検出された。Axを有するAy
はごく少量しか含まないヒト肝臓L005Nは、A1−ｘおよ
びA1−１を示したが、Ax−ｘは、L006Nの場合と同様に
全く検出されなかった。少量のP1は、５つの全ての試料
において逆相分析によって検出され、そしてまた５つの
肝臓のうち４つにおいてアフィニティ分析によって検出
された。以前の調査もまた、πがヒト肝臓中の少量成分
であることを示している。少量のμクラスGSTは、逆相
法により検出された。μクラスが、全GST内容物のごく
少量部分を構成する場合、アフィニティクロマトグラフ
ィーにおける小さなピーク形状により、μクラスの検出
は困難である。

HPLC技術を用いたこの新しいアフィニティクロマトグ
ラフィーシステムは、組織のGST二量体含量の分析に対
する従来のソフトゲルアフィニティシステムに比べて著
しい利点を有している。分析時間は十分の一に減少す
る。さらに、このアフィニティシステムに対する感度は
より大きい。なぜなら、従来のソフトゲルを用いた場合
では、ピーク容量が50〜100ミリリットルであったのに
比べて、HPLCアフィニティに対するピーク容量がほんの
約0.5ミリリットルであるからである。この技術はま
た、試料の洗浄および分析の両工程を組合わせて１工程
にできるという利点も有している。逆相HPLC、等電点ク
ロマトグラフィーまたは電気泳動のような他の技術は、
最終分析前にGSTをバッチ精製するために別のアフィニ
ティ工程を必要とする。

溶出液中の逆リガンドの勾配を用いたアフィニティク
ロマトグラフィーは、強力な分離技術である。溶出液中
の生体特異的リガンドの違いによって、クロマトグラフ
ィー分離は異なる選択性を示す。観察された異なる選択
性は、様々なイソ酵素に関連してリガンド間に存在する
結合定数の特有のセットによる。これは、逆リガンドと
してTER106またはＳ−ブチルグルタチオンを用いた溶出
プロフィールを比較したときのGSTの場合である。本発
明化合物の多数および他のリガンドはGSTと相互作用
し、そしてこれらのいかなるものも通常の分離を展開さ
せて特有の分離を与え得る。特に、本明細書中に報告し
た分析法は、注目の特定のGSTの予備単離に対して容易
にスケールアップし得る。

実施例11 ヒト細胞中の細胞毒性薬剤の相乗作用における本発明化
合物の使用 本実施例は、本発明化合物を含むGSTインヒビターに
よる癌化学療法に現在用いられる細胞毒性薬剤のヒト腫
瘍細胞における相乗作用、ならびに、これらの化合物の
エステル形の増強された細胞内効力を記載している。

HT−29（ヒト結腸アデノカルチノーマ）細胞をDr.Rob
erto Ceriani（Cancer Research Fund of Contra Costa
Country、Walnut Creek、CA）から入手し、そして他に
指定しなければ対数成長期に用いた。クロラムブシル
（CMB）をSigma（St.Louis、MO）から入手し、100％エ
タノールに溶解した。全てのGSTインヒビターを、使用
する直前に、エタノール、DMSO、または水に溶解した。
培養倍地に加えた同量の溶媒はベヒクルコントロールと
して役割を果たした。

細胞毒性に対する改変されたクローン原性アッセイで
は、ベヒクルまたはインヒビターの存在下、細胞を無血
清培地中に２×10⁵細胞/mlで懸濁させた。インヒビター
は、ベヒクル処理した細胞と比較した場合、≧90％生存
となる濃度で使用した。細胞を２時間培養し、次いで様
々な用量のCMBを加えた。次の２時間培養の終わりに、
細胞を血清含有培地で7.5−10×10³/mlに希釈し、そし
てMicrotest IIIマイクロタイタープレートにおいて、2
00μl/ウェルにて４つに分けてプレート接種した。

プレートを６日間培養し、そして改変メチレンブルー
法によりアッセイを行った。簡単に言えば、1.25％グル
タルアルデヒドを含むPBS液で細胞を固定し、次いで蒸
留水に溶かした0.05％メチレンブルーにより染色した。
プレートを蒸留水で数回洗浄して、保持されていない染
料を除去し、そして保持された染料を0.03N HCl中に再
可溶化した。プレートを、Molecular Devices Vmax pla
te reader（Molecular Devices、Redwood City、CA）に
おいて650nmで読み取った。IC₅₀値（細胞の生存を50％
減少させるインヒビター濃度）を、インヒビターの存在
下または非存在下で薬物に対して用量−応答曲線から決
定した。用量改変係数（dose modification factor）
（DMF）（細胞毒性の相乗作用の尺度）は、インヒビタ
ー処理をしていないCMBのIC₅₀値を、インヒビター処理
をしたCMBのIC₅₀値で割ることによって、各々のインヒ
ビターに対して計算した。

HT29細胞培養におけるいくつかのGSTインヒビターの
相乗作用試験の結果を表10に要約する。

表10〜12の結果は、実施例９、表５に示すように、GS
HのインヒビターであるとわかったいくつかのGSHアナロ
グもまた、様々なGSTの基質であるCMBによる培養ヒト腫
瘍細胞の死滅を増強することを示す。さらに、表10に示
すように、この相乗作用は、GSTインヒビターの取り込
みを増加させるように設計されたエステル化によって大
きく増大する。従って、100μＭのγＥ−Ｃ（Bz）−φ
Ｇ（化合物４、表５）は、CMBにより細胞死滅を増大せ
ず、50％細胞死滅に必要なCMB濃度を1.08のDMF減少させ
た。これに対して、ほんの12.5μＭの化合物４のジエチ
ルエステルは、CMB細胞毒性を1.65分の１に増大させ
た。

P1−１の優先的発現は、ヒト腫瘍の領域で報告されて
きた。本研究において、試験したいくつかのGSTインヒ
ビターのCMB相乗作用の効力は、表11に示すように、ヒ
トπ−クラスGSTイソ酵素であるP1−１のインヒビター
としての効力と直接に相関した。

クロラムブシルおよびHT−29細胞の相乗作用に対し
て、式（１）の化合物をエステル化またはアミド化した
場合の効果もまた、決定した。用量改変係数は、関連濃
度のγＥ−Ｃ（Bz）−φＧのジエチルエステル、ジアミ
ド、およびエステル／アミドに対して決定した。ジエス
テルは、12.5μＭでクロラムブシル毒性の1.65±0.04改
変を示した；ジアミドは、一度の実験ではあるが、200
μＭで1.0改変を示した；エステル／アミドハイブリッ
ドは、50μＭ濃度で1.45±0.16改変を示した。ジエチル
エステルおよびエステル／アミドハイブリッドに対する
結果は、３つの実験の平均±SDとして示す。

オクチルＧおよびベンジルPGを、３つの細胞株を用い
た標準的なクローン原性アッセイにおいて試験した:HT
−29のサブクローンであるHT4−1;卵巣癌腫であるSKOV
−３、およびSKOV−３のビンブラスチン耐性変異体であ
るVLB。３つの化学療法剤、クロラムブシル、アドリア
マイシンおよびマイトマイシンＣを毒性薬剤として用い
た。これらのアッセイでは、細胞を、ジエチルエステル
としての本発明化合物の存在下、６−ウェルプレートに
おいて2mlの培地で300細胞／ウェルにてプレート接種し
た。コントロールと比較した場合、85％より多い生存を
生じる濃度の化合物を使用した。細胞を付着させるため
に、１〜２時間培養した後、様々な用量の化学療法剤を
加えた。少なくとも３つのレプリケートウェルを、各々
の試験条件に対してプレート接種し、そしてプレートを
２週間培養した。コロニーを95％エタノールで固定し、
そしてコロニーを計数するために、クリスタルバイオレ
ットで染色した。IC₅₀値は、本発明化合物の存在下また
は非存在下における化学療法剤に対して決定し、そして
用量改変係数は、本発明化合物を有しない薬物のIC₅₀値
を、本発明化合物を有する薬物のIC₅₀値で割ることによ
り計算された。各々のプロトコールで得られた改変係数
を表12に示す。

表に示すように、25μＭのベンジルPGのジエチルエス
テルの存在下で、クロラムブシルを薬物対HT4−１細胞
として用いた場合、有意な改変が得られた。25μＭの同
化合物の存在下で、アドリアマイシンで処理した場合に
もVLB細胞において有意な改変が達成された。

図2aは、クロラムブシルの様々な投与量に対する結果
および25μＭのベンジルPGのジエチルエステルの改変効
果を表す。白ヌキ四角（□）は、クロラムブシルのみを
表し、黒塗丸（●）は、本発明化合物の存在下でのクロ
ラムブシルを表す。図2aに示すように、本発明化合物を
加えた場合、生存率が著しく減少する。図2bは、ジエチ
ルエステルが、細胞を透過するのに必要であることを確
認するものである。HT4−１細胞を、ベンジルPG（黒塗
四角■）またはそのジエチルエステル（黒塗丸●）のど
ちらかの存在下で、生存について試験した。エステル化
されていないジエチルＧは、これらの細胞に実質上効果
を示さないが、一方、ジエチルエステルは、明らかに毒
性がある。

実施例12 本発明化合物の代謝効果 毒性に関連してHT−29細胞に対する本発明化合物の代
謝効果を、Molecular Devices、Inc.,Menlo Park,CAに
より製造され、そしてMcConnell,H.M.ら.Science（199
2）257:1906〜1912およびWada、H.G.ら.AATEX（1992）
１:154〜164によって記載されたサイトセンサーマイク
ロフィジオメーター（Cytosenser Microphysiometer）
を用いて試験した。培養培地のpH変化を細胞代謝の関数
として測定する。細胞じゅうを流れる少容量の液体の酸
性化率は、反応チャンバーの生細胞数と相関する；酸性
化率の減少は、生存細胞数の減少を反映している。

この例では、HT−29細胞を10％ウシ胎児血清を含む培
地中に４×10⁵細胞／チャンバーにてプレート接種し
た。16〜18時間後、血清レベルを１％まで下げ、そして
細胞をさらに18時間維持した。次に、細胞をエタクリン
酸（50μＭ）、ベンジルPGのジエチルエステル（20μ
Ｍ）またはベヒクル（0.1％エタノール）のいずれかに
４時間曝した。次に、培地を無血清低緩衝能培地で置き
換え、そしてマイクロフィジオメーター分析を開始し
た。チャンバーの半分を100μＭクロラムブシルに曝
し、そしてもう半分をベヒクル（0.1％エタノール）に
曝した。酸性化率を16時間モニターし、データを基準
（100％）の酸性化率のパーセンテージとして表す。

結果を図３に示す。フェニルPGのジエチルエステルま
たはエタクリン酸のみのいずれも、酸性化率に対してあ
まり効果を示さなかった；しかし、エタクリン酸前処理
およびベンジルPGジエチルエステルによる前処理は、ク
ロラムブシルの効果を増強した。図において、白抜き記
号は、クロラムブシルの未添加を表す、黒塗り記号はク
ロラムブシルの添加を表す；四角はベヒクルによる前処
理を表し、三角はエタクリン酸による前処理を表し、そ
して丸は、ベンジルPGジエチルエステルによる前処理を
表す。

実施例13 様々な細胞株のGST分析 前述の分析に用いた細胞株のGSTプロフィールを以下
のように行った：細胞を採集し、無血清培地で二度洗浄
し、無カルシウム−マグネシウムPBSで一度洗浄し、次
いでペレットをスナップ凍結し、そして−80℃で保存し
た。凍結した細胞を、Castro、V.M.ら、Biochem J（199
3）292:371〜377に記載されるように、10mMのリン酸ナ
トリウム（pH7.0）;0.16MのKCl、100μＭのPefabloc SC
（Central Chem,Inc.,Stamford,CT）、１μＭのロイペ
プチン（Sigma）、2mMのEDTA、および2mMのジチオ−３
−イトール（dithio−３−itol）中で、ホモジナイズし
た。GSTを心収縮性（systolic）の画分からHPLCカラム
を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって単離
した。J.T.Baker 7105−00 Wide−PoreオクチルHPLCカ
ラム（25cm×4.6mm、VWR Scientific）によるGSTの逆相
分析、タンパク質決定、およびCDNB複合体化活性の決定
を、Castro、V.M.ら、Biochem J（1993）292:371〜377
に記載されるように行った。結果を表13に示す。

その結果は、全ての細胞株が、主要GSTイソ酵素とし
てP1−１を発現することを示す。SKOV−３およびVLB細
胞もまた中程度レベルのA2−２を発現するが、このイソ
酵素は、HT−29細胞で痕跡量にのみ見られた。それは、
HT4−１細胞では検出不能であった。非常に低レベルのM
T2−２が、HT−29およびSKOV−３において検出された。
33kDおよび27kDタンパク質（それぞれエノイルCo−Ａイ
ソメラーゼおよびGST−M3として同定された）もまた、
これらの細胞中に見出される。

実施例14 骨髄顆粒球マクロファージ（GM）前駆体の刺激 本発明化合物はまた、細胞を透過し得るためにエステ
ル化された場合、哺乳動物の被験体に投与された場合の
骨随のGM前駆体の生成を刺激する。実証的なアッセイで
は、３匹のB6D2F₁マウスを、腹腔内投与により様々な用
量のベンジルPGで処置した。大腿骨の骨随を24時間後に
採集し、そしてEast、C.J.ら.Cancer Chemother Pharma
col（1992）31:123〜126の方法によって、GM−CFUに対
するアッセイを行った。用量−依存の様式で、90mg/kg
のベンジルPGの投与量までコロニー数の増加があった。
これらの結果を図４に示す。90mg/kgにおいて、コント
ロールに対する約140/10⁴有核細胞のコロニーと比較し
て、50より多い細胞の約275コロニー/10⁴有核細胞が得
られた。

実施例15 インビボにおけるメルファラン（Melphalan）毒性の相
乗作用 雄性scidマウスに、ドナーマウスからHT4−１腫瘍を
皮下に移植した。腫瘍が約100mm³に達したとき、マウス
を６つの処置グループに無作為に分け、７日間以下のよ
うに処置した： 1. 5mg/kgメルファラン； 2. 10mg/kgエタクリン酸； 3. 60mg/kgベンジル−PGのジエチルエステル； 4. 5mg/kgメルファラン＋10mg/kgエタクリン酸； 5. 5mg/kgメルファラン＋60mg/kgベンジル−PGのジエ
チルエステル； 6.ベヒクルのみ。

マウスの体重変化をモニターし、そして腫瘍容量をカ
リパス（calipers）を用いた測定により決定した。腫瘍
の増殖は、メルファラン＋エタクリン酸のグループを除
いた全てのグループに対して、平均腫瘍サイズが1500mm
³に達するまでモニターした。このグループは、72日後
においてさえもこの容量に達しなかった。

結果は、コントロール腫瘍容量（すなわち、ベヒクル
のみを投与したグループにおいて）のパーセンテージと
して、実験において腫瘍容量によって計算した。メルフ
ァランのみが投与されたグループ１において、腫瘍は、
コントロールの容量の約75％であった。ベンジル−PGの
ジエチルエステルがメルファランと一緒に投与された場
合のグループ５においては、腫瘍容量平均は、コントロ
ールの約55％であった。メルファランとエタクリン酸と
を組み合わせて投与したグループ４においては、その容
量は、コントロールの約35％であった。従って、エタク
リン酸およびベンジル−PGのジエチルエステルの両方
は、メルファランの効果を増強する。（容量測定は、コ
ントロール腫瘍が1500mm³に達した時点で行った。）

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 5/10 Ｃ０７Ｋ 7/06 7/06 Ｃ１２Ｎ 9/10 // Ｃ１２Ｎ 9/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 リトル，マシュー エイチ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94956，ポイント レイズ ステーショ ン，ピー．オー．ボックス 1116（番地 なし) (56)参考文献 特開 昭61−15870（ＪＰ，Ａ) 特公 昭46−18730（ＪＰ，Ｂ１) 特表 平２−500841（ＪＰ，Ａ) 国際公開92／000320（ＷＯ，Ａ１) 国際公開92／019767（ＷＯ，Ａ１) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，Ｖｏｌ．292 （２），ｐ．371−377（1993) Ｅｎｚｙｍｅ，Ｖｏｌ．41，ｐ．175 −180（1989) Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏ ｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．35，ｐ. 55−62（1990) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 5/037 C07K 5/08 C07K 5/10 C07K 7/06 A61K 38/00 A61K 45/00 A61P 35/00 C12N 9/10 C12Q 1/48 G01N 33/566 G01N 33/573 ＣＡ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＢＩＯＳＩＳ／ ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下式の化合物： のアルキル型（１−10C）、アルケニル型（１−10C）、
   およびアリールアルキル型（７−12C）ジエステルまた
   はその塩： ここで、Ｚは、Ｓ、Ｏ、およびＣからなる群から選択さ
   れ； ｎは、１、２、または３であり； ここで、ＺがＯまたはＳであり、かつｎが１である場
   合、Ｘはモノ置換またはジ置換または非置換ヒドロカル
   ビル（１−20C）部分であって、任意に１個または２個
   の非隣接ヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、またはＮ）を含有し、そ
   してここで、該置換は、ハロ、−NO、−NO₂、−NR₂、O
   R、およびSRからなる群から選択され、ここで各Ｒは独
   立してＨまたは低級アルキル（１−4C）であり； ここで、ＺがＳであり、かつｎが２である場合、１つの
   Ｘは、上記の定義通りであり、そして他のＸは低級アル
   キル（１−4C）であり；そして ここで、ＺがＣであり、かつｎが３である場合、１つの
   Ｘは、上記の定義通りであり、そして他の２つのＸは、
   独立して、Ｈまたは低級アルキル（１−4C）である； Ｙ−COは、γ−Glu、β−ASP、Glu、Asp、γ−Glu−Gl
   y、β−Asp−Gly、Glu−Gly、およびAsp−Glyからなる
   群から選択され、そしてAA_cは、式（１）の化合物の残
   りの部分にペプチド結合によりカップリングされるフェ
   ニルグリシンおよびフェニルアラニンからなる群から選
   択されるアミノ酸である。
2. 【請求項２】前記ｎが１であり、そして前記Ｘが置換ま
   たは非置換ヒドロカルビルである、請求項１に記載のジ
   エステルまたはその塩。
3. 【請求項３】少なくとも１つの前記Ｘが置換または非置
   換のメチル、プロピル、ヘキシル、オクチル、ベンジ
   ル、ナフチル、またはトリチルである、請求項２に記載
   のジエステルまたはその塩。
4. 【請求項４】前記Ｙ−COがγ−Gluである、請求項１〜
   ３のいずれかに記載のジエステルまたはその塩。
5. 【請求項５】エチルエステルまたはベンジルエステルで
   ある、請求項１〜４のいずれかに記載のジエステルまた
   はその塩。
6. 【請求項６】前記ＺがＳである、請求項１〜５に記載の
   ジエステルまたはその塩。
7. 【請求項７】前記式１の化合物が、γＥ−Ｃ（Bz）−φ
   ＧまたはγＥ−Ｃ（Bz）−φＡである請求項４または５
   に記載のジエステルまたはその塩酸塩。
8. 【請求項８】請求項１〜７のいずれかに記載のジエステ
   ルまたは薬学的に受容可能なその塩を含有する、癌治療
   のための薬学的組成物。
9. 【請求項９】γＥ−Ｃ（Bz）−φＧのジエステルを塩酸
   塩として含有する、請求項８に記載の薬学的組成物。