DE69424678T2

DE69424678T2 - Glutathionanaloge und paraloge mischungen aus glutathion-ähnlichen substanzen

Info

Publication number: DE69424678T2
Application number: DE69424678T
Authority: DE
Inventors: Lawrence M. Kauvar; Matthew H. Lyttle
Original assignee: Telik Inc
Current assignee: Telik Inc
Priority date: 1993-09-24
Filing date: 1994-09-23
Publication date: 2000-09-07
Anticipated expiration: 2014-09-24
Also published as: EP0720620B1; AU693807B2; CA2171453A1; JP4025248B2; JP2004002442A; AU7842194A; PT720620E; DE69424678D1; ATE193302T1; WO1995008563A1; JPH09506336A; US5786336A; ES2148348T3; JP3503641B2; GR3033230T3; EP0720620A1; DK0720620T3; JP4099430B2; CA2171453C; JP2004059586A

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft Tripeptid-Verbindungen, welche neuartige Analoga von Glutathion sind. Die Erfindung betrifft auch Gruppen von Tripeptiden, welche Glutathion-Analoga sind, die unterschiedliche Eigenschaften aufweisen und sich zur Charakterisierung von Glutathion-Transferasen (GSTn) und als Inhibitoren von GST in Lösungsphase eignen.

Hintergrund der Erfindung

Glutathion (GSH) ist in seiner reduzierten Form ein Tripeptid der Formel: γ- Glu-Cys-Gly. Reduziertes Glutathion spielt eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung des Redox-Zustands in Zellen und ist auch ein essentielles Substrat für Glutathion-S-Transferase (GST), welche die Entgiftung fremder Substanzen durch eine Reihe von Mechanismen fördert, einschließlich Katalyse der Kopplung eines elektrophilen Anteils eines Toxins an beispielsweise Glutathion, was das Toxin für die Clearance zugänglicher macht. Ein zweiter Mechanismus, welcher ebenfalls Glutathion als Substrat beinhaltet, beruht auf der Reduktion von Peroxiden unter gleichzeitiger Oxidation von Glutathion.
Adang, A. E. P., et al., Biochem. J. (1990) 269: 47-54, beschrieben Tripeptid- Analoga von GSH, welche mit verschiedenen GST-Isoenzymen in verschiedenen Konzentrationen wechselwirken. Diese Analoga sind modifizierte Formen von GSH, bei denen mindestens einer der Glycin-, Cystein- oder γ-Glutaminreste durch einen alternativen Aminosäurerest ersetzt ist.
Weitere modifizierte Formen wurden beispielsweise von Principato, G. B., et al., Enzyme (1989) 41: 175-180, offenbart, welche die Wirkung eines Tripeptid-GSH- Analogons auf das Glyoxalase II-Enzym von Rattenleber untersuchten. Das von dieser Gruppe eingesetzte Tripeptid besaß die Formel γ-Glu-p-chlorphenylcarbonylmethyl-Cys-Ser. Morris, D., beschrieb in Biochem. J. (1960) 76: 349-353 die Synthese von γ-Glu-Benzyl-Cys-Val. Eine große Anzahl von GSH-Tripeptid-Analoga, die eine Substitution für nur eine der drei GSH-Aminosäuren enthalten, wurden mitgeteilt und sind im Handel erhältlich.
Die hier im folgenden beschriebene Erfindung betrifft neuartige Glutathion- Tripeptid-Analoga, welche sich eignen als Affinitätsliganden auf chromatographischen Trägern und als Mitglieder von Gruppen, welche zur Charakterisierung der verschiedenen Isoenzyme von Glutathion-S-Transferase eingesetzt werden. Glutathion-S-Transferasen (GSTn) liegen in Form einer Reihe von Isoenzymen vor, welche sich hinsichtlich spezifischer Bindungsfähigkeiten, hinsichtlich Substrat- und Inhibitorspezifitäten und in der Gewebeverteilung unterscheiden. Spezielle Komplemente von GST-Isoenzymen mit ihren verbundenen Unterschieden in den Eigenschaften sind somit charakteristisch für spezielle Gewebe oder Zelltypen, wie z. B. Tumorgewebe. Nachdem GST für den gesamten Metabolismus des Gewebes oder der Zelle eine zentrale Rolle spielt, da sie deren/dessen Verteidigung gegen toxische Substanzen betrifft, ist der Charakter des Komplements der GST für die Zelle oder das Gewebe von Bedeutung bei der Entwicklung von Strategien entweder zur Zerstörung der Zelle oder des Gewebes, wie es für Tumorzellen wünschenswert wäre, oder zur Erhöhung deren/dessen metabolischer Funktion, wie es für normales Gewebe der Fall wäre.
Die verschiedenen GST-Isoenzyme sind dimere Proteine, gebildet von binären Kombinationen von Monomeren, die von mindestens fünfzehn bekannten Genen in vier Genfamilien kodiert werden, was sogar unter der Annahme einer bevorzugten Dimerisierung von Monomeren aus derselben Genfamilie zu der theoretischen Möglichkeit von mehreren Dutzend verschiedener Dimere führt. Neben der Variabilität, die sich aus diesen kombinatorischen Möglichkeiten ergibt, sind die GST-Isoenzym-Untereinheiten in der menschlichen Bevölkerung polymorph und es wurde angenommen, daß sie aufgrund von Genkonversionsereignissen bei den als Tandem wiederholten Mitgliedern der Familie einer zusätzlichen Variation unterworfen sind. Posttranslationale Modifikationen tragen darüber hinaus zu dieser Variabilität bei. Nachdem jede Zelle oder jedes Gewebe eines oder mehrere dieser theoretisch möglichen Enzyme enthalten kann, ist die Bestimmung des GST- Komplements von großer Bedeutung.
Die vorliegende Erfindung bietet durch die Bereitstellung neuer Glutathion- Analoga, welche sich als Sorbentien und als Inhibitoren in Lösungsphase eignen, sowie von Gruppen, welche diese einschließen, verbesserte Verfahren zur Charakterisierung und Manipulation individueller GST-Enzyme oder Gruppen davon.

Offenbarung der Erfindung

Die Erfindung betrifft Reagenzien, die sich zur Charakterisierung von Glutathion-S-Transferase-Isoenzymen, zur Bestimmung der GST-Komplemente von Zellen und Geweben und für therapeutische Anwendungen eignen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind systematisch modifizierte Formen von reduziertem Glutathion und Gruppen, die solche Analoga mit unterschiedlichen Eigenschaften bezüglich der Zielenzyme aufweisen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich auch als chromatographische Affinitätsliganden, bindende Reagenzien und Enzyminhibitoren.
Die Ester der Tripeptide der Erfindung eignen sich besonders für therapeutische und diagnostische Anwendungen; die Amide sind auch zur Derivatisierung mit Gruppierungen befähigt, welche pharmakologische Eigenschaften oder physikalisches Verhalten modifizieren können. Somit betrifft die Erfindung in einem Aspekt Verbindungen der Formel:
und die Ester, Amide und gemischten Ester/Amide vom Alkyl-Typ (1-10C), Alkenyl-Typ (1-10C) und Arylalkyl-Typ (7-12C) davon;
worin Z aus der Gruppe, bestehend aus S, O und C, ausgewählt ist;
n 1, 2 oder 3 ist;
worin, wenn Z O oder S ist und n 1 ist, X eine mono- oder disubstituierte oder unsubstituierte Hydrocarbyl (1-20C)-Gruppierung darstellt, die gegebenenfalls 1 oder 2 nicht benachbarte Heteroatome (O, S oder N) enthält, und worin die Substitution ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Halogen, -NO, -NO&sub2;, -NR&sub2;, OR und SR, worin jedes R unabhängig H oder Niederalkyl (1-4C) ist;
worin, wenn Z S ist und n 2 ist, ein X wie oben definiert ist und das andere X Niederalkyl (1-4C) ist; und
worin, wenn Z C ist und n 3 ist, ein X wie oben definiert ist und die anderen beiden X unabhängig H oder Niederalkyl (1-4C) sind;
Y-CO aus der Gruppe, bestehend aus γ-Glu, β-Asp, Glu, Asp, γ-Glu-Gly, β- Asp-Gly, Glu-Gly und Asp-Gly, ausgewählt ist, und
AAc Phenylglycin, Phenylalanin oder substituiertes Phenylalanin; über eine Peptidbindung mit dem Rest der Verbindung der Formel (1) verknüpft, darstellt.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung oder Charakterisierung eines Human-Glutathion-S-Transferase (GST)- Enzyms, welches umfaßt das Kontaktieren einer Probe, von der angenommen wird, daß sie das Enzym enthält, mit einem festen Träger, an den eine Verbindung der Formel (1) wie oben definiert gekoppelt ist, unter Bedingungen, unter denen die Human-GST an den festen Träger adsorbiert wird, Abtrennen des Trägers von der Probe und Elution der Human-GST von dem Träger. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens eignet sich der Träger zur Verwendung in Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Systemen.
In noch weiteren Aspekten betrifft die Erfindung Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines GST-Enzyms in der Probe und gegebenenfalls zu dessen Charakterisierung anhand der Klasse, welches umfaßt die Behandlung der Probe mit einer Verbindung der Formel (1) wie oben definiert und Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Komplexes zwischen etwaiger, in der Probe vorhandener GST und der Verbindung der Formel (1).
Die Erfindung umfaßt auch Gruppen, die mindestens fünf verschiedene Tripeptid-Glutathion-Analoga der Formel (1) (oder die Ester, Salze, Amide, gemischten Ester/Amide oder Cycloamido-Formen davon) umfassen, wobei die Verbindungen in der Gruppe unterschiedliche Eigenschaften aufweisen. Die Gruppen können als Gruppen chromatographischer Träger aufgebaut sein und zur Charakterisierung eines GST-Komplements von Zellen eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft auch Verbindungen der Formel (1), worin X ein mono- oder disubstituiertes mono- oder bicyclisches Aryl (1-20C) ist, vorzugsweise Benzyl, wobei die Substitution aus der Gruppe, bestehend aus Halogen, -NO, -NO&sub2;, NR&sub2;, OR und SR, worin R H oder Alkyl (1-4C) ist, ausgewählt ist.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren und Protokolle, welche die Selektivität der Tripeptid-Glutathion-Analoga der Erfindung für die verschiedenen GST- Isoenzyme nutzen. Durch Berücksichtigung der GST-Isoenzym-Niveaus in Zielzellen im Vergleich zu Nicht-Zielzellen kann das geeignete Glutathion-Analogon ausgewählt werden, um einen selektive zytotoxische Wirkung auszuüben oder um selektiv die Wirkung eines chemotherapeutischen Agens bzw. Reagens zu erhöhen. Darüber hinaus sind die Analoga der Erfindung in der Lage, Knochenmark bei Säugerpatienten zu stimulieren und zu potenzieren. Es wurde ferner festgestellt, daß zur Entfaltung intrazellulärer Wirkungen die Verbindungen der Erfindung vorzugsweise als die Diamide oder Diester oder Hybride davon zugeführt werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung der Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Wirkung eines chemotherapeutischen Agens bzw. Reagens in einer Tumorzelle, welches Verfahren umfaßt, daß der Tumorzelle zusammen mit dem chemotherapeutischen Reagens eine wirkungserhöhende Menge eines Diesters oder Diamids einer Verbindung der obigen Formel (1) oder eines Amids, Esters oder eines Hybrid Amids/Esters davon verabreicht wird.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung der Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Ausübung einer zytotoxischen Wirkung auf Zielzellen im Vergleich zu Nicht-Zielzellen, welches Verfahren umfaßt die Identifizierung der GST-Isoenzyme, deren Niveaus in den Zielzellen gegenüber Nicht-Zielzellen erhöht sind;
das Auswählen einer Verbindung der Formel (1), welche das Isoenzym selektiv inaktiviert; und
Verabreichen der ausgewählten Verbindung oder eines Amids, Esters oder Hybrid-Amids/Esters davon an die Zielzeilen in einer Menge, die für die Zielzellen im Vergleich zu den Nicht-Zielzellen toxisch ist.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung der Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung der Produktion von Granulozyten-Makrophagen (GM)-Vorläuferzellen im Knochenmark eines Patienten, welches Verfahren umfaßt, daß dem Patienten eine wirksame Menge einer Verbindung der Formel (1) oder eines Amids, Esters oder Hybrid-Amids/Esters davon verabreicht wird.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1. Multivarianzanalyse von GST-Inhibitoren.
Die Inhibitor-Qualität wird sichtbar gemacht durch Auftragen der Wirksamkeit gegenüber jedem von drei rekombinanten Human-GST-Isoenzymen (A1-1, M1a-1a und P1-1) und Projektion der Punkte auf eine Ebene, welche durch die Hauptkomponenten der Verteilung definiert ist. Zielwerte für ideale Inhibitoren eines jeden Isoenzyms werden durch Kreise bezeichnet, die mit dem Namen des Isoenzyms markiert sind, die Kriterien für einen idealen Inhibitor sind eine 100-fache Spezifität und Ki = 0,1 uM. Drei Familien von Verbindungen, in Beispiel 9 dargestellt, werden verglichen: eine Auswahl von Paraloga aus Tabelle 5 (Zahlen), eine Reihe von n- Alkyl-GSH-Analoga aus Tabelle 7 (Cn in Fettdruck) und eine Auswahl der kleinen organischen Moleküle aus Tabelle 7 (Kursivdruck). Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind bestimmte Daten nicht aufgetragen, insbesondere diejenigen für Verbindungen niedriger Spezifität, welche im Zentrum des Diagramms gehäuft auftreten.
Fig. 2a demonstriert, daß die Diester-Form für das Eindringen in die Zelle hilfreich ist; Fig. 2b ist ein Diagramm, welches die Auswirkung des Diethylesters von Benzyl-PG (γE-C(Bz)-φG, siehe unten) auf die Potenzierung von Chlorambucil zeigt.
Fig. 3 zeigt die Auswirkung von Ethacrinsäure und Benzyl-PG auf die Chlorambucil-Toxizität in HT-29-Zellen.
Fig. 4 zeigt die Dosis-Antwort-Beziehung der Stimulierung von GM- Vorläuferzellen durch Verabreichung von Benzyl-PG.

Ausführungsformen der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verbindungen, welche sich individuell als chromatographische Liganden und als GST-Inhibitoren eignen, sowie Gruppen verwandter Verbindungen, welche unterschiedliche Eigenschaften aufweisen und sich zur Bestimmung von Profilen, beispielsweise von GST-Enzymen, und zur Bestimmung des GST-Komplements in unbekannten Proben eignen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind systematisch modifizierte Formen von reduziertem Glutathion und Gruppen, welche solche Analoga mit unterschiedlichen Eigenschaften bezüglich der Zielenzyme umfassen.
Frühere Tripeptid-Analoga von GSH, welche mit verschiedenen GST- Isoenzymen in verschiedenen Konzentrationen wechselwirken, sind modifizierte Formen von GSH, worin mindestens einer der Glycin-, Cystein- oder γ-Glutaminreste durch einen alternativen Aminosäurerest ersetzt ist. Siehe beispielsweise Adang, A. E. P., et al., Biochem. J. (1990) 269: 47-54, WO92/197. Angesichts der Vielfalt von Nicht-Standard-Aminosäuren, mit denen jede Aminosäure in dem GSH-Tripeptid substituiert wurde, und der zahlreichen anderen Möglichkeiten, kombiniert mit der Vielfalt an Substraten, welche mit dem Cystein-Sulfhydryl verknüpft werden könnten, wäre es möglich, zehntausende von GSH-Analoga als GST-Inhibitoren in Betracht zu ziehen.
Nach der bereits beschriebenen Paraloga-Strategie (US-Patente 4,963,263 und 5,133,866) wurde eine systematische Probenauswahl dieser potentiellen Gruppe vorgenommen. So wird eine repräsentative Statistik der potentiellen Vielfalt erzielt durch Monomer-Auswahlen, welche zu gleichzeitigen Variationen über ein breites Spektrum von multiplen Parametern mit Relevanz für die Bindung an GSTn aus verschiedenen Säugerspezies, vorwiegend der Ratte, führen. Parameter, auf die Gewicht gelegt wurde, schließen Hydrophobizität, Größe und Elektronegativität ein. Variationen in den Eigenschaften wurden primär am C-Terminus und an den Sulfhydryl-Positionen erzeugt.
Bei Tests mittels Affinitätschromatographie binden mehrere dieser verschiedenen Sorbentien selektiv Säuger-GST-Isoenzyme einer bestimmten Klasse oder Klassen nach dem folgenden Klassifizierungsschema, das von Mannervik, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1985) 82: 7202-7206, vorgeschlagen wurde: Alpha (z. B. Human-α und -A1-1, Ratten-1-1 und -2-2), My (Human-u, -M1a-1a, Ratten-3-3 und 4-4), P1 (Human-π und -P1-1, Ratten-7-7) und eine in jüngerer Zeit vorgeschlagene Klasse Theta (Ratten-5-5). Beim Test auf Inhibierung von enzymatischer GST- Aktivität wirken mehrere Sorbentien auch als selektive oder spezifische Inhibitoren von GST-Isoenzym-Klassen. Deshalb ermöglichen die Verbindungen, Gruppen und Verfahren dieser Erfindung neue Strategien zur Entwicklung von Arzneimitteln, die Zellen mit erhöhten Niveaus spezieller GST-Isoenzyme als Ziele haben.
Die Verbindungen der Erfindung potenzieren auch die Toxizität von chemotherapeutischen Reagenzien, während sie gleichzeitig anscheinend die Schutzwirkungen von Knochenmark potenzieren.
Konkret wurde festgestellt, daß die Verabreichung der Verbindungen der Erfindung die Produktion von Granulozyten-Makrophagen (GM)-Vorläuferzellen erhöht. In Anbetracht dieser Wirkung wird nicht nur die Toxizität des chemotherapeutischen Reagens gegenüber Tumorzellen erhöht, sondern normale Zellen sind auch besser gegen das chemotherapeutische Reagens geschützt. Ferner könnten die Verbindungen der Erfindung zur Behandlung verschiedener Defekte, die mit dem Knochenmark in Zusammenhang stehen, wie z. B. Anämie, geeignet sein.
Die Verbindungen, aus denen Reagenzien, die Selektivität für verschiedene GST-Isoenzyme zeigen, ausgewählt werden, sind eine Gruppe von Tripeptid- Glutathion-Analoga. Diese Verbindungen, wie im folgenden dargelegt, bieten ein Selektivitätsspektrum für die verschiedenen Isoenzyme. Dies macht entsprechende Mitglieder dieser Klasse geeignet für chromatographische Auftrennungen der Isoenzyme, als selektive Forschungsreagenzien bei der Manipulation von GSTn und als selektiv aktive Bestandteile in Verfahren zum gezielten Ansprechen bestimmter Zellen entweder hinsichtlich einer direkten zytotoxischen Wirkung oder durch Wirkungserhöhung anderer chemotherapeutischer Reagenzien.

Die Verbindungen der Erfindung

Die neuen Verbindungen der Erfindung umfassen die Gruppierung der Formel (1), worin ein X eine mono- oder disubstituierte oder unsubstituierte Hydrocarbylgruppierung (1-20C) ist, die gegebenenfalls ein oder zwei nicht benachbarte Heteroatome (O, S oder N) enthält, und das andere nicht vorhanden oder Niederalkyl (1-4C) ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist n 1 und X ist unsubstituiertes Hydrocarbyl. Bevorzugte Ausführungsformen für X schließen Methyl, Propyl, Hexyl, Octyl, Benzyl, Naphthyl und Trityl ein.
Wie hier verwendet, bezieht sich "Hydrocarbyl" auf einen geradkettigen oder verzweigtkettigen oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen oder aromatischen Hydrocarbylrest, der 1-20C enthält. Über die 1-20C hinaus kann das Hydrocarbyl auch, falls strukturell vertretbar, ein oder zwei nicht benachbarte Heteroatome enthalten, die O, S oder N sind. Somit kann die so modifizierte Hydrocarbylgruppe ein Ether, ein Diether, ein Thioether oder Dithioether oder ein sekundäres oder tertiäres Amin oder Diamin sein. Repräsentative Beispiele solcher Substituenten schließen Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, tert.-Butyl, Hexyl, Octyl, Nonyl, 2,3-Dimethyloctyl, Dodecyl, 9,9-Dimethylundecyl, Allyl, 2-Butenyl, Isobutenyl, Cyclohexyl, Cyclopentyl, Cycloheptyl, Phenyl, Benzyl, 4-Methylbenzyl, Triphenylmethyl, Methoxyethyl, Ethylthioethyl, Diethylaminopropyl und dgl. ein. Von den Hydrocarbylgruppen, die sich für X eignen, werden auch bicyclische Aryl (1-20C)-Gruppierungen, einschließlich Naphthyl und heterocyclische Verwandte und dgl., umfaßt.
Darüber hinaus kann das Hydrocarbyl oder das Hydrocarbyl, welches ein oder zwei Heteroatome enthält, gegebenenfalls mit einem oder zwei Substituenten substituiert sein. Diese Substituenten können Halogen, d. h., Fluor, Chlor, Brom oder Iod, oder Hydroxy oder Sulfhydryl und/oder Alkoxy oder Alkylthio, z. B. Methylthio, Butylthio, Propoxy oder Ethoxy, und/oder -NO, -NO&sub2; oder -NH&sub2;, -NH(Alkyl) oder -N(Alkyl)(Alkyl) sein.
Gemäß den Valenzvorgaben muß, wenn Z O ist, n 1 sein; wenn Z S ist, kann n 1 sein (oder 2, wenn S eine positive Ladung aufweist); und wenn Z C ist, muß n 3 sein. Nur ein X darf aus der oben angegebenen komplexen Gruppe stammen. Wenn n 2 ist, ist das zweite X Niederalkyl, wenn n 3 ist, sind das zweite und dritte X jeweils unabhängig H oder Niederalkyl (1-4C).
AAc kann Phenylglycin (PG oder φG), Phenylalanin oder substituiertes Phenylalanin sein. AAc ist mit dem Rest der Verbindung der Formel (1) über eine Peptidbindung verknüpft.
In den Verbindungen der Erfindung führt die Substitution von Phenylglycin für Gly, welche die Hydrophobizität und die Raumbeanspruchung an dieser Stelle erhöht, zu einer hohen Spezifität für Isoenzyme der π-Klasse (z. B. Ratten 7-7).
Für Verbindungen der Erfindung, worin X substituiertes Benzyl ist, sei es in Form der freien Säure oder eines Salzes der Formel (1) oder als Ester, Amide oder Cycloamido-Formen, kann die Spezifität für verschiedene Subtypen von Human- GSTn gesteuert werden durch Variation des para-Substituenten auf der Benzyl gruppierung. Ausführungsformen von X, welche hydrophobe para-Substituenten enthalten, wie z. B. t-Butyl oder Methyl oder Benzyl, binden vorwiegend an Human- GSTn der u (M1)-Klasse, wie z. B. GST-M1a-1a. Elektronenziehende Substituenten an der para-Position, wie z. B. Nitro oder Chlor, binden vorzugsweise π (P1-1)- Enzyme. Auftragungen von Hammett-Sigma/Meta-Werten gegen den logarithmischen Bruchteil von gebundenem Isoenzym zeigen eine lineare Korrelation, es scheint jedoch keine klare Korrelation auf, wenn Sigma/Para-Werte verwendet werden. Eine gewisse sterische Raumbeanspruchung scheint erforderlich zu sein, um GSTn allgemein zu binden; Benzyl-Substituenten, die unsubstituiert sind oder nur Fluorid-Substitutionen enthalten, binden nicht nennenswert.
Für erfindungsgemäße Verbindungen, worin X eine unsubstituierte Hydrocarbylgruppierung (1-20C) ist, sei es in Form der freien Säure oder des Salzes der Formel (1) oder als Ester, Amide oder Cycloamido-Formen, kann die Spezifität für verschiedene Subtypen von Human-GSTn gesteuert werden durch Variation der Hydrophobizität des Substituenten am Schwefelatom der Cys-Gruppierung, beispielsweise der Länge von n-Alkyl-Addukten. Im allgemeinen nimmt die Bindungsstärke für GSTn mit der Kettenlänge der Alkylgruppe zu, es gibt jedoch eine Veränderung der Isoenzym-Selektivität mit zunehmender Kettenlänge. Ausführungsformen von X, welche S-Alkyl-Ketten von drei oder vier Atomen enthalten, inhibieren vorwiegend Human-GSTn der u-Klasse, insbesondere GST-M1a-1a. Im Bereich von Alkylgruppen, die 5 bis 8 Kohlenstoffe enthalten, werden Human-GSTn der α- und u-Klassen etwa im selben Ausmaß inhibiert und werden im Vergleich zu einem Human-π-Klasse-Isoenzym selektiv inhibiert. Schließlich werden Human- GSTn aus allen drei Klassen von S-Nonyl- und S-Decyl-GSH-Derivaten etwa im selben Ausmaß inhibiert.
Die Verbindungen der Erfindung können die Alkyl-, Alkenyl- oder Arylalkyl- Ester oder Amide vom Alkyl-Typ, Alkenyl-Typ oder Arylalkyl-Typ einschließen oder in den amidocyclischen Formen vorliegen. Alkyltyp-Ester der freien Carboxylgruppen sind Ester der geradkettigen und verzweigtkettigen und cyclischen Alkylalkohole (1- 10C), wie z. B. Methanol, Ethanol, Isopropanol, t-Butanol, n-Hexanol und dgl. Die Kohlenstoffkette des Alkohols vom Alkyl-Typ kann durch ein oder zwei nicht benach barte(s) Heteratom(e), d. h. N, O oder S, unterbrochen sein. Beispielsweise schließen Alkohole vom Alkyl-Typ N,N-Dimethylethanolamin und 2-(1-Hydroxy-2-ethyl)-4,4,6- trimethyltetrahydro-1,3-oxazin ein. Geeignete Amide vom Alkyl-Typ (1-10C) sind diejenigen von primären geradkettigen oder verzweigtkettigen oder cyclischen Alkylaminen, wie z. B. Methylamin, Ethylamin, n-Propylamin, Isopentylamin und Isohexylamin. Diese Kohlenstoffketten können auch von einem oder zwei nicht benachbarten Heteratom(en), d. h. N, O oder S, unterbrochen sein. Ester und Amide vom Alkenyl- Typ werden aus den entsprechenden Aminen hergestellt, welche mindestens eine Doppelbindung enthalten. Ester vom Arylalkyl-Typ können 7-12 C enthalten und schließen Phenylniederalkyl-Derivate wie Benzyl, 2-Phenylethyl, 2-Phenylpropyl und dgl. ein. Die Phenylgruppe kann unsubstituiert sein oder mit 1-2 Substituenten substituiert, wie z. B. Methyl, Chlor und dgl., welche die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen nicht substantiell beeinflussen. Wiederum kann die Kohlenwasserstoffkette von einem oder zwei Heteroatom(en) unterbrochen sein und heterocyclische aromatische Systeme können ebenfalls eingeschlossen sein. Die Ester und Amide werden nach herkömmlichen Techniken unter geeignetem Schutz etwaiger funktioneller Alkohol- oder Aminogruppen in der Substratverbindung der Formel (1) hergestellt.
Es sollte betont werden, daß die Verbindungen entweder als die Mono- oder Diester oder als die Mono- oder Diamide (oder Triester oder Triamide, je nach Wahl von AAC) hergestellt werden können. Somit umfaßt die Erfindung Ester, worin nur eine der Carboxylgruppen verestert ist, worin zwei Carboxylgruppen verestert sind oder worin alle Carboxylgruppen (falls mehr als zwei vorliegen) verestert sind. Ähnliche Ausführungsformen sind auf die entsprechenden Amide übertragbar. Darüber hinaus können die Verbindungen als gemischte Ester/Amide hergestellt werden, worin ein Carboxyl ein Ester und ein anderes ein Amid ist.
Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen können von anorganischen Basen wie Natrium- oder Kaliumhydroxid oder von organischen Basen wie Koffein oder Piperidin gebildet werden, um die basischen Salze der freien Carboxylgruppen zu bilden, oder können von organischen oder anorganischen Säuren gebildet werden, um die Säureadditionssalze von freien Aminogruppen zu erhalten. So können die Salze von anorganischen Basen, wie z. B. Natriumhydroxid, Calciumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Magnesiumhydroxid und dgl., stammen oder von organischen Basen, wie z. B. Trimethylamin, Pyridin, Pyrimidin, Lysin, Koffein und dgl. Die Säureadditionssalze können von anorganischen Säuren, z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dgl., oder von organischen Säuren, wie z. B. Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure und dgl., gebildet werden.
Salze werden in Standardprotokollen durch Behandlung mit der geeigneten Base oder Säure bei einer Temperatur von etwa 0ºC bis etwa 100ºC, vorzugsweise bei Raumtemperatur, entweder in Wasser allein oder in Kombination mit einem inerten, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol oder Dioxan gebildet.
Cyclische Formen der Verbindung der Formel (1) werden hergestellt durch Verbrückung von freien Amino- und freien Carboxylgruppen, die in der Substratverbindung enthalten sind. Die Bildung der cyclischen Verbindungen erfolgt auf herkömmliche Weise durch Behandlung mit einem Dehydratisierungsmittel wie Dicyclohexylcarbodümid nach im Stand der Technik an sich bekannten Verfahren, erforderlichenfalls unter geeignetem Schutz.
In den meisten Ausführungsformen der Verbindungen der Formel (1) wird das Cycloamid zwischen der freien Aminogruppe, die am Aminoterminus von Y vorliegt, und der Carboxylgruppe am Carboxyterminus, der durch AAc repräsentiert wird, gebildet. Geeignete Schutzgruppen können eingesetzt werden, um die Cycloamidierung zu steuern, wie im Stand der Technik bekannt.
Die Verbindungen der Erfindung können weiter charakterisiert werden durch Festlegung der Identitäten von Y-CO, n, X, Z und AAc. Die verschiedenen Ausführungsformen von "Y-CO" umfassen γ-Glu, β-Asp, Glu, Asp, γ-Glu-Gly, β-Asp- Gly, Glu-Gly und Asp-Gly, welche in dem einbuchstabigen Aminosäure-Code als γE, βD, E, D, γE-G, βD-G, E-G bzw. D-G symbolisiert werden können. Die verschiedenen Substituenten, die durch X bezeichnet werden, können mit Standardabkürzungen angegeben werden und deren Einschluß in die Tripeptid-Analoga der erfindungsgemäßen Verbindungen symbolisiert durch C(O) (X), wenn n = 1 und Z O ist, oder C(X), wenn Z S ist, oder C(X) (X), wenn n = 2 (Z muß S sein), oder C(X) (X) (X), wenn n = 3 (Z muß C sein). Falls jedoch ein X H ist, so ist es in der Darstellung einfach nicht als H oder H&sub2; angegeben. In denjenigen Verbindungen der Formel (1), worin n gleich 2 ist, wird das Schwefelatom des Cysteinrests eine positive Ladung aufweisen und als Sulfoniumion vorliegen.
Verbindungen, in denen Z O ist, schließen beispielsweise γ-Glutamyl-(o- hexyl)serinylglycin, γ-Glutamyl-(o-octyl)serinylglycin und dgl. ein. Verbindungen, in denen Z C ist, schließen beispielsweise γ-Glutamylhistidinylglycin, γ-Glutamyl-(π- benzyl)histidinylglycin und γ-Glutamyl-α-aminooctanoylglycin und dgl. ein. Verbindungen, in denen Z O oder C ist, sind oxidationsbeständiger als Verbindungen, die S an der Z-Position enthalten.
Die Notation für AAc kann ebenfalls in dem einbuchstabigen Standard- Aminosäureabkürzungscode vorliegen oder als irgendeine andere geeignete Abkürzung für nicht von Genen kodierte Aminosäuren.
Somit schließen bei Verwendung dieser Notation geeignete Verbindungen der Formel (1):
γE-CH(Me)(p-NO&sub2;Bz)-PG,
γD-C(Hx)-PG,
D-G-C(Hx)-F,
γE-C(O)(p-EtSBz)-PG,
γE-C(O-BuBz)-PG
und dgl. sowie die cyclisierten oder veresterten/amidierten Formen ein.

Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen

Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich als immobilisierte oder in Lösungsphase vorliegende Inhibitoren von Enzymen, wie z. B. Gutathion-S-Transferasen (GSTn), welche Glutathion als Substrat einsetzen. Eine solche Inhibierung kann sowohl auf analytischen als auch therapeutischen Gebieten wünschenswert sein.
Als therapeutische Mittel sind die veresterten Verbindungen der Erfindung am geeignetsten, da die Permeation der Zellmembran am besten durch diese weniger hydrophilen Formen erreicht wird. Geeignete Amide oder Ester/Amid-Hybride können so ebenfalls eingesetzt werden. Besonders bevorzugte Ester sind die Benzylester und derivatisierten Benzylester. Ebenfalls bevorzugt sind die Ethylester.
Es wird jedoch angenommen, daß die intrazellulären Wirkungen auf der Bildung der unveresterten Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen beruhen.
Nachdem die Verbindungen der Erfindung Dicarbonsäuren sind, sind die Diester die bevorzugte Form. In einigen Fällen scheint der Metabolismus über den Monoester abzulaufen; nichtsdestoweniger wird angenommen, daß die aktive Form intrazellulär die unveresterte Form ist. Allerdings scheint die Aufnahme von Glutathion an sich durch Veresterung inhibiert zu werden, wie beschrieben von Welner, W. P., et at, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 4732-4735; Anderson, M. E., et al., Arch. Biochem. Biophys. (1985) 239: 538-548; Tsan, M. -F., et al., J. App. Physiol. (1989) 66: 1029-1034. Dies ist möglicherweise auf die Nutzung von Aminosäure- Aufnahmekanälen für Glutathion selbst zurückzuführen. Andererseits stellten Lo, T. W. C., et al., Biochem. Pharmacol. (1992) 44: 2357-2363 fest, daß Diethylester von Glyoxalase-Inhibitoren zum Eindringen in Tumorzellen in der Lage waren.
Somit sind zur Verwendung in vitro in Zellkultur, beispielsweise in Screening- Assays, die bevorzugten Verbindungen der Erfindung die veresterten Formen. Dies wird hinsichtlich der Toxizität gegenüber HT-29-Zellen nach 4-stündiger Exposition von 2 · 10&sup5; Zellen/ml in serumfreiem Medium für den Diethylester gegenüber der Dicarbonsäureform drastisch demonstriert. Vier Modellverbindungen wurden verwendet, um dieses Merkmal zu demonstrieren. Diese vier Verbindungen sind wie folgt:
1) γ-Glutamyl-S(octyl)cysteinylglycin, abgekürzt "Octyl-G", besitzt einen IC&sub5;&sub0;-Wert von > 200 uM in der Dicarbonsäureform; der IC&sub5;&sub0;-Wert ist 22 uM für den Diethylester;
2) γ-Glutamyl-S(hexyl)cysteinyl-R(-)-phenylglycin, abgekürzt "Hexyl-PG", besitzt einen IC&sub5;&sub0;-Wert von > 200 uM in seiner Dicarbonsäureform, als Diethylester jedoch einen IC&sub5;&sub0;-Wert von 24 uM;
3) γ-Glutamyl-S(benzyl)cysteinyl-R(-)-phenylgylcin, abgekürzt "Benzyl-PG", besitzt ebenfalls einen IC&sub5;&sub0;-Wert von > 200 uM in der Form der freien Säure, jedoch einen IC&sub5;&sub0;-Wert von 47 uM für den Diethylester;
4) γ-Glutamyl-S(naphthyl)cysteinylglycin, abgekürzt "Naphthyl-G", besitzt einen IC&sub5;&sub0;- Wert von > 200 uM, jedoch einen IC&sub5;&sub0;-Wert von 40 uM für den Diethylester.
Die vorgenannten Werte für IC&sub5;&sub0; wurden wie oben beschrieben bestimmt und die Zellen wurden unter Anwendung des in Beispiel 11 unten beschriebenen modifizierten klonogen Assays untersucht.
Darüber hinaus bieten sowohl die Ester als auch die Amide die Möglichkeit, die erfindungsgemäßen Verbindungen auf Weisen zu modifizieren, welche deren Eignung als therapeutische Agentien, als diagnostische Reagenzien und als Liganden zur Kopplung an feste Träger beeinflussen. Die Ester- oder Amidgruppen können weitere geeignete Liganden enthalten, beispielsweise hydrophobe Gruppierungen, um das Eindringen in die Zelle zu fördern, reaktive Gruppen, um die Verknüpfung mit anderen Substanzen zu erleichtern, und weitere Liganden, wie z. B. Antikörper oder Fragmente davon, Träger zur Erhöhung der Immogenizität und dgl. Ferner können die Verbindungen modifiziert werden durch den Einschluß von Substituenten wie Ghelatbildnern, welche die Reinigung durch Immobilisierte-Metallionen-Affinitätschromatographie erleichtern, oder Substituenten, welche die Löslichkeit des Peptids verändern, oder welche Pharmakokinetiken beeinflussen, wie z. B. die Zugabe von Polyethylenglykol.
Somit bieten die Ester und Amide der Verbindung der Formel (1) in einer Vielfalt von Zusammenhängen deutliche Vorteile gegenüber den Formen der freien Säure oder des Salzes.
Die Cycloamido-Formen der Verbindung der Formel (1) bieten den Vorteil erhöhter Spezifität und Selektivität gegenüber Ziel-GSTn. Die cyclischen Formen sind im allgemeinen den offenkettigen Formen als chromatographische Liganden überlegen. Darüber hinaus werden deren Inhibierungseigenschaften - durch dieses Merkmal moduliert.
Die Verbindungen der Erfindung, welche substituiertes Benzyl als Ausführungsform von X enthalten, sind insofern vorteilhaft, als sie die Möglichkeit bieten, die Selektivität der Verbindungen für die verschiedenen GSTn systematisch zu steuern. Beispielsweise wird, wie hier in Beispiel 8 gezeigt, die Bindungsspezifität bei den u- und π-Gruppen von Human-GSTn gesteuert durch die Natur des para- Substituenten auf einer Benzylgruppierung, die mit dem Schwefelatom des Cysteinrests bestimmter Verbindungen der Erfindung verbunden ist. Es besteht eine Korrelation in der Bindungsspezifität zu den Sigma (Meta)-Werten der para- Substituenten auf S-Benzyl-Cys-Gruppierungen.
Die oben dargelegten vier bevorzugten Verbindungen zeigen eine klare Selektivität bezüglich GST-Isoenzyme. Keine dieser Verbindungen zeigte irgendeine nennenswerte Inhibierung von Glutathion-Reduktase (wobei GSSG-Reduktion durch das Verschwinden von NADPH gemessen wurde) oder von γ-Glutamyl- Transpeptidase (wobei der Transfer von Glutamyl von Glutamyl-p-nitroanilin zu Glycylglycin bewertet wurde). Bei diesen Tests besaßen alle vier Verbindungen (ebenso wie Ethacrinsäure) IC&sub5;&sub0;-Werte von mehr als 1 mM. Es wurden jedoch erhebliche Unterschiede festgestellt bezüglich des Vermögens jeder dieser vier Verbindungen, GST-Isoenzyme zu inhibieren. Wenn die GST-Isoenzyme P1-1, A1-1, M1a-1a und M2-2 bezüglich dieser Verbindungen getestet wurden, wurden die Unterschiede in der Selektivität deutlich. Benzyl-PG und Hexyl-PG inhibierten P1-1 im Vergleich zu den verbleibenden drei Isoenzymen selektiv, obwohl Hexyl-PG eine annehmbare Inhibierung bezüglich A1-1 zeigte. So betrugen, während Benzyl-PG bezüglich P1-1 einen Ki-Wert von nur 0,4 uM zeigte, die entsprechenden Ki-Werte für die verbleibenden A1-1, M1a-1a und M2-2 20, 25 bzw. 31 uM. Während Hexyl- PG bezüglich P1-1 einen Ki-Meßwert von 0,85 uM bezüglich P1-1 ergab, betrugen die Ki-Werte für die verbleibenden Enzyme, in dieser Reihenfolge, 5,8, 41 bzw. 97.
Andererseits zeigte Naphthyl-G einen Ki-Wert bezüglich M1a-1a von nur 0,1 uM; die Werte für P1-1, A1-1 und M2-2 betrugen 1,2, 4,2 bzw. 1,5 uM. Octyl-G war eindeutig selektiv für A1-1 und ergab einen Ki-Wert von 0,27 uM im Vergleich zu 1,2 uM für M1a-1a und 1,9 uM für P1-1. Die Ki-Werte für Ethacrinsäure bezüglich aller drei Isoenzyme waren vergleichbar: 4,0 uM für P1-1; 2,0 uM für A1-1 und 3,0 uM für M1a-1a.
Somit sind Benzyl-PG und Hexyl-PG besonders wirksame Inhibitoren für P1-1 zum Ausschluß der anderen getesteten Isoenzyme; Naphthyl-G ist selektiv für M1a- 1a und Octyl-G ist selektiv für A1-1.
Es ist somit ersichtlich, daß unter den verschiedenen Verbindungen der Erfindung Analoga gefunden werden können, welche für gewünschte Ziel-GSTn selektiv sind. Wie in den folgenden Beispielen reflektiert, führt dies zu der Möglichkeit, therapeutische Protokolle entsprechend der Art des chemotherapeutischen Mittels und seines damit verbundenen Engiftungsmechanismus und entsprechend dem GST-Komplement der Zielzellen zu gestalten.

Verwendung als chromatographische Liganden und analytische Reagenzien

Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich auch individuell als diagnostische chromatographische Träger und chromatographische Werkzeuge. Der Einsatz dieser Verbindungen bei der Affinitätschromatographie zur Charakterisierung und zur Reinigung sowie in diagnostischen Assays ist von besonderer Bedeutung im Falle von Human-GSTn. Obwohl Gruppen der erfindungsgemäßen Verbindungen am bequemsten sind, um das GST-Komplement von Geweben zu bestimmen, können individuelle Verbindungen eingesetzt werden, um die Anwesenheit von GSTn allgemein oder von GSTn eines bestimmten Typs bei Menschen nachzuweisen, sowie bei der Reinigung bestimmter Typen von Human-GSTn. Wie in Beispiel 8 unten gezeigt, besitzen verschiedene Verbindungen der Erfindung somit unterschiedliche Neigungen zur Bindung von Human-GSTn der Klassen u (M1) und π (P1) sowie verschiedener Ratten-Isoenzyme. Darüber hinaus zeigen, wie in Beispiel 9 gezeigt, Verbindungen der Erfindung auch eine selektive Inhibierung bestimmter Human-GSTn in Lösungsphase. In den meisten Fällen zeigen Affinitätschromatographie- und Inhibierungsstudien dieselbe Enzymspezifität für jede Verbindung der Erfindung.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen oder die Verbindungen der Formel (1) allein als freie Säuren oder Salze können als chromatographische Liganden zur Reinigung und Charakterisierung von Human-GSTn als Kollektiv, zur Reinigung und Identifizierung von Human-Klassen von GSTn oder zur Reinigung oder Auftrennung von individuellen Human-GST-Enzymen je nach der Wahl des Liganden eingesetzt werden.
Zur Verwendung als Affinitätsliganden auf einem chromatographischen Träger werden die Verbindungen, die Formel (1) einschließen, an eine geeignete feste Matrix, wie z. B. Sepharose, Polyacrylamid, Silica und dgl., unter Anwendung von Standard-Kopplungstechniken gekoppelt. Die nicht-cyclischen Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten mindestens funktionelle Amino- und Carboxylgruppen, die mit geeigneten Linkem derivatisiert oder direkt an Träger derivatisiert werden können. Je nach der Art des festen Trägers kann die Kopplung des Affinitätsliganden eine direkte kovalente Kopplung einsetzen oder die Verwendung von homo- oder hetero-bifunktionellen Linkem, wie z. B. diejenigen, welche von Pierce Chemical Company (Rockford, IL) erhältlich sind, erfordern. Es kann auch wünschenswert sein, den Affinitätsliganden von der Oberfläche des Trägers zu beabstanden, um ihn leichter zugänglich zu machen. Eine solche Beabstandung kann, wie allgemein verständlich, durch Verwendung von Spacer- Armen erzielt werden. Ferner kann der Träger mit einem inerten Material, beispielsweise Human-Serumalbumin, behandelt werden, um so unerwünschte Wechselwirkungen zu minimieren, insbesondere, falls der Träger für die Chromatographie von biologischen Proben eingesetzt werden soll.
Die derivatisierten chromatographischen Träger können die Vielfalt der Verbindungen, welche die Struktur der Formel (1) beinhalten, nutzen durch Kopplung des festen Trägers an mehr als einen solchen Liganden. Die Liganden können in einem Gradienten, willkürlich als Mischung oder in irgendeinem vorherbestimmten gewünschten Muster zusammengestellt werden. Darüber hinaus können Kombinationen der Verbindungen der Erfindung in chromatographischen Anwendungen eingesetzt werden, worin eine Abstimmmung zwischen einer oder mehreren Verbindung(en), welche als Affinitätsligand(en) dient/dienen, und einer oder mehreren Verbindung(en), welche als Konkurrenz zu dem Affinititätsliganden eingesetzt wird/werden, vorgenommen wird, um eine Elution derjenigen Materialien zu bewirken, die Gegenstand einer chromatographischen Auftrennung oder Charakterisierung sind. Materialien variierender Affinität für die Gruppierungen, die der chromatischen Technik unterworfen werden, werden für die Liganden und die Elutionsmittel eingesetzt, wie in Beispiel 10 unten erläutert.
Die chromatographischen Träger, die mit Verbindungen, welche die Formel (1) beinhalten, derivatisiert sind, können dann eingesetzt werden zur präparativen Auftrennung von Human-GSTn oder anderen Enzymen, für welche die Liganden Affinität aufweisen, anderen Enzymen, die Glutathion als Substrat nutzen, Antikörpern, welche mit Glutathion reagieren, oder anderen Gruppierungen, die mit mäßiger Affinität an die Liganden binden. Chromatographische Träger, die an die Verbindungen der Erfindung gekoppelt sind, können auch in der Diagnose eingesetzt werden, um die Anwesenheit, Abwesenheit, Quantität oder Art von Materialien in biologischen oder anderen Proben zu bestimmen, von denen angenommen wird, daß sie Materialien enthalten, die eine ähnliche Struktur wie Glutathion aufweisen. Beispielsweise kann Affinitätschromatographie unter Verwendung von Verbindungen der Erfindung in einem neuen HPLC-Verfahren eingesetzt werden, um GST-Isoenzyme in dimerer bioaktiver Form aus Human- Geweben wie Leber zu isolieren und aufzutrennen, wie in Beispiel 10 unten erläutert.
Die geeignete Verbindung, welche die Struktur der Formel (1) enthält, die sich für solche Auftrennungen oder Analysen eignet, kann sich aus der Art des Analyten oder Materials ergeben, dessen Präparation gewünscht wird, oder kann unschwer bestimmt werden durch Herstellung einer vielfältigen Gruppe der Verbindungen und Screenen der Gruppe hinsichtlich des wirkungsvollsten Affinitätsliganden.
Die Verbindungen, welche die Struktur der Formel (1) enthalten, können auch eingesetzt werden zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Human- GSTn allgemein oder für eine spezielle Klasse oder ein spezielles Isoenzym davon. Protokolle für solche Assays sind denjenigen nachgebildet, die in einem Immunoassay eingesetzt werden; diese Protokolle sind allgemein anwendbar auf beliebige Assays unter Beteiligung von spezifischen Bindungspartnern, wobei die Spezifität des Assays von der Spezifität der Bindung abhängt. Somit spielen bei solchen Assays die Verbindungen, welche die Struktur der Formel (1) beinhalten, die Rolle von Antikörpern oder anderen immunreaktiven Agentien, die für den Analyten spezifisch sind, in diesem Falle die relevante GST. Solche Protokolle umfassen Sandwich-Assays, Konkurrenz-Assays, direkte Bindungsassays und dgl. mit einer großen Vielfalt von Nachweismitteln zur Bildung von "Immunkomplexen" (in diesem Falle eines Komplexes zwischen GST und der Verbindung, welche die Struktur der Formel (1) beinhaltet). Solche Nachweismittel schließen fluoreszierende Markierungen, Enzym-Markierungen, radioaktive Markierungen und Kombinationen davon ein.

Gruppen

Die Gruppen der Erfindung sind aufgebaut aus mindestens fünf verschiedenen Tripeptid-Analoga von Glutathion der Formel (1), worin X, AAc und Y wie oben definiert sind, worin jedoch X auch H sein kann. Die Gruppen snd am geeignetsten, wenn sie eine maximale Eigenschaftsvielfalt aufweisen. Diese Vielfalt kann hervorgerufen werden durch Variation der Arten von Y, AAc und X. Im allgemeinen kann durch Einsatz von X-Substituenten, beispielsweise von variierender Hydrophobizität, ein Spektrum solcher Hydrophobizitätseigenschaften erhalten werden. X ist auch ein günstiger Substituent zur Variation der Hammett-Konstanten (Sigma/Meta- und Sigma/Para)-Diversität der resultierenden Verbindungen. Die Diversität, welche aus einer Variation von AAc resultiert, ist etwas weniger ausgeprägt; die sich durch Variationen von Y ergebende ist durch die Beschränkungen dieser Struktur begrenzt.
Die Hammett-Konstanten beziehen sich auf Werte in Analogie zu denjenigen, welche erhalten werden, wenn der elektronische Einfluß von Substituenten auf die Ionisierungskonstante von Benzoesäure gezeigt wird. Als Ergebnis dieser frühen Arbeit wurden einem großen Spektrum verschiedener Substituenten Zahlenwerte zugeordnet. Tabellen solcher Werte für verschiedene Substituenten werden beispielsweise von Ritchie, C. D., et al., Proq. Phys. Org. Chem. (1964) 2: 323, gegeben.
Die Konstruktion einer Reihe der Analoga der Erfindung kann vorgenommen werden, welche systematisch den Wert dieses Parameters variiert, beispielsweise indem als Ausführungsform von X eine Benzylgruppe, welche weiter durch einen zusätzlichen Substituenten an der para-Position substituiert ist, beispielsweise Nitro, Chlor, Methoxy oder Methyl, eingesetzt wird.
Die sterischen Charakteristiken und die resultierenden Eigenschaften der Verbindungen der Formel (1), welche Mitglieder der Gruppe sind, können auch durch Cyclisierung eines oder mehrerer Mitglieder der Gruppe gesteuert werden.
Beispielsweise kann eine zweidimensionale Matrix der Glutathion-Analogon- Tripeptide der Erfindung, die eine geeignete zweidimensionale Gruppe bilden, konstruiert werden, indem die AAc-Komponente von einem kleinen hydrophoben Rest zu einem großen hydrophoben Rest, zu einem positiv geladenen Rest, zu einem neutralen Rest und schließlich zu einem negativ geladenen Rest variiert und somit bei den letzteren drei Analoga der induktive elektronische Effekt beeinflußt wird. Gleichermaßen können die X-Substituenten in der zweiten Dimension über dasselbe Spektrum von einem kleinen hydrophoben Rest zu einem großen hydrophoben Rest, zu positiver Ladung, zu neutraler Ladung, zu negativer Ladung variiert werden. Die resultierende Matrix ergibt eine geeignete Gruppe zur Verwendung bei z. B. der Bestimmung geeigneter Verbindungen zur Verwendung als Sorbentien.
Besonders geeignete Ausführungsformen von X sind die substituierten Benzyle, bei denen gezeigt werden kann, daß die Variation der Hydrophobizität und elektronenabgebenden oder elektronenziehenden Fähigkeiten des para-Substituenten eine systematische Korrelation zu dem Vermögen, bestimmte Klassen von Human-GSTn zu binden, aufweist.

Einsatz der erfindungsgemäßen Gruppen

Die Gruppen sind geeignet zur Bestimmung der unterschiedlichen Komplemente der Glutathion-S-Transferase (GST)-Isoenzyme, wie sie in normalen (im Vergleich zu unerwünschten) Zellen oder Geweben auftreten. Mit "GST- Komplement" ist das Muster von GST-Isoenzym-Niveaus gemeint, das in solchen Zellen oder Geweben vorliegt oder welches genetisch auf solche Weise programmiert ist, daß die Induktion oder Repression von Expressionsniveaus solcher GSTn manipulierbar ist. Wie im obigen Hintergrundabschnitt erläutert, sind GSTn Homo- oder Heterodimere, gebildet aus Untereinheiten, von denen mindestens sieben wohlbekannt sind. Darüber hinaus können sich, obwohl diese Isoenzyme grob klassifiziert wurden, individuelle Mitglieder innerhalb einer jeden Klasse aufgrund genetischer Variation von Individuum zu Individuum unterscheiden. Die Eigenschaften der verschiedenen Isoenzyme unterscheiden sich bezüglich einer Reihe meßbarer Parameter, einschließlich Substratspezifität, Empfänglichkeit für eine Inhibierung, Bindung an spezifische Reagenzien und Induzierbarkeit der Expression.

Verwendung der erfindungsgemäßen Gruppen zur Bestimmung von GST-Profilen - Hintergrund

Vielleicht die am leichtesten verständliche Vorgehensweise zur Bestimmung des GST-Isoenzym-Komplements einer unbekannten Gewebeprobe geht von einem Referenzsatz aller GST-Isoenzyme aus, welche Reaktivitätsprofile aufweisen, die bestimmt wurden oder bestimmt werden können. So wird unter der Annahme einer Auftrennung mit ausreichend hoher Auflösung, z. B. bei Anwendung irgendeiner Auftrennungstechnik, die beispielsweise analog zur hochauflösenden chromatographischen Fokussierung ist, ein Elutionsmuster zu einer Reihe bekannter Enzyme in Bezug gesetzt. Andere Verfahren zur Auftrennung und Charakterisierung der bekannten Isoenzyme könnten den Einsatz von Antikörpern einschließen, welche für spezielle Isoenzyme präpariert wurden, wie z. B. diejenigen, welche für mehrere GST-Human-Isotypen etabliert wurden und zur Bewertung des GST-Gehalts dieser Isotypen in Kandidatengeweben eingesetzt wurden (Howie, A. F., et al., Carcinogenesis (1990) 11: 451458; Beckett, G. J., Clinica Chimica Acta (1984) 141: 267-273). Gelelektrophorese-Auftrennungen können ebenfalls eingesetzt werden. Die Lokalisierung der GST-Banden nach Elektrophorese unter nicht- denaturierenden Bedingungen kann beispielsweise nach dem Verfahren von Ricci, G., et al., Anal. Biochem. (1984) 143: 226-230, bestimmt werden. Die Lokalisierung verschiedener Isoenzyme, die sich aus chromatographischen Auftrennungen ergeben, kann nachgewiesen werden mit Hilfe von Substraten, die allen Isoenzymen gemeinsam sind, z. B. 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol (CDNB). In der Tat wurde die Aktivitätsverteilung wie mittels CDNB in verschiedenen Geweben nachgewiesen von Pickett, C. B., und Lu, A. Y. H., Ann. Rev. Biochem. (1989) 58: 743-764, untersucht.
Der Einsatz dieser direkten Auftrennungsverfahren, um ein Muster von GST- Isoenzym-Verteilungen in Zellen und Geweben von Interesse zu erhalten, kann verwendet werden, um ein GST-Komplement für solche Zellen und Gewebe zu erhalten, das bei der Entwicklung einer Therapie von Nutzen sein könnte, vorausgesetzt, daß jedes dieser Isoenzyme ein Reaktivitätsprofil aufweist, das im Anschluß an Separationstechniken, die eine Isolierung des individuellen Isoenzyms unter Beibehaltung der Aktivität erlauben, vorher bestimmt wurde. Ein solches Reaktivitätsprofil würde Substanzen berücksichtigen, welche effektive Substrate sind, Substanzen, welche effektive Inhibitoren sind, und Substrate, welche effektive Induktoren oder Aktivatoren von GST-Aktivität darstellen. Sobald das GST-Isoenzym z. B. aufgrund seiner Position in dem Elutionsmuster oder elektrophoretischen Gel identifiziert und quantitativ bestimmt ist, wird Bezug auf das Reaktivitätsprofil des bekannten und vorher isolierten Isoenzyms genommen, um Behandlungsprotokolle vorauszusagen oder zu entwerfen.
Dieses Verfahren, obwohl leicht verständlich, ist nicht praktikabel aufgrund der großen Anzahl von GST-Isoenzymen, welche potentielle Kandidaten für den Einschluß in das Komplement sind, und aufgrund der Mutationsfähigkeit des Repertoires an GST-Isoenzymen per se. So ist es wahrscheinlich, daß ein Polymorphismus in der Population von verfügbaren GST-Isoenzmen zu einem Protein mit beispielsweise unveränderter Mobilität im Elutionsmuster führt, jedoch mit einer/m geänderten Substratspezifität oder Inhibierungsmuster oder umgekehrt. In jedem Fall würden die Ergebnisse der Zuordnung der Position im Elutionsmuster zu dem Satz von Referenzeigenschaften zu irreführenden Resultaten führen.
Ein etwas verbessertes Ergebnis kann durch Einsatz von Mehrfachseparationstechniken erhalten werden, da es weniger wahrscheinlich ist, daß die Mobilität in Mehrfachseparationssystemen im Vergleich zu einem einfachen System nicht beeinflußt würde. Ein solches System wird allgemein veranschaulicht durch ein einfaches hypothetisches System, in dem ein erstes Sorbens, P1, 4 Isoenzym-Peaks in seinem Elutionsmuster produziert und auf einem zweiten Sorbens, P2, 5 Peaks erhalten werden. Falls die Muster der Substratspezifität (beispielsweise für die Substrate A, B und C) anzeigen, daß ein gegebener Peak von P1 (z. B. als 1.2 identifiziert) in dem Substratprofil im wesentlichen derselbe ist wie ein bestimmter Peak, der auf dem Sorbens P2 aufgetrennt wurde (Peak 2.4), würde man annehmen, daß eine Gewebeprobe, die einen Peak bei 1.2 im Sorbens P1 und bei 2.4 im Sorbens P2 ergab, höchstwahrscheinlich ein Reaktionsprofil (mit A, B und C) wie dasjenige des Isoenzyms aufweisen würde, das die Peaks 1.2 und 2.4 bildet.
Die in diesem hypothetischen System erläuterte Technik kann bei Verwendung der neuen Glutathion-Tripeptid-Analoga der Erfindung oder eines solchen neuen Tripeptids in Kombination mit einem zusätzlichen Analogon oder Gruppen von analogen Glutathion-Analoga mit unterschiedlichen Eigenschaften als Sorbentien auf Affinitätsbasis eingesetzt werden. Es wird angenommen, daß zur Durchführung einer effektiven Charakterisierung eine Gruppe von mindestens zwei und vorzugsweise drei und noch bevorzugter fünf solcher Analoga eingesetzt werden sollte. Die Mitglieder der Gruppe sollten Eigenschaften aufweisen, welche ausreichend unterschiedlich sind, um eine Unterscheidung der verschiedenen GST-Isoenzyme in dem Komplement sicherzustellen.
Falls die Auftrennungstechnik die enzymatische Aktivität aufrechterhält, können die Reaktivitäten eines jeden Enzyms gegenüber potentiellen Arzneimitteln direkt bestimmt werden. Nicht-denaturierende Auftrennungen leiden im Stand der Technik jedoch entweder unter mangelnder Auflösung oder unter Überempfindlichkeit gegenüber strukturellen Änderungen, was eine Peak-Identifizierung für eine effektive Therapieführung zu problematisch macht. Ionenaustauschchromatographie kann beispielsweise als Schritt zur Reinigung individueller GST-Isoenzyme eingesetzt werden, weist jedoch eine nicht adäquate oder ungeeignete Auflösung als analytisches Werkzeug auf. IEF, ein weiteres im Stand der Technik verfügbares Verfahren, tendiert zur Erzeugung zahlreicher Fremdpeaks aufgrund von posttranslationaler Modifizierung des Proteins in vivo oder in vitro und es gibt keine zwangsläufige Verknüpfung zwischen solchen strukturellen Änderungen und funktioneller Variation.
Somit wäre die Bestimmung des Aktivitätsprofils des GST-Komplements in Zellen oder Geweben durch Auftrennung der individuellen Isoenzyme unter Anwendung von Verfahren des Standes der Technik und Bestimmung eines Aktivitätsprofils für jedes davon gegenüber allen möglichen chemotherapeutischen Arzneimitteln aufwendig, wird jedoch durch die Verfügbarkeit der neuen GSH- Analogon-Tripeptide der Erfindung verbessert. Die Verbindungen der Erfindung erlauben eine Auftrennung ohne Denaturierung der GST-Enzyme.
Eine effizientere Vorgehensweise zieht Nutzen aus den Profilen von GST- Isoenzym-Komplementen, welche gleichzeitig die spezifische Bindungsaktivität und Reaktivitätseigenschaften messen. Diese Profile, Merkmalübersichtsprofile oder "MÜ-Profile" genannt, erlauben die Bestimmung eines Referenzsatzes von MÜ- Profilen, welche Information über Substratspezifität, Induktion als Reaktion auf spezifische Induktoren und dgl., sowie weitere Bindungseigenschaften oder elektrophoretische Mobilitätseigenschaften einschließen. Durch Anwendung von rechnerischen Verfahren zum Vergleich dieser Profile kann die erforderliche Information für die Entwicklung therapeutischer Modulatoren und begleitender Protokolle und zur Voraussage eines Erfolgs oder Fehlschlags von vorgeschlagenen Protokollen für erheblich größere Probenzahlen als nach Verfahren des Standes der Technik erhalten werden, wie es erforderlich ist, um eine adäquate Leitlinie für die Therapie zu bieten. Unter den Parametern, welche zur Gewinnung eines MÜ-Profils eingesetzt werden können, ist das Vermögen, Mitglieder der Gruppen von Tripeptid-GSH- Analoga der Erfindung zu binden, oder die Wirkung solcher Gruppenmitglieder auf die Aktivität.
Bei dieser Vorgehensweise zur Bestimmung des GST-Komplements unbekannter Proben von Zellen und Geweben werden Techniken zur Mustererkennung genutzt. In Zusammenhang mit dieser Vorgehensweise wird das, was hier ein MÜ- Profil genannt wird, allgemein bestimmt unter Bezug auf eine Gruppe von Reagenzien, welche spezifisch und unterschiedlich mit den verschiedenen GST- Isoenzymen reagieren. Dies ist analog zu der Bestimmung von Profilen, welche durch Kreuzreaktions-Immunoassay erhalten werden, und bezieht sich auf jedes Reaktivitätsmuster eines Kandidaten-GST-Isoenzyms oder einer Mischung von Isoenzymen mit einer Gruppe von Reagenzien. So kann das MÜ-Profil bestimmt werden im Hinblick auf Umsatzraten für verschiedene Substrate; effektive Niveaus der Inhibitorkonzentration für verschiedene Inhibitoren; Niveaus an Induktoren, welche erforderlich sind, um die Expression des Gens für das GST-Isoenzym im Kontext einer bestimmten Wirtszelle zu induzieren; Mobilität in der Elektrophorese in Anwesenheit oder Abwesenheit von Inhibitoren oder Substraten; Elutionszeiten von Paralogon- oder anderen Affinitätssäulen oder in der Tat das klassische Muster der Bindung an eine Gruppe von Antikörpern. Die MÜ-Profile, welche für individuelle GST-Isoenzyme oder Mischungen von Isoenzymen in verschiedenen Konzentrationsniveaus erhalten wurden, können auf verschiedene Weise wie hier beschrieben manipuliert werden, um einen Referenzsatz zu ergeben, mit dem MÜ-Profile unbekannter Proben verglichen werden können.
Im allgemeinen wird das MÜ-Profil Werte für jeden von einer Gruppe von "Informationskanälen" liefern, wobei jeder Informationskanal eine charakteristische Eigenschaft des GST-Komplements oder Standards beschreibt, wie z. B. die Bindungsaffinität für einen Antikörper, eine Substrataffinität, eine Elutionszeit oder dgl. Mindestens einige der Informationskanäle sollten sich auf Werte beziehen, die mit der Konzentration der GST variieren.
Die Bestimmung des GST-Komplements für Zellen oder Gewebe ist per se für die Diagnose und Charakterisierung von Proben von Nutzen. Darüber hinaus müssen die MÜ-Profile zur Verwendung bei der Entwicklung von Ausführungsformen der Strategien zur Beeinträchtigung oder Zerstörung von unerwünschtem Gewebe Informationen liefern, die in Bezug zur GST-Aktivität stehen, so daß Aktivitätsunterschiede zwischen normalen und unerwünschten Geweben bestimmt werden können. Somit müssen die MÜ-Profile des unerwünschten Gewebes leicht vergleichbar sein mit den Referenzstandards, welche wiederum mindestens teilweise auf Reaktivitätsmustern basieren müssen, welche bei der Entwicklung therapeutischer Modulatoren und der Auswahl von Arzneimitteln oder Prodrugs hilfreich sein werden. Für diese Anwendung muß mindestens ein Teil der Referenzprofile auf Daten bezüglich Substratumsatzraten, Inhibierungsdaten oder Daten bezüglich der Induktion eines Isoenzym-Produktionsniveaus oder irgendeiner anderen Reaktivität beruhen, welche die Manipulation des GST-Isoenzyms in situ erlauben wird. Die Gruppen der Erfindung können zur Feststellung solcher Auswirkungen auf die Aktivität eingesetzt werden. Die Kombination von chromatographischer Auftrennung, welche bei Verwendung der neuen Verbindungen der Erfindung eine Aufrechterhaltung der Aktivität ermöglicht, zusammen mit der Erstellung von MÜ-Profilen bezüglich reaktivitätsbeeinflussender Reagenzien für diese Standards ist eine Vorgehensweise, um die benötigten Daten zu erhalten.
Die MÜ-Profile der Referenzstandards und der unbekannten Proben werden bezüglich Gruppen von "spezifisch reaktiven Reagenzien" bestimmt. Diese Reagenzien können eine Vielfalt von Substanzen, einschließlich Paraloga, Substrate, Inhibitoren, Induktoren, Antikörper sowie "Reagenzien", welche tatsächlich Techniken wie Gelelektrophorese oder Affinitätschromatographie sind, wobei das Ausmaß der Reaktivität als elektrophoretische Mobilität oder Elutionszeit bestimmt wird, einschließen. Somit sind "spezifisch reaktive Reagenzien" nicht auf diejenigen Reagenzien beschränkt, welche eine chemische Reaktion bewirken, sondern beinhalten jedes Reagenz oder jede Technik, welche(s) es ermöglicht, einen charakteristischen Parameter für die Probe bezüglich dieses Reagenzes zu erhalten.
Natürlich können die Gruppen der Analoga der Erfindung als "spezifisch reaktive Reagenzien" entweder als bindende Agentien, chromatographische Träger oder als Inhibitoren der Enzymwirkung in Lösung eingesetzt werden. Die vergleichbare Fähigkeit dieser Verbindungen als Mitglieder der Gruppe, die durch GST katalysierten enzymatischen Reaktionen zu inhibieren, kann als charakteristisches MÜ-Profil eingesetzt werden, ebenso wie Elutionsmuster von Säulen, welche die Tripeptid-Analoga als Affinitätsliganden enthalten.

Bestimmung von Referenz-MÜ-Profilen

Während Referenzstandards für einige Zwecke, wie im folgenden beschrieben, direkt aus normalem Gewebe eines bestimmten Patienten erstellt werden können, ist es auch von Nutzen, eine Datenbank von MÜ-Profilen für eine Vielfalt von vorher isolierten GST-Isoenzymen mit charakteristischen Reaktivitätsmustern bereitzustellen. Durch Zuordnung dieser Reaktivitätsmuster zu denjenigen von Biopsie-Proben des unerwünschten Gewebes kann die geeignete Gestaltung für therapeutische Modulatoren und geeignete Wahl von Prodrugs oder Toxinen vorgenommen werden.
Die US-Patente 4,963,263 und 5,133,866, deren Offenbarungen hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen sind, beschreiben Gruppen von paralogen Affinitätsreagenzien, welche sich für chromatographische Auftrennungen von eng verwandten Substanzen eignen. Die Gruppen der Erfindung sind gleichermaßen unterschiedlich. Paralogon-Typ-Gruppen unter Verwendung der GSH-Tripeptid- Analoga der Erfindung können bequem eingesetzt werden zur Herstellung von Affinitätsträgern für die Auftrennung verschiedener GST-Isoenzyme in gereinigter Form, wobei in jedem Fall die Aktivität des nativen Isoenzyms aufrechterhalten wird. Im Gegensatz zu den Umkehrphasen-HPLC- oder Western-Blot-Verfahren des Standes der Technik verhalten sich die aufgetrennten Isoenzyme, welche unter Anwendung von Chromatographie auf Basis der Affinität für die erfindungsgemäßen Verbindungen hergestellt wurden, in einer Weise, die praktisch identisch ist mit derjenigen der Isoenzyme, wie sie in der Natur vorkommen. Für jedes derartige gereinigte Isoenzym kann dann ein MÜ-Profil bezüglich der Reaktivität von Substrat oder einem anderen aktivitätsbeeinflussenden Reagenz, wie z. B. den von den Verbindungen der Erfindung repräsentierten, erstellt werden. Eine hilfreiche Datenbank einer großen Anzahl von MÜ-Profilen, charakteristisch für diese gereinigten Isoenzyme, kann dann erhalten und in mathematischer oder für Computer zugänglicher Form gespeichert werden für einen Vergleich mit Proben, die von dem unerwünschten Gewebe erhalten wurden.
Gruppen von Tripeptid-Glutathion-Analoga, von denen mindestens ein Mitglied die Struktur der Formel (1) enthält, können als Basis für die Sammlung von Informationskanälen verwendet werden, welche die MÜ-Profile für den Referenzsatz ergibt. Eine Konjugation bekannter Isoenzym-spezifischer Substrate mit den Mitgliedern der Gruppe oder Konjugation der Gruppenmitglieder direkt mit Sorbens erhöht weiter die systematische Diversifizierung von Bindungseigenschaften. Profile für Standards und unbekannte Proben können bei Verwendung der erfindungsgemäßen Gruppen in geeigneten Konfigurationen, wie z. B. Affinitätssäulen, erhalten und verglichen werden. Besonders geeignet sind somit Gruppen von unterschiedlichen Tripeptid-Analoga, einschließlich mindestens eines Analogons, das Formel (1) beinhaltet, worin X eine mono- oder disubstituierte oder unsubstituierte Hydrocarbylgruppierung (1-20C) ist, die gegebenenfalls 1 oder 2 nicht benachbarte Heteroatome (O, S oder N) enthält, und worin die Substitution aus der Gruppe, bestehend aus Halogen, NO, NO&sub2;, NR&sub2;, OR und SR, worin R H oder Niederalkyl (1-4C) bedeutet, ausgewählt ist, und
AAc Phenylglycin, Phenylalanin oder substituiertes Phenylalanin, über eine Peptidbindung mit dem Rest der Verbindung der Formel (1) verknüpft, darstellt.

Bestimmung des GST-Komplements

Im allgemeinen können zwei verschiedene Vorgehensweisen angewandt werden, um das GST-Komplement einer/s "unbekannten" Probenzelle oder Probengewebes zu bestimmen. Zunächst, wie oben beschrieben, können unter Anwendung allgemeiner Verfahren, die gegenwärtig im Stand der Technik praktiziert werden, die individuellen Isoenzyme, welche in der Probe enthalten sind, mit Hilfe von Affinitätsträgern aufgetrennt und individuell auf ihre Aktivitätsmuster getestet werden. Die individuellen Isoenzyme aus der Probe können erhalten und dann unabhängig hinsichtlich ihrer Substratspezifität, Inhibitorspezifität und zur Identifizierung von Substanzen, welche die Aktivität oder Produktion des Isoenzyms induzieren, beurteilt werden.
Bei einer zweiten, weniger aufwendigen Vorgehensweise werden Mustererkennungsverfahren eingesetzt, um ein sofortiges Ergebnis für Proben von entweder unerwünschtem oder normalem Gewebe oder beiden für einen individuellen Patienten zu erhalten, indem diese Muster einem wie oben hergestellten Referenzsatz zugeordnet werden. Bei dieser Vorgehensweise wird weniger Probenvolumen benötigt und es ist keine Auftrennung erforderlich. Dieses Verfahren ist auch von Nutzen bei der Anwendung auf Gewebescheiben unter Einsatz einer histochemischen Anfärbung auf GST-Aktivität.
Bezüglich der ersten Vorgehensweise kann eine Modifikation des von Vos, R. M. E., et al., Biochem. Pharmacol. (1988) 37: 1077-1082, verwendeten Auftrennungsverfahren angewandt werden. Bei diesem Verfahren wurde die Zytosol- Fraktion aus einer vollständigen Rattenleber einer Affinitätssäule von S-Hexyl-GSH- Sepharose, die als Affinitätsreagenz für GSTn als Gruppe eingesetzt wurde, ausgesetzt. Die eluierte GST-Mischung wurde konzentriert und aufgetrennt durch chromatographische Fokussierung auf einer Mono-PHR-5/20-Säule (Pharmacia FPLC-System). Die individuellen Isoenzyme wurden in separaten Fraktionen gewonnen und analysiert. Fraktionen wurden identifiziert durch ihre Position im Elutionsprofil, deren Untereinheitsmolekulargewicht und spezifischen Aktivitäten gegenüber 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol, welches ein Substrat für die meisten bekannten GSTn ist.
Bei Verwendung eines Paralogons, das unter den Verbindungen der Erfindung ausgewählt wurde, als Affinitätsliganden können mildere Bedingungen angewandt werden und aktivere Formen des GST-Isoenzyms gewonnen werden. Diese werden dann auf Substratspezifität etc. getestet.
Wie oben beschrieben, könnte man die Möglichkeit in Betracht ziehen, einfach eine frei gewählte Auftrennungstechnik wie die von Vos einzusetzen, welche ein für die verschiedenen GST-Isoenzyme charakteristisches Elutionsmuster ergibt, und das Elutionsmuster für Zellen oder Gewebe eines unbekannten GST-Komplements dem vorgegebenen Elutionsmuster zuzuordnen, um die Art des GST-Komplements in der unbekannten Probe zu bestimmen. Ein Problem bei dieser Vorgehensweise liegt jedoch in der genetischen Mutationsfähigkeit von GST, so daß es schwierig ist, zuverlässige Zuordnungen durchzuführen, welche die angegebenen charakteristischen Eigenschaften behalten werden und von denen somit gewährleistet ist, daß sie ähnliche Reaktivitätsmuster aufweisen. Die genetische Mutationsfähigkeit der Isoenzyme ebenso wie deren Sensitivität gegenüber posttranslationalen Modifikationen wird höchstwahrscheinlich in jedem speziellen Fall eine erhebliche Wirkung auf die Substratspezifität, Inhibierungsmuster und dgl. ebenso ausüben wie auf Bindungseigenschaften und physikalische Eigenschaften wie pl. Es gibt keine Garantie, daß eine Korrelation zwischen Reaktivitätsvariation und physikalischer Eigenschaft oder Bindungsvariation vorliegen wird; in der Tat ist es wahrscheinlich, daß die Effekte nicht korreliert sein werden. Wie oben beschrieben, kann dieses Problem durch Verwendung von Mehrfachaffinitätsreagenzien, welche ebenfalls durch die erfindungsgemäßen Verbindungen bereitgestellt werden, gemildert werden.
Bei der Vorgehensweise der Musterzuordnung wird ein verläßlicherer Assay durchgeführt, indem das Reaktivitätsprofil einer unbekannten Probe mit einem Satz von Referenz-MÜ-Profilen verglichen wird. Die Anwendung dieser Vorgehensweise auf die Bestimmung der Analytenzusammensetzung im allgemeinen ist in US-A- 5,338,659, eingereicht am 2. April 1991, beschrieben. Gemäß den in dieser Anmeldung beschriebenen Techniken wird ein vorgegebenes Diagramm von Profilen, erhalten von Proben einer bekannten Analytenzusammensetzung, als Referenz eingesetzt, mit der ein MÜ-Profil der zu untersuchenden Probe verglichen werden kann. Im allgemeinen wird zunächst eine Gruppe von 2-10, vorzugsweise 4- 6, verschiedenen spezifisch reaktiven Reagenzien eingesetzt, um Profile für Proben bekannter Zusammensetzungen zu liefern. In der genannten Anmeldung wurden spezifische Bindungsassays eingesetzt, wenn es Kreuzreaktivität bei den Kandidaten-Analyten in einer Gruppe von bindenden Agentien gab, und die Profile wurden erhalten durch Messung von Inhibierungswerten für die Bindung eines bekannten Bindungspartners durch verschiedene Analyten. Die Sammlung von Profilen wird dann mathematisch mit irgendeinem aus einer Reihe von Verfahren behandelt, um einen ablesbaren Vergleich mit dem entsprechenden MÜ-Profil einer unbekannten Probe zu ergeben.
Für die Verwendung bei der Bestimmung der GST-Komplemente, die zur Durchführung der therapeutischen Verfahren der Erfindung erforderlich sind, können die analogen MÜ-Profile unter Verwendung entweder isolierter GST-Isoenzyme oder Mischungen davon, welche bekannte Zusammensetzungen enthalten, oder beider bestimmt werden. Die spezifisch reaktiven Reagenzien müssen als Gruppe mindestens ein GSH-Analogon, vorzugsweise drei oder noch bevorzugter fünf GSH- Analoga der Formel (1) zusammen mit weiteren Reagenzien, falls dies gewünscht wird, einschließen. Solche weiteren Reagenzien können eine Reihe bekannter Substrate einschließen, wobei die Umsatzraten gemessen werden. Geeignete Substrat-Kandidaten schließen beispielsweise Ethacrinsäure, Bromsulfophthalein, Cumenhydroperoxid, BCNU, Chlorambucil, trans-Stilbenoxid und dgl. ein.
Zur Verwendung als spezifisch reagierende Reagenzien, die Mitglieder der Gruppe sind, um ein MÜ-Profil bereitzustellen, stehen auch Inhibitoren zur Verfügung, welche mit dem GST-Isoenzym auf verschiedenen Niveaus wechselwirken. Diese Inhibitoren schließen beispielsweise Piriprost, Cibacron Blue und Hämatin ein. Antikörper, die mit den verschiedenen Isoenzymen eine spezifische Immunreaktion eingehen können, können eingesetzt werden, ebenso wie Affinitätsreagenzien vom Paralogon-Typ. Falls das Profil eine Basis für die Entwicklung einer therapeutischen Strategie liefern soll, ist es bevorzugt, daß mindestens einige Mitglieder der Gruppe die enzymatische Aktivität der GST beschreiben.
Eine weitere Technik zum Erhalt von MÜ-Profilen ist analog zu der von Takeo, K., et al., J. Immunol. (1978) 121: 2305-2310, beschriebenen Technik. Bei dieser Vorgehensweise erlaubt eine differentielle Elektrophorese in Gegenwart verschiedener bindender Agentien für die individuellen Proteine die Messung eines Mobilitätswerts. Bei der von Takeo beschriebenen speziellen Anwendung wurden Messungen von Dextran-spezifischen Myelom-Proteinen bei Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt, die eine Verzögerung zeigten, wenn die Dextrane dem Trenngel zugesetzt wurden, welche Verzögerung durch Zugabe des Haptens Isomaltose-Oligosaccharid rückgängig gemacht werden konnte. Bei Anwendung dieser Vorgehensweise konnte eine Reihe von Mobilitäten, z. B. abhängig von der Wahl des retardierenden Mittels, für bekannte Zusammensetzungen erhalten werden. Diese Technik kannn angewandt werden, indem die neuen Verbindungen oder Gruppen der Erfindung als retardierende oder mobilisierende Agentien eingesetzt werden.
Bei einem bevorzugten Verfahren zur Bestimmung des GST-Komplements von Biopsien wird eine Reihe von HPLC-Säulen unter Verwendung der bekannten GST-Substrate, die von Mannervik, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1985) 85: 7202- 7206, untersucht wurden, aufgebaut. Diese Substrate sind direkt mit den Säulen- Trägern konjugiert oder mit den GSH-Analogon-Varianten verknüpft, die von Adang, A.E.P., et al., Biochem. J. (1990) 269: 47-54, beschrieben wurden. Eine Reihe von 50-100 verschiedenen Säulen, resultierend aus den verschiedenen möglichen Kombinationen von Substraten mit GSH-Analoga der Formel (1), repräsentiert eine Reihe von Kandidaten-Sorbentien. Diese Sorbentien werden getestet, um diejenigen mit einer maximalen Unterschiedlichkeit in den Eigenschaften auszuwählen, indem ein jedes für die Auftrennung einer Mischung von bekannten GST-Isoenzymen eingesetzt wird. Die vier oder fünf Säulen mit den größten Differenzierungsvermögen werden dann als Gruppenmitglieder zur Bestimmung von MÜ-Profilen in unbekannten Proben und in Standards ausgewählt.
Statt die Auftrennungen als Elutionsmuster auf jedem individuellen Sorbens darzustellen, werden die Daten somit neu angeordnet, so daß das Vermögen zur Adsorption an jedes Sorbens einen Informationskanal im MÜ-Profil des Isoenzyms darstellt. Die Reaktivitätsmuster bezüglich Induktoren, Aktivatoren, Substraten und Inhibitoren werden ebenfalls für jedes Isoenzym bestimmt und als Informationskanal verwendet. Das vervollständigte Profil für jedes bekannte Isoenzym wird dann als Mitglied eines Referenzsatzes eingesetzt. Weitere Mitglieder der Referenzsätze werden bestimmt durch Verwendung von Proben von normalen Geweben und Bewertung der Werte, die demselben Satz von Informationskanälen zugeordnet werden. Die entsprechenden Profile von Biopsie-Proben aus unbekannten, unerwünschten Geweben werden dann mit diesem Referenzsatz verglichen.
Die Profile für bekannte Zusammensetzungen werden in einer für Computer zugänglichen Form gespeichert zum Vergleich mit Profilen, die auf ähnliche Weise für unbekannte Proben bestimmt wurden. Somit können Kits zur Bestimmung des GST-Komplements unbekannter Proben bereitgestellt werden, welche die Testgruppenmitglieder, die zur Bestimmung der Referenzprofile eingesetzt wurden, zusammen mit Instruktionen für eine MÜ-Profilbestimmung der unbekannten Proben einschließen. Geeignete Software für den Zugang zu den Referenzprofilen kann ebenfalls eingeschlossen sein. Das GST-Komplement kann eingesetzt werden, um die getestete Probe zu charakterisieren, und kann, falls dies angebracht ist, zur Entwicklung einer Therapie eingesetzt werden:
Für erkranktes Gewebe kann die angebrachte Strategie zur Behandlung ausgewählt werden. Das Komplement kann beurteilt werden, um zu bestimmen, ob Standard-Behandlungsprotokolle erfolgreich sein werden oder nicht, wenn sie auf die unerwünschten Zellen oder Gewebe angewandt werden, oder kann zur Entwicklung unterschiedlicher Protokolle eingesetzt werden, einschließlich der Wahl eines Toxins oder einer Prodrug und des Einschlusses oder Nichteinschlusses eines therapeutischen Modulators.

Synthese der Tripeptid-Analoga

Die Tripeptid-Analoga der Erfindung oder weitere Tripeptid-Analogon- Mitglieder verschiedener Gruppen können synthetisiert werden unter Anwendung von im Stand der Technik allgemein bekannten Mitteln, jedoch unter Einsatz von Modifikationen, welche diese allgemeinen Verfahren auf das gewünschte Tripeptid anwendbar machen. Obwohl Festphasen-Syntheseverfahren angewandt werden können, erscheint eine Flüssigphasen-Peptidsynthese für diese kurzen Peptide überlegen. Die ursprünglich für Festphasen-Synthese entwickelten Fmoc- Reagenzien können auf ein Verfahren in Lösungsphase zur Herstellung von 100-mg- Mengen der Tripeptid-Analoga eingesetzt werden.
Die unter Anwendung von Lösungsphase-Fmoc-Chemie synthetisierten, geschützten Dipeptide und Tripeptide als Zwischenprodukte werden mittels Chromatographie auf Silicagel isoliert und in einer milden Base von Schutzgruppen befreit und gestatten somit die Synthese von säurelabilen Thiokonjugaten (Iselin, B., et al., Helv. Chem. Acta. (1955) 38: 1508-1516). Die Analoga können gereinigt und gewonnen werden oder die Rohproduktmischungen können direkt mit einem festen Träger gekoppelt werden, um Affinitäts-derivatisierte Träger zu ergeben (Sundburg, L., et al., J. Chromatoa. (1974) 90: 87-98).
In denjenigen Fällen, in denen ein Ester der C-terminalen Aminosäure AAc nicht zur Verfügung steht, wird der Ester durch Synthese der N-Fmoc-geschützten Aminosäure hergestellt (Atherton, E., et al., in "Solid Phase Peptide Synthesis", IRL Press, Oxford, England (1989), Seiten 47-61) und dann durch Behandlung mit dem gewünschten Alkohol in Gegenwart von konzentrierter Schwefelsäure verestert (Benoiton, L., Can. J. Chem. (1962) 40: 570-572). Nicht veresterte Materialien werden durch Extraktionen mit milder Base entfernt und der gewünschte N-Fmoc- Aminosäureester wird durch Eindampfung isoliert.
Die Schwefel-funktionalisierten Fmoc-Cystein-Derivate werden in einem Ein- Topf-Verfahren durch Behandlung von Cystein mit Fmoc-OS bei pH 9 und anschließende Behandlung dieser Mischung mit dem geeigneten Alkylierungsmittel hergestellt.
Die Synthese wird durchgeführt wie im Reaktionsschema 1 dargestellt. Schema 1 Schema 1 (Fortsetzung)
Die Kopplung des Cystein-Derivats an die C-terminale Aminosäure erfolgt mit dem wasserlöslichen Carbodümid EDC (Sheehan, J., et al., J. Org. Chem. (1961) 26: 2525-2528) und HOBT (Konig, W., et al., Chem. Ber. (1970) 103: 788-798) (zugesetzt, um eine unerwünschte Racemisierung zu verzögern und die Reaktion zu beschleunigen) in DMF. Nachdem die Kopplung abgeschlossen ist, gewöhnlich etwa 1 Stunde bei RT, wird die Mischung im Vakuum eingeengt und in KHCO&sub3; Lösung gegossen (John Hughes, private Mitteilung). Dieser Schritt extrahiert den größten Teil des DMF und EDC und EDC-Harnstoffs sowie einen Teil des Fmoc-Cystein- Derivats, welches nicht koppelte. Der resultierende gummiartige Rückstand wird dann durch Abdekantieren der Flüssigkeit erhalten. Dieses rohe Dipeptid wird in EtOAc gelöst und mit 1 N Salzsäure und Wasser gewaschen, um etwaigen verbleibenden ungekoppelten C-terminalen Aminosäureester sowie restliches EDC und EDC-Harnstoff zu entfernen. Die Lösung wird konzentriert und das Dipeptid mittels Chromatographie gereinigt.
Das gewonnene Dipeptid wird dann mit 25%igem Piperidin in DMF 30 Minuten lang behandelt, um die Fmoc-Gruppe zu entfernen. Das Dibenzofulven oder dessen Piperidin-Addukt, resultierend aus der Fmoc-Entfernung, sollte die Ergebnisse der nächsten Kopplung nicht beeinflussen (Atherton, E., et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. (1981) 1: 538-546). Etwaiges überschüssiges Piperidin muß jedoch entfernt werden, welches erreicht wird durch wiederholte gemeinsame Verdampfung mit DMF, bis der Geruch von Piperidin in dem deblockierten Material nicht - länger nachweisbar ist. Die zweite Kopplung wird dann mit dem Glutaminsäure-Derivat durchgeführt, gefolgt von derselben Aufarbeitung wie für das Dipeptid.
Fmoc-Glutaminsäure-α-benzylester wird in guter Ausbeute und Reinheit aus im Handel erhältlichem Glutaminsäure-α-benzylester hergestellt. Fmoc-Glutaminsäure-α-t-butylester, ebenfalls im Handel erhältlich, kann ebenfalls eingesetzt werden, dies erfordert jedoch einen separaten Säurebehandlungsschritt bei der Aufarbeitung. Es gibt Löslichkeitsprobleme mit einigen der geschützten Tripeptide während dieses Schrittes und oft werden unreine, teilweise von Schutzgruppen befreite Produkte erhalten.
Das Material, welches durch die Kopplung des Glutaminsäure-Derivats an das Dipeptid und die Aufarbeitung hergestellt wurde, enthält mehrere chromatographisch mobile Komponenten. Das Material, welches zuerst von der letzten Säule eluiert, ist fluoreszierend, was Dibenzofulven nahelegt. Das mutmaßliche gewünschte Produkt eluiert als nächstes zusammen mit einem weiteren UV-absorbierenden Material, welches wahrscheinlich das Piperidin-Addukt von Dibenzofulven ist. Nachdem während der letzten Aufarbeitung ähnliche Produkte gebildet und von dem deblockierten Tripeptid abgetrennt werden, werden diese Verunreinigungen in diesem Stadium nicht entfernt.
Nachdem das geschützte Tripeptid (nebst Verunreinigungen) isoliert ist, wird es im Vakuum getrocknet und 18 Stunden lang mit 0,25 N NaOH in 3 : 1 Ethanol: Wasser für 18 Stunden behandelt. Dies entfernt das Fmoc und die Ester schützenden Gruppen. Wird t-Butyl-geschützte Glutaminsäure verwendet, so wird 3 N HCl in Ethanol/Wasser 3/1 Vol./Vol. für 3 Stunden eingesetzt, um die t-Butylgruppe vor der Basebehandlung zu entfernen. Die Säure wird durch Rotationsverdampfung und gemeinsame Eindampfung mit Ethanol und Wasser entfernt und dieselbe Basebehandlung wie oben entfernt die verbleibenden Schutzgruppen. Nach der Basebehandlung über Nacht entfernt eine Zugabe von Wasser und Extraktion mit Hexan die organischen Nebenprodukte der Schutzgruppenbefreiung. Die wäßrige Lösung des Peptids wird angesäuert und zu einem Feststoff eingeengt. Die Lösung des Peptids in Ethanol und Filtration entfernt das Satz. Dieses wird zu einem Schaum eingedampft und über Nacht einem Hochvakuum ausgesetzt.
Die Verbindungen werden mittels HPLC, DC und FAB-Massenspektroskopie analysiert. Während die DC-Analyse in den meisten Fällen gute Ergebnisse zeigt, sind die HPLC-Ergebnisse gemischt, teilweise deshalb, weil die eingesetzten Analysebedingungen für einige der stärker hydrophoben Peptide (C-terminales S- Alkyl-Valin, β-Alanin und 4ABu) nicht optimiert waren.
Eine Racemisierung während der letzten Schutzgruppenbefreiung mit Base kann in kleinem Umfang auftreten, insbesondere mit dem Phenylglycin-Analogon (Bodansky, M., et al., in "Practical Methods in Peptide Synthesis", Springer Verlag, Berlin (1984)). Diese ist geringer als diejenige, welche unter den Natrium-Ammoniak- Bedingungen, die vorher von Adang, A., et al. (Biochem. J. (1989) 264: 721-724) eingesetzt wurden, auftritt.
Unter Anwendung der oben angegebenen Techniken wurden die Analoga von Tabelle 1 hergestellt. TABELLE 1
a Standard-Einbuchstaben-AS-Code, mit Me = Methyl, Pr = n-Propyl, Hx = n-Hexyl, Bz = Benzyl, Trt = Trityl (Triphenylmethyl)
b Mole an von Schutzgruppen befreitem Produkt, geteilt durch die Mole des eingesetzten Fmoc-Cystein-Derivats
c DC-Rf-Werte für Silica-Platten, die mit EtOAc/Pyridin/HOAc/Wasser 5/5/3/1 eluiert und mit Ninhydrin-Spray sichtbar gemacht wurden
d Beobachtete Molekularmasse in AME, gewöhnlich das Molekulargewicht plus 1; Thioglycerin- oder Nitrobenzylalkohol-Matrix
e Mikromole Peptid pro ml gequollenen Harzvolumens (Wasser)
f Natrium-Addukt, M + 22
g Molekülion und Natrium-Addukt minus Wasser; MH&spplus; -18
Ferner werden andere Verbindungen der Formel (1), einschließlich der Cycloamido-Formen dieser Verbindungen und Ethyl- und Benzylester davon, hergestellt.

BEISPIEL 1

Synthese von 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-4-aminobuttersäureethylester

45 g (0,1339 M, 0,94 Äq.) an Fmoc-OS wurden langsam einer Lösung von 14,75 g (0,143 M, 1 Äq.) 4-Aminobuttersäure (4-ABu) und 20 g Na&sub2;CO&sub3; in 300 ml entionisiertem Wasser und 200 ml Tetrahydrofuran (THF) zugegeben. Der pH-Wert wurde überwacht und mehr Na&sub2;CO&sub3; zugegeben, um den pH-Wert oberhalb von 8 zu halten. Die Reaktion wurde 2 Stunden lang gerührt und dann mit konzentrierter HCl angesäuert. Die resultierende trübe Suspension wurde mit 600 ml Ethylacetat (EtOAc) extrahiert, wonach die organische Schicht weiter mit 300 ml 0,5 N NaOH extrahiert wurde. Die wäßrige Schicht wurde schnell in 20 ml konz. HCl in 500 ml Eiswasser gegossen. Die resultierende weiße Suspension wurde mit 300 ml EtOAc extrahiert, über 50 g Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und auf 35 g (76% Ausbeute) Fmoc-4-ABu als weißes Pulver eingedampft. Dieses wurde in 500 ml absolutem Ethanol gelöst und 40 ml konz. H&sub2;SO&sub4; wurden zugegeben. Nach 4 Stunden war die Lösung eine halbfeste weiße Masse geworden. Diese wurde in 2 l Wasser gegossen und filtriert. Das weiße Material wurde in 500 ml EtOAc gelöst und einmal mit 200 ml 0,5 N NaOH extrahiert, getrocknet und eingedampft, um 30 g (79% Ausbeute) an Gesamtverbindung zu ergeben, Rf 0,71 (20% MeOH in CH&sub2;Cl&sub2;), Schmelzpunkt 83- 86º.
Analyt. Berechnung für C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub3;NO&sub4;: C, 71,37; H, 6,56; N, 3,96. Gefunden: C, 71,42; H, 6,67; N, 3,72.

BEISPIEL 2

Synthese von 9-Fluorenylmethoxycarbonylphenylglycinethylester

Bei einem ähnlichen Syntheseverfahren ergaben 20 g Phenylglycin 33,7 g (68% Ausbeute) an Fmoc-Phenylglycin. 19 g dieses Produkts wurden in 10 g (57% Ausbeute) Produkt überführt, R, 0,95 (gleiches DC-System), Schmelzp. 130-133º.
Analyt. Berechnung für C&sub2;&sub5;H&sub2;&sub3;NO&sub4;: C, 74,80; H, 5,77; N, 3,49. Gefunden: C, 74,72; H, 5,91, N, 3,20.

BEISPIEL 3

Synthese von 9-Fluorenylmethoxycarbonylasparaginsäuredimethylester

45 g (0,134 M, 0,96 Äq.) an Fmoc-OS wurden zu 20 g (0,15 M, 1 Äq.) Asparaginsäure und 20 g Na&sub2;CO&sub3;, gelöst in 400 ml Wasser und 200 ml Dioxan, zugegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden lang gerührt, während der pH durch die Zugabe kleiner Mengen an Na&sub2;CO&sub3; bei etwa 9 gehalten wurde. Dann wurde die trübe weiße Mischung in 500 ml Eiswasser, enthaltend 40 ml konz. HCl, gegossen. Der weiße Feststoff wurde mit 500 ml EtOAc extrahiert und dieses mit 500 ml Hexan gemischt. Die Mischung wurde über Nacht gekühlt und am nächsten Tag gerührt, um nach Filtration und Lufttrocknung 38 g Fmoc-Asparaginsäure als Kristalle (71% Ausbeute) zu ergeben. 10 g (0,28 M) dieses Produkts wurden in 200 ml Methanol gelöst und 20 ml konz. H&sub2;SO&sub4; wurden zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht stehengelassen. Die Mischung wurde in 1 l Wasser gegossen und filtriert. Der resultierende weiße Feststoff wurde getrocknet und in EtOAc erneut gelöst. Langsame Zugabe von Hexan und Abkühlen ergab 9 g (83% Ausbeute) Produkt als weiße Nadeln, Schmelzp. 78-80º. [α]d = -13,9º. Anal. Berechnung für C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub1;NO&sub4;: C, 65,78; H, 5,52; N, 3,65: Gefunden: C, 66,18; H, 5,68; N, 3,69.

BEISPIEL 4

Synthese von 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-hexylcystein

A. 20 g (0,127 M, 1 Äq.) Cysteinhydrochlorid und 20 g Na&sub2;CO&sub3; wurden in 800 ml Wasser unter einem Argonstrom gelöst. 200 ml CH&sub3;CN wurden zugegeben und dann wurden 42 g (0,122 M, 0,96 Äq.) Fmoc-OS in kleinen Portionen zugegeben, während der pH-Wert durch Zugabe von 5-g-Portionen Na&sub2;CO&sub3; auf etwa 9 gehalten wurde. Die Reaktion wurde weitere 2 Stunden lang gerührt und 18,6 ml (26,8 g, 0,126 M, 0,99 Äq.) 1-Iodhexan wurden als Lösung in 200 ml CH&sub3;CN zugegeben. Die Reaktion wurde weitere 2 Stunden lang gerührt und in 1 I Eiswasser und 50 ml konz. HCl gegossen. Die weiße Mischung wurde mit 600 ml EtOAc extrahiert und die organische Schicht mit 2 500-ml-Portionen 1 N KOH extrahiert. Jede davon wurde unmittelbar in separate Portionen von 500 ml Wasser und 30 ml konz. HCl getropft und die erhaltenen trüben Mischungen wurden jeweils mit 500 ml EtOAc extrahiert. Diese wurden jeweils über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingedampft. Die Gesamtausbeute betrug 24,6 g (45%). Die zweite Fraktion (3,5 g) kristallisierte nach Stehen, Schmelzp. 101-103º. Rf = 0,57. [a]d = 14,3º.
Anal. Berechnung für C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub3;NO&sub4;S: C, 65,42; H, 6,01; N, 3,63.
Gefunden: C, 65,53; H, 5,74; N, 2,91.
B. Weitere S-funktionalisierte Fmoc-Cystein-Derivate wurden wie in Abschnitt A angegeben hergestellt.

BEISPIEL 5

Synthese von Fmoc-Glutaminsäure-α-benzylester

25 g (0,105 M) Glutaminsäure-α-benzylester und 25 g Na&sub2;CO&sub3; wurden in 400 ml Wasser gelöst und 200 ml THF zugegeben. 34 g (0,101 M, 0,96 Äq.) Fmoc- OS wurden in kleinen Portionen unter Rühren zugegeben und der pH-Wert durch Zugabe von gegebenenfalls weiterem Na&sub2;CO&sub3; auf etwa 9 gehalten. Nach 1 Stunde wurde die Reaktion in 500 ml Wasser gegossen und mit konz. HCl angesäuert. Die weiße Suspension wurde mit EtOAc extrahiert, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einer festen Masse eingedampft. Diese wurde in 500 ml heißem EtOAc gelöst und 300 ml Hexan wurden zugegeben. Kühlung über Nacht, Gewinnung und Lufttrocknung ergab 38,7 g (83% Ausbeute) weißer Kristalle, Schmelzp. 110-112º. [a]d = -13,8º. M/e (rel. Intens.): 460,2 (19), 363,4 (8), 345,4 (19), 307,2 (10), 289,2 (12), 238,2 (12), 191,2 (10), 178,2 (89), 165,1 (23), 154,1 (57), 136,1 (48). ¹H-NMR (400 mHz), ppm: 1,9 (m, 1H), 2,2 (m, 1H), 2,4 (m, 2H), 4,1 (t, 1H), 4,4 (d, 2H), 4,43 (m, 1H), 5,1 (s, 2H), 5,6 (d, 1H), 7,3 (m, 9H), 7,5 (d, 2H), 7,7 (d, 2H), 9,4-9,6 (breites s, 1H).
¹³C (100 mHz), ppm: 27,5, 30,0, 47,3, 53,5, 67,3, 67,7, 120,2, 125,0, 127,3, 128,5, 128,8, 129,2, 135,2, 141,5, 143,6, 143,9, 156,3, 171,4, 177,8.
Anal. Berechnung für C&sub2;&sub7;H&sub2;&sub5;NO&sub6;: C, 70,57; H, 5,48; N, 3,05.
Gefunden: C, 69,71; H, 5,58; N, 2,88.

BEISPIEL 6

Synthese von γ-Glutamyl-S-benzylcysteinyl-β-alanin

1,5 g (9,76 mMol, 1 Äq.) β-Alaninethylester-Hydrochlorid wurden zu 50 ml DMF zugegeben und 1,8 ml DIPEA wurden zugesetzt. 3,5 g (8,1 mM, 0,83 Äq.) Fmoc-S-benzylcystein wurden zugegeben und durch Verwirbeln der Lösung gelöst. Anschließend wurden 2 g EDAC und 250 mg HOBT zugegeben und die Feststoffe durch Verwirbeln aufgelöst. Die Mischung wurde 1 Stunde lang stehengelassen und im Vakuum zu einem dünnflüssigen Öl von etwa 5 ml Volumen konzentriert. Dazu wurden 100 ml von 10% Gew./Vol. KHCO&sub3; in Wasser zugegeben und die Mischung wurde geschüttelt und die Flüssigkeit durch Filtration entfernt. Der Rückstand wurde in 100 ml EtOAc gelöst, mit 50 ml 1 N HCl, 50 ml Wasser gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Die Lösung wurde filtriert und im Vakuum konzentriert, um einen Schaum zu ergeben, der mit Hilfe eines 2 · 6 cm-Betts von Silicagel, gepackt in CH&sub2;Cl&sub2;, chromatographiert wurde. Die Säule wurde eluiert, bis das erste UV- absorbierende Material erschien, dann wurde ein Gradient in 1%igen Methanol- Inkrementen von 100 ml Volumen bis 3% Methanol laufengelassen. Eine stark UV- absorbierende Bande eluierte nach 2 Portionen an 3%igem Methanol; diese wurden mittels DC auf Reinheit überprüft und vereinigt und im Vakuum eingedampft, um 4,6 g (83% Ausbeute) an Fmoc-Cys(S-benzyl)-β-alaninethylester zu ergeben. Die Hälfte davon (4 mMol) wurde in einer Mischung von 30 ml DMF und 10 ml Piperidin gelöst und 30 Minuten lang stehengelassen. Die Lösung wurde im Vakuum zu einem Feststoff eingeengt und der Prozess zwei weitere Male mit 50 ml DMF wiederholt. Der resultierende weiße Feststoff wurde 1 Stunde lang einem Hochvakuum ausgesetzt und dann in 50 ml DMF gelöst. Für den zweiten Kopplungsschritt wurden 1,6 g (3,5 mMol, 0,9 Äq.) Fmoc-Glutaminsäure-(α)-benzylester (v) zugegeben, gefolgt von 0,8 g (4,2 mMol, 1,05 Äq.) EDAC und 200 mg (1,4 mMol) HOBT. Die Mischung wurde 1 Stunde stehengelassen und im Vakuum auf etwa 5 ml Volumen konzentriert. Diese wurde in 100 ml einer 10%igen wäßrigen KHCO&sub3; Lösung gegossen und geschüttelt. Die Flüssigkeit wurde abgegossen und der Rückstand in 100 ml Ethylacetat gelöst. Die organische Schicht wurde mit 50 ml 1 N HCl, 50 ml Wasser gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Diese wurde zu einem Teer eingeengt und auf dieselbe Weise wie das geschützte Dipeptid chromatographiert. 1,2 g (42% Ausbeute) des geschützten Tripeptids wurden erhalten. Dieses Material wurde in 30 ml absolutem Ethanol gelöst und 10 ml 1 N NaOH-Lösung wurden zugegeben. Die Mischung wurde 18 Stunden lang stehengelassen und in einen Scheidetrichter mit 40 ml Wasser und 40 ml Hexan gegossen. Die Schichten wurden geschüttelt und getrennt und die wäßrige Phase mit weiteren 40 ml Hexan gewaschen. Der pH-Wert der Wasserschicht wurde durch Zugabe einiger weniger Tropfen konz. HCl auf etwa 3 eingestellt und die trübe Lösung im Vakuum zu einem Feststoff eingeengt und mehrere Stunden lang einem Hochvakuum ausgesetzt. Der Rückstand wurde mit zwei 20-ml-Portionen absoluten Ethanols gewaschen. Die Ethanol-NaCl-Aufschlämmung wurde filtriert und die klare Lösung zu einem Teer eingedampft. Das Gewicht betrug 620 mg (89% Ausbeute von dem geschützten Tripeptid, 19% von Fmoc-Cys(benzyl)-OH). Eine DC-Platte wurde in Ethylacetat/Pyridin/Wasser/Essigsäure 5/5/3/1 Vol./Vol. laufengelassen und mit Ninhydrin-Spray und Wärme sichtbar gemacht (Stewart, J., et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (1984) S. 53-124, Pierce Chemical Co., Rockford, IL), Rf 0,66. Die HPLC-Analyse zeigte 74% Reinheit durch Flächenintegration von UV-absorbierendem Material (Fig. 1). "Fast Atom Bombardment"-Massenspektroskopie (FABMS) zeigte einen Ionenpeak bei 434,2 M/e, in Übereinstimmung mit dem Tripeptid-Mononatriumsalz. Andere Peaks mit höherer Masse waren ebenfalls vorhanden, die teilweise unvollständig geschütztem Peptid zuzuschreiben waren.
In Fällen, in denen der Fmoc-geschützte C-terminale Aminosäureester anstelle des im Handel erhältlichen C-terminalen Aminosäureesters mit freier Aminogruppe eingesetzt wurde, wurde dieses Material mit denselben Verfahren wie zur Deblockierung des obigen geschützten Dipeptids eingesetzt deblockiert und dann mit der ersten Kopplungsreaktion wie oben fortgefahren.

BEISPIEL 7

Derivatisierung an Sepharose-Harz

0,66 g Epoxy-SepharoseTM 6B (Pharmacia) wurde 15 Minuten lang mit 10 ml Wasser gequollen, dann zweimal mit 10 ml Wasser in einen 15-ml-Sinterglastrichter gespült. Eine Lösung von 100-500 mg des rohen Tripeptids in 5 ml Ethanol und 10 ml Wasser wurde mit 6 N NaOH in einem 20-ml-Szintillationsgefäf3 mit einem Polycon-Deckel auf pH 11-12 eingestellt. Das gespülte Harz wurde zugegeben und über Nacht in einem 37º-Wasserbad sanft mechanisch bewegt. Der pH-Wert wurde am nächsten Tag überprüft und erforderlichenfalls mit 6 N NaOH auf pH 11-12 zurückgebracht. Nach einem weiteren Tag mechanischer Bewegung wurde das Harz filtriert (die peptidhaltige Flüssigkeit wurde mit konz. HCl angesäuert, eingedampft und gewonnen) und dreimal mit 10 ml Wasser gespült. Die unfunktionalisierten Epoxygruppen wurden mit Endgruppen versehen, indem das Harz 1 Stunde lang in 10 ml Wasser getränkt wurde, welches etwa 0,1 ml Ethanolamin enthielt. Das Harz wurde dann dreimal mit 10 ml Wasser gespült und eine Probe zur Analyse entnommen. Der Rest wurde mit 10 ml Puffer von 0,1 M NaOAc, 0,5 M NaCl, pH 4,0, gefolgt von 10 ml Puffer von 0,1 M Tris-Chlorid, 0,5 M NaCl, pH 8,0, gespült. Das Harz wurde bei 4ºC in diesem Puffer von pH 8 gelagert.

BEISPIEL 8

Verwendung der Verbindungen als Affinitätssorbentien

Eine Reihe der Verbindungen der Formel (1) wurde konstruiert, worin YCO γ-Glu war, AAc Gly bedeutete und X Benzyl mit Nitro-, Chlor-, Methoxy- und Methylsubstituenten an der para-Position darstellte. Die relevanten Analoga wurden an Sepharose-Harz wie oben beschrieben derivatisiert und als Affinitätssorbentien bei der Auftrennung der drei rekombinanten Human-GST-Enzyme eingesetzt. HPLC wurde zur Messung der relativen Mengen der Enzyme, welche an die Träger banden, eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. TABELLE 2
Wurde der Prozentsatz der π- und u-Isoenzyme gegen deren Sigma (Meta)- Werte aufgetragen, so wurde eine gute lineare Korrelation erhalten. Es wurde jedoch eine schlechte Korrelation erhalten, wenn die Sigma (Para)-Werte eingesetzt wurden. Die Sigma (Meta)-Werte sind ein Maß für den rein induktiven Effekt; die Sigma (Para)-Werte hängen jedoch von der Resonanz ab, in welcher der Substituent Partialladungen an einem Atom im Ring nahe der Verknüpfungsstelle plazieren kann.
Die Rückgewinnungen von Protein und (CDNB-konjugierender) GST-Aktivität in den Elutionsfraktionen nach Affinitätsreinigung der zytosolischen GST-Isoenzyme aus der Rattenleber mit verschiedenen Verbindungen der Erfindung sind in Tabelle 3 dargestellt. TABELLE 3 Rückgewinnung von Protein und CDNB-konjugierender Aktivität nach Affinitätschromatographie von Rattenleber-Zytosol mit GSH und ausgewählten GSH-Analoga-Sorbentien
Abkürzung: Cu = Cumyl (α,α-Dimethylbenzyl)
Herkömmliche S-L-GSH- und HxGSH-Sorbentien zeigten eine starke Bindung und eine breite Isoenzym-Erkennung. Die neuen Sorbentien hielten eine geringere Masse der GST-Isoenzyme zurück, wobei die Proteinrückgewinnung für drei der neuen Sorbentien weniger als die Hälfte derjenigen der herkömmlichen Sorbentien betrug.
Im Vergleich zu HxGSH zeigten die neuen Sorbentien keine direkte Entsprechung der CDNB-konjugierenden Aktivität zu der Proteinrückgewinnung. Beispielsweise ergaben γE-C(Bz)-βA- und γE-C(Bz)-A-Sorbentien 33% und 16% der Proteinrückgewinnung, die mit HxGSH zu beobachten war, jedoch waren die CDNB- konjugierenden Aktivitäten nach Korrektur bezüglich der inhibitorischen Eigenschaften des eluierenden Liganden wesentlich höher (52% bzw. 33%). Im Gegensatz dazu nahm die Proteinrückgewinnung durch das γE-C(Cu)-G-Sorbens minimal ab, während die Aktivität um 50% abnahm. Es ist wohlbekannt, daß verschiedene GST-Isoenzyme individuelle spezifische Aktivitäten gegenüber CDNB zeigen. Die Differenz zwischen der Proteinrückgewinnung und der Aktivitätsrückgewinnung wurde den Unterschieden in der Isoenzym-Zusammensetzung in den Elutions fraktionen eines jeden Sorbens zugeschrieben. Diese Hypothese wurde durch SDS/PAGE- und Umkehrphasen-HPLC-Analyse der Eluatfraktionen gestützt.
Fraktionen, die von den in Tabelle 3 aufgelisteten Sorbentien eluierten, wurden mittels SDS/PAGE, gefolgt von Silberanfärbung, analysiert. S-L-GSH- und HxGSH-Sorbentien banden Proteine, welche den vorher beobachteten elektrophoretischen Bandenmustern von Rattenleber-GST-Untereinheiten entsprachen. Die neuen Sorbentien zeigten unterschiedliche Bandenmuster. Beispielsweise zeigte das oben angesprochene uE-C(Bz)-βA-Eluat eine hochangereicherte Bande für mutmaßliche u-Klasse-Isoenzyme. Nachdem die π-Klasse-GST 7-7 in niedrigen Niveaus in Rattenleber-Zytosol gefunden wird, wurden auch andere Rattengewebe getestet, von denen bekannt ist, daß sie höhere Niveaus dieses Isoenzyms exprimieren. Das GST-Gelmuster aus zytosolischen Rattenniere-Proteinen, eluiert von dem γE-C(Hx)-φG-Sorbens, zeigte ein Protein mit derselben molekularen Wanderungsgeschwindigkeit wie Ratten-GST-Untereinheit 7, welches die einzige Komponente dieses Eluats ist, was anzeigt, daß dieses Sorbens ein, π-selektives Reagens ist.
Ein Protein mit einer ähnlichen molekularen Wanderungsgeschwindigkeit wie diejenige eines weiteren GSH-abhängigen Enzyms, Glyoxalase I, war ebenfalls in den Eluaten von γE-C(Bz)-A und γE-C(Bz)-βA vorhanden, wurde jedoch nicht in Eluaten der anderen Sorbentien nachgewiesen. Bei diesen Experimenten zeigte HxGSH, von dem bereits gezeigt wurde, daß es an Glyoxalase I bindet, keinerlei nachweisbare Niveaus dieses GSH-abhängigen Enzyms. Glyoxalase I ist bekannterweise ein Metall-abhängiges Enzym und die Anwesenheit von EDTA in den Puffern mag die Bindungsaffinität gestört haben.
Der hohe Reinheitsgrad von Proteinen entsprechender Größe, welche bei SDS/PAGE der Affinitäts-eluierten Proteine beobachtet wurde, legte nahe, daß die beobachteten Banden in der Tat GSTn sind. Eine unabhängige Bestätigung dieser Schlußfolgerung bei einer höheren Auflösung ergaben Umkehrphasen-HPLC- Analysen der GST-Isoenzyme in den Eluaten von verschiedenen Sorbentien. Der Vergleich mit gereinigten GST-Standards zeigte, daß die von den neuen Sorbentien eluierten Isoenzyme bekannten GST-Isoenzymen entsprechen. Diese Verfahren zeigten, daß die GST-Untereinheit 3 bei 14 Minuten eluierte, Untereinheit 4 bei 17 Minuten, Untereinheit 7 bei 18 Minuten, Untereinheit 3 bei 23 Minuten, Untereinheit 6 bei 25 Minuten, die Untereinheiten 1a und 1b bei 37 und 40 Minuten und die Untereinheit 8 bei 42 Minuten. Die Untereinheiten 3, 4 und 6 sind u-Klasse-Isoenzyme, die Untereinheiten 1a, 1b, 2 und 8 sind α-Klasse-Isoenzyme und Unterheit 7 ist das π-Klasse-Isoenzym. S-L-GSH- und HxGSH-Sorbentien banden wie erwartet alle Enzyme mit Ausnahme von 5-5, dem Theta-Klasse-Isoenzym.
γE-C(Cu)-G erhöhte den Anteil des Isoenzyms 2, band jedoch alle Isoenzyme bis zu einem gewissen Grad. Im Gegensatz dazu waren andere Sorbentien in ihrer Bindung der Isoenzyme sehr selektiv. Beispielsweise band γE-C(Bz)-βA selektiv die u-Klasse-Isoenzyme 3 und 4 und bestätigte die SDS/PAGE-Resultate.
Die Spezifitäten einer Vielfalt der neuen Sorbentien für Ratten-Zytosol-GST- Isoenzyme sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Einige Strukturänderungen des Liganden ergaben Sorbentien, welche kein Isoenzym wirksam banden; mehrere davon sind der Vollständigkeit halber aufgeführt. TABELLE 4 Auftrennung von Ratten-GST-Isoenzymen durch neue Sorbentien
*Abkürzungen wie in Tabelle 1 und dem Text oben, außer Cu = Cumyl (α,α- Dimethylbenzyl) und φG = Phenylglycin.
Systematische Veränderungen des Cys-Rests, um die bereits festgestellte H-Stelle (hydrophobe Tasche) zu sondieren, führte zu Liganden, welche zur Bindung an die Isoenzyme in der Lage waren. Adang et al. (1990) untersuchten keinerlei Analoga mit systematischen Modifikationen von Gruppen, die mit der Cys- Gruppierung verknüpft waren. Veränderungen dieser Gruppe wirkten sich auf das Ausmaß der Proteinrückgewinnung und die Spezifität der Isoenzym-Bindung in mehreren Fällen aus. Beispielsweise veranlaßte die Änderung der S-verknüpften Gruppierung von Glutathion zu einer ähnlichen Struktur wie der von Cumenhydroperoxid, einem α-Klasse-Substrat, die Sorbentien zur Bevorzugung des Isoenzyms 2-2 der α-Klasse. Wurde Ala als terminale Aminosäure eingesetzt, führten sowohl Propyl- als auch Benzylgruppierungen am Cys zu Sorbentien, welche für u-Klasse-Isoenzyme spezifisch waren (Tabelle 4). Das Propyl-Sorbens hielt mehr GST-Protein zurück, zum Teil deshalb, da es beide Isoenzyme 3 und 4 bindet, im Vergleich zu dem Benzyl-Sorbens, welches hochspezifisch für das Isoenzym 4 ist. Wurde His als terminale Aminosäure eingesetzt, führte die Propylgruppierung zu einer hohen u-Klasse-Spezifität, während die Benzylgruppierung keinerlei Bindung ergab. Im Gegensatz zu diesen Sorbentien hatten Änderungen der Cys-Gruppierung von Val- und Asp-substituierten Sorbentien keine Auswirkung auf die niedrige Bindung. Somit kann der Cys-Substituent bei der Modifizierung der Gesamtspezifität des Sorbens, wie sie durch die terminale Aminosäure bestimmt wird, von Bedeutung sein.

BEISPIEL 9

Verwendung der Verbindungen als Inhibitoren in Lösungsphase

Screening-Strategie

Ein systematisch diversifizierter Satz von Peptid-Analoga wurde als Isoenzymspezifische Inhibitoren von Human-Glutathion-S-Transferase (GST) getestet. Die Wirksamkeit der besten Inhibitoren liegt im Bereich von 0,5 bis 20 uM, wobei die Kinetiken eine kompetitive Inhibierung mit Glutathion an der aktiven Stelle anzeigen. Die beobachtete Spezifität bei drei GST-Isoenzymen rekombinanten Ursprungs sowohl von niedriger als auch hoher Wirksamkeit reichte von vernachlässigbar bis hoch (mindestens 20-fach gegenüber dem nächstsensibleren Isoenzym).
Diese Verbindungen wurden zunächst in Konzentrationen von 1 mM gegen drei rekombinante Human-GSTn, eine von jeder Haupt-Isoenzym-Klasse, gescreent, um festzustellen, ob sie die Enzymaktivität inhibieren würden, wobei CDNB als spektralphotometrisch nachweisbares Substrat eingesetzt wurde. Um die schnelle Untersuchung eines breiten Spektrums von Verbindungen zu erlauben, waren die in diesem Stadium eingesetzten Paraloga rohe synthetische Proben und wurden vor dem Test nicht auf Reinheit charakterisiert, obwohl in den meisten Fällen die vorgesehene synthetische Verbindung die dominierende Spezies war und etwa 50% der Masse darstellte. Die Nominalkonzentration von 1 mM basierte auf einer Annahme von 100%iger Reinheit. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse dieser Inhibierungstests für eine Reihe von 51 paralogen Analoga von GSH. TABELLE 5 Inhibierung von Human-GST-Aktivität durch GSH-Analoga TABELLE 5 (FORTSETZUNG)
Abkürzungen wie in Tabelle 1 und dem Text oben, außer: Konz. = Konzentration; NN = nicht nachgewiesen; IC&sub5;&sub0; = Inhibitorkonzentration, die eine 50%ige Verringerung der Aktivität verursacht; Bu = Butyl; t-Bu = tert.-Butyl; Cu = Cumyl (α,α-Dimethylbenzyl); IMe = Iodmethyl; γE-α-Aminooctansäure-G (Verbindung 8) = γE-C(Hx)-G, wobei C(Hx) durch ein Analogon ersetzt ist, dem Schwefel fehlt; G-γE- C(Octyl)-G (Verbindung 14) = zusätzliches G am N-Terminus von γE-C(Octyl)-G; cyclisch = N- und C-Termini des Tripeptids sind kovalent verknüpft (Peptidbindung); γE-G-C(Hx)-φG (Verbindung 44) = ein zusätzliches G ist zwischen G und C in γE- C(Hx)-φG inseriert.
In der Tabelle 5 sind die Paraloga nach der Human-GST-Isoenzym-Selektivität gruppiert und innerhalb jeder Selektivitätsklasse nach abnehmender Wirksamkeit geordnet. Paraloga, welche eine starke Selektivität für die P1-1- und M1a-1a- Isoenzyme zeigten, wurden in dieser Übersicht eindeutig identiziert, es wurde jedoch über die bereits beschriebenen hinaus kein neuer selektiver Inhibitor für A1-1 gefunden. Die aufgestellten Kriterien für die Fortsetzung des Screenings über den Inhibierungstest bei der Konzentration von 1 mM hinaus waren: inhibierungen von > 90% irgendeines GST-Isoenzyms oder eine > 6-fache Differenz der Inhibierung zwischen einem Isoenzympaar. Die IC&sub5;&sub0;-Werte für diese Paraloga, welche die Anfangskriterien erfüllten, sind ebenfalls in Tabelle 5 dargestellt.
Eine genauere Messung der Bindung von Paraloga an GST-Isoenzyme wird erhalten mit Hilfe von GST-Konkurrenzexperimenten, um einen Ki-Wert zu bestimmen. Solche Tests wurden mit denjenigen Verbindungen durchgeführt, welche IC&sub5;&sub0;-Wirksamkeiten im Bereich von 10 bis 100 uM aufwiesen oder > 5-fache Selektivitäten zwischen den Isoenzymen zeigten und für die > 90% reine Verbindungen hergestellt worden waren. Falls die Inhibierung durch das Paralogon kompetitiv ist, können die Km Werte für GSH in Anwesenheit oder Abwesenheit von Inhibitor zur Bestimmung des Ki-Werts oder der Dissoziationskonstante zwischen dem Paralogon und dem GST-Isoenzym eingesetzt werden. Die IC&sub5;&sub0;-Werte wurden zur Festlegung einer angemessenen Inhibitorkonzentration, um eine etwa 50%ige Inhibierung bei 1 mM GSH zu ergeben, verwendet. Die bei dem GSH- Konkurrenzexperiment mit verschiedenen Paraloga erhaltenen Daten wurden in einem Hanes-Woolf-Plot aufgetragen. Parallele Linien der inhibierten und nicht- inhibierten Zustände in einem Hanes-Wolf-Plot zeigen an, daß das Paralogon mit der aktiven Stelle der GST wechselwirkt. Für die meisten Kombinationen von Paralogon und GST wurde strikte Parallelität beobachtet. Der Km Wert, welcher für GSH allein in dieser gesamten Folge von Experimenten erhalten wurde, lag im Bereich zwischen 0,4 und 0,6 mM, welches etwa 10-100 Größenordnungen schwächer war als der für das wirkungsvollste Paralogon registrierte.
Tabelle 6 repräsentiert die Ki-Werte für diese Untergruppe interessanter Verbindungen. TABELLE 6 Inhibierung der Human-GST-Aktivität durch gereinigte GST-Paraloga: mikromolare Ki-Konzentration, bestimmt durch Konkurrenzbindung an GSH
Die meisten dieser Verbindungen erschienen in diesen Untersuchungen wirksamer als in den ursprünglichen Screening-Tests, da die für die GSH- Konkurrenzexperimente verwendeten neuen Präparationen zu mindestens 90% rein waren. Ein weiterer Beitrag ergibt sich aus der arithmetischen Definition von IC&sub5;&sub0; im Vergleich zu Ki; die Werte sind nur gleich, wenn sich die GSH- und CDNB- Konzentrationen beide Null nähern, welches im vorliegenden Standardprotokoll nicht der Fall war. Hinsichtlich der Spezifität stimmten die genaueren Bestimmungen im allgemeinen mit den vorläufigen Daten überein, obwohl sich in mehreren Fällen die relativen Präferenzen änderten.

Quantitative Struktur/Aktivitäts-Beziehungen

Unter Anwendung von Standardverfahren der medizinischen Chemie wurden Trends bei der quantitativen Struktur/Aktivitäts-Beziehung (QSAR) dieser Verbindungen gesucht. Für diesen Zweck wurde eine Reihe von n-Alkyl-Derivaten von GSH getestet. Resultate einer detaillierten Untersuchung dieses Merkmals sind in Tabelle 7 zusammengefaßt. TABELLE 7 Inhibierung der GST-Aktivität durch S-(n-Alkyl)-GSH-Addukte: mikromolare Konzentration, die für eine 50%ige Inhibierung erforderlich war
Abkürzung: V = Verbindung
Diese Ergebnisse zeigen erstens, daß die inhibitorische Wirksamkeit der Verbindungen mit der Kettenlänge der n-Alkyl-Gruppe zunimmt, und zweitens, daß dieser Parameter keinen regelmäßigen Trend bei der Isoenzym-Selektivität ergibt. Es ist auffallend, daß die für die in Tabelle 5 dargestellten Paraloga-Verbindungen erhaltenen Ergebnisse eine wesentlich größere Diversität in den Inhibierungsmustern zeigen als diejenigen, welche für den Satz von n-Alkyl-Derivaten von GSH, die in Tabelle 7 dargestellt werden, erhalten wurden.
Von zahlreichen kleinen organischen Molekülen wurde ebenfalls bereits berichtet, daß sie die GST-Aktivität inhibieren (Mannervik, B., et al., CRC Crit. Rev. Biochem. (1988) 23: 283-337), obwohl nur einige wenige bezüglich isolierter Human- Isoenzyme sorgfältig charakterisiert wurden. Nachdem zu erwarten stand, daß Vergleiche dieser Verbindungen mit den radikal unterschiedlichen Strukturen auf Peptidbasis sich für eine detailliertere QSAR-Untersuchung als nützlich erweisen würden, wurden auch Tests solcher Verbindungen vorgenommen. Mehrere dieser Verbindungen zeigten eine Wirksamkeit und Selektivität, die mit den Verbindungen auf Peptidbasis vergleichbar waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefaßt. TABELLE 8 Inhibierung der GST-Aktivität durch (kleine organische) Nicht-Peptid-Verbindungen; mikromolare Konzentration, die für eine 50%ige Inhibierung erforderlich war

Graphische Analyse der Inhibierungsdaten

Die mehrdimensionalen Inhibierungsdaten (jede Achse repräsentiert den Inhibierungsgrad für eine der rekombinanten GSTn) wurden auf einem IBM- kompatiblen PC mit dem Hauptkomponenten-Algorithmus in Pirouette, einem statistischen Multivarianz-Software-Paket, das für chemische Daten von Infometrix, Inc. (Seattle; Wash.) entwickelt wurde, analysiert. Die Hauptkomponenten sind die Eigenvektoren der Covarianz-Matrix mit den größten assoziierten Eigenwerten. Als solche repräsentieren sie Verbund-Parameter, die von den ursprünglichen Achsen abgeleitet sind, um zwei Bedingungen zu erfüllen: (1) die Hauptkomponenten sind unabhängige (orthogonale) Dimensionen, und (2) sie machen den größten Teil der Varianz in dem Datensatz aus. Folglich maximiert die Projektion von Daten auf eine Ebene, die durch die Hauptkomponenten definiert ist, die Klarheit der visuellen Darstellung, indem die Daten entlang von Dimensionen maximaler Streuung ausgebreitet werden. Punkte, die in einer solchen Projektion nahe beieinander liegen, geben deshalb Korrelationen in dem ursprünglichen höherdimensionalen Raum wahrheitsgetreu wieder Zielwerte sind ebenfalls aufgetragen, welche postulierte ideale Verbindungen mit 100-fachen Spezifitätsfaktoren und 0,1-uM-Ki- Werten darstellen. Für diese Analyse wurde die Inhibierungswirksamkeit als log (1/IC&sub5;&sub0;) definiert oder als log (1/Ki), wenn dieser genauere Wert verfügbar war.
Fig. 1 präsentiert eine graphische Analyse von IC&sub5;&sub0;-Daten aus den Tabellen 5, 7 und 8, kombiniert mit den Ki-Daten in Tabelle 6. Zur Bestimmung dieses Diagramms wurden die Inhibierungseigenschaften zuerst in einem dreidimensionalen Raum aufgetragen, dessen Achsen den Inhibierungsgrad für jedes der drei rekombinanten Isoenzyme repräsentieren. Die Hauptkomponenten der Datenverteilung wurden dann bestimmt (Massart, D. L., et al., Chemometrics: a textbook (1988), Elsevier, Amsterdam). Einfach ausgedrückt, Hauptkomponenten sind zusammengesetzte Faktoren, abgeleitet von den ursprünglichen Achsen, welche mathematisch optimiert sind, um Korrelationen in einem Multivarianz- Datensatz zu zeigen, indem Punkte entlang Achsen aufgetragen werden, welche zur Maximierung der Streuung gewählt wurden. Das dargestellte Diagramm ist eine Projektion der Daten auf die Ebene, welche durch die zweiten und dritten Hauptkomponenten definiert ist. Die erste Hauptkomponente ist eine Dimension, welche hauptsächlich die Wirksamkeit darstellt und eine Streuung in dieser Eigenschaft ist in den Tabellen gut wiedergegeben. Die Wahl der zweiten und dritten Hauptkomponenten für Fig. 1 betont den Spezifitätsfaktor, von dem angenommen wird, daß er ein gleichermaßen bedeutsamer Aspekt der Qualität ist. Ein solcher Multivarianz-Plot erlaubt eine bequeme Überprüfung der Qualität (sowohl Wirksamkeit als auch Selektivität) der getesteten Reagenzien. In dem Diagramm sind auch Zieleigenschaften, definiert als 100-fache Spezifität und ein Ki-Wert von 0,1 uM, angegeben.
Die Multivarianz-Analyse der Wirksamkeiten und Selektivitäten der Inhibitoren, welche in Fig. 1 präsentiert wird, hebt auch mehrere andere interessante Merkmale hervor. Zunächst zeigt sie, daß das Benzyl/Phegly-Parafogon (Verbindung 4, Tabelle 5) dem Ziel eines P1-1-spezifischen Inhibitors recht nahe kommt. Zweitens sind die Benzyl/β-Ala- (Verbindung 30), 4-Methylbenzyl/β-Ala- (Verbindung 29) und cyclisches Benzyl/Phegly (Verbindung 31) -Paraloga die am meisten selektiven für das M1a-1a-Enzym, kommen jedoch dem Ziel, wie es für das P1-Enzym erreicht wurde, nicht so nahe. Drittens wurde bei dieser Untersuchung kein neues A1-1- selektives Paralogon entdeckt.
Die Analyse kleiner organischer Moleküle zeigt, daß eine Vielfalt von Wirksamkeiten und Spezifitäten auch von dieser Klasse von chemischen Strukturen erhältlich ist. Viele der wirksamsten solcher Verbindungen sind jedoch extrem hydrophobe Farbstoffe und es ist somit unwahrscheinlich, daß sie aufgrund der hohen Hintergrundbindung an Proteine im allgemeinen klinisch geeignet sein werden. Obwohl Konkurrenzexperimente mit diesen Inhibitoren noch nicht durchgeführt wurden, um direkt zu bestimmen, ob es sich um kompetitive Inhibitoren handelt, sind Arbeiten im Gange, um sie in GSH-Derivate zu überführen, mit der Hoffnung, eine größere Wirksamkeit und Selektivität zu erreichen als diejenigen, welche mit den in dieser Veröffentlichung beschriebenen Verbindungen möglich sind.
Bei der Gestaltung effektiverer Inhibitoren sollte die Datenanalyse durch Multivarianz-Statistik, wie in Fig. 1 zusammengefaßt, besonders nützlich zur Bestimmung von strukturellen Trends sein. Schließlich sollten die auf diese Weise sichtbar gemachten, empirisch beobachteten Trends nützliche Einsichten liefern zum Vergleich mit Strukturdaten bezüglich GSTn, einschließlich Studien unter Anwendung von Röntgenkristallographie, hochauflösender Kernspinresonanz (NMR) und stellengerichteter Mutagenese.

Pharmakologische Folgerungen

Die Unterschiedlichkeit der GST-Aktivität in Tumoren, sowohl qualitativ als auch quantitativ, stellt eine beachtliche therapeutische Gelegenheit dar, um vorhandene chemotherapeutische Arzneimittel bevorzugt gegen Tumore zu richten. Dieselbe Unterschiedlichkeit stellt jedoch insofern eine große Herausforderung für den pharmazeutischen Chemiker dar, als die Wirksamkeit alleine für eine Brauchbarkeit nicht ausreichend ist; Selektivität gegenüber einer Gruppe von nahe verwandten Enzymen ist ebenfalls erforderlich. Der Paralogon-Weg dieser Erfindung ist für eine solche Herausforderung gut geeignet. Wie in der vorliegenden Arbeit demonstriert, eignen sich rohe Liganden als erste Sonden (Tabelle 5). Eine zuverlässige Bewertung der inhibitorischen Eigenschaften erfordert jedoch etwa 50 mg gereinigter Verbindungen (Tabelle 6). Eine systematische Probenauswahl ist deshalb eine sehr nützliche Strategie, um die Charakterisierungsarbeit auf ein vernünftiges Maß zu begrenzen.
Ferner trägt das Spektrum der als Proben ausgewählten Strukturen direkt zu QSAR- und Enzym-Struktur-Korrelationsuntersuchungen bei, welche die Identifizierung der für Isoenzym-Selektivität und Wirksamkeit verantwortlichen Merkmale zum Ziel haben. Beispielsweise haben alle bis auf einen der am meisten selektiven Inhibitoren für die M1a-1a-Isoenzyme β-Alanin als C-terminale Aminosäure in der GSH-Gruppierung des Paralogons. Beide der am meisten selektiven Inhibitoren für das P1-1-Isoenzym haben Phenylglycin als C-terminale Aminosäure der GSH-Gruppierung.
Die besten Inhibitoren, die bei dieser Untersuchung erhalten wurden, zeigen dasselbe Wirksamkeitsspektrum wie der bereits untersuchte Inhibitor Hexyl-GSH, welches der Standardligand ist, der zur Affinitätsreinigung von GST-Isoenzymen eingesetzt wird. Die Wirksamkeit dieser Inhibitoren ist auch gleich oder besser als diejenige von Ethacrinsäure, welche klinisch als Arzneimittel zur Erhöhung der Wirkung von Chemotherapie getestet wird, und diese Beobachtung legt nahe, daß diese neuen Inhibitoren ebenfalls zur Verstärkung der Wirkung von Chemotherapie geeignet sein könnten. Beispielsweise wurde eine vorwiegende Expression von P1-1 bei einem Spektrum von Tumoren berichtet und ein Verstärker auf Basis des für P1-1 selektiven Inhibitors Benzyl/Phegly (Verbindung 4) könnte so bei der Krebstherapie von Nutzen sein.
Von den mit diesem Screening identifizierten Paraloga, für die ein Ki-Wert bestimmt wurde (Tabelle 6), zeigten alle eine kompetitive Inhibierung mit GSH, welches anzeigt, daß sie für ihre Wirkung die aktive Stelle der GST-Isoenzyme als Ziel haben, und somit, daß sie die Aktivität von GST gegenüber anderen Substraten als CDNB beeinflussen sollten. Eine Vielfalt von Alkylierungsmitteln sind Substrate für GST und die Isoenzyme unterscheiden sich in ihrer Spezifität für diese Substrate signifikant. Eine unterschiedliche Expression bestimmter Isoenzyme in einzelnen Tumoren kann deshalb für die Variabilität in der Ansprechbarkeit auf die Behandlung verantwortlich sein. Dieses Problem könnte bewältigt werden durch Anwendung geeigneter Paraloga dieser Erfindung, zunächst, um GST-Isoenzym-Komplemente einzelner Tumoren zu bestimmen und dadurch akzeptable zytotoxische Agentien zu identifizieren, die für die vorherrschenden GST-Isoenzyme eines gegebenen Tumors am wenigsten anfällig sind, und zweitens, um Paralogon-Inhibitoren bereitzustellen, welche die größte Wirkungsverstärkung eines ausgewählten Arzneimittels durch Inhibierung etwaiger immer noch vorhandener GST-Aktivität gegen dieses Arzneimittel zu bieten.
Zur Inhibierung von GST-Isoenzym-Aktivitäten in lebenden Zellen, beispielsweise um die Wirkung zytotoxischer Arzneimittel zu erhöhen, erfordern die in diesem Beispiel identifizierten Inhibitoren Modifikationen gemäß der vorliegenden Erfindung, um das Passieren der Zellmembran zu fördern, wie oben beschrieben und in Beispiel 11 unten beispielhaft dargestellt.

BEISPIEL 10

Verwendung der Verbindungen bei HPLC-Affinitätschromatographie von Human-Leber-GSTn

Dieses Beispiel beschreibt ein schnelles Verfahren zur Bestimmung der Glutathion-S-Transferase (GST)-Isoenzyme, beispielsweise in Human-Leber, unter Verwendung eines neuen HPLC-Affinitätsträgers. Leber-Zytosol wird direkt in eine HPLC-Säule (0,46 · 5 cm) eingespritzt, die einen Träger mit einem kovalent gebundenen Affinitätsliganden (S-Octylglutathion), der für die Isoenzyme spezifisch ist, enthält. Kontaminierende zytosolische Proteine werden in einem Waschschritt entfernt. Die Isoenzyme werden mit einem linearen Gradienten eines unterschiedlichen Affinitätsliganden in der mobilen Phase eluiert. Gleichzeitig mit dem Gradienten des Affinitätsliganden wird ein Salzgradient (0-200 mM Natriumchlorid) angewandt. Auf diese Weise werden die Enzyme in die enzymatisch aktiven Homodimere und Heterodimere fraktioniert. Die monomere und dimere Zusammensetzung der fraktionierten Isoenzyme wird durch SDS-PAGE, ELISA und Umkehrphasen- Chromatographie bestimmt. Für eine Leber werden drei α-Klasse-Isoenzymuntereinheiten, die drei Heterodimere und zwei Homodimere bilden, nachgewiesen. Fünf Lebern werden analysiert und das Homodimer A1-1 wird als das vorherrschende Glutathion-S-Transferase-Isoenzym befunden. Kleinere Mengen von Isoenzymen der π- und u-Klasse werden ebenfalls nachgewiesen. Dieses nicht- denaturierende Hochleistungsaffinitätschromatographie-Verfahren verringert die Analysezeit um einen Faktor von 10 im Vergleich zu anderen Affinitätsanalyseverfahren für die Glutathion-S-Transferasen.
Ein verfügbares chromatographisches Verfahren zur Auftrennung eines Spektrums von Glutathion-S-Transferasen (GSTn) in einer dimeren aktiven Form ist Affinitätschromatographie unter Anwendung isokratischer und/oder Gradienten- Elution mit einem Gegenliganden. Dieses Verfahren kombiniert die Reinigung der GSTn aus dem Zytosol durch Affinitätschromatographie mit einer Auftrennung der individuellen GSTn. Eine Auftrennung von GST-Homodimeren und Heterodimeren wurde bereits früher unter Anwendung dieser Technik mit entweder S- Hexylglutathion oder Glutathion, gebunden an Agarose, als Affinitätsligand erreicht. Aufgrund des großen Teilchendurchmessers und der langsamen Durchflußraten, die Agarosegelen zu eigen sind, betrug die Fraktionierungszeit für diese Untersuchungen etwa 25 Stunden (Hayes, J. D., et al. (Hrsg.), Glutathione S-Transferases and Drua Resistance, Taylor und Francis, London, 1989, S. 17), was erklärt, warum diese Technik für die Routineanalyse von GSTn nicht eingesetzt wird. Eine HPLC- Säule, enthaltend immobilisiertes Glutathion als Affinitätsligand wurde für die präparative Reinigung von GSTn beschrieben (LeCreta, F. P., et al., J. Chromatog. (1988) 434: 83-93), es wurde jedoch kein Versuch gemacht, die individuellen Isoenzyme aufzutrennen.
Dieses neue HPLC-Verfahren dieser Erfindung verwendet eine stationäre Phase mit einem GST-Affinitätsliganden (z. B. S-Octylglutathion) in kovalenter Verknüpfung mit HPLC-Teilchen, die in eine analytische HPLC-Säule gepackt sind.
Affnitätsmatrix. Die Synthese der Affinitätsmatrix folgt dem allgemeinen Verfahren von Sundberg und Porath (J. Chromatogr. (1974) 90: 87). HEMA (Hydroxyethylmethacrylat) BIO 1000, 1,4-Butandioldigiycidylether und 0,6 M Natriumhydroxid, enthaltend 2 mg/ml Natriumborhydrid (0,031111, Gew./Vol./Vol.) wurden über Nacht gemischt. Die Teilchen wurden filtriert und mit Wasser, Ethylalkohol und Aceton gewaschen. Zu 700 mg der getrockneten Teilchen wurde S-Octylglutathion (75 mg), gelöst in 3,5 ml 0,5 M Natriumcarbonat, zugegeben. Die Suspension wurde etwa 90 Stunden lang gemischt. Nach Filtration wurden die Teilchen mit (i) 1 M Natriumchlorid, 0,1 M Natriumphosphat (pH 9), (ii) 1 M Natriumchlorid, 0,1 M Natriumacetat (pH 4,5), (iii) Wasser, (iv) Ethanol und (v) Aceton gewaschen.
Packung von HPLC-Säulen. Das Affinitätsmaterial (650 mg) wurde in 20 ml Wasser aufgeschlämmt und bei hohem Druck in Säulen aus rostfreiem Stahl von 0,46 · 5 cm (Supelco Co., Bellefonte, PA) gepackt. Bei den Säulenfritten handelte es sich um Titan von 2 um (durchschnittlicher Porendurchmesser), in einem CTFE-Ring eingeschlossen (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA). Eine Haskell (Burbank, CA) DSTV-122-Flüssigkeitspumpe wurde verwendet, um das treibende Lösungsmittel (Wasser) während des Packungsprozesses zu liefern. Die Säulen wurden bei 2000 psi mit 50 ml Wasser und dann bei 400 psi mit 50 ml Wasser gepackt.
Eine beträchtliche Verkürzung der GST-Analysezeit wurde erzielt, indem die Auftrennung mit der hier beschriebenen neuen HPLC-Packung durchgeführt wurde. Leber-Proben wurden in 2 Stunden analysiert, mehr als zehnmal schneller als ähnliche Auftrennungen unter Verwendung von Affinitätsträgern auf Sepharose-6B- Basis. Wasch- und Elutionsschritte waren mit dem HPLC-Verfahren von beträchtlich kürzerer Dauer. Bei der Analyse von fünf Human-Lebern (Tabelle 9 unten) wurde die Druckstabilität der HPLC-Matrix ausgenutzt, indem der Waschschritt mit 1,5 ml/Min. durchgeführt wurde. Durchflußraten von mindestens 2 ml/Min. können in diesem System ohne Verlust von affinitätsgebundenen GST-Isoenzymen toleriert werden.
Die hochauflösende Affinitätstrennung der hier beschriebenen GST- Isoenzyme hing von der gleichzeitigen Anwendung von zwei Konzentrationsgradienten ab. Ein Gradient bestand aus einer linear zunehmenden Konzentration von entweder einem Glutathion-Paralogon, beispielsweise TER106 (d. h. γE-C(Bz)- βA), oder S-Butylglutathion, welches beides bekannte kompetitive Inhibitoren der GSTn sind (siehe Beispiel 9 oben). Bei dem Beladungsschritt komplexiert eine GST mit einem Affinitätsliganden, der mit der stationären Phase kovalent verknüpft ist. Mit zunehmender Konzentration des kompetitiven Inhibitors (TER106 oder S- Butylglutathion) während des Elutionsschrittes verteilt sich die GST zunehmend in die mobile Phase und eluiert schließlich.
Die Reihenfolge der Elution für eine Mischung von GSTn ist eine komplexe Funktion ihrer Affinitäten für sowohl den immobilisierten Affinitätsliganden als auch den kompetitiven Inhibitor in der mobilen Phase. Beispielsweise wurde beim Vergleich der Differenz in den GST-Elutionsprofilen bei Verwendung zweier verschiedener Elutionsliganden eine Änderung der Elutionsreihenfolge beobachtet. Eine Elution mit S-Butylglutathion im Vergleich zur Elution mit TER106 verschob das u-Klasse-Isoenzym zu einem breiten, länger zurückgehaltenen Peak in Relation zu den α-Klasse-Peaks. Darüber hinaus resultierte die S-Butylglutathion-Elution in der gemeinsamen Elution von Ax-y und Ay-y, welche mit der TER106-Elution aufgetrennt wurden. Es war die zweifache Konzentration von TER106 gegenüber S-Butylglutathion erforderlich, um ähnliche Chromatographien zu ergeben, was deren unterschiedliche Affinitäten für die Isoenzyme reflektiert.
Der zweite Gradient war ein Salzgradient, der gleichzeitig mit dem Ligandengradienten angewandt wurde. Ohne diesen Gradienten eluierten die ersten drei Peaks zusammen. Somit hing diese Auftrennung sowohl von einem Aflinitätsgradienten als auch von einem Salzgradienten ab. Der Salzgradient könnte dazu dienen, ionische Wechselwirkungen zwischen den Proteinen und dem an die stationäre Phase gebundenen Affinitätsliganden S-Octylglutathion, von dem zu erwarten stand, daß er bei pH 6,0 eine negative Nettoladung aufweist, zu überwinden.
Die Rückgewinnung von CDNB-konjugierender Aktivität, die mit einem Affinitätsliganden von der Affinitätssäule eluiert wurde, betrug im Durchschnitt 76% für drei Lebern, während die durchschnittliche Ausbeute an Gesamtaktivität (mit Affinitätsligand eluierte Aktivität plus nicht zurückgehaltene Aktivität) 83% betrug. Die Ausbeute an CDNB-konjugierender Aktivität von der hier beschriebenen Affinitätssäule war vergleichbar mit der in früheren Berichten beschriebenen unter Verwendung anderer Systeme.
Der Anteil nicht zurückgehaltener Aktivität für drei Lebern variierte von 3% bis 13%. Um sicherzustellen, daß die Fraktion nicht zurückgehaltener Aktivität nicht auf einem Systemproblem wie Säulensättigung beruhte, wurden Portionen von Zytosol aus derselben Leber (L005N) in fünf aufeinanderfolgenden Chromatographieläufen verarbeitet. Die Fraktion der nicht zurückgehaltenen Aktivität betrug im Durchschnitt 2,7% mit hohen und niedrigen Werten von 3,5% und 2,3%. Daraus wurde geschlossen, daß die Variation der nicht zurückgehaltenen Aktivität für verschiedene Leberproben eine Eigenschaft der Leberprobe war.
Die Identitäten der GST-Isoenzyme in den Hauptpeaks wurden mittels SDS- PAGE-Elektrophorese, ELISA und Umkehrphasen-HPLC festgestellt. Die Leber L006N scheint drei Formen von α-Untereinheiten zu enthalten. Das Umkehrphasen- Chromatogramm der aus der Leber L006 isolierten GSTn zeigt zwei Peaks, welche nach A1 eluieren. Diese später eluierenden Proteine wurden vorläufig als Untereinheiten Ax und Ay, basierend auf weiteren Untereinheits-Analysen, bezeichnet.
Für die Analyse von Human-Lebern wurde S-Butylglutathion als Elutionsligand gewählt, da er GSTn der u-Klasse von der α-Klasse trennte. Darüber hinaus besaßen andere Lebern als L006N nur A1 oder in einigen Fällen A1 plus nur eine der Ax- oder Ay-Untereinheiten, so daß die vollständige Auftrennung der α-Klasse- Dimere, die TER106 lieferte, nicht erforderlich war. Die fünf Human-Lebern wurden hinsichtlich des Gehalts an GST-Dimeren mittels Affinitätschromatographie und hinsichtlich des Monomer-Gehalts mittels Umkehrphasen-Chromatographie analysiert (Tabelle 9). TABELLE 9 Affinitäts- und Umkehrphasen-Analyse von Human-Leber Affinititäts-Auftrennung¹
¹ Affinitätschromatographie-Puffer; A, 10 mM Natriumphosphat (pH 6,0); B, 200 mM Natriumchlorid in A; C, 20 mM S-Butylglutathion in B. Bedingungen: 0-5 Minuten, A, 0,1 ml/Min.; 5-21 Minuten, B, 1,5 ml/Min.; 21-34 Minuten, A, 1 ml/Min.; 34-35 Minuten, A, 0,1 ml/Min.; 35-155, 0-42% C, 0,1 ml/Min.
² Symbole: +, mehr als 10% der gesamten Peak-Fläche; Nebenbestandteil, weniger als 10% der gesamten Peak-Fläche; -, nicht nachgewiesen.
Die Menge an Zytosol, welche in die Affinitätssäule eingespritzt wurde, entsprach etwa 20 mg Leber. In früheren Berichten waren die überwiegenden Formen von GST in Human-Leber A1-Monomere und A1-1-Dimere. Dies war für die hier untersuchten fünf Lebern der Fall. Wenn Ax- oder Ay-Untereinheiten in nennenswerten Mengen nachgewiesen wurden, wurden auch die entsprechenden Heterodimere gefunden. Für L007 N, welche nennenswerte Mengen an Monomer Ay aufwies, wurden sowohl das Homodimer Ay-y als auch das Heterodimer A1-y sowie A1-1 nachgewiesen. Die Human-Leber L005N, die Ax, aber nur eine kleinere Menge an Ay aufwies, zeigte A1-x und A1-1, jedoch wurde kein Ax-x wie im Fall von L006N nachgewiesen. Kleinere Mengen an P1 wurden mittels Umkehrphasen-Analyse in allen fünf Proben nachgewiesen und in vier der fünf Lebern auch mittels Affinitätsanalyse nachgewiesen. Frühere Untersuchungen zeigen ebenfalls, daß π eine Nebenkomponente in Human-Leber ist. Kleine Mengen der u-Klasse-GSTn wurden mit dem Umkehrphasen-Verfahren nachgewiesen. Aufgrund der ungünstigen Peak-Form bei der Affinitätschromatographie ist der Nachweis der u-Klasse schwierig, wenn sie nur einen kleinen Teil des gesamten GST-Gehalts ausmacht.
Dieses neue Affinitätschromatographie-System unter Verwendung von HPLC- Technologie besitzt erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Weichgel- Affinitätssystemen für die Analyse des GST-Dimer-Gehalts von Geweben. Die Analysezeit wird um einen Faktor von 10 herabgesetzt. Darüber hinaus ist die Empfindlichkeit bei diesem Affinitätssystem größer, da die Peak-Volumina für HPLC- Affinität nur etwa 0,5 ml betragen, im Vergleich zu 50-100 ml, wenn herkömmliche Weichgele verwendet werden. Diese Technik besitzt auch den Vorteil, sowohl die Aufreinigung der Probe als auch die Analyse in einem einzigen Schritt zu kombinieren. Andere Techniken wie Umkehrphasen-HPLC, chromatographische Fokussierung oder Elektrophorese erfordern einen separaten Affinitätsschritt, um die GSTn vor der letzten Analyse diskontinuierlich zu reinigen.
Affinitätschromatographie unter Verwendung von Gradienten eines Gegenliganden in dem Elutionsmittel ist eine wirkungsvolle Auftrennungstechnik. Eine Variation des biospezifischen Liganden in dem Elutionsmittet führt zur chromatographischen Auftrennungen, die unterschiedliche Selektivitäten aufweisen. Die beobachteten unterschiedlichen Selektivitäten beruhen auf dem einmaligen Satz von Bindungskonstanten, welche bei Liganden in ihren Assoziationen mit verschiedenen Isoenzymen vorliegen. Dies war der Fall für die GSTn, wenn Elutionsprofile unter Verwendung von TER106 oder S-Butylglutathion als Gegenligand verglichen wurden. Viele weitere Verbindungen der vorliegenden Erfindung sowie andere Liganden wechselwirken mit GSTn und irgendwelche davon können eine einmalige Auftrennung ergeben, welche die Entwicklung einer speziell zugeschnittenen Auftrennung erlaubt. Insbesondere können die hier mitgeteilten analytischen Verfahren unschwer in größerem Maßstab zur präparativen Isolierung von speziellen GSTn von Interesse durchgeführt werden.

BEISPIEL 11

Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Wirkungsverstärkung von zytotoxischen Agentien in menschlichen Zellen

Dieses Beispiel beschreibt die Wirkungsverstärkung in menschlichen Tumorzellen eines zytotoxischen Agens bzw. Reagens, welches gegenwärtig in der Krebs- Chemotherapie eingesetzt wird, durch GST-Inhibitoren, einschließlich Verbindungen der vorliegenden Erfindung, sowie erhöhte intrazelluläre Wirksamkeit veresterter Formen dieser Verbindungen.
HT-29 (Human-Dickdarm-Adenokarzinom)-Zellen wurden von Dr. Roberto Ceriani (Cancer Research Fund of Contra Costa County, Walnut Creek, CA) erhalten und in der logarithmischen Phase des Wachstums eingesetzt, soweit nicht anders angegeben. Chlorambucil (CMB) wurde von Sigma (St. Louis, M0) erhalten und in 100%igem Ethanol gelöst. Alle GST-Inhibitoren wurden in Ethanol, DMS oder Wasser unmittelbar vor der Verwendung gelöst. Dieselbe Menge an Lösungsmittel, die Kulturmedium zugesetzt wurde, diente als Vehikel-Kontrolle.
In einem modifizierten klonogenen Assay auf Zytotoxizität wurden Zellen mit 2 · 10&sup5; Zellen/ml in serumfreiem Medium in Anwesenheit von Vehikel oder Inhibitor suspendiert. Die Inhibitoren wurden in Konzentrationen eingesetzt, welche zur einem ≥90% Überleben im Vergleich zu Vehikel-behandelten Zellen führten. Die Zellen wurden 2 Stunden lang inkubiert, dann wurden variierende Dosen an CMB zugegeben. Am Ende einer zweiten zweistündigen Inkubation wurden die Zellen auf 7,5-10 · 10³/ml in serumhaltigem Medium verdünnt und vierfach mit 200 ul/Mulde in Mikrotest III-Mikrotiterplatten ausplattiert.
Die Platten wurden 6 Tage lang inkubiert und nach einem modifizierten Methylenblau-Verfahren einem Assay unterworfen. In Kürze, die Zellen wurden mit 1,25% Glutaraldehyd in PBS fixiert, dann mit 0,05% Methylenblau in destilltiertem Wasser angefärbt. Die Platten wurden mehrere Male in destilliertem Wasser gewaschen, um nicht zurückgehaltenen Farbstoff zu entfernen, und zurückgehaltener Farbstoff wurde erneut in 0,03 N HCl solubilisiert. Die Platten wurden bei 650 nm in einem Molecular Devices Vmax-Plattenlesegerät (Molecular Devices, Redwood City, CA) abgelesen. IC&sub5;&sub0;-Werte (Inhibitorkonzentration, die eine 50%ige Verringerung der Zell-Lebensfähigkeit verursacht) wurden für das Arzneimittel in Anwesenheit oder Abwesenheit von Inhibitor aus Dosis-Antwort- Kurven bestimmt. Ein Dosis-Modifikationsfaktor (DMF), ein Maß der Potenzierung der Zytotoxizität, wurde für jeden Inhibitor berechnet durch Teilen des IC&sub5;&sub0;-Werts von CMB ohne Inhibitorbehandlung durch den IC&sub5;&sub0;-Wert für CBM mit Inhibitorbehandlung.
Die Ergebnisse von Potenzierungstests mit mehreren GST-Inhibitoren in HT29-Zellkulturen sind in Tabelle 10 zusammengefaßt. TABELLE 10 Potenzierung der Chlorambucil-Zytotoxizität in Human-Zellen durch GST-Inhibitoren und deren Ester
a Nummer der Verbindung in Tabelle 5, Beispiel 9, oben.
b Die Testdosis wurde aus der Toxizitätskurve bestimmt und Analoga wurden bei der Dosis eingesetzt, bei der 90%iges Überleben in Anwesenheit des Analogons allein vorlag.
c Dosis-Modifikationsfaktor. Die Werte sind Mittelwerte ± S.A. von 2-3 Experimenten.
Die Ergebnisse in den Tabellen 10-12 zeigen, daß mehrere GSH-Analoga, die befunden worden waren, Inhibitoren von GSH zu sein, wie in Beispiel 9, Tabelle 5 gezeigt, auch die Abtötung von Human-Tumorzellen in Kultur durch CMB, welches ein Substrat für verschiedene GSTn ist, verstärken. Darüber hinaus wird, wie in Tabelle 10 gezeigt, diese Verstärkung stark erhöht durch Veresterung, welche die Aufnahme der GST-Inhibitoren erhöhen soll. So erhöhte γE-C(Bz)-φG (Verbindung 4, Tabelle 5) bei 100 uM die Zellabtötung durch CMB nicht, es verringerte die Konzentration an CMB, die für eine 50%ige Zellabtötung erforderlich war, um einen DMF von 1,08. Im Gegensatz dazu erhöhte der Diethylester der Verbindung 4 bei nur 12,5 uM die CMB-Zytotoxizität um einen Faktor von 1,65.
Eine bevorzugte Expression von P1-1 wurde bei einem Spektrum von Human- Tumoren mitgeteilt. In der vorliegenden Studie korrelierte die Wirksamkeit der CMB- Potenzierung der verschiedenen getesteten GST-Inhibitoren direkt mit deren Wirksamkeiten als Inhibitoren der Human-GST-Isoenzyms P1-1 der π-Klasse, wie in Tabelle 11 gezeigt. TABELLE 11 Rangfolge-Korrelation von Chlorambucil-Dosis-Modifikationsfaktoren von GST-Inhibitoren mit dem K-Wert für die Inhibierung von Human-GST-P1-1
a Nummer der Verbindung in Tabelle 5, Beispiel 9, oben.
b Dosis-Modifikationsfaktor von Diethylester. Die Werte sind Mittelwerte ± S.A. von 2-3 Experimenten.
Die Wirkung der Veresterung oder Amidierung der Verbindungen der Formel (1) hinsichtlich deren Wirkungserhöhung von Chlorambucil und HT-29-Zellen wurde ebenfalls bestimmt. Der Dosis-Modifikationsfaktor wurde für den Diethylester, das Diamid und den/das Ester/Amid von γE-C(Bz)-φG bei relevanten Konzentrationen bestimmt. Der Diester zeigte eine Modifikation der Chlorambucil-Toxizität bei 12,5 uM von 1,65 ± 0,04; das Diamid zeigte eine Modifikation von 1,0 in einem Einzelexperiment bei 200 uM; das Ester/Amid-Hybrid zeigte eine Modifikation von 1,45 ± 0,16 bei einer Konzentration von 50 uM. Die Ergebnisse für den Diethylester und das Ester/Amid-Hybrid sind als Mittelwert ± S.A. von drei Experimenten angegeben.
Octyl-G und Benzyl-PG wurden in einem klonogenen Standard-Assay unter Verwendung von drei Zellinien getestet: HT4-1, ein Subklon von HT-29; SKOV-3, ein Hühner-Karzinom, und VLB, eine Vinblastin-resistente Variante von SKOV-3. Drei chemotherapeutische Arzneimittel, Chlorambucil, Adriamycin und Mitomycin C, wurden als toxische Agentien eingesetzt. Bei diesen Assays wurden die Zellen mit 300 Zellen/Mulde in 2 ml Medium in 6-Mulden-Platten in Gegenwart der Verbindungen der Erfindung als die Diethylester ausgesät. Die Verbindungen wurden in Konzentrationen eingesetzt, welche zu einem mehr als 85%igen Überleben im Vergleich zu Kontrollen führten. Nach Inkubation für 1-2 Stunden, um den Zellen die Anhaftung zu ermöglichen, wurden variierende Dosen der chemotherapeutischen Reagentien zugegeben. Mulden wurden in mindestens dreifacher Ausführung für jeden Testzustand ausplattiert und die Platten zwei Wochen lang inkubiert. Die Kolonien wurden in 95%igem Ethanol fixiert und mit Kristallviolett zur Kolonienzählung angefärbt. IC&sub5;&sub0;-Werte wurden für das chemotherapeutische Reagens in Gegenwart oder Abwesenheit der Verbindung der Erfindung bestimmt und Dosis- Modifikationsfaktoren wurden berechnet durch Teilung des IC&sub5;&sub0;-Werts eines Arzneimittels ohne die erfindungsgemäße Verbindung durch den IC&sub5;&sub0;-Wert des Arzneimittels mit der erfindungsgemäßen Verbindung. Die bei jedem Protokoll erhaltenen Modifikationsfaktoren sind in Tabelle 12 gezeigt. TABELLE 12 Vermögen ausgewählter GSH-Analoga zur Potenzierung von Arzneimittel-Toxizität wie in einem klonogenen Assay demonstriert
a Dosis-Modifikationsfaktor
b Keine Daten aufgrund von Toxizität des Analogons
c Testdosis war von der links angegebenen verschieden
D Nicht bestimmt
Wie in der Tabelle gezeigt, wurde eine signifikante Modifikation erhalten, wenn Chlorambucil in Gegenwart von 25 uM des Diethylesters von Benzyl-PG als Arzneimittel gegen HT4-1-Zellen eingesetzt wurde. Eine signifikante Modifikation wurde auch in VLB-Zellen erzielt bei Behandlung mit Adriamycin in Gegenwart von 25 uM derselben Verbindung.
Fig. 2a illustriert die Ergebnisse für variierende Dosen von Chlorambucil und die modifizierende Wirkung von 25 uM des Diethylesters von Benzyl-PG. Die offenen Kästchen ( ) repräsentieren Chlorambucil allein, die geschlossenen Kreise ( ) Chlorambucil in Gegenwart der erfindungsgemäßen Verbindung. We in Fig. 2a ersichtlich, ist die Überlebensrate deutlich verringert, wenn die erfindungsgemäße Verbindung zugesetzt wird. Fig. 2b bestätigt, daß der Diethylester erforderlich ist, um in die Zellen einzudringen. HT4-1-Zellen wurden auf das Überleben in Anwesen heit von entweder Benzyl-PG (ausgefüllte Kästchen, ) oder dessen Diethylester (ausgefüllte Kreise, ) getestet. Nicht verestertes Diethyl-G besitzt praktisch keine Wirkung auf diese Zellen, während der Diethylester eindeutig toxisch ist.

BEISPIEL 12

Metabolische Wirkungen der Verbindungen

Die metabolischen Wirkungen der Verbindungen auf HT-29-Zellen, bezogen auf die Toxizität, wurden mit Hilfe eines Cytosensor-Mikrophysiometers, hergestellt von Molecular Devices, Inc., Menlo Park, CA und in McConnell, H. M., et al. Science (1992) 257: 1906-1912 und von Wada, H. G., et al. AATEX (1992) 1: 154-164 beschrieben, getestet. Veränderungen im pH-Wert des Kulturmediums werden als Funktion des zellulären Metabolismus gemessen. Ansäuerungsraten des kleinen Flüssigkeitsvolumens, welches über die Zellen fließt, korrelieren mit der Anzahl lebender Zellen in der Reaktionskammer; eine Verringerung der Ansäuerungsrate reflektiert verringerte Zahlen überlebender Zellen.
In diesem Beispiel wurden HT-29-Zellen mit 4 · 10&sup5;-Zellen/Kammer in einem Medium ausplattiert, das 10% fötales Kalbsserum enthielt. Nach 16-18 Stunden wurde das Serum-Niveau auf 1% reduziert und die Zelten weitere 18 Stunden lang aufrechterhalten. Die Zellen wurden dann entweder Ethacrinsäure (50 uM), dem Diethylester von Benzyl-PG (20 uM) oder einem Vehikel (0,1% Ethanol) 4 Stunden lang ausgesetzt. Das Medium wurde dann durch serumfreies Medium mit niedriger Pufferkapazität ersetzt und eine Mikrophysiometer-Analyse begonnen. Die Hälfte der Kammern wurden 100 uM Chlorambucil und die andere Hälfte Vehikeln (0,1% Ethanol) ausgesetzt. Die Ansäuerungsraten wurden 16 Stunden lang überwacht und die Daten als Prozentsatz der Ausgangswerte der Ansäuerungsraten (100%) ausgedrückt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Weder der Diethylester von Phenyl- PG noch Ethacrinsäure allein besaßen irgendeine nennenswerte Wirkung auf die Ansäuerungsraten; jedoch potenzierten die Ethacrinsäure-Vorbehandlung und die Vorbehandlung mit dem Benzyl-PG-Diethylester beide die Wirkung von Chlorambucil. In der Figur bedeuten die offenen Symbole keine Zugabe von Chlorambucil;
die ausgefüllten Symbole bedeuten die Zugabe von Chlorambucil; Kästchen bedeuten die Vorbehandlung mit Vehikel, Dreiecke die Vorbehandlung mit Ethacrinsäure und Kreise die Vorbehandlung mit Benzyl-PG-Diethylester.

BEISPIEL 13

GST-Analyse verschiedener Zellinien

GST-Profile der Zellinien, welche in den vorangegangenen Analysen eingesetzt wurden, wurden wie folgt erhalten: Zellen wurden geerntet, zweimal in serumfreiem Medium gewaschen, einmal in Calcium-Magnesium-freiem PBS gewaschen und dann die Pellets schockgefroren und bei -80ºC gelagert. Die gefrorenen Zellen wurden wie von Castro, V. M., et al., Biochem. J. (1993) 292: 371- 377, beschrieben in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0; 0,16 M KCl, 100 uM Pefabloc SC (Central Chem., Inc., Stamford, CT), 1 uM Leupeptin (Sigma), 2 mM EDTA und 2 mM Dithiothreitol homogenisiert. Die GSTn wurden aus zytosolischen Fraktionen mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung einer HPLC-Säule isoliert. Umkehrphasen-Analyse der GSTn auf einer J. T. Baker 7105-00 Wide-Pore Octyl- HPLC-Säule (25 cm · 4,6 mm, VWR Scientific), Proteinbestimmungen und Bestimmung der CDNB-konjugierenden Aktivität wurden durchgeführt wie von Castro, V. M., et al., Biochem. J. (1993) 292: 371-377, beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 dargestellt. TABELLE 13 Umkehmhasen-HPLC-Analyse von zytosolischen GSTn, exprimiert in Tumorzellinien, die Arzneimittelresistenz gegenüber Alkylierungsmitteln aufweisen
a Werte sind ausgedrückt als Peakfläche = mV-sec/mg zytosolisches Protein.
b Werte sind ausgedrückt als mOD/Min./mg zytosolisches Protein.
c HT-29-Subklon, der Wildtyp-Sensitivität gegenüber Ethacrinsäure behält.
d Vinblastin-resistenter Subklon von SKOV-3.
Die Ergebnisse zeigen, daß alle Zellinien P1-1 als vorherrschendes GST- Isoenzym exprimieren. Die SKOV-3- und VLB-Zellen exprimieren auch mäßige Niveaus an A2-2, dieses Isoenzym wurde jedoch nur in Spurenmengen in HT-29- Zellen gefunden. Es war in HT4-1-Zellen nicht nachweisbar. Sehr geringe Niveaus an MT2-2 wurden in HT-29 und SKOV-3 nachgewiesen. 33-kD- und 27-kD-Proteine, identifiziert als Enoyl-Co-A-Isomerase bzw. GST-M3, werden ebenfalls in diesen Zellen gefunden.

BEISPIEL 14

Stimulierung von Knochenmark-Granulozyten-Makrophagen (GM)-Vorläuferzllen

Die Verbindungen der Erfindung stimulieren, im veresterten Zustand, um so in der Lage zu sein, in Zellen einzudringen, auch die Produktion von GM- Vorläuferzellen in Knochenmark bei Verabreichung an Säuger-Patienten. In einem illustrativen Assay wurden drei B6D2F&sub1;-Mäuse mit variierenden Dosen an Benzyl-PG intraperitoneal behandelt. Knochenmark aus den Oberschenkelknochen wurden 24 Stunden später entnommen und hinsichtlich GM-CFU nach dem Verfahren von East, C. J., ef al., Cancer Chemother. Pharmacol. (1992) 31: 123-126, untersucht. Eine Erhöhung der Kolonienzahl in dosisabhängiger Weise bis zu einer Dosierung von 90 mg/kg Benzyl-PG wurde erhalten. Diese Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Bei 90 mg/kg wurden etwa 275 Kolonien/10&sup4; kernhaltiger Zellen von mehr als 50 Zellen erhalten, im Vergleich zu etwa 140 Kolonien/10&sup4; kernhaltiger Zellen für Kontrollen.

BEISPIEL 15

Potenzierung von Melphalan-Toxizität in vivo

Männlichen Scid Mäusen wurden subkutan HT4-1-Tumore aus Donor-Mäusen implantiert. Als die Tumore etwa 100 mm³ erreichten, wurden die Mäuse willkürlich in sechs Behandlungsgruppen eingeteilt und 7 Tage lang wie folgt behandelt:
1. 5 mg/kg Melphalan;
2. 10 mg/kg Ethacrinsäure;
3. 60 mg/kg Diethylester von Benzyl-PG;
4. 5 mg/kg Melphalan + 10 mg/kg Ethacrinsäure;
5. 5 mg/kg Melphalan + 60 mg/kg Diethylester von Benzyl-PG;
6. nur Vehikel.
Die Mäuse wurden hinsichtlich Gewichtsänderungen überwacht und Tumorvolumen durch Messung mit Eichzirkeln bestimmt. Das Tumorwachstum wurde überwacht, bis die durchschnittliche Tumorgröße 1500 mm³ für alle Gruppen mit Ausnahme von Melphalan mit Ethacrinsäure erreichte. Diese Gruppe erreichte dieses Volumen sogar nach 72 Tagen nicht.
Die Ergebnisse wurden als Tumorvolumen in dem Experiment als Prozentsatz des Kontrolltumorvolumens (d. h., in der Gruppe, die nur Vehikel allein erhielt) berechnet. In Gruppe 1, welcher nur Melphalan verabreicht wurde, hatten die Tumore etwa 75% des Volumens von Kontrollen. In Gruppe 5, in welcher der Diethylester vom Benzyl-PG zusammen mit dem Melphalan verabreicht wurde, betrug das mittlere Tumorvolumen etwa 55% der Kontrolle. Für die Gruppe 4, welcher eine Kombination von Melphalan und Ethacrinsäure verabreicht wurde, betrugen die Volumen etwa 35% der Kontrolle. Somit verstärken sowohl Ethacrinsäure als auch der Diethylester von Benzyl-PG die Wirkung von Melphalan. (Die Volumenmessungen wurden zu dem Zeitpunkt vorgenommen, als die Kontrolltumore 1500 mm³ erreichten.)

Claims

1. Verbindung der Formel:

und die Ester, Amide und gemischten Ester/Amide vom Alkyl-Typ (1-10C), Alkenyl-Typ (1-10C) und Arylalkyl-Typ (7-12C) davon;

worin Z aus der Gruppe, bestehend aus S, O und C, ausgewählt ist;

n 1, 2 oder 3 ist;

worin, wenn Z O oder S ist und n 1 ist, X eine mono- oder disubstituierte oder unsubstituierte Hydrocarbyl (1-20C)-Gruppierung darstellt, die gegebenenfalls 1 oder 2 nicht benachbarte Heteroatome (O, S oder N) enthält, und worin die Substitution ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Halogen, -NO, -NO&sub2;, -NR&sub2;, OR und SR, worin jedes R unabhängig H oder Niederalkyl (14C) ist;

worin, wenn Z S ist und n 2 ist, ein X wie oben definiert ist und das andere X Niederalkyl (14C) ist; und

worin, wenn Z C ist und n 3 ist, ein X wie oben definiert ist und die anderen beiden X unabhängig H oder Niederalkyl (14C) sind;

Y-CO aus der Gruppe, bestehend aus γ-Glu, β-Asp, Glu, Asp, γ-Glu- Gly, β-Asp-Gly, Glu-Gly und Asp-Gly, ausgewählt ist, und

AAc Phenylglycin, Phenylalanin oder ein substituiertes Phenylalanin, über eine Peptidbindung mit dem Rest der Verbindung der Formel (1) verknüpft, darstellt.

2. Verbindung nach Anspruch 1, welche ein Ester oder Amid oder ein gemischter/s Ester/Amid ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1, worin mindestens ein X substituiertes oder unsubstituiertes Methyl, Propyl, Hexyl, Octyl, Benzyl, Naphthyl oder Trityl ist.

4. Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1-3, worin AAc Phenylglycin ist.

5. Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1-4, worin Y-CO γ-Glu ist.

6. Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1-5, worin Z S ist.

7. Verbindung nach Anspruch 1, worin AAc Phenylglycin ist, Y-CO γ-Glu ist, Z S ist, X Benzyl ist und n 1 ist.

8. Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1-7, welche ein Ester ist.

9. Ester nach Anspruch 8, welcher ein Ethylester oder ein Benzylester ist.

10. Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1-7, welche der Monoester oder das Monoamid ist.

11. Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1-7, welche der Diester oder das Diamid oder der/das gemischte Ester/Amid ist.

12. Verfahren zur Reinigung oder Charakterisierung eines Human-Glutathion-S- Transferase (GST)-Enzyms aus einer Probe, welches Verfahren umfaßt das Kontaktieren der Probe mit einem festen Träger, an den die Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1-11 gekoppelt ist,

unter Bedingungen, unter denen die Human-GST an den Träger adsorbiert wird,

Abtrennen des festen Trägers von der Probe, und

Eluieren der Human-GST von dem festen Träger durch Bereitstellung einer Elutionslösung.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Elutionslösung eine Verbindung der Formel nach irgendeinem der Ansprüche 1-11 enthält, welche sich von derjenigen unterscheidet, die an den festen Träger gekoppelt ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, worin die Probe Zellen oder Gewebe umfaßt.

15. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines GST- Enzyms in einer Probe, welches Verfahren umfaßt die Behandlung der Probe mit der Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1-11,

unter Bedingungen, unter denen ein Komplex zwischen dem GST- Enzym und der Verbindung gebildet wird, und

Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit des Komplexes.

16. Gruppe, umfassend mindestens fünf verschiedene Tripeptid-Glutathion- Analoga, die Verbindungen nach irgendeinem der Ansprüche 1-11 sind, wobei diese Verbindungen unterschiedliche Eigenschaften aufweisen.

17. Gruppe nach Anspruch 16, worin diese unterschiedlichen Eigenschaften einen Unterschied in einer Eigenschaft umfassen, die aus der Gruppe, bestehend aus Hydrophobizität von X, Hammett's Konstanten von X und Hydrophobizität von AAc, ausgewählt ist.

18. Verfahren zur Bestimmung des GST-Komplements einer Zelle oder Gewebeprobe, von der angenommen wird, daß sie mindestens ein GST- Enzym enthält, welches Verfahren umfaßt:

Bestimmung einer Elutionscharakteristik bezüglich eines jedes Trägers in einer Gruppe von chromatographischen Trägern, wobei die Gruppe Träger umfaßt, die mit den Verbindungen der Gruppe nach Anspruch 16 derivatisiert sind, um ein Merkmalübersichts (MÜ)-Profil zu erhalten; und

Vergleich des resultierenden MÜ-Profils, das von dem Gewebe oder den Zellen erhalten wurde, mit dem Referenzsatz von MÜ-Profilen, die von Geweben oder Zellen bekannter GST-Komplemente erhalten wurden.

19. Verwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Wirkung eines chemotherapeutischen Reagens in einer Tumorzelle.

20. Verwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments, um einen zytotoxischen Effekt auf Zielzellen im Vergleich zu Nicht-Zielzellen auszuüben, wobei die Zielzellen mindestens ein GST-Isoenzym umfassen, dessen Niveau in den Zielzellen im Vergleich zu Nicht-Zielzellen erhöht ist; worin die Verbindung das Isoenzym selektiv inaktiviert.

21. Verwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung der Produktion von Granulozyten-Makrophagen-Vorläuferzellen im Knochenmark eines Patienten.

22. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 19 bis 21, worin die Verbindung ein Diester einer Verbindung ist, die aus der Gruppe, bestehend aus Octyl-G, Naphthyl-G, Hexyl-PG und Benzyl-PG, ausgewählt ist.