PT720620E - Analogos da glutationa e paineis paralogos compreendendo mimicos da glutationa - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "ANÁLOGOS DA GLUTATIONA E PAINÉIS PARÁLOGOS COMPREENDENDO MÍMICOS DA GLUTATIONA"

Campo Técnico O invento relaciona-se com compostos tripeptídicos que são novos análogos da glutationa. O invento diz respeito também a painéis de tripeptídeos que são análogos da glutationa que apresentam diversas propriedades e que são úteis para a caracterização das transferases da glutationa (GSTs) e como inibidores da fase de solução de GST.

Fundamentos da Técnica A glutationa (GSH) na sua forma reduzida, é um tripeptídeo da fórmula: γ-Glu-Cis-Gli. A glutationa reduzida tem um papel central na manutenção da condição redox em células e é também um substrato essencial para a glutationa S-transferase (GST) a qual facilita a destoxificação de substâncias estranhas por um certo número de mecanismos, incluindo catálise do acoplamento de uma porção electrofílica de uma toxina, por exemplo, para a glutationa, tomando a toxina mais susceptivel à clearance (eliminação). Um segundo mecanismo, que também envolve a glutationa como substrato, reside na redução de peróxidos com a oxidação concomitante da glutationa.

Adang, A E.P., et al., Biochem J (1990) 269: 47-54, descreveram análogos tripeptídicos de GSH que interactuam com vários isoenzimas GST em -2- diferentes concentrações. Estes análogos são formas modificadas da GSH em que pelo menos um dos resíduos glicina, cisteína, ou gama-glutamina é substituído por um resíduo aminoácido alternativo.

Foram apresentadas formas modificadas adicionais, por exemplo, por Principato, G. B., et al., Enzvme (1989) 41: 175-180, que estudaram o efeito de um análogo de GSH tripeptídico no enzima glioxalase II do fígado do rato. O tripeptídeo usado por este grupo foi da fórmula γ-Glu-p-clorofenilcarbonilmetil-Cis-Ser. Morris, D., em Biochem J (1960) 76: 349-353, descreveu a síntese de γ-Glu-benzil-Cis-Val. Um grande número de análogos tripeptídicos de GSH contendo uma substituição para apenas um dos três aminoácidos de GSH foram referidos e encontram-se disponíveis comercialmente. O invento descrito aqui mais abaixo diz respeito a novos análogos tripeptídicos da glutationa que são úteis como ligandos de afinidade sobre suportes de cromatografia e como membros de painéis que são usados para caracterizar os vários isoenzimas da glutationa-S-transferase. As glutationas-S-transferases (GSTs) estão presentes sob a forma de um certo número de isoenzimas que diferem nas capacidades específicas de ligação, no substrato e nas especificidades inibidoras e na distribuição do tecido. Complementos particulares de isoenzimas de GST, com as suas diferenças concomitantes nas propriedades, nestas condições são caracteristicos de tecidos ou tipos celulares específicos, tais como tecidos tumorais. Como a GST é de importância central para o metabolismo global dos tecidos ou células visto relacionar-se com a sua defesa contra substâncias tóxicas, o caracter do complemento da GST para a célula ou tecido é importante para a elaboração de estratégias quer para a destruição da célula ou do tecido, como seria desejável para células tumorais, ou para a melhoria da sua função metabólica, tal como aconteceria para o tecido normal. -3-

Os vários isoenzimas de GST são proteínas diméricas formadas por combinações binárias de monómeros codificados por, pelo menos, quinze genes conhecidos em quatro famílias de genes dando origem à possibilidade teórica de várias dúzias de diferentes dímeros, permitindo mesmo uma dimerização preferencial de monómeros a partir da mesma família de genes. Para além da variabilidade que resulta destas possibilidades de combinação, as subunidades de isoenzima de GST são polimórficas na população humana e foram consideradas como estando sujeitas a uma variação adicional devido a eventos de conversão genética entre os membros da família repetidos em fila. Modificações pós-translacionais aumentam ainda mais esta variabilidade. Como cada célula ou tecido pode conter um ou vários destes enzimas teoricamente possíveis, a determinação do complemento de GST é da maior importância. O presente invento, ao proporcionar novos análogos da glutationa que são úteis como sorventes e como inibidores da fase de solução, assim como painéis que os incluam, proporciona métodos aperfeiçoados para caracterizar e manipular enzimas individuais de GST ou seus conjuntos.

Apresentação do Invento O invento é dirigido a reagentes úteis para a caracterização dos isoenzimas da glutationa S-transferase, para a determinação dos complementos de GST de células e de tecidos, e para aplicações terapêuticas. Os compostos do invento são formas sistematicamente modificadas de glutationa reduzida e painéis compreendendo esses análogos possuindo diversas propriedades no que se refere aos enzimas alvo. Os compostos do invento são também úteis como ligandos de afinidade cromatográficos, reagentes de ligação, e inibidores de enzimas.

Os ésteres dos tripeptídeos do invento são particularmente úteis no -4- contexto terapêutico e diagnóstico; as amidas são também capazes de derivatização em porções que possam modificar propriedades farmacológicas ou comportamento físico. Assim, num aspecto, o invento é dirigido a compostos da fórmula: Y-CO-NHCHCO-AAc (1) CH2-Z-(X)n; e a seus ésteres, amidas e éster/amidas mistos do tipo alquilo (1-10C), do tipo alquenilo (1-10C), e do tipo arilalquilo (7-12C); em que Z é seleccionado de entre o grupo consistindo em S, O e C; n é 1, 2 ou 3; em que quando ZéOouSenél,Xé uma porção hidrocarbilo (1-10C) mono- ou di-substituído ou não substituído contendo facultativamente 1 ou 2 heteroátomos não adjacentes (O, S ou N), e em que a referida substituição é seleccionada de entre o grupo consistindo em halo, -NO, -N02, -NR2, OR e SR, em que cada R é, de um modo independente, H ou alquilo inferior (1-4C); em que quando Z é S e n é 2, um X é tal como foi acima definido e o outro X é alquilo inferior (1-4C); e em que Z é C e n é 3, um X é tal como foi acima definido e os outros dois X são, de um modo independente, H ou alquilo inferior (1-4C); Y-CO é seleccionado de entre o grupo consistindo em γ-Glu, β-Asp, Glu, Asp, γ-Glu-Gli, /í-Asp-Gli, Glu-Gli, e Asp-Gli, e AAC é fenilglicina, fenilalanina ou fenilalanina substituída acoplada através de uma ligação peptídica à porção restante do composto da Fórmula (1).

Ainda num outro aspecto, o invento é dirigido a um método para purificar ou caracterizar uma glutationa S-transferase (GST) humana que - 5 -

compreende fazer contactar uma amostra que se pensa conter o enzima com um suporte sólido ao qual está acoplado um composto da Fórmula (1), tal como foi acima definido, em condições em que a GST humana é adsorvida para o suporte sólido, separando o suporte da amostra e fazendo a eluição da GST humana a partir do suporte. Numa apresentação preferida deste método, o suporte é apropriado para utilização em sistemas de cromatografia líquida de elevada performance (HPLC).

Em ainda outros aspectos, o invento é dirigido a métodos para a detecção da presença ou ausência de um sistema GST na amostra, e facultativamente para o caracterizar por classe, o que compreende o tratamento da amostra com um composto da Fórmula (1) tal como foi acima definido e a detecção da presença ou ausência de um complexo entre qualquer GST contida na amostra e o composto da Fórmula (1). O invento também inclui painéis compreendendo pelo menos cinco análogos diversos de tripeptídeo glutationa da Fórmula (1) (ou as suas formas ésteres, sais, amidas, éster/amidas mistos ou cicloamido) em que os compostos no painel têm diversas características. Estes painéis podem ser constituídos como painéis de suporte cromatográfico e ser usados para caracterizar um complemento de GST de células. O invento é também dirigido a compostos da Fórmula (1) em que X é um arilo (1-20C) mono- ou bi-cíclico mono- ou di-substituído, de preferência benzilo, em que a substituição é seleccionada de entre o grupo consistindo em halo, -NO, -NO2. NR2, OR, e SR, em que R é H ou alquilo (1-4C). O invento é também dirigido a métodos e protocolos que tiram vantagem da selectividade dos análogos do tripeptídeo glutationa do invento para -6-

os vários isoenzimas de GST. Ao tomar em consideração os níveis de isoenzima de GST em células alvo em comparação com células não alvo, o análogo apropriado da glutationa pode ser seleccionado para que exerça um efeito citotóxico selectivo ou para que potencie de um modo selectivo um agente quimioterapêutico. Além disso, os análogos do invento são capazes de estimular e de potenciar a medula óssea em mamíferos. Verificou-se ainda que para exercer efeitos intracelulares, os compostos do invento são de preferência fornecidos sob a forma de diamidas ou de diésteres ou seus híbridos.

Num outro aspecto, o invento é dirigido à utilização dos compostos no fabrico de medicamentos, a fim de potenciar o efeito de um agente quimioterapêutico numa célula tumoral, método esse que compreende a administração à referida célula tumoral, juntamente com o referido agente quimioterapêutico, de uma quantidade potenciadora de um diéster ou diamida de um composto da Fórmula (1) acima referida ou de uma sua amida, éster ou híbrido amida/éster.

Em ainda outro aspecto, o invento é dirigido à utilização dos compostos no fabrico de medicamentos para exercer um efeito citotóxico sobre células alvo em comparação com células não alvo método esse que compreende a identificação dos isoenzimas de GST cujos níveis estejam elevados nas referidas células alvo em comparação com células não alvo; selecção de um composto da Fórmula (1) cuja inactive selectivamente o referido isoenzima; e administração do referido composto seleccionado ou de uma sua amida, éster ou híbrido amida/ester, às referidas células alvo numa quantidade tóxica para as referidas células alvo em comparação com as referidas células não alvo. -7-

Em ainda um outro aspecto, o invento é dirigido à utilização dos compostos no fabrico de medicamentos para estimular a produção de progenitores de macrófagos granulócitos (GM) na medula óssea de um indivíduo, método esse que compreende a administração ao referido indivíduo de uma quantidade eficaz de um composto da Fórmula (1) ou de uma sua amida, éster ou híbrido amida/éster.

Descrição Resumida dos Desenhos

Figura 1. Análise multivariada de inibidores de GST. A qualidade inibidora é visualizada registando a potência contra cada um dos três isoenzimas de GST humanos recombinantes (A 1-1, Ml a-la, e Pl-1) e projectando os pontos para um plano definido pelos componentes principais de distribuição. Valores alvo para inibidores ideais de cada isoenzima são indicados por círculos marcados com o nome do isoenzima; os critérios para um inibidor ideal são especificidade de 100 vezes e Kj=0,l μΜ. São comparadas três famílias de compostos apresentados no Exemplo 9: uma selecção de parálogos do Quadro 5 (números), uma série de análogos de GSH n-alquilos do Quadro 7 (Cn em negrito), e uma selecção das pequenas moléculas orgânicas do Quadro 7 {itálico). Tendo como finalidade a clareza, certos dados não são registados, nomeadamente, os relavionados com compostos de baixa especificidade, que são reunidos no centro do registo. A Figura 2a demonstra que a forma diéster é útil para a penetração na célula; a Figura 2b é um gráfico que revela o efeito do éster dietílico de Benzil-PG (yE-C(Bz)-c|)G ver mais abaixo) sobre a potenciação de clorambucil. A Figura 3 revela o efeito de ácido etacrínico e de benzil-PG sobre a toxicidade de clorambucil em células 2H-29. A Figura 4 revela a relação dose-resposta da estimulação de progenitores de GM por administração de benzil-PG.

Modos de Realização do Invento O invento é dirigido a compostos que são úteis, de um modo individual, como ligandos cromatográficos e como inibidores de GST, e também como painéis de compostos afins que têm diversas propriedades e que são úteis na determinação de perfis, por exemplo, de enzimas de GST, e na determinação do complemento de GST em amostras desconhecidas. Os compostos do invento são formas modificadas de um modo sistemático de glutationa reduzida e painéis compreendendo esses análogos tendo diversas propriedades no que se refere a enzimas alvo.

Análogos tripeptídicos prévios de GSH, que interactuam com vários isoenzimas de GST em diferentes concentrações, são formas modificadas de GSH em que pelo menos um de entre glicina, cisteína, ou resíduos de y-glutamina é substituído por um resíduo de aminoácido alternativo. Ver, por exemplo, Adang, A.E.O., et al., Biochem J (1990) 269: 47-54, W092/197. Dada a variedade de aminoácidos não padrão que foram substituídos por cada aminoácido no tripeptídeo GSH e as numerosas outras possibilidades, combinada com a variedade de substratos que podem ser ligados ao sulfidrilo de cisteína, será possível contemplar dez milhares de análogos de GSH como inibidores de GST.

Seguindo a estratégia de parálogos previamente descrita (Patentes dos E.U.A. Nos. 4.963.263 e 5.133.866), foi preparada uma amostragem deste conjunto potencial. Assim, uma amostragem representativa da diversidade -9- potencial é conseguida através de escolhas monoméricas dando origem a variações concomitantes através de uma ampla gama para múltiplos parâmetros relevantes para ligação a GSTs a partir de várias espécies de mamíferos, principalmente o rato. Parâmetros que foram realçados incluem hidrofobicidade, tamanho e electronegatividade. Variações em propriedades foram criadas principalmente no término C e nas posições sulfídridrilo.

Quando testados por cromatografia de afinidade vários destes diversos sorventes ligam de um modo selectivo isoenzimas de GST de mamíferos de uma classe ou classes particular(es) de acordo com o esquema de classificação que se segue proposto por Mannervik, B., et al., Proc Natl Acad Sei (1985) 82: 7202-7206: Alpha (por exemplo, α e Al-1 humanos, 1-1 e 2-2 do rato), Mu (μ humano, Ml a-la, 3-3 e 4-4 do rato), Pi (π e Pl-1 humanos, 7-7 do rato) e, uma classe proposta mais recentemente, Teta (5-5 do rato). Quando testados quanto a inibição de actividade enzimática de GST, vários sorventes também actuam como inibidores selectivos ou específicos de classes de isoenzima de GST. Assim, os compostos, painéis e métodos deste invento permitem novas estratégias para a criação de drogas que possam alvejar células com níveis elevados de particulares isoenzimas de GST.

Os compostos do invento também potenciam a toxicidade de agentes quimioterapêuticos, enquanto que, ao mesmo tempo, potenciam aparentemente os efeitos protectores da medula óssea. De um modo específico, foi estabelecido que a administração dos compostos do invento melhoram a produção de progenitores de macrófagos granulócitos (GM). Tendo em vista este efeito, não somente é a toxicidade do agente quimioterapêutico em relação às células tumorais aumentada, mas também as células normais são melhor protegidas vis-à-vis o agente quimioterapêutico. Além disso, os compostos do - 10- invento podem ser úteis no tratamento de várias deficiências relacionadas com a medula óssea tais como a anemia.

Os compostos a partir dos quais reagentes que revelam selectividade em relação a vários isoenzimas de GST são seleccionados constituem um conjunto de análogos de glutationa tripeptídica. Estes compostos, tal como são apresentados aqui mais abaixo, proporcionam uma gama de selectividade para os vários isoenzimas. Isto toma membros desta classe úteis para separações cromatográficas dos isoenzimas, reagentes de pesquisa selectiva na manipulação de GSTs, e ingredientes activos selectivos em processos para alvejar células particulares quer no que se refere a um efeito citotóxico directo quer potenciando outros agentes quimioterapêuticos.

Os Compostos do Invento

Os novos compostos do invento incluem a porção da Fórmula (1), em que um X é uma porção hidrocarbilo (1-20C) mono- ou di-substituído ou não substituído contendo facultativamente um ou dois heteroátomos não adjacentes (O, S ou N), e o outro não está presente ou é alquilo inferior (1-4C). mono- ou di-substituído ou não substituído. Em apresentações preferidas n é 1 e X é hidrocarbilo não substituído. Apresentações preferidas para X incluem metilo, propilo,, hexilo, octilo, benzilo, naftilo e tritilo.

Tal como é aqui usado o termo "hidrocarbilo" refere-se a um resíduo hidrocarbil alifático ou aromático, saturado ou insaturado, de cadeia linear ou ramificada ou cíclico contendo 1-20C. Para além do 1-20C, quando estruturalmente realista, o hidrocarbilo pode também conter um ou mais heteroátomos não adjacentes que são O, S ou N. Assim, o grupo hidrocarbilo assim modificado pode ser um éter, um diéter, um tioéter ou um ditioéter, ou uma - 11 - amina ou diamina secundária ou terciária. Representativos desses substituintes incluem metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, butilo terciário, hexilo, octilo, nonilo, 2,3-dimetiloctilo, dodecilo, 9,9-dimetilundecilo, alilo, 2-butenilo, isobutenilo, ciclo-hexilo, ciclopentilo, ciclo-heptilo, fenilo, benzilo, 4-metilbenzilo, trifenilmetilo, metoxietilo, etiltioetilo, dietilaminopropilo, etc. Também incluídas em grupos hidrocarbilo apropriados para X são porções de arilo bicíclico (1-20C) incluindo naftilo e afins heterocíclicos, etc.

Além disso, o hidrocarbilo ou hidrocarbilo contendo um ou dois heteroátomos podem, de um modo facultativo, ser substituídos por um ou dois substituintes. Estes substituintes podem ser halo, isto é, fluor, cloro, bromo ou iodo, ou hidroxi ou sulfidrilo, e/ou alquiloxi ou alquiltio, tais como metiltio, butiltio, propoxi ou etoxi, e/ou -NO, -N02, ou -NH2, -NH(alquilo) ou -N(alquil)(alquilo).

De acordo com os papeis da valência, quando Z é O, n deverá ser 1; quando Z é S, n poderá ser 1 (ou 2 quando S tem uma carga positiva); e quando Z é C, n deverá ser 3. Apenas um X é permitido na complexidade acima indicada. Quando n é 2, o segundo X será alquilo inferior; quando n é 3, o segundo e terceiro X serão cada um deles, de um modo independente, H ou alquilo inferior (1-4C). AAc pode ser fenilglicina (PG ou φϋ), fenilalanina ou fenilalanina substituída. AAC está ligado à porção restante do composto da Fórmula (1) através de uma ligação peptídica.

Nos compostos do invento, a substituição de Gli por fenilglicina, aumentando a hidrofobicidade e a massa deste sítio, origina elevada especificidade para isoenzimas da classe π (por exemplo, 7-7 do rato). - 12-

Para compostos do invento em que X é benzilo substituído, quer sob a forma do ácido livre quer sob a forma de sal da Fórmula (1) quer sob as formas ésteres, amidas ou cicloamido, a especificidade para vários subtipos de GSTs humanas pode ser controlada variando o substituinte para na porção benzilo. Apresentações de X que contêm substituintes para hidrofóbicos tais como t-butilo ou metilo ou benzilo, ligam-se de preferência a GSTs humanas da classe μ (Ml), tal como GST-Mla-la. Substituintes de retirada de electrão na posição para, tal como nitro ou cloro ligam-se de preferência a enzimas π (Pl-l).Registos de valores sigma/meta de Hammet contra a fracção log de isoenzima ligado revelam uma correlação linear mas não aparece uma correlação nítida quando são usados valores sigma/para. Parece ser necessária uma certa massa estérica para ligar GSTs em geral; substituintes benzilo que são não substituídos ou que contêm apenas substituições fluoreto não se ligam de um modo apreciável.

Para compostos do invento em que X é uma porção hidrocarbilo (1-20C) não substituída, quer sob a forma de ácido livre ou de sal da Fórmula (1) ou como formas ésteres, amidas ou cicloamido, a especificidade para vários subtipos de GSTs humanos pode ser controlada ao variar a hidrofobicidade do substituinte no átomo de enxofre da porção Cis, por exemplo, o comprimento de aductos n-alquilo. De um modo geral, a intensidade da ligação para GSTs aumenta com o comprimento de cadeia do grupo alquilo, mas existe uma modificação na selectiv idade do isoenzima com um maior comprimento da cadeia. Apresentações de X que contêm cadeias S-alquilo de três ou quatro átomos inibem, de um modo preferencial, GSTs humanos da classe μ, particularmente GST-Mla-la. Na gama de grupos alquilo contendo cinco a oito carbonos, GSTs humanos das classes α e μ são inibidos mais ou menos no mesmo grau e são inibidos de um modo selectivo em comparação com o - 13 - isoenzima humano da classe π. Finalmente, para derivados S-nonilo e S-decilo, GSTs humanos das três classes são inibidos mais ou menos no mesmo grau.

Os compostos do invento podem incluir os ésteres alquilo, alquenilo ou arilalquilo ou amidas do tipo alquilo, do tipo alquenilo ou do tipo arilalquilo, ou podem apresentar-se sob formas amidocíclicas. Ésteres do tipo alquilo dos carboxilos livres são ésteres dos álcoois alquilo cíclicos (1-10C) de cadeia linear ou ramificada, tais como metanol, etanol, isopropanol, t-butanol, n-hexanol, etc. A cadeia de carbono do álcool do tipo alquilo pode ser interrompida por um ou dois heteroátomos não adjacentes, isto é, N, O ou S. Por exemplo, álcoois do tipo alquilo incluem Ν,Ν-dimetiletanolamina e 2-(l-hidroxi-2-etil)-4,4,6-trimetiltetra-hidro-l,3-oxazina. Amidas (1-10C) do tipo alquilo apropriadas são as de aminas alquilo primárias de cadeia linera ou ramificada ou cíclicas, tais como metilamina, etilamina, n-propilamina, isopentilamina, e iso-hexilamina. Estas cadeias de carbono podem ser interrompidas por um ou dois heteroátomos não adjacentes, isto é, N, O ou S. Ésteres e amidas do tipo alquenilo são preparados a partir das aminas correspondentes que contenham pelo menos uma r dupla ligação. Esteres do tipo arilalquilo podem conter 7-12C e incluem, derivados de fenilo-alquilo inferior tais como benzilo, 2-feniletilo, 2-fenilpropilo, etc. O grupo fenilo pode ser não substituído ou pode ser substituído com 1-2 substituintes, tais como metilo, cloro, etc., que não afectem de modo relevante as propriedades dos compostos do invento. De novo, a cadeia hidrocarboneto pode ser interrompida com 1 ou 2 heteroátomos, e podem também ser incluídos sistemas aromáticos heterocíclicos. Os ésteres e amidas são preparados usando técnicas convencionais, com protecção apropriada de qualquer álcool ou grupo funcional amino no composto substrato da Fórmula (1).

Deverá ser tomado em consideração que os compostos podem ser preparados quer como os mono- ou di-ésteres quer como as mono- ou di-aminas - 14- (ou triésteres ou triamidas, dependendo da escolha de AAC). Assim, o invento inclui ésteres em que apenas um dos grupos carboxilo é esterificado, onde dois grupos carboxilo são esterificados ou em que todos os grupos carboxilo (no caso de serem mais de dois) são esterificados. Apresentações semelhantes são aplicáveis às amidas correspondentes. Além disso, os compostos podem ser preparados sob a forma de ésteres/amidas mistos em que um carboxilo é um éster e um outro é amida.

Sais dos compostos do invento podem ser formados por bases inorgânicas tais como hidróxido de sódio ou de potássio ou de bases orgânicas tais como cafeina ou piperidina para formar os sais básicos dos grupos carboxilo livres ou podem ser formados a partir de ácidos orgânicos ou inorgânicos a fim de se obter sais de adição de ácido de grupos amino livres. Assim, os sais podem ser de bases inorgânicas tais como hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio, hidróxido de amónio, hidróxido de magnésio, etc., ou de bases orgânicas tais como trimetilamina, piridina, pirimidina, lisina, cafeina, etc. Os sais de adição de ácido podem ser formados a partir de ácidos inorgânicos tais como o ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, etc., ou a partir de ácidos orgânicos tais como o ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido salicílico, etc.

Sais são formados em protocolos padronizados por tratamento com a base ou ácido apropriado a uma temperatura variando entre 0o C e 100° C, de preferência à temperatura ambiente quer em água isoladamente quer em combinação com um solvente orgânico miscível com a água inerte tal como metanol, etanol ou dioxano.

Formas cíclicas do composto da Fórmula (1) são preparados - 15- fazendo uma ponte entre amino livre e grupos carboxilo livres contidos no composto substrato. A formação dos compostos cíclicos é conduzida, de um modo conveniente, por tratamento com um agente de desidratação tal ccomo diciclo-hexilo carbodi-imida por meios conhecidos nesta técnica per se, com protecção apropriada caso seja necessário.

Na maior parte dos compostos da Fórmula (1), a cicloamida é formada entre o grupo amino presente no término amino em Y com o grupo carboxilo no término carboxi representado por AAC. Grupos protectores apropriados podem ser usados para dirigir a cicloamidação tal como é conhecido nesta técnica.

Os compostos do invento podem ainda ser caracterizados indicando as identidades de Y-CO, η, X, Z e AAC. As várias apresentações de "Y-CO" incluem γ-Glu, /5-Asp, Glu, Asp, γ-Glu-Gli, yÓ-Asp-Gli, Glu-Gli, e Asp-Gli, que nos códigos de aminoácidos de uma letra podem ser simbolizados como γΕ, /5D, E, D, γΕ-G, yÓD-G, E-G, e D-G, respectivamente. Os vários substituintes designados por X podem ser indicados por abreviaturas padrão, e a sua inclusão nos análogos tripeptídicos dos compostos do invento simbolizados por C(O) (X) quando n=l e Z é O ou C(X) quando Z é S ou C(X) (X) quando n=2 (Z deve ser S), ou C(X) (X) (X) quando n=3 (Z deve ser C). Contudo, quando um X é H, ele é simplesmente não indicado na representação como H ou H2. Nos compostos da Fórmula (1) em que n é igual a 2, o enxofre do resíduo cisteína irá ter uma carga positiva e irá existir como um ião sulfónio.

Compostos em que Z é O, incluem, por exemplo, y-glutamil-(o-hexiljserinil-glicina, y-glutamil-(o-octil)serinil-glicina, etc. Compostos em que Z é C incluem, por exemplo γ-glutamil-histidinil-glicina, y-glutamil-(7i-benzil)histidinil-glicina, e y-glutamil-a-aminooctanoil-glicina, etc. Compostos - 16- em que Z é O ou C são mais resistentes a oxidação do que compostos contendo S na posição Z. A notação para AAC pode também ser feita no código de abreviatura de aminoácido de uma letra padrão ou noutra abreviatura apropriada para aminoácidos não-gene codificados.

Assim, usando esta notação, compostos apropriados da Fórmula (1) incluem: yD-C(Hx)-PG, D-G-C(Hx)-F,

yE-C(o-BuBz)-PG etc., assim como as formas ciclizadas ou esterificadas/amidadas.

Aspectos dos Compostos do Invento

Os compostos do invento são úteis como inibidores da fase de solução ou como inibidores imobilizados de enzimas, tais como glutationa-S-transferases (GSTs), que utilizam glutationa como substratos. Essa inibição pode ser desejável em contextos tanto analíticos como terapêuticos.

Como agentes terapêuticos, os compostos esterificados do invento são muito úteis visto que a permeação da membrana celular é melhor conseguida por estas formas menos hidrofílicas. Híbridos amidas ou éster/amida apropriados podem assim ser também usados. Esteres particularmente preferidos são os ésteres benzilo e ésteres benzilo derivatizados. Também preferidos são os ésteres de etilo.

Contudo, pensa-se que os efeitos intracelulares sejam devidos à formação de formas não esterificadas dos compostos do invento.

Visto que os compostos do invento são ácidos dicarboxílicos, os diésteres são a forma preferida. Nalguns casos, o metabolismo parece realizar-se através do monoéster; contudo, pensa-se que a forma activa seja a forma não esterifícada intracelularmente. Contudo, a fixação de glutationa per se parece ser inibida por esterificação tal como é descrito por Welner, W. P., et al., Proc Natl Acad Sei USA (1984) 81_: 4732-4735; Anderson, M.E. et al. Arch Biochem Biophvs (1985) 239: 538-548; Tsan, M.F., et al. J App Phvsiol (1989) 66: 1029-1034. Possivelmente isto é devido à utilização de canais de fixação de aminoácido para a própria glutationa. Por outro lado, Lo, T.W.C. et al. Biochem Pharmacol (1992) 44: 2357-2363 verificaram que ésteres de dietilo de inibidores da glioxalase eram capazes de permear células tumorais.

Assim, para utilização in vitro em cultura de células, por exemplo em ensaios de avaliação, os compostos preferidos do invento são as formas esterificadas. Isto é demonstrado de um modo dramático no que se refere a toxicidade contra células HT-29 após quatro horas de exposição de 2 x 105 células/ml em meio sem soro para o éster dietílico em oposição à forma ácido dicarboxílico. Quatro compostos modelo foram usados para demonstrar este aspecto. Estes quatro compostos são como se segue: 1) y-glutamil-S(octil)-cisteinil-glicina, abreviadamente "octil G", tem uma CI5o de >200 μΜ quando na forma ácido dicarboxílico; a CI50 é 22 μΜ para o éster dietílico; 2) y-glutamil-S(hexil)cisteinil-R(-)-fenil-glicina, abreviadamente "hexil PG", tem uma CI50 de >200 μΜ na sua forma ácido dicarboxílico, mas como o éster dietílico tem uma Cl50 de 24 μΜ; 3) y-glutamil-S(benzil)cisteinil-R(-)-feni1-glicina, abreviadamente - 18- "benzil PG", tem também uma CI50 de > 200 μΜ na forma ácido livre, mas uma CI50 de 47 μΜ para o éster dietílico; 4) y-glutamil-S(naftil)cisteinil-glicina, abreviadamente "naftil G", tem uma CI50 de > 200 μΜ mas uma CI50 de 40 μΜ para o éster dietílico.

Os valores anteriores para a CI50 foram determinados tal como foi acima descrito e as células foram submetidas a ensaio usando o ensaio clonogénico modificado descrito no Exemplo 11 mais abaixo.

Além disso, tanto os ésteres como as amidas oferecem a oportunidade para modificar os compostos do invento de modo a afectar a sua aptidão como agentes terapêuticos, como reagentes para diagnóstico, e como ligandos para acoplamento com suportes sólidos. Os grupos éster ou amida podem conter ligandos adicionais úteis tais como porções hidrofóbicas para melhorar a permeação celular, grupos reactivos para facilitar a ligação a outras substâncias, e ligandos adicionais tais como anticorpos ou seus fragmentos, veículos para melhorar a imunogenicidade, etc. Além disso, os compostos podem ser modificados incluindo substituintes tais como agentes quelantes que facilitam a purificação por cromatografia de afinidade de ião metálico imobilizado ou substituintes que alteram a solubilidade do peptídeo ou que afectam a farmacocinética tal como a adição de polietileno glicol.

Assim, os ésteres e amidas do composto da Fórmula (1) oferecem vantagens distintas em relação a formas de ácido livre ou de sal numa variedade de contextos.

As formas cicloamido do composto da Fórmula (1) oferecem a vantagem de especificidade e de selectividade aumentadas entre GSTs alvo. As formas cíclicas são em geral superiores como ligandos cromatográficos para as - 19- formas de cadeia aberta. Além disso, as suas características inibitórias são moduladas por este aspecto.

Os compostos do invento que contêm benzilo substituído como a apresentação de X são vantajosos pelo facto de oferecerem a oportunidade de sistematicamente controlarem a selectividade dos compostos para as várias GSTs. Por exemplo, tal como é indicado no Exemplo 8 aqui apresentado, a especificidade de ligação entre os grupos μ e π de GSTs humanas é controlada pela natureza do substituinte para numa porção benzilo ligada ao átomo de enxofre do resíduo Cis de certos compostos do invento. Existe uma correlação na. especificidade de ligação com valores sigma (meta) dos substituintes para nas porções S-benzilo Cis.

Os quatro compostos preferidos acima indicados revelam uma clara selectividade em relação a isozimas GST. Nenhum destes compostos apresentou qualquer inibição apreciável quer da glutationa reductase (em que a redução GSSG foi medida pela desaparição de NADPH) ou de γ-glutamil transpeptidase (onde a transferência de glutamil a partir de glutamil p-nitroanilina para glicilglicina foi avaliada). Nestes testes, os quatro compostos (assim como ácido etacrínico) apresentavam uma CI50 de mais de 1 raM. Contudo, verificaram-se diferenças substânciais no que se refere à capacidade de cada um destes quatro compostos para inibirem isoenzimas de GST. Quando os isoenzimas de GST Pl-1, Al-1, Ml a-la, e M2-2 foram testados no que se refere a estes compostos, as diferenças na selectividade tomaram-se aparentes. benzil-PG e PG hexílico inibiram de um modo selectivo Pl-1 em comparação com os três isoenzimas restantes, embora PG hexílico tivesse revelado uma inibição razoável em relação a Al-1. Assim, enquanto que benzil-PG apresentou Ki no que se refere a Pl-1 de apenas 0,4 μΜ, os valores de Ki correspondentes para os restantes Al-1, Ml a-la, e M2-2 foram de 20, 25 e 31 μΜ respectivamente. Enquanto que o PG hexílico -20- mediu um Ki de 0,85 μΜ no que se refere a Pl-1, para os restantes enzimas, por ordem, os valores de Ki foram de 5,8,41 e 97 respectivamente.

Por outro lado, naftil G apresentou um Ki no que se refere a Mlaia de apenas 0,1 μΜ; os valores para Pl-1, Al-1 e M2-2 foram de 1,2, 4,2 e 1,5 μΜ respectivamente. Octilo G foi claramente selectivo para Al-1 dando um valor Ki de 0,27 μΜ em comparação com 1.2 μΜ para Ml a-la e 1,9 μΜ para Pl-1. Os valores Ki para ácido etacrínico no que se refere aos três isoenzimas são comparáveis: 4,0 μΜ para Pl-1; 2,0 μΜ para Al-1 e 3,0 μΜ para Ml a-la.

Assim, benzil-PG e PG hexílico são inibidores particularmente eficazes para Pl-1 para a exclusão de outros isoenzimas testados; naftilo G é selectivo para Mia-la e octilo G é selectivo para Al-1.

Toma-se assim aparente que entre os vários compostos do invento, verificou-se que análogos são selectivos para GSTs alvo desejados. Tal como é reflectido no exemplo mais abaixo, isso origina a capacidade para esquematizar protocolos terapêuticos de acordo com a natureza do agente quimioterapêutico e seu mecanismo de detoxificação afim e de acordo com o complemento GST das células alvo.

Utilização como Ligandos Cromatográficos e Reagentes Analíticos

Os compostos do invento são também úteis individualmente como suportes cromatográficos diagnósticos e como utensílios cromatográficos. A utilização destes compostos em cromatografia de afinidade, para caracterização e para purificação, assim como em ensaios diagnósticos, é particularmente importante no caso de GSTs humanas. Enquanto que painéis dos compostos do invento são muito convenientes na determinação do complemento de GST de -21 - tecidos, compostos individuais podem ser usados para detectar a presença de GSTs em geral, ou de GSTs de um tipo particular no ser humano, assim como em purificação de tipos particulares de GSTs humanas. Assim, tal como é indicado no Exemplo 8 mais abaixo, vários compostos do invento apresentam diferentes propensões para ligarem GSTs humanas das classes μ (Ml) e das classes π (Pl), assim como vários isoenzimas de rato. Além disso, tal como é indicado no Exemplo 9, compostos do invento também apresentam inibição selectiva de fase de solução de GSTs humanas particulares. Na naior parte dos casos cromatografia de afinidade e estudos de inibição revelam a mesma especificidade enzimática para cada composto do invento.

Os compostos do invento, ou os compostos da Fórmula (1) isoladamente sob a forma de ácidos livres ou de sais, podem ser usados como ligandos cromatográficos para purificação e caracterização de GSTs humanas colectivamente, para purificação e identificação de classes humanas de GSTs ou para purificação ou separação de enzimas GST humanas individuais, dependendo da escolha de ligando.

Para utilização como ligandos de afinidade em suporte cromatográfico, os compostos que incluem a Formula (1) são acoplados a uma matriz sólida apropriada, tal como Sepharose, poliacrilamida, sílica, etc., usando técnicas de acoplamento padronizadas. As formas não cíclicas dos compostos do invento contêm pelo menos amino e grupos funcionais carboxilo que podem ser derivatizados para agentes de ligação apropriados ou directamente para suportes. Dependendo da natureza do suporte sólido, o acoplamento do ligando de afinidade pode utilizar acoplamento co vai ente directo ou pode requerer a utilização de agentes de ligação homo ou heterobifuncionais tais como os disponíveis a partir de Pierce Chemical Company (Rockford, IL). Pode também -22- ser desejável distanciar o ligando de afinidade da superfície do suporte a fim de tomá-lo mais acessível. Esse distanciamento pode ser realizado usando braços de espaçamento, tal como é geralmente compreendido. Além disso, o suporte pode ser tratado com um material inerte, tal como, por exemplo, albumina do soro humano, de modo a minimizar interacções indesejáveis, especialmente se o suporte for usado para a cromatografia de amostras biológicas.

Os suportes cromatográficos derivatizados podem tirar vantagem da diversidade dos compostos que incluem a estrutura da Fórmula (1) por acoplamento do suporte sólido com mais de um desses ligandos. Os ligandos podem ser ordenados num gradiente, aleatoriamente como uma mistura, ou em qualquer padrão prédeterminado desejado. Além disso, combinações dos compostos do invento podem ser usadas em aplicações cromatográficas em que é conseguido um equilíbrio entre um ou mais compostos que servem como ligandos de afinidade e um ou mais compostos que são usados como competidores para o ligando de afinidade para efectuar eluição dos materiais submetidos a separação ou a caracterização cromatográfica. Materiais de afinidade variada para as porções submetidas à técnica cromatográfica são usados para os ligandos e para os agentes de eluição, tal como é ilustrado no Exemplo 10, mais abaixo.

Os suportes cromatográficos derivatizados em compostos que incluem a Fórmula (1) podem então ser usados para separação preparativa de GSTs humanas ou de outros enzimas para os quais os ligandos tenham afinidade, outros enzimas utilizando glutationa como substrato, anticorpos que reajam com glutationa, ou outras porções que se liguem com moderada afinidade aos ligandos. Suportes cromatográficos acoplados aos compostos do invento podem também ser usados em diagnóstico a fim de determinar a presença, ausência, -23- quantidade ou natureza de materiais em amostras biológicas ou em outras amostras suspeitas de conterem materiais tendo uma estrutura semelhante à da glutationa. Por exemplo, cromatografia de afinidade usando compostos do invento num novo método HPLC pode ser usada para isolar e separar isoenzimas GST em forma bioactiva, dimérica, a partir de tecidos humanos tais como o fígado, tal como é ilustrado no Exemplo 10, mais abaixo. O composto apropriado contendo a estrutura da Fórmula (1) útil nessas separações ou análises pode ser evidente a partir da natureza do produto analisado ou material cuja preparação seja desejada, ou pode rapidamente ser determinado preparando uma painel diverso dos compostos e avaliando o painel quanto ao ligando de afinidade mais eficaz.

Os compostos contendo a estrutura da Fórmula (1) podem também ser usados para detecção da presença ou ausência de GSTs humanas em geral ou para uma classe particular de seus isoenzimas. Protocolos para esses ensaios imitam os utilizados em imunoensaios; estes protocolos são geralmente aplicáveis a quaisquer ensaios que envolvam parceiros de ligação específicos onde a especificidade do ensaio dependa da especificidade da ligação. Assim, nesses ensaios, os compostos incluindo a estrutura da Fórmula (1) desempenham o papel de anticorpos ou de outros agentes imunoreactivos específicos para o produto analisado, neste caso a GST relevante. Esses protocolos incluem ensaios em sandwich, ensaios de competição, ensaios de ligação diracta, etc., com uma ampla variedade de meios de detecção para formação de "imunocomplexos" (meste caso um complexo entre GST e o composto contendo a estrutura da Fórmula (19). Essa detecção significa etiquetas fluorescentes, marcas enzimáticos, marcas radioactivas e combinações destes.

Painéis

Os painéis do invento são construídos com pelo menos cinco análogos tripeptídicos diversos de glutationa da Fórmula (1), em que X, AAC e Y são tal como foram acima definidos mas em que X pode também ser H. Os painéis são muito úteis quando com características maximamente diversas. Esta diversidade pode ser proporcionada variando as naturezas de Y, AAC e X. Em geral, usando substituintes X, por exemplo, com hidrofobicidade variável, poderá ser obtida uma gama dessas características de hidrofobicidade. X é também um substituinte conveniente para variação da diversidade das Hammett Constants (sigma/beta e sigma/para) dos compostos resultantes. A diversidade resultante da variação de AAC é de certo modo menos realçada; a proporcionada por variações em Y é limitada pelas limitações dessa estrutura.

As Hammett Constants referem-se aos valores análogos aos obtidos apresentando a influencia electronica de substituintes sobre a constante de ionização de ácido benzoico. Como um resultado deste trabalho inicial, valores numéricos foram atribuídos a uma grande lista de diferentes substituintes. Quadros desses valores para vários substituintes são fornecidos, por exemplo, por Ritchie, C.D. et al., Prog Phvs Org Chem (1964) 2: 323.

Pode ser feita a construção de uma série dos análogos do invento que faça variar de um modo sitemático o valor deste parâmetro, por exemplo, ao utilizar como apresentação de X, um grupo benzilo que seja posteriormente substituído com um substituinte adicional na posição para, tal como nitro, cloro, metoxi, ou metilo.

As características estéricas e as propriedades resultantes dos -25 - compostos da Fórmula (1) que são membros do painel podem também ser controladas por ciclização de um ou mais membros do painel.

Por exemplo, uma matriz bi-dimensional dos tripeptídeos análogos da glutationa do invento formando um painel bi-dimensional pode ser construída fazendo variar o componente AAc de um pequeno resíduo hidrofóbico até um grande resíduo hidrofóbico até um residuo carregado positivamente até a um residuo neutral e finalmente até um resíduo carregado negativamente, desse modo influenciando, nos últimos três análogos, o efeito electronico indutivo. De um modo semelhante, os substituintes X podem ser variados na segunda dimensão na mesma gama de pequeno hidrofóbico a grande hidrofóbico de carregados positivamente a neutros e negativos. A matriz resultante proporciona um paimel apropriado para utilização em, por exemplo, determinação de compostos apropriados para utilização como adsorventes.

Apresentações particularmente úteis de X são os benzilos substituídos em que se pode demonstrar que variação da hidrofobicidade e das capacidades de doação ou de retirada do substituinte para têm uma correlação sistemática com a capacidade para ligar certas classes de GSTs humanas.

Utilizaçãodos Painéis do Invento

Os painéis são úteis para a determinação de diferentes complementos dos isoenzimas da glutationa-S-transferase (GST) como ocorrem em células ou tecidos normais (em comparação com não desejados). "Complemento de GST" significa o padrão de níveis de isoenzimas de GST que está presente nessas células ou tecidos ou que é geneticamente programado de modo a que essa indução ou repressão de níveis de expressão dessas GSTs seja manipulável. Tal como é explicado na secção de Fundamentos acima -26-

apresentada, GSTs são homo ou heterodímeros formados a partir de subunidades, das quais pelo menos sete são bem conhecidas. Além disso, embora estes isoenzimas tenham sido amplamente classificados, membros individuais em cada classe podem diferir de indivíduo para indivíduo devido a variação genética. As propriedades dos vários isoenzimas diferem no que se refere a uma série de parâmetros mensuráveis incluindo especificidade do substrato, susceptibilidade a inibição, ligação a reagentes específicos, e inducibilidade de expressão.

Utilização dos Painéis do Invento para Determinar Perfis de GST —

Fundamentos

Talvez a abordagem mais facilmente compreendida para a determinação do complemento do isoenzima de GST de uma amostra de tecido desconhecido presuma um conjunto de referências de todos os isoenzimas de GST que apresentem perfis de reactividade que tenham ou possam ser determinados. Assim, assumindo uma separação por resolução suficientemente elevada, por exemplo, usando qualquer técnica de separação, análoga, por exemplo, a focalizaçâo cromatográfíca de elevada resolução, um padrão de eluição é referenciado a uma série de enzimas conhecidos. Outros métodos para a separação e caracterização dos isoenzimas conhecidos poderão incluir a utilização de anticorpos que tenham sido preparados para isoenzimas específicos, tais como os estabelecidos para vários isotipos humanos de GST e usados para avaliar o conteúdo de GST destes isotipos em tecidos candidatos (Howie, A.F., et al., Carcinogenesis (1990) ϋ: 451-458; Beckett, G.J. Clinica Chimica Acta (1984) 141: 267-273). Podem também ser usadas separações electroforéticas com gel. A localização das bandas de GST a seguir a electroforese em condições não desnaturantes pode ser determinada, por exemplo, pelo método de Ricci, G., et al., Anal Biochem (1984) 143: 226-230. A localização de vários isoenzimas resultantes de separações cromatográfícas pode ser detectada usando substratos / -27- comuns a todos os isoenzimas, tais como l-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB). De facto, a distribuição de actividade tal como é ensaiada por CDNB em vários tecidos foi conduzida por Pickett, C.B., and Lu, A.Y.H., Ann Rev Biochem (1989) 58: 743-764. A utilização destes métodos de separação directos para se obter um padrão de distribuições de isoenzima de GST em células e tecidos de interesse pode ser usada para se obter um complemento de GST para as células e tecidos que possam ser úteis no esquema terapêutico, contanto que cada um destes isoenzimas apresente um perfil de reactividade que tenha sido determinado previamente seguindo técnicas de separação que permitam isolamento do isoenzima individual com retenção de actividade. Esse perfil de reactividade tomará em consideração as substâncias que sejam substratos eficazes, substâncias que sejam inibidores eficazes, e substratos que sejam indutores ou activadores eficazes da actividade de GST. Uma vez identificado e quantificado o isoenzima de GST em virtude da sua posição no padrão de eluição ou gel electroforético, por exemplo, será feita referência ao perfil de reactividade do isoenzima conhecido e previamente isolado a fim de predizer ou esquematizar protocolos de tratamento.

Este método, embora rapidamente compreensível, não é prático devido ao grande número de isoenzimas de GST que são potenciais candidatos para inclusão no complemento e devido à mutabilidade do reportório de isoenzimas de GST per se. Assim, o polimorfismo na população de isoenzimas de GST disponíveis irá resultar, provavelmente, numa proteína com mobilidade inalterada, por exemplo, no padrão de eluição, mas com especificidade ou padrão de inibição alterado do substrato, ou vice versa. Em cada um dos casos, os resultados da junção da posição no padrão de eluição para o conjunto de características de referência poderia dar origem a resultados enganadores. -28-

Um resultado de certo modo melhorado poderá ser obtido utilizando múltiplas técnicas de separação, sendo menos provável que a mobilidade pudesse ser não afectada em múltiplos sistemas de separação em comparação com um sistema de separação. Um tal sistema é geralmente ilustrado por meio de um simples sistema hipotético em que um primeiro sorvente, Pl, produz quatro picos de isoenzima no seu padrão de eluição sendo obtidos cinco num segundo sorvente, P2. Se os padrões de especificidade do substrato (para substratos A, B e C, por exemplo) indicarem que um determinado pico Pl (identificado, por exemplo, como 1.2) for substâncialmente o mesmo em perfil de substrato como um pico particular separado sobre sorvente P2 (pico 2.4), então poder-se-ia assumir que uma amostra de tecido que proporcionasse um pico a 1.2 em sorvente Pl e a 4 em sorvente P2 iria ter muito provavelmente um perfil de reactividade (com A, B e C) igual ao dos picos formadoes de isoenzima 1.2 e 2.4. A técnica ilustrada neste sistema hipotético pode ser aplicada usando, como sorventes à base de afinidade, os novos análogos de glutationa tripeptídica do invento ou um desses novos tripeptídeos em combinação com um análogo adicional ou painéis de análogos de glutationa analógicos com diversas propriedades. Pensa-se que para realizar uma caracterização eficaz, deverá ser usado um painel de pelo menos dois, e de preferência três, e com maior preferência 5 desses análogos. Os membros do painel devem ter propriedades que sejam suficientemente diversas para assegurar discriminação entre os vários isoenzimas de GST no complemento.

Se a técnica de separação preservar a actividade enzimática, as reactividades de cada enzima contra potenciais drogas poderão ser determinadas directamente. Separações sem desnaturação na técnica, contudo, sofrem quer de falta de resolução quer de hipersensibilidade a mudanças estruturais, tomando a -29- identifícação de pico demasiadamente problemática para uma orietação eficaz da terapêutica. Cromatografia de permuta iónica, por exemplo, poderá ser usada como um passo para a purificação individual de isoenzimas de GST, mas apresenta resolução inadequada ou inapropriada como um utensílio analítico. IEF, outra técnica disponível neste campo, tem tendencia a produzir numerosos picos estranhos devido a modificação póstranslacional in vivo ou in vitro da proteína, e não existe ligação necessária entre essas modificações estruturais e a variação funcional.

Assim, a determinação do perfil de actividade do complemento de GST em células ou tecidos por separação dos isoenzimas individuais usando métodos de técnicas anteriores e determinando um perfil de actividade para cada um deles contra todas as drogas quimioterapêuticas possíveis seria laboriosa, mas é melhorada pela disponibilidade dos novos tripeptídeos de GSG-análogo do invento. Os compostos do invento permitem separação sem desnaturação dos enzimas de GST.

Uma abordagem mais eficiente tira vantagem de perfis de complementos de isoenzimas de GST que medem simultâneamente a actividade de ligação específica e características de reactividade. Estes perfis, designados para um levantamento dos perfis de características, ou perfis "SC", permitem a determinação de um conjunto de referências de perfis SC que incluem informação sobre especificidade do substrato, indução da resposta a indutores específicos, etc., assim como características de ligação adicional ou de mobilidade electroforética. Ao aplicar métodos computorizados à comparação destes perfis, a informação requerida para o esquema de moduladores terapêuticos e de protocolos acompanhantes e para previsão de sucesso ou de insucesso de protocolos propostos pode ser obtida para números significativamente maiores de espécimes que com métodos de técnicas anteriores, -30- visto ser necessário proporcionar um modelo adequado para a terapêutica. De entre os parâmetros que podem ser usados para a obtenção de um perfil SC há a considerar a capacidade para ligação a membros dos painéis de análogos de GSH tripeptídicos do invento, ou o efeito desses membros do painel sobre a actividade.

Nesta abordagem para a determinação do complemento de GST de amostras de células e tecidos desconhecidos, é tirada vantagem do padrão de técnicas de identificação. Em relação com esta abordagem, o que é aqui designado como perfil SC é determinado geralmente no que se refere a um painel de reagentes que reagem de um modo específico e diferencial com os vários isoenzimas de GST. Isto é análogo à determinação de perfis obtidos por imunoensaio de reacção cruzada, e refere-se a qualquer padrão de reactividade de um isoenzima de GST candidato ou mistura de isoenzimas com um painel de reagentes. Assim, o perfil SC pode ser determinado no que se refere às taxas de tumover para vários substratos; níveis efectivos de concentração inibidora para vários inibidores; níveis de indutores requeridos para induzir a expressão do gene para o isoenzima de GST no contexto de uma célula hospedeira particular; mobilidade em electroforese na presença ou ausência de inibidores ou substratos; tempos de eluição a partir de parálogos ou de outras colunas de afinidade ou, de fato, o padrão clássico de ligação com um painel de anticorpos. Os perfis SC obtidos para isoenzimas de GST individuais ou misturas de isoenzimas com vários níveis de concentração podem ser manipulados de vários modos, aqui descritos, a fim de proporcionar um conjunto de referências contra as quais perfis SC de amostras desconhecidas possam ser comparados.

Em geral, o perfil SC irá proporcionar valores para cada um de um painel de "canais de informação" em que cada canal de informação descreve uma característica do complemento ou padrão de GST, tal como a afinidade de ligação para um aniticorpo, uma afinidade de substrato, um tempo de eluição, etc. Pelo -31 - menos alguns dos canais de informação deverão relacionar-se com valores que variem com a concentração do GST. A determinação do complemento de GST para células ou tecidos é útil per se em diagnóstico e caracterização de amostras. Além disso, para utilização no esquema de apresentações das estratégias para debilitar ou destruir tecido indesejado, os perfis SC deverão proporcionar informação relacionada com a actividade de GST de modo a que diferenças de actividade entre tecidos normais e indesejados possam ser determinadas. Assim, os perfis SC do tecido indesejado deverão ser rapidamente comparáveis com os padrões de referência os quais, por seu lado, deverão pelo menos em parte ser baseados nos padrões de reactividade que irão auxiliar o esquema de moduladores terapêuticos e a selecção de drogas e de prodrogas. Para esta aplicação, pelo menos uma porção dos perfis de referência deverão ser fundamentados em dados sobre taxa de tumover do substrato, dados sobre inibição, ou dados relacionados com indução de nível de produção de isoenzima, ou qualquer outra reactividade que vá permitir manipulação do enzima de GST in situ. Os painéis do invento podem ser usados para determinar os efeitos sobre a actividade. A combinação de separação cromatográfica que permite que a actividade seja retida usando os novos compostos do invento juntamente com a preparação de perfis SC no que se refere a reagentes que afectem a reactividade para esses padrões constitui uma abordagem para a obtenção dos dados necessários.

Os perfis SC dos padrões de referência e das amostras desconhecidas são determinados no que se refere a painéis de "reagentes especificamente reactivos". Estes reagentes podem incluir uma série de substâncias, incluindo parálogos, substratos, inibidores, indutores, anticorpos, assim com "reagentes" que são na realidade técnicas tais como electroforese de gel ou cromatografia de afinidade onde o grau de reactividade é determinado -32- como mobilidade electroforética ou tempo de eluição. Assim, "reagentes especificamente reactivos" não se limitam aos reagentes que efectuam uma reacção química, incluindo sim qualquer reagente ou técnica que permita que se obtenha um parâmetro característico para a amostra no que se refere a esse reagente.

Evidentemente, os painéis dos análogos do invento podem ser usados como "reagentes especifícamente reactivos" quer como agentes de ligação, suportes cromatográfícos, quer como inibidores de acção enzimática em solução. A capacidade comparativa destes compostos como membros do painel para inibir as reacções enzimáticas catalisada por GST pode ser usada como um perfil SC característico, assim como padrões de eluição a partir de colunas contendo os análogos tripeptídicos como ligandos de afinidade.

Determinação de Perfis SC de Referência

Embora padrões de referência para algumas finalidades, tal como é descrito mais abaixo, possam ser preparados directamente a partir de tecido normal de um determinado indivíduo, é também útil proporcionar um banco de dados de perfis SC para uma série de isoenzimas de GST isolados previamente com padrões de reactividade caracteristicos. Reunindo estes padrões de reactividade com os de amostras de biopsia do tecido não desejado, poderá ser feito o esquema apropriado para moduladores terapêuticos e escolha de prodrogas ou toxinas.

As Patentes dos E.U.A. Nos 4.963.263 e 5.133.866, cujas apresentações são aqui incorporadas como referências, descrevem painéis de reagentes de afinidade parálogos que sejam úteis em separações cromatográficas de substâncias intimamente relacionadas. Os painéis do invento são, de um modo -33- semelhante, diversos. Painéis do tipo parálogo usando os análogos tripeptídicos de GSH do invento podem ser convenientemente usados na preparação de suportes de afinidade para a separação de vários isoenzimas de GST em forma purificada embora, em cada caso, retendo a actividade do isoenzima nativo. Diferentemente de HPLC de fase reversa ou de métodos de registo Western das técnicas anteriores, os isoenzimas separados preparados usando cromatografia tendo como base a afinidade para os compostos do invento comportam-se, de um modo virtual, de um modo preciso, semelhante ao dos isoenzimas tal como ocorrem na natureza. Para cada um desses isoenzimas purificados, então, poderá ser elaborado um perfil SC no que se refere à reactividade de substrato ou de outro reagente que afecte a actividade tal como os representados pelos compostos do invento. Um banco de dados útil de um grande número de perfis SC caracteristicos destes isoenzimas purificados poderá então ser retido e armazenado numa forma matematicamente ou computacionalmente acessível para comparação com amostras obtidas a partir de tecido não desejado.

Painéis de análogos de glutationa tripeptídica, em que pelo menos um membro contenha a estrutura da Fórmula (1), podem ser usados como a base para recolha de canais de informação que proporcionem os perfis SC para o conjunto de referência. A conjugação de substratos específicos de isoenzimas conhecidos para os membros do painel ou conjugação dos membros do painel directamente para o sorvente aumenta posteriormente a diversificação sistemática de propriedades de ligação. Perfis para amostras padronizadas e desconhecidas podem ser obtidos e comparados usando os painéis do invento em configurações apropriadas, tais como colunas de afinidade. Assim, particularmente úteis são painéis de diversos análogos tripeptídicos incluindo pelo menos um análogo contendo a Fórmula (1) em que X é um hidrocarbilo (1-20C) mono- ou di-substituído ou não substituído contendo facultativamente 1 ou 2 heteroátomos não adjacentes (O, S ou N), e em que a referida substituição é seleccionada de -34- entre o grupo consistindo em halo, NO, Ν02, NR2, OR e SR, em que R é H ou alquilo inferior (1-4C) e AAC é fenilglicina, fenilalanina ou fenilalanina substituída acoplada através de uma ligação peptídica à porção restante do composto da Fórmula (1).

Determinação do Complemento de GST

Em geral, podem ser feitas duas abordagens diferentes para determinar 0 complemento de GST de uma amostra de célula ou de tecido "desconhecido". Em primeiro lugar, tal como foi acima descrito, usando técnicas gerais presentemente praticadas nesta técnica, os isoenzimas individuais contidos na amostra podem ser separados usando suportes de afinidade e podem ser testados individualmente quanto aos seus padrões de actividade. Os isoenzimas individuais a partir da amostra podem ser obtidos sendo em seguida avaliados de um modo independente quanto à sua especificidade de substrato, especificidade inibidora e para identificação de substâncias que induzam a actividade ou produção do isoenzima.

Numa segunda abordagem, menos laboriosa, técnicas de reconhecimento do padrão são utilizadas para que se obtenha uma leitura imediata para amostras de qualquer um ou de ambos os tecidos não desejados e normal para um determinado indivíduo avaliando estes padrões em comparação com um conjunto de referência preparado tal como foi acima referido. Nesta abordagem, é requerido um menor volume de amostra não sendo necessária qualquer separação. Este método é também úitil quando aplicado a cortes de tecidos usando coloração histoquímica para avaliação da actividade de GST.

No que se reefere à primeira abordagem, pode ser usada uma modificação do método de separação usado por Vos, R.M.E., et al., Biochem -35-

Pharmacol (1988) 37: 1077-1082. Neste método, a fracção citosol a partir de um fígado de rato completo foi submetida a uma coluna de afinidade de S-hexil GSH Sepharose usada como um reagente de afinidade para GSTs como um grupo. A mistura de GST eluída foi concentrada e separada focando a cromatografia numa coluna mono-PHR 5/20 (sistema Pharmacia FPLC). Os isoenzimas individuais foram recolhidos em fracções separadas que foram analisadas. As fracções foram identificadas pela sua posição no perfil de eluição, pelo seu peso molecular subunitário, e por actividades específicas em relação a l-cloro-2,4-dinitrobenzeno, que constitui um substrato para a maior parte de GSTs conhecidos.

Ao utilizar como ligando de afinidade um parálogo escolhido de entre os compostos do invento, poderão ser utilizadas condições mais suaves, e formas mais activas dos isoenzimas de GST poderão ser recuperadas. Estas são então testadas quanto a especificidade do substrato, etc.

Tal como foi acima descrito, pode-se considerar a possibilidade de se utilizar, simplesmente, uma tecnologia de separação arbitraria tal como a de Vos que proporcione um padrão de eluição caracteristico dos vários isoenzimas de GST, e comparando o padrão de eluição para células ou tecido de complemento de GST desconhecida com o presente padrão de eluição a fim de determinar a natureza do complemento de GST no desconhecido. Um problema com esta abordagem reside, contudo, na mutabilidade genética de GST, e assim toma-se difícil fazer comparações fiáveis que retenham as características inferidas e desse modo estar seguro de ter padrões de reactividade semelhantes. A mutabilidade genética dos isoenzimas assim como a sua sensibilidade a modificações póstranslacionais têm muita probabilidade de, em qualquer caso particular, ter um profundo efeito sobre sobre a especificidade do substrato, padrões de inibição, etc., assim como sobre características de ligação e físicas, -36- tais como pi. Não existe garantia de que exista uma correlação entre variação da reactividade e propriedade física ou variação de ligação; na verdade, a probabilidade é de que os efeitos não se correlacionem. Tal como foi acima descrito, este problema pode ser mitigado usando múltiplos reagentes de afinidade, também proporcionados pelos compostos do invento.

Na abordagem de comparação de padrão é realizado um ensaio fiável comparando o perfil de reactividade de uma amostra desconhecida com um conjunto de perfis SC de referência. A aplicação desta abordagem para a determinação da composição do produto analisado em geral é descrito na Patente dos E.U.A. No. 5.338.659, registada em 2 de Abril de 1991. De acordo com as técnicas descritas nesta aplicação, um registo predeterminado de perfis obtidos a partir de amostras de composição analisada conhecida é usado como uma referência com a qual um perfil SC da amostra a ser testada pode ser comparada. De um modo geral, um painel de 2-10, de preferência 4-6, reagentes reactivos especificamente diferentes é usado em primeiro lugar para proporcionar perfis para amostras de composições conhecidas. Na aplicação referenciada, ensaios de ligação específica foram usados em que existia reactividade cruzada pelo produto analisado candidato através de um painel de agentes de ligação, e os perfis foram obtidos por medição de valores de inibição para ligação de um associado de ligação conhecido por vários produtos analisados. A colecção de perfis é então tratada matematicamente por qualquer uma de várias técnicas a fim de proporcionar uma comparação legível com o correspondente perfil SC de uma amostra desconhecida.

Para utilização na determinação de complementos de GST necessários para a prática de métodos terapêuticos do invento, os perfis SC de análogos podem ser determinados usando quer isoenzimas de GST isolados quer -37- suas misturas que contenham ambas as composições ou ambos. Os reagentes especifícamente reactivos devem incluir, como um painel, pelo menos um, de preferência três, e com maior preferência cinco análogos de GSH da Fórmula (1), juntamente com reagentes adicionais, caso seja desejado. Esses reagentes adicionais podem incluir uma série de substratos conhecidos em que são medidas as taxas de tumover. Candidatos para substrato apropriados incluem, por exemplo, ácido etacrínico, bromosulfoftaleina, hidroperoxido de cumeno, BCNU, clorambucil, óxido de trans-estilbeno, etc.

Também disponíveis para utilização como reagentes reagindo de um modo específico que são membros do painel para proporcionar um perfil SC são inibidores que interactuam com o isoenzima de GST em vários níveis. Estes inibidores incluem, por exemplo, piriprost, Cibacron Blue, e hematina. Anticorpos que são especifícamente imunoreactivos com os vários isoenzimas podem ser usados, assim como reagentes de afinidade do tipo parálogo. Se o perfil proporcionar uma base para uma estratégia terapêutica, é preferido que pelo menos alguns membros do painel devam ser descritivos da actividade enzimática da GST.

Uma técnica adicional para a obtenção de perfis SC é análogo à descrita por Takeo, K., et al., J Immunol (1978) 121: 2305-2310. Nesta abordagem, electroforese diferencial na presença de vários agentes de ligação para as proteínas individuais permite a medição de um valor de mobilidade. Na aplicação específica descrita por Takeo, foram feitas medições de proteínas de mieloma específicas em relação ao dextrano em electroforese em gel poliacrilamida, revelando retardamento quando os dextranos foram adicionados ao gel de separação, retardamento esse que poderá ser revertido adicionando o oligossacarídeo hapten isomaltose. Ao usar esta abordagem, uma série de -38- mobilidades dependendo da escolha de agente de retardamento, por exemplo, poderá ser obtida para composições conhecidas. Esta técnica pode ser aplicada usando os novos compostos ou painéis do invento como os agentes de retardamento ou de mobilização.

Num método preferido para a determinação do complemento de GST de biópsias, é construída uma série de colunas HPLC usando os substratos de GST conhecidos estudados por Mannervik, B., et al., Proc Natl Acad Sei (1985) 82: 7202-7206. Estes substratos são conjugados directamente com os suportes da coluna ou são ligados às variantes análogas de GSH descritas por Adang, A.E.P., et al., Biochem J (1990) 269: 47-54. Uma série de 50-100 diferentes colunas resultantes de várias combinações possíveis de substratos com análogos de GSH da Fórmula (1) representa uma série de sorventes candidatos. Estes sorventes são testados de modo a seleccionar os que possuam máxima diversidade nas propriedades utilizando cada um deles para a separação de uma mistura de isoenzimas de GST conhecidos. As quatro ou cinco colunas com as maiores capacidades de diferenciação são então escolhidas como membros de painel para determinação de perfis SC em amostras desconhecidas e em padrões.

Assim, antes de apresentarem as separações como padrões de eluição sobre cada sorvente individual, os dados são rearranjados de modo a que a capacidade para adsorção de cada sorvente represente uma canal de informação no perfil SC do isoenzima. O padrão de reactividade no que se refere a indutores, activadores, substratos, e inibidores é também determinado para cada isoenzima e usado como um canal de informação. O perfil completado para cada isoenzima conhecido é então usado como um membro de um conjunto de referência. Membros adicionais dos conjuntos de referência são determinados utilizando amostras a partir de tecidos normais e avaliando os valores atribuídos ao mesmo -39- conjunto de canais de informação. Os perfis correspondentes de amostras de biópsia a partir de tecidos desconhecidos, não desejados, são então comparados com este grupo de referência.

Os perfis para composições conhecidas são armazenados numa forma computacionalmente acessível para comparação com perfis determinados de um modo semelhante para amostras desconhecidas. Assim, poderão ser proporcionados estojos para determinação do complemento de GST de amostras desconhecidas que incluam os membros do painel do teste usados na determinação de perfis de referência juntamente com instruções para determinação do perfil SC dos desconhecidos. Software apropriado para avaliar os perfis de referência pode também ser incluído. O complemento de GST pode ser usado para caracterizar a amostra testada e, caso seja apropriado, poderá ser usado para esquematizar a terapêutica.

Para tecido patológico, a estratégia apropriada pode ser seleccionada para tratamento. O complemento pode ser avaliado para determinar se os protocolos de tratamento padrão terão ou não sucesso quando aplicados às células ou tecidos não desejados ou poderão ser usados para esquematizar diferentes protocolos incluindo a escolha de toxina ou de prodroga e a inclusão ou não inclusão de um modulador terapêutico. Síntese dos Análogos Tripeptídicos

Os análogos tripeptídicos do invento ou membros adicionais de análogos tripeptídicos de diversos painéis podem ser sintetizados usando meios geralmente conhecidos nesta técnica, mas usando modificações que tomem estes métodos gerais aplicáveis ao tripeptídeo desejado. Embora metodologias de sintese de fase sólida possam ser usadas, a síntese de peptídeos de fase líquida -40- parece ser superior para estes peptídeos curtos. Os reagentes Fmoc originalmente desenvolvidos para síntese de fase sólida podem ser aplicados a um método de fase de solução para a produção de quantidades de 100 mg dos análogos tripeptídicos.

Os dipeptídeos e tripeptídeos protegidos intermediários sintetizados usando química Fmoc de fase de solução são isolados por cromatografia sobre gel de sílica, e desprotegidos em base suave, permitindo desse modo a síntese de tioconjugados lábeis em relação a ácido (Iselin, B., et al., Helv Chem Acta (1955) 38: 1508-1516). Os análogos podem ser recuperados, ou as misturas de produto crú podem ser acopladas directamente com suporte sólido a fim de proporcionar suportes derivatizados por afinidade (Sundburg, L., et al., J Chromatog (1974) 90: 87-98).

Nas circunstâncias em que o éster do aminoácido AAC C-terminal não se encontra disponível, o éster é produzido por síntese do aminoácido N-Fmoc-protegido (Atherton, E., et al., em "Solid Phase peptide Synthesis," IRL Press, Oxford, England (1989), páginas 47-61) sendo então esterifícado por tratamento com o álcool desejado na presença de ácido sulfurico concentrado (Benoiton, L., Can J Chem (1962) 40: 570-572). Materiais não esterificados são removidos por extracções com base suave e o éster de aminoácido N-Fmoc desejado é isolado por evaporação.

Os derivados de cisteína Fmoc funcionalizados com enxofre são produzidos num processo em um recipiente tratando cisteína com Fmoc-OSu a PH 9 e em seguida tratando esta mistura com o agente de alquilação apropriado. A síntese é conduzida tal como é indicado no Esquema de Reac-ção 1. -41 -

Esquema 1

OH- -42-

Esquema 1 (continuação)

O acoplamento do derivado da cisteína ao aminoácido C-terminal é realizado com a carbodi-imida EDC solúvel em água (Sheehan, J., et al., J Org Chem (1961) 26: 2525-2528) e HOBT (Konig, W., et al., Chem Ber (1979) 103: 788-798) (adicionados para retardar racemização indesejada e para acelerar a reacção) em DMF. Depois do acoplamento ficar completo, usualmente cerca de 1 -43 - hora à temperatura ambiente, a mistura é reduzida in vacuo e vertida para solução de KHCO3 (John Hughes, comunicação privada). Este passo extrai a maior parte da DMF e de EDC e da ureia EDC, assim como uma parte do derivado Fmoc-cisteína que não se tenha acoplado. O resíduo gomoso resultante é retido por separação com decantação do líquido. Este dipeptídeo crú é dissolvido em EtOAc e é lavado com ácido clorídrico IN e água para remover qualquer éster de aminoácido C-terminal não acoplado, assim como EDC e EDC ureia residuais. A solução é concentrada e 0 dipeptídeo é purificado por cromatografia. O dipeptídeo recuperado é então tratado com piperidina a 25% em DMF durante 30 minutos para remover o grupo Fmoc. O dibenzofulveno ou o seu aducto piperidina resultante da remoção de Fmoc não deverá afectar os resultados do acoplamento seguinte (Atherton, E., et al., J Chem Soc Perkin Trans (1981) 538-546). Qualquer excesso de piperidina, contudo, deverá ser recuperado, o que é realizado por meio de co-evaporação repetida com DMF até que o odor de piperidina deixe de ser detectável no material desbloqueado. O segundo acoplamento é então realizado com o derivado de ácido glutâmico seguindo-se uma manipulação semelhante à do dipeptídeo. Éster α-benzílico de ácido glutâmico Fmoc é produzido com bom rendimento e pureza a partir de éster α-butílico de ácido glutâmico comercialmente disponível. Éster α-tert butílico de ácido glutâmico-Fmoc, também comercialmente disponível, pode também ser usado, mas isto requere um passo de tratamento ácido separado na manipulação. Existem problemas de solubilidade com alguns dos tripeptídeos protegidos durante este passo, e produtos parcialmente desprotegidos, impuros, são frequentemente obtidos. O material produzido por meio acoplamento do derivado de ácido glutâmico com o dipeptídeo e processamento contem vários componentes croma-tograficamente móveis. O material que é primeiro eluído a partir da coluna final -44- é fluorescente, sugerindo dibenzofulveno. O produto desejado putativo é eluído em seguida juntamente com outro material que absorva UV, o qual é provavelmente o aducto piperidina de dibenzofulveno. Visto que produtos semelhantes são produzidos e separados a partir de tripeptídeos desbloqueados durante a manipulação final, estes contaminantes não são removidos neste estádio.

Uma vez queo tripeptídeo protegido (e impurezas) seja isolado, ele é seco sob vácuo e tratado com NaOH 0,25 N em etanol: água 3:1 durante 18 horas. Isto remove os grupos Fmoc e protectores de éster. Quando é usado ácido glutâmico protegido com t-butilo, HC1 3N em etanol/água 3/1 v/v durante 3 horas é usado para remover o grupo t-butilo antes do tratamento básico. O ácido é removido por evaporação rotativa e co-evaporação com etanol e água, e um tratamento básico igual ao acima referido remove os grupos protectores restantes. Após o tratamento básico durante a noite, adição de água e extracção com hexano remove os subprodutos orgânicos da desprotecção. A solução aquosa do peptídeo é acidificada e reduzida até se formar um sólido. A dissolução do peptídeo em etanol e filtração remove o sal. Este é evaporado até se formar uma espuma sendo submetido a vácuo elevado durante a noite.

Os compostos são analisados por espectroscopia de massa HPLC, TLV e FAB. Embora a análise por TLC (cromatografia de placa delgada) apresente bons resultados na maior parte dos casos, os resultados com HPLC (cromatografia líquida de elevada performance) são mistos, parcialmente devido ao facto das condições de análise usadas não serem optimizadas para alguns dos peptídeos mais hidrofóbicos (S-alquilo, valina C-terminal, /5-alanina e 4ABu). A racemização durante a desprotecção final com base pode ocorrer numa pequena quantidade, particularmente com o análogo fenilglicina (Bodansky, M., et al., em "Practical Methods in Peptide Synthesis," Springer Verlag, Berlin (1984)). Isto acontece em menor grau do que o que ocorre com as -45- condições sódio-amónio usados previamente por Adang, A. et al. (Biochem J (1989) 264: 721-724).

Usando as técnicas acima indicadas, foram preparados os análogos do Quadro 1.

Quadro 1

Composto3 Rend.. %b TLC Rf„ M/ed Carea' γΕ - C(Bz)-G 32 0,49 388,2. 402,2f 1,0 γΕ - C(Pr)-A 23 0,71 365,2 9,0 γΕ - C(Hx)-A 17 0,76 406,2, 428,2f 4,8 γΕ - C(Bz)-A 44 0,35 412,2, 434,lf 6,6 γΕ - C(Trt)-A 15 0,83 586,4f 1,2 γΕ - C(Me)-/5A 27 0,58 357, lf γΕ - C(Pr)-/5A 27 0,41 364.1, 386,lf γΕ - C(Hx)-y6A 13 0,49 406,3, 428,3f 6,0 γΕ - C(Bz)-/5A 17 0,66 434,2r 8,1 γΕ - C(Trt)-/5A 42 0,92 564,3, 586,5f N/A γΕ - C(Pr)-4ABu 13 0,51 378, 400f γΕ - C(Hx)-4ABu 17 0,52 402,3, 424,3g 4,6 γΕ - C(Bz)-4ABu 23 0,70 426, 448,2f 4,0 γΕ - C(Or)-V 23 0,67 391 13,7 γΕ - C(Hx)-V 15 0,64 434,2, 456,2f 19,5 γΕ - C(Bz)-V 26 0,73 440,1, 462, lf 6,5 γΕ - C(Pr)-D 33 0,55 408 7,0 γΕ - C(Hx)-D 25 0,68 451,2 5,9 γΕ - C(Bz)-D 22 0,59 456,1, 478,lr 2,4 γΕ - C(Pr)-PG 14 0,64 426,4, 448f γΕ - C(Hx)-PG 13 0,63 468,3 4,8 γΕ - C(Bz)-PG 11 0,61 474,1, 496, lf 2,0 γΕ - C(Pr)-H 6 0,57 429,2 γΕ - C(Hx)-H 30 0,61 473,3 6,0 γΕ - C(Bz)-H 11 0,58 499,3f 1,0 -46- a Código AA de uma letra padrão, com Me = metilo, Pr = n-propilo, Hx = n-hexilo, Bz = benzilo, Trt = tritilo (trifenil metilo). b Moles de produto desprotegido dividido pelos moles de derivado Fmoc-cisteína usado. c Valores Rf de TLC para placas de sílica eluídas com EtOAc/piridi-na/HOAc/água 5/5/3/1 e visualizados com pulverização com ninhidrina. d Massa molecular observada, em AMU, usualmente o peso molecular mais 1. Matriz de tioglicerol ou de álcool nitrobenzílico. e Micromoles de peptídeo por mL de volume de resina tumefacta (água) f Aducto sódio, M + 22. s Ião molecular e aducto de sódio menos água; MH+ - 18.

Além disso, são preparados outros compostos da Fórmula (1), incluindo as formas cicloamido desses compostos, assim como os seus ésteres etílico e benzílico. EXEMPLO 1

Sintese de éster etílico de ácido 9-fluorenilmetoxicarbonil-4-aminobutírico

Quarenta e cinco g (0,1339 M, 0,94 eq) de Fmoc-Osu foram adicionados lentamente a uma solução de 14,75 g (0,143 Μ, 1 eq) de ácido 4-aminobutírico (4-ABu) e 20 g de Na2C03 em 300 mL de água desionizada e 200 ml de tetra-hidrofurano (THF). O pH foi monitorizado e foi adicionado mais Na2C03 para manter o pH acima de 8. A reacção foi agitada durante 2 horas sendo em seguida acidificada com HC1 concentrado A suspensão turva resultante foi extraída com 600 ml de acetato de etilo (EtOAc), e em seguida a camada orgânica foi ainda extraída com 300 ml de NaOH 0,5 N. A camada aquosa foi rapidamente vertida para 20 ml de HC1 conc. em 500 ml de água gelada. A suspensão branca resultante foi extraída com 300 ml de EtOAc, seca sobre 50 g de Na2S04 e evaporada até 35 g (rendimento de 75%) de Fmoc-4-ABu sob a forma de um pó branco. Este foi dissovido em 500 ml de etanol absoluto e foram -47- adicionados 40 ml de H2S04 concentrado. Após 4 horas, a solução tinha-se tomado uma massa branca semí-sólida. Esta foi vertida para 2 L de água e foi filtrada. O material branco foi dissolvido em 500 ml de EtOAc e extraído uma vez com 200 ml de NaOH 0,5 N, seco e evaporado para dar origem a 30 g (rendimento de 79%) de composto total, Rf 0,71 (MeOH a 20% em CH2C12), p.f. 83-86°.

Anal. Cale. para C21H23N04: C, 71,37; H, 6,56; N, 3,96.

Encontrados: C, 71,42; H, 6,67; N, 3,72. EXEMPLO 2 Síntese de éster etílico de 9-florenilmetoxicarbonil-fenilglicina

Num processo sintético semelhante, 20 g de fenilglicina deram origem a 33,7 g (rendimento de 68%) de Fmoc-fenilglicina. 19 g deste produto foram convertidos em 10 g (rendimento de 57%) de produto, Rf 0,95 (igual sistema TLC), p.f. 130-133°.

Anal. calc. para C25H23N04: C, 74,80; H, 5,77; N, 3,49.

Encontrados: C, 74,72; H, 5,91; N, 3,20. EXEMPLO 3 Síntese de éster dimetílico de ácido 9-florenilmetoxicarbonil-aspartico

Quarenta e cinco g (0,134 M, 0,96 eq) de Fmoc-Osu foram adicionados a 20 g (0,15 Μ, 1 eq) de ácido aspértico e 20 g de Na2C03 dissolvidos em 400 ml de água e 200 ml de dioxano. A mistura foi agitada durante 2 horas enquanto o pH era mantido a cerca de 9 por adição de pequenas quantidades de NA2C03. Em seguida a mistura branca turva foi vertida para 500 ml de água gelada contendo 40 ml de HC1 concentrado. O sólido branco foi -48- extraido com 500 ml de EtOAc e isto foi misturado com 500 ml de hexano. A mistura foi arrefecida durante a noite e agitada no dia seguinte para dar origem a 38 g de ácido Fmoc-aspártico sob a forma de cristais (rendimento de 71%) após filtração e secagem ao ar. 10 g (0,28 M) deste produto foram dissolvidos em 200 ml de metanol e foram adicionados 20 ml de H2S04 concentrado. A solução foi deixada a repousar durante a noite. A mistura foi vertida para 1 L de água e filtrada. O sólido branco resultante foi seco e redissolvido em EtOAc. Adição lenta de hexano e arrefecimento deram origem a 9 g (rendimento de 83%) de produto sob a forma de agulhas brancas, p.f. 78-80°. [a]d = -13,9°.

Anal. Cale. para C21H21NO4: C, 65,78; H, 5,52; N, 3,65.

Encontrados: C, 66,18; H, 5,68; N, 3,69. EXEMPLO 4 Síntese de 9-fluorenilmetoxicarbonil-S-hexii cisteína A. Vinte g (0,127 Μ, 1 eq) de hidrocloreto de cisteína e 20 g de Na2C03 foram dissolvidos em 800 ml de água sob uma corrente de argão. Duzentos ml de CH3CN foram adicionados, e em seguida 42 g (0,122 M, 0,96 eq) de Fmoc-Osu foram adicionados em pequenas porções enquanto o pH era mantido a cerca de 9 pela adição de porções de 5 g de Na2C03. A reacção foi agitada durante 2 horas adicionais, e 18,6 ml (26,8 g, 0,126 M, 0,99 eq) de 1-iodo-hexano foram adicionados como uma solução em 200 ml de CH3CN. A reacção foi agitada durante 2 horas adicionais e foi vertida para 1 L de água gelada e 50 ml de HC1 concentrado. A mistura branca foi extraída com 600 ml de EtOAc, e a camada orgânica foi extraída com 2 porções de 500 ml de KOH 1 N. Cada uma destas foi imediatamente feita gotejar para porções separadas de 500 ml de água e 30 ml de HC1 concentrado, e as misturas turvas obtidas foram, cada uma delas, extraída com 500 ml de EtOAc. Estas foram, cada uma delas, seca sobre Na2S04 e evaporadas. O rendimento total foi de 24,6 g (45%). A segunda -49- fracção (3,5 g) cristalizou ao repousar, p.f. 101-103°. Rf = 0,57. [a]d = -14,3°. Anal. Cale. para C21H23NO4S: C, 65,42; H, 6,01; N, 3,63.

Encontrados: C, 65,53; H, 5,74; N, 2,91. B. Derivados adicionais de Fmoc S-funcionalizado foram preparados tal como é indicado no parágrafo A. EXEMPLO 5 Síntese de éster a-benzílico de ácido Fmoc-glutâmico

Vinte e cinco g (0,105 M) de éster α-benzílico de ácido glutâmico e 25 g de Na2C04 foram dissolvidos em 400 ml de água e foram adicionados 200 ml de THF. 34 g (0,101 M, 0,96 eq) de Fmoc-OSu foram adicionados em pequenas porções com agitação, e o pH foi mantido a cerca de 9 por adição de mais Na2C03 tal como fosse necessário. Após 1 hora, a reacção foi vertida para 500 ml de água e foi acidificada com HC1 concentrado. A suspensão branca foi extraida com EtOAc, seca sobre Na2S04 e evaporada até se obter uma massa sólida. Esta foi dissolvida em 500 ml de EtOAc quente e foram adicionados 300 ml de hexano. Arrefecimento durante a noite, recolha e secagem ao ar deram origem a 38,7 g (rendimento de 83%) de cristais brancos, p.f. 110-112°. [a]d = -13,8°. M/e (Rei. inten.): 460,2 (19), 363,4 (8), 345,4 (19), 307,2 (10), 289,2 (12), 238,2 (12), 191,2 (10), 178,2 (89), 165,1 (23), 154,1 (57), 136,1 (48). 'H RMN (400 mHz); PPM: 1,9 (m, 1H), 2,2 (m, 1H), 2,4 (Μ, 2H), 4,1 (t, 1H), 4,4 (d, 2H), 4,43 (m, 1H), 5,1 (s, 2H), 5,6 (d, 1H), 7,3 (m, 9H), 7,5 (d, 2H), 7,7 (d, 2H), 9,4-9,6 (s amplo, 1H). 13C (100 mHz), PPM: 27,5, 30,0, 47,3, 53,5, 67,3, 67,7, 120,2, 125,0, 127,3, 128,5, 128,8, 129,2, 135,2, 141,5, 143,6, 143,9, 156,3, 171,4, 177,8. Anal. Cale. para C27H25NO6: C, 70,57; H, 5,48, N, 3,05.

Encontrados: C, 69,71; H, 5,58; N, 2,88. -50- EXEMPLO 6 Síntese de γ-glutamil S-benzil cisteinil fi-alanina 1,5 g (9,76 mmol, 1 eq) de hidrocloreto de éster yô-alanino etílico foram adicionados a 50 ml de DMF e foram adicionados 1,8 ml de DIPEA . 3,5 g (8,1 mM, 0,83 eq) de Fmoc-S-benzil cisteína foram adicionados e dissolvidos por redemoinho da solução. Em seguida 2 g de EDAC e 250 mg de HOBT foram adicionados, e os sólidos foram dissolvidos por redemoinho. A mistura foi deixada repousar durante 1 hora, e foi concentrada in vacuo até se obter um óleo móvel de cerca de 5 ml em volume. A este foram adicionados 100 ml de KHCO3 a 10% em peso/volume, e a mistura foi agitada e o liquido foi removido por filtração. O residuo foi dissolvido em 100 ml de EtOAc, lavado com 50 ml de HC1 1 N, 50 ml de água e foi seco sobre Na2S04. A solução foi filtrada e concentrada in vacuo para dar origem a uma espuma que foi cromatografada usando uma camada de gel de sílica com 2 x 6 cm embalada em CH2CI2. A coluna foi eluída até aparecer o primeiro material absorvendo UV, e em seguida foi realizado um gradiente em incrementos de metanol a 1% com um volume de 100 ml para 3% de metanol. Uma banda de absorção forte de UV foi eluída após duas porções de 3% de metanol; estas foram avaliadas quanto à sua pureza por TLC e reunidas e evaporadas in vacuo para dar origem a 4,6 g (rendimento de 83%) de éster etílico de Fmoc-Cis^-benzi^-^-alanina. Metade desta (4 mmol) foi dissolvida numa mistura de 30 ml de DMF e 10 ml de piperidina, e deixada repousar durante 30 minutos. A solução foi reduzida até se obter um sólido in vacuo, e o processo foi repetido de novo duas vezes com 50 ml de DMF. O sólido branco resultante foi submetido a um vácuo elevado durante 1 hora, sendo em seguida dissolvido em 50 ml de DMF. Para o segundo passo de acoplamento, 1,6 g (3,5 mmol, 0,9 eq) de éster (a) benzílico de ácido Fmoc-glutâmico (v) foram -51 - adicionados, seguindo-se 0,8 g (4,2 mmol, 1,05 eq) de EDAC e 200 mg (1,4 mmol) de HOBT. A mistura foi deixada repousar durante 1 hora, e concentrada in vacuo para cerca de 5 ml em volume. Este foi vertido para 100 ml de KHCO3 aquoso a 10% e agitado. O líquido foi separado ao ser vertido, e o resíduo foi dissolvido em 100 ml de acetato de etilo. A camada orgânica foi lavada com 50 ml de HC1 1 N, 50 ml de água, e foi seca sobre Na2S04. Isto foi reduzido até se obter um alcatrão cromatografado do mesmo modo que o dipeptídeo protegido. Foram obtidos 1,2 g (rendimento de 42%) do tripeptídeo protegido. Este material foi dissolvido em 30 ml de etanol absoluto e foram adicionados 10 ml de solução de NaOH 1 N. A mistura foi deixada repousar durante 18 horas, e foi vertida para um funil separatório com 40 ml de água e 40 ml de hexano. As camadas foram agitadas e separadas, e a fase aquosa foi lavada com 40 ml adicionais de hexano. O pH da camada de água foi ajustado para cerca de 3 adicionando algumas gotas de HC1 concentrado, e a solução turva foi reduzida até se obter um sólido in vacuo e submetida a um vácuo elevado durante várias horas. O resíduo foi lavado com 2 porções de 20 ml de etanol absoluto. A pasta etanol-NaCl foi filtrada, e a solução transparente foi evaporada até se obter um alcatrão. O peso foi de 620 mg (rendimento de 89% a partir do tripeptídeo protegido, 19% a partir de Fmoc-Cis(Benzil)-OH). Uma placa para TLC foi submetida a acetato/piridi-na/água/ácido acético 5/5/3/1 e foi visualizada com pulverização de ninhidrina e calor (Stewart, J. et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (1984) pp. 53-124, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Rf 0,66. Análise FIPLC revelou uma pureza de 74% por integração em área de material de absorção de UV (Fig. 1) Espectroscopia de Massa por bombardeamento de átomos rápido (FABMS) revelou um pico iónico a 434,2 M/e, consistente com o sal de monossódio tripeptídico. Outros picos de massa mais elevados estiveram também presentes, atrbuíveis em parte a peptídeo desprotegido de um modo incompleto. -52-

Em casos em que o éster de aminoácido C-terminal protegido com Fmoc foi usado em vez do éster de aminoácido C-terminal amino livre, este material foi desbloqueado com os mesmos processos que foram usados para desbloquear o dipeptídeo protegido acima referido, continuando então com a primeira reacção de acoplamento tal como foi acima referido. EXEMPLO 7

Derivatização para Resina Sepharose 0,66 g de Sepharose™ epoxi 6B (Pharmacia) foi feita inchar com 10 ml de água durante 15 minutos, sendo em seguida lavado duas vezes com 10 ml de água num funil de vidro aglomerado de 15 ml. Uma solução de 100-500 mg do tripeptídeo crú em 5 ml de etanol e 10 ml de água foi ajustada para pH 11-12 com NaOH 6 N num recipiente de cintilação de 20 ml com uma tampa de policone. A resina lavada foi adicionada, e foi agitada suavemente durante a noite num banho de água a 37°. O pH foi avaliado no dia seguinte e levado de novo a pH 11-12 com NaOH 6 N caso fosse necessário. Após um outro dia de agitação, a resina foi filtrada (o líquido contendo peptídeo foi acidificado com HC1 concentrado, evaporado e preservado) e lavado três vezes com 10 ml de água. Os grupos epoxi não funcionalizados foram revestidos embebendo a resina em 10 ml de água que continha 0,1 ml de etanolamina durante 1 hora. A resina foi então lavada três vezes com 10 ml de água, e uma amostra foi removida para análise. A porção restante foi lavada com 10 ml de NaOAc 0,1 M, NaCl 0,5 M para tampão pH 4,0, seguindo-se 10 ml de tris cloreto 0,1 M, NaCl 0,5 M para tampão pH 8,0. A resina foi armazenada a 4o C neste tampão para pH 8. EXEMPLO 8

Utilização do Composto como Sorventes de Afinidade

Foi construida uma série dos compostos da Fórmula (1) em que -53- YCO foi γ-Glu, AAC foi Gli, e X foi benzilo tendo na posição para, substituintes nitro, cloro, metoxi e metilo. Os análogos relevantes foram derivatizados para resina Sepharose tal como foi acima descrito e usados como sorventes de afinidade na separação de três enzimas GST humanos recombinantes. HPLC foi usada para medir as quantidades relativas dos enzimas que se ligam aos suportes.

Os resultados são indicados no Quadro 2.

Quadro 2

Substituinte %π %μ no2 95 5 Cl 89 11 OMe 70 17 Me 3 94

Quando a percentagem de isoenzimas π e μ foi registada contra os seus valores sigma (meta) foi obtida uma boa correlação linear. Contudo, foi obtida uma fraca correlação quando foram usados valores sigma (para). Os valores sigma (meta) constituem uma medida de efeito puramente indutivo; contudo, os valores sigma (para) dependem da ressonância em que o substituinte pode colocar cargas parciais num átomo no anel vizinho do ponto de ligação.

As recuperações da actividade de proteína e de GST (conjugando CDNB) nas fracções de eluição após purificação de afinidade de isoenzimas GST citosólicos de fígado de rato em vários compostos do invento são apresentadas no Quadro 3. -54-

Quadro 3

Recuperação de proteína e actividade de CDNB-coniugação após cromatografía de afinidade de citosol de fígado de rato sobre sorventes GSH e análogos de GSH seleccionados

Proteína Actividade

Sorvente íug) (% total) (umol/min/ml) (% total) HxGSH 60 3,0 1,32 67 S-L-GSH 51 2,5 1,21 61 yE-C(Cu)-G 49 2,5 0,64 32 yE-C(Bz)/5A 20 1,0 0,69 35 yE-C(Bz)-A 11 0,5 0,43 22 yE-C(Hx)-òG 4 0,2 0,10 5

Abreviatura: Cu = cumilo (a, a-dimetilbenzilo)

Sorventes S-L-GSH e HxGSH tradicionais revelaram ligação elevada e reconhecimento amplo de isoenzima. Os novos sorventes retiveram uma massa inferior dos isoenzimas de GST, sendo a recuperação para três dos novos sorventes inferior a metade dos sorventes tradicionais.

Em comparação com HxGSH, os novos sorventes não revelam uma correspondência directa de actividade CDNB conjugadora com recuperação de proteína. Por exemplo, sorventes yE-C(Bz)-/5A e yE-C(Bz)-A deram origem a 33% e a 16% da recuperação de proteína observada com HxGSH, mas as actividades de CDNB-conjugação foram de longe mais elevadas (52% e 33% respectivamente) após correcção para as propriedades inibidores do ligando de eluição.Pelo contrario, a recuperação de proteína por sorvente yE-C(Cu)-G diminuíram minimamente, enquanto que a actividade diminuiu em 50%. E bem sabido que diferentes isoenzimas de GST apresentam actividades específicas - 55 - individuais com CDNB. A discrepância entre recuperação de proteína e recuperação de actividade foi atribuída a diferenças na composição de isoenzima nas fracções de eluição de cada sorvente. Esta hipótese foi suportada por análise SDS/PAGE e por análise HPLV de fase reversa das fracções eluídas.

Fracções eluídas a partir dos sorventes indicados no Quadro 3 foram analisadas por SDS/PAGE seguindo-se coloração com prata. Os sorventes S-L-GSH e HxGSH ligaram proteínas que corresponderam ao padrão da banda electroforética observada previamente de subunidades de GST de fígado de rato. Os novos sorventes apresentaram diferentes padrões de banda. Por exemplo, o produto eluído yE-C(Bz)-/?A acima referido revelaram uma banda altamente enriquecida para isoenzimas da classe μ presuntivos. Como a classe π GST 7-7 é encontrada em baixos níveis no citosol do fígado de rato, outros tecidos de rato que é sabido expressarem níveis mais elevados deste isoenzima foram também testados. O padrão de gel GST de proteínas citosólicas de rim de rato eluído a partir do sorvente yE-C(Hx)-(j)G revelou uma proteína com a mesma migração molecular visto que a da subunidade 7 de GST é o único componente deste produto eluído, indicando que este sorvente é um reagente π-selectivo.

Uma proteína com uma migração molecular semelhante à de outro enzima dependente de GSH, glioxalase I, esteve também presente nos produtos eluídos a partir de yE-C(Bz)-A e de yE-C(Bz)-/5A, mas não foi detectada em produtos de eluição a partir de outros sorventes. Nestas experimentações HxGSH, que revelou anteriormente ligar-se a glioxalase I, não revelou quaisquer níveis detectáveis deste enzima dependente de GSH. É sabido que glioxalase I é um enzima que depende de metal, e a presença de EDTA nos tampões podem ter interferido com a actividade de ligação. -56- O elevado grau de pureza de proteínas com tamanho apropriado observado por SDS/PAGE das proteínas eluídas por afinidade sugeriu que as bandas observadas são realmente GSTs. Confirmação independente desta conclusão, com separação mais elevada, foi proporcionada por análises HPLC de fase reversa dos isoenzimas de GST nos produtos eluídos a partir de diferentes sorventes. A comparação com padrões GST purificados revelou que os isoenzimas eluídos a partir de novos sorventes correspondem a isoenzimas de GST conhecidos. Estes processos revelaram que a subunidade GST 3 eluiu aos 14 minutos, a subunidade 4 aos 17 minutos, a subunidade 7 aos 18 minutos, a subunidade 2 aos 23 minutos, a subunidade 6 aos 25 minutos, as subunidades la e lb aos 37 e aos 40 minutos, e a subunidade 8 aos 42 minutos. As subunidades 3, 4 e 6 são isoenzimas da classe μ, subunidades la, lb, 2 e 8 são isoenzimas da classe a, e a subunidade 7 é o enzima da classe π. Sorventes S-L-GSH e HxGSH, tal como era de esperar, ligam-se todos excepto 5-5, ao isoenzima da classe Teta. yE-C(Cu)-G aumentou a proporção de isoenzima 2, contudo ligou todos os isoenzimas em certo grau. Pelo contrário, outros sorventes foram muito selectivos na sua ligação dos isoenzimas. Por exemplo, yE-C(Bz)-/5A ligou-se de um modo selectivo aos isoenzimas 3 e 4 da classe μ, confirmando os resultados de SDS/PAGE.

As especificidades de uma série de novos sorventes para isoenzimas de GST citosólicos de rato são resumidas no Quadro 4. Algumas alterações estruturais do ligando produziram sorventes que não ligaram efectivamente qualquer isoenzima; alguns destes são indicados para plenitude.

Quadro 4 -57-

Separacão de isoenzimas de GST de rato por novos sorventes

Sorvente* Isoenzima subunidade especificidade Recuperação proteína (%) Ligação elevada, não selectiva Hx-GSH Al 1 3,0 S-L-GSH Al 1 2,5 Selectiva γΕ - C(Cu)-G 2 >3 >4 2,5 γΕ - C(BuBz)-G 2>4>3>7 1,7 γΕ - C(Bz)-A 4>3»6>2 0,5 γΕ - C(Bz)-,6A 3=4»2>6 1,0 γΕ - C(Pr)-H 4>3»2 1,0 γΕ - C(Pr)-A 3=4>2>1>6>7 1,4 γΕ - C(Hx)-<J)G 7»3=4 0,2 γΕ - C(Bz)-<|)G 7»2=3=4 1,3 Ligação fraca γΕ - C(Pr)-V Pequena: 2=3=4 0,5 γΕ - C(Hx)-V Pequena: 2-3-4 0,4 γΕ - C(Pr)-D Pequena: 3>2>4 0,2 γΕ - C(Hx)-D Nenhuma 0,1 γΕ - C(Bz)-H Nenhuma 0,1 * Abreviaturas tyal como no Quadro 1 e texto acima referidos, com excepção de Cu = cumilo (α,α-dimetilbenzilo) e <{>G = fenilglicina.

Alterações sistemáticas do resíduo Cis para provar o sítio H definido previamente (bolsa hidrofóbica) originaram ligandos capazes de se ligarem aos isoenzimas. Adang et al. (1990) não examinaram quaisquer análogos com modificações sistemáticas de grupos ligados à porção Cis. Alterações deste grupo tiveram efeitos sobre o nível de recuperação de proteína e sobre a especificidade de ligação de isoenzima em vários casos. Por exemplo, alteração da porção ligada a S de glutationa a uma estrutura semelhante à do hidroperóxido de cumeno, um substrato da classe a, tomou os sorventes preferenciais para o isoenzima 2-2 da classe a. Quando Ala foi usado como o aminoácido terminal, as -58- porções propilo e benzilo sobre Cis originaram sorventes específicos para isoenzimas da classe μ (Quadro 4). O sorvente propilo reteve mais proteína GST, em parte porque fixou isoenzimas tanto 3 como 4, em comparação com o sorvente benzilo, o qual é altamente específico para isoenzima 4. Quando His foi usado como o aminoácido terminal, a porção propilo originou especificidade elevada da classe μ, enquanto que a porção benzilo não originou qualquer ligação. Ao contrários destes sorventes, alterações da porção Cis de sorventes substituídos em Vai e em Asp não tiveram qualquer efeito sobre baixa ligação. Assim, o substituinte Cis pode ser importantes na modificação da especificidade global do sorvente tal como foi determinado pelo aminoácido terminal. EXEMPLO 9

Utilização dos Compostos como Inibidores da Fase de Solução Estratégia de Avaliação

Um conjunto de análogos peptídicos diversificados de um modo sistemático foram testados como inibidores específicos em relação ao enzima de glutationa-S-transferase (GST) humana. A potência dos melhores inibidores situa-se na gama 0,5 a 20 micromolar, com cinética indicativa de inibição competitiva com glutationa no sítio activo. A especificidade observada entre três isoenzimas GST derivados por recombinação tanto a baixa como a elevada potência variou entre insignificante e elevada (pelo menos 20 vezes em relação ao isoenzima seguinte mais sensível).

Estes compostos foram inicialmente avaliados a concentrações 1-mM contra três GSTs humanos recombinantes, um a partir de cada classe major de isoenzima, para se ver se iriam inibir a actividade enzimática, usando CDNB como um substrato espectrofotometricamente detectável. Para permitir o teste rápido de um amplo espectro de compostos, os parálogos usados neste estádio foram amostras sintéticas cruas e não foram caracterizados quanto a pureza antes -59- do teste, embora na maior parte dos cassos, o composto sintético pretendido representasse a espécie dominante, representando cerca de 50% da massa. A concentração 1-mM nominal foi baseada numa hipótese de 100% de pureza. O Quadro 5 apresenta os resultados destes testes de inibição para uma série de 51 análogos de parálogo de GSH.

Quadro 5

Inibição de actividade GST humana por análogos GSH

Inibição Percentual

No. Estrutura a 1 mMuM Cone, para CIsn PI -1 Al-1 Mla-la Pl-1 Al-1 Mla-la Análogos peptídicos de GSH apresentando tendência de inibição em relação a Pl-1: 1 yE-C(Hx)(IMe)-<|>-G9996833536450 2 yE-C(p-ClBz)-<|)G999289 3 yE-C(octil)-<(>G 96 92 90 100 1.000 300 4 yE-C(Bz-<|)G 85 68 30 5 yE-C(Hx)-R(-)-<|)G 75 62 4 6 yE-C(Hx)-S(+)-<t>G 71 61 48 4 12 100 7 γE-C(decil)-φG 70 60 60 300 300 500 8 yE-a-aminooctanóico-G 52 1 8

Análogos peptídicos de GSH apresentando tendência de inibição em relação a Al-1: 9 yE-C(octil)-G 99 99 99 7 1 1 10 yE-C(Hx)-G 93 99 99 75 25 40 11 yE-C(p-N02Bz)-<j)G 90 99 99 12 yE-C(octil)(IMe)-G 90 99 99 50 20 50 13 yE-C((Bz)-4ABu 70 70 95 575 575 570 14 G-yE-C(octil)-G 99 91 90 500 100 100 15 yE-C(Hx)-<j>G cíclico 53 85 80 16 yE-C(Bz)-4ABu 4 78 44 17 yE-C(2,5-dicloroBz)-G 50 70 90 1.150 570 570 18 yE-C(Bz)-V 35 64 74 19 yE-C(Bz)-D 12 62 57 900 900 20 yE-C(Hx)-4ABu 25 58 83 3.000 875 1.750 21 yE-C(Hx)-V 24 48 47 22 yE-C(Hx)-D 0 35 30 20.000 2.000 2.000 23 yE-C(Pr)-H 2 17 3 24 yE-C(Hx)-H 8 11 1 -60-

Quadro 5 (continuação)

Análogos peptídicos de GSH apresentando tendência de inibição em relação a Mla-la: 25 yE-C(p-ClBz)-G 85 98 99 200 20 9 26 ocE-C(Hx)-<|)G 78 80 99 27 yE-C(p-MeBz)-G 70 90 99 500 150 40 28 yE-C(Hx)-M 8 69 99 29 yE-C(p-MeBz)-/5A 55 65 99 800 600 20 30 yE-C(Bz)-M 0 25 99 1.00 1.000 25 31 yE-C(Bz)-<|)G cíclico 11 36 95 6.00 1.500 70 32 yE-C(3,5-difluoroBz)-G 70 70 95 575 575 570 33 yE-C(Bu)-G 91 865 93 48 106 21 34 yE-C(Trt)-A 46 30 93 35 yE-C(octil)-/iA 30 60 90 2.200 1.100 500 36 yE-C(p-cianoBz)-G 80 70 90 250 550 500 37 yE-C(t-Bu)-G 88 74 90 38 yE-C(p-BrBz)-G 60 50 90 1.000 1.140 300 38 yE-C(Bz)-G 26 53 84 40 yE-C(p-t-BuBz)-G 49 51 82 2.000 950 200 41 yE-C(Bz)-A 40 30 80 42 yE-C(Hx)-A 8 30 80 43 yE-C(Me-I) (Bz)-y6A 10 20 80 2.000 2.000 30 44 yE-G-C(Hx)-<|)G 30 45 7 45 yE-C(Cu)-G 38 25 74 3.000 1.500 400 46 yE-C(Pr)-A 13 46 62 ND 900 800 47 yE-C(Neopentil)-G 35 36 62 3.000 1.200 300 48 yE-C(p-FBz)-G 10 40 60 20.000 3.800 640 49 yE-C(Pr)-D ND 33 49 50 yE-C(Pr)-V 12 15 28 51 yE-C(Bz)-H 4 2 8 25.000 25.000 10.000

Abreviaturas tal como no Quadro 1 e texto acima apresentado, com excepção de:

Cone. = Concentração; ND = não detectado; CI5o = Concentração Inibidora causando 50% de redução na actividade; Bu = butilo; t-Bu = tert-butilo; Cu = cumilo (α,α-dimetilbenzilo); IMe = iodometilo; γΕ-α-aminooctanóico-G (composto 8) = yE-C(Hx)-G com C(x) substituído por um análogo sem enxofre; -61 - G-γΕ—C(octil)-G (composto 14) = G adicional no término N de yE-C(octil)-G; cíclico = términos N e C do tripeptídeo estão ligados de um modo covalente (ligação peptídica); yE-G-C(Hx)-<)>G (composto 44) = um G adicional é inserido entre G e C em yE-C(Hx)-<|>G.

No Quadro 5 os parálogos estão agrupados por selectividade de isoenzima GST humano, e em cada classe de selectividade estão ordenados por potência decrescente. Parálogos que apresentaram forte selectividade para os isozimas Pl-1 e Mla-la foram claramente identificados nesta descrição, mas não se encontrou qualquer novo inibidor selectivo para Al-1 para além dos que foram previamente descritos. Os critérios indicados para realizar a avaliação para além do teste de inibição à concentração de 1-mM foram: inibições de > 90% em qualquer isoenzima GST ou uma diferença > que 6 vezes na inibição entre um par de isoenzimas. O valor da CI50 para esses parálogos que satisfaziam os critérios iniciais é também apresentado no Quadro 5.

Um medição mais exacta da ligação de parálogos a isozimas de GST é obtida por meio de experimentações de competição de GSH a fim de determinar um valor Kj. Esses testes são realizados nos compostos que tinham potências de CI50 na gama dos 10 a 100 μΜ ou que apresentavam delectividades > 5 vezes entre isozimas, e para os quais foram produzidos compostos com > 90% de pureza. Se a inibição pelo parálogo for competitiva, então os valores Km para GSH na presença e ausência de inibidor poderá ser usada para determinar o valor KÍ5 ou constante de dissociação, entre o parálogo e o isozima de GST. Os valores da CI50 foram usados para estabelecer uma concentração apropriada de inibidor a fim de proporcionar uma inibição de grosseiramente 50% a GSH 1 mM. Dados obtidos na experimentação de competição com vários parálogos foram registados num registo de Hanes-Woolf. Linhas paralelas das condições inibidas e não inibidas num registo Hanes-Woolf indica que o parálogo interactua com o sitio GST-activo. Para a maior parte de combinações de parálogo e GST, -62- foi observado um estricto paralelismo. O valor Km obtido para GSH isoladamente nesta série completa de experimentações variou entre 0,4 e 0,6 mM, o que representou aproximadamente ordens de magnitude 10-100 vezes mais fracas do que as registadas para o parálogo mais potente. O Quadro 6 indica os valores de K, para este subconjunto de compostos interessantes.

Quadro 6

Inibição da actividade de GST por parálogos de GST purificados: Concentração K; micromolar determinada por ligação de competição com GSH

Estrutura _Valores K, α μΐΊ μ2-2 π γΕ - C(Hx)-G 0,84 2,0 36,0 10,0 γΕ - C(Hx)-(|)G 5,8 41,0 97,0 0,85 γΕ - C(Hx)-y6A 43,0 11,0 42,0 550,0 γΕ - C(Bz)-/5A 360,0 22,0 26,0 710,0 γΕ - C(Bz)-<|)G 20,0 25,0 31,0 0,45 γΕ - C(p-MeBz)-/5A 43,0 2,1 20,0 40,0 γΕ - C(p-ClBz)-(|)G 10 11 16 0,09 A maior parte destes compostos pareceu ser mais potente nestes estudos que nos testes de avaliação originais visto que novas preparações apresentaram pelo menos 90% de pureza. Uma outra contribuição resulta da definição aritmética de CI5o em comparação com K;; os valores são iguais apenas quando ambas as concentrações de GSH e de CDNB se aproximam de zero, o que não aconteceu no presente protocolo padrão. No que se refere a especificidade, as determinações mais exactas foram geralmente consistentes com os dados preliminares, embora em vários casos preferências relativas tenham sido modificadas. -63-

Estrutura Quantitativa/Relacões de Actividade

Seguindo processos químicos medicinais padrão, foram procuradas tendências na relação quantitativa estrutura/actividade (QSAR) destes compostos. Para esta finalidade, foi testada uma série de derivados n-alquilo de GSH. Resultados de uma exploração detalhada deste aspecto são resumidos no Quadro 7.

Quadro 7

Inibição de actividade de GST por aductos S-(n-alquil)-GSH: concentração micromolar requerida para inibição de 50%

S-(n-alquil)-GSH_Isozima GST C número Nome Pl-1 Al-1 Mla-la Cl Metilo 1.000 2.500 1.300 C2 Etilo 750 1.800 650 C3 Propilo 500 900 100 C4 Butilo 200 140 20 C5 Pentilo 100 10 5,0 C6 Hexilo 80 2,0 3,0 C7 Heptilo 20 1,5 1,5 C8 Octilo 10 1,5 1,5 C9 Nonilo 1,5 1,0 1,0 CIO Decilo 0,75 1,0 0,75

Abreviatura: C = Composto

Estes resultados revelam, em primeiro lugar, que a potência inibidora dos compostos aumenta com o comprimento da cadeia do grupo n-alquilo e, em segundo lugar, que este parâmetro não produz uma tendencia regular na selectividade do isozima. E surpreendente que os resultados obtidos para os compostos parálogos apresentados no Quadro 5 apresentem uma diversidade muito maior no padrão de inibição do que os obtidos para o conjunto de derivados de n-alquilo de GSH apresentados no Quadro 7.

Numerosas pequenas moléculas orgânicas foram também anteriormente referidas como sendo inibidoras da actividade de GST (Mannervik, B., et ai., CRC Crit Rev Biochem (1988) 23: 283-337), embora apenas alguns tenham sido caracterizados cuidadosamente no que se refere a isozimas humanos isolados. Visto que se esperava que as comparações destes compostos com as estruturas à base de peptídeos radicalmente diferentes fossem úiteis para um estudo QSAR mais detalhado, os testes desses compostos foram também realizados. Vários desses compostos revelaram potência e selectividade comparáveis às dos compostos à base de peptídeos. Os resultados são resumidos no Quadro 8.

Quadro 8

Inibição de actividade de GST por compostos não peptídicos (pequenos orgânicos): concentração micromolar requerida para 50% de inibição

Abreviatura Composto Isozima GST Pl-1 Al-1 Mla-la cb Azul Cibacron 0,4 4,0 1,5 dx Doxorubicina 700 80 500 ea Acido etacrínico 4,0 2,0 3,0 gs Acido gossipol acético 200 4,0 4,0 hm Hematina 1.000 2,0 5,0 rb Rosa bengala 8,0 0,5 1,0 sp Sulfobromoftaleina 20 25 5,0 in Indometacina >600 300 >600 eb Eosina b 4,0 2,5 2,0 ey Eosina y 3,5 5,0 30 -65-

Análise gráfica de dados sobre inibição

Os dados sobre inibição multidimensional (cada eixo representando o grau de inibição para um dos GSTs recombinantes) foram analisados num computador pessoal (PC) IBM-compatível pelo algoritmo de componentes principais em Pirouette, uma embalagem de software estatístico multivariado desenvolvido para dados químicos por Infometrix, Inc. (Seattle, Wash). Os componentes principais são os vectores próprios da matriz de covariancia com os valores próprios associados maiores. Como tal eles representam parâmetros compositos derivados dos eixos originais para satisfazer duas condições: (1) os principais componentes são dimensões (ortogonais) independentes, e (2) contribuem para a maior porção da variância no grupo de dados. Consequentemente, a projecção de dados num plano definido por componentes principais maximiza a clareza de visualização espalhando os dados para fora ao longo de dimensões de dispersão máxima. Pontos que se encontram próximos numa sua projecção apresentam, de um modo fiável, correlações no espaço original de maiores dimensões. São também registados valores alvo que representem compostos ideais postulados com factores de especificidade de 100 vezes e valores Ki de 0,1 -μΜ. Para esta análise, a potência de inibição foi definida como log (1/CI50) ou log 1/Kj) quando este valor mais exacto se encontrou disponível. A Figura 1 apresenta uma análise gráfica de dados de CI5o a partir dos Quadros 5, 7 e 8 combinados com os dados de Ki no Quadro 6. A fim de determinar este registo, as propriedades de inibição foram registadas primeiro num espaço tridimensional cujos eixos representam o grau de inibição para cada um dos três isozimas recombinantes. Os principais componentes da distribuição -66- dos dados foram então determinados (Massart, D. L., et al., Chemometrics: a textbook (1988), Elsevier, Amsterdam). Em termos simples, componentes principais são factores compósitos, derivados dos eixos originais, os quais são matematicamente optimizados para apresentarem correlações em dados multivariados apontados por pontos de registo ao longo de eixos escolhidos para maximizar dispersão. O registo apresentado é uma projecção dos dados para o plano definido pelo segundo e terceiro componentes principais. O primeiro componente principal é uma dimensão largamente representando potência, e a dispersão nesta propriedade é bem apresentada nos quadros. Escolhendo o segundo e terceiro principais componentes para a Figura 1 esclarece-se o factor da especificidade, que se pensa ser um aspecto igualmente importante de qualidade. Esse registo multivariado permite conveniente inspecção da qualidade (tanto da potência como da selectividade) dos reagentes testados. São também indicados no registo propriedades alvo definidas como especificidade de 100 vezes e Kj de 0,1 -μΜ. A análise multivariada das potências e selectividades dos inibidores que é apresentada na Figura 1 esclarece também vários outros aspectos interessantes. Em primeiro lugar, isso indica que o parálogo benzilo/fengli (composto 4, Quadro 5) aproxima-se bastante do objectivo de um inibidor Pl-1-específico. Em segundo lugar, os parálogos benzilo//?-ala (composto 30), 4-metilbenzilo//?-ala (composto 29), e benzilo/fengli cíclico (composto 31) são os mais selectivos para o enzima Ml a-la mas não se encontram tão próximos do objectivo como acontece para o enzima Pl-1. Em terceiro lugar, não foi descoberto qualquer novo parálogo Al-l-selectivo nesta análise. A análise de moléculas orgânicas pequenas revela que uma série de -67- potencias e de especificidades se encontram também disponíveis a partir desta classe de estruturas químicas. Muitos desses compostos mais eficazes são, contudo, corantes extremamente hidrofóbicos, não sendo assim provável que sejam clinicamente úteis devido a elevado potencial de ligação a proteínas em geral. Embora experimentações de competição com estes inibidores não tenham ainda sido feitas para determinar directamente se eles são inibidores competitivos, está a trabalhar-se para os converter em derivados de GSH com a esperança de se atingir uma potência e uma selectividade superior às disponíveis a partir dos compostos descritos neste artigo.

No plano de obtenção de inibidores mais eficazes, a análise dos dados por estatística multivariada, tal como é resumida na Fig. 1, deverão ser particularmente úteis para a definição de tendências estruturais. Finalmente, as tendências observadas de um modo empírico visualizadas deste modo deverão proporcionar conhecimentos para comparação com dados estruturais sobre GSTs, incluindo estudos usando cristalografia por raios X, ressonância magnética nuclear (RMN) de elevada resolução, e mutagenese dirigida.

Implicações Farmacológicas A diversidade de actividade de GST em tumores, tanto qualitativamente como quantitativamente, representa uma oportunidade terapêutica significativa para alvejar drogas quimioterapêuticas de preferência para tumores. Contudo, a mesma diversidade, coloca um desafio major para a química farmacêutica pelo facto da potência por sí só não ser suficientes para ser útil; selectividade entre um grupo de enzimas intimamente afins é também necessária. A abordagem por parálogos deste invento é bem apropriada para esse desafio. Tal como é demonstrado no presente trabalho, ligandos crús são úteis como inquéritos iniciais (Quadro 5). Contudo, avaliação fiável sobre propriedades inibidoras, requere cerca de 50 mg de compostos purificados (Quadro 6). Amostragem sistemática constitui assim uma estratégia muito útil para a limitação do trabalho de caracterização até um nível razoável.

Além disso, a gama de estruturas submetidas a amostragem contribui directamente para QSAR e estudos sobre correlação enzima-estrutura tendo como finalidade aspectos de identificação responsáveis por selectividade de isozima e por potência. Por exemplo, todos, com excepção de um, os inibidores mais selectivos para isozimas Ml a-la têm beta-alanina como o aminoácido C-terminal na porção GSH do parálogo. Ambos os inibidores mais selectivos para o isozima Pl-1 têm fenilglicina como o aminoácido C-terminal da porção GSH.

Os melhores inibidores obtidos neste estudo revelam uma gama de potência igual à do inibidor hexil GSH previamente estudado, o qual é o ligando padrão usado para purificação de afinidade de isozimas GST. A potência desses inibidores é também semelhante a ou melhor do que a do ácido etacrínico, o qual está sendo testado clinicamente como uma droga para potenciar a quimioterapia, e esta observação sugere que estes novos inibidores podem também ser úteis para a potenciação da quimioterapia. Por exemplo, expressão preferencial de Pl-1 foi referida numa gama de tumores, e um potenciador tendo como base o inibidor selectivo benzilo/fengli (composto 4) pode assim ser útil na terapêutica do cancro.

De entre os parálogos identificados por esta avaliação para a qual -69- foi determinado um valor Kj (Quadro 6), todos eles revelaram inibição competitiva com GSH indicando que eles são alvejados no sítio activo dos isozimas GST quanto ao seu efeito e, assim, que eles deverão afectar a actividade de GST contra substratos diferentes de CDBN. Uma série de agentes de alquilação são substratos para GST, e isozimas diferem de um modo significativo nas sua especificidade para estes substratos. Expressão diferencial de isozimas particulares em tumores individuais pode assim contribuir para variabilidade na resposta ao tratamento. Este problema pode ser ultrapassado por aplicação de parálogos apropriados deste invento, em primeiro lugar, para determinar complementos de isoenzima GST de tumores individuais, e assim para identificar agentes citotóxicos aceitáveis menos susceptiveis aos isozimas GST predominantes de um dado tumor e, em segundo lugar, para proporcionar inibidores de parálogos oferecendo a maior potenciação de uma droga seleccionada por inibição de qualquer actividade de GST que esteja ainda presente contra a droga.

Para inibição de actividades de isozima GST em células vivas, por exemplo para potenciar drogas citotóxicas, os inibidores identificados neste exemplo requerem modificações de acordo com o presente invento, a fim de melhorar a permeação da membrana celular, tal como foi acima descrito e exemplificado no Exemplo 11, mais abaixo. EXEMPLO 10

Utilização dos Compostos em Cromatografia de Afinidade HPLC de GSTs de Fígado Humano

Este exemplo descreve um método rápido para a determinação dos isoenzimas glutationa S-transferase (GST), por exemplo, no fígado humano, usando um novo suporte de afinidade para HPLC. Citosol de fígado é injectado diariamente para uma coluna HPLC (0,46 x 5 cm) contendo um suporte com um ligando de afinidade ligado de um modo covalente (S-octil glutationa) específico para isoenzimas. Proteínas citosólicas contaminantes são removidas num passo de lavagem. Os isoenzimas são eluídos com um gradiente linear de um ligando de afinidade diferente na fase móvel. Coincidindo com o gradiente de ligando de afinidade, é aplicado um gradiente salino (cloreto de sódio 0-200 mM). Deste modo os isoenzimas são fraccionados em homodímeros e heterodímeros enzimaticamente activos. A composição monomérica e dimérica dos isoenzimas fraccionados é determinada por SDS-PAGE; ELISA e cromatografia de fase reversa. Para um fígado são detectadas três subunidades de isoenzima da classe Alfa, formando três heterodímeros e dois homodímeros. Cinco fígados são analisados e verifica-se que o homodímero Al-1 é o isoenzima predominante da glutationa S-transferase. São também detectadas quantidades menor de isoenzimas da classe Pi e de Mu. Este método de cromatografia de afinidade de elevada performance sem desnaturação reduz o tempo de análise por um factor de dez quando comparado com outros métodos de análise de afinidade para as glutationa S-transferases.

Um método cromatográfico disponível para a separação de uma gama de glutationa S-transferases (GSTs) numa forma dimérica, activa, é a cromatografia de afinidade usando eluição isocrático e/ou de gradiente com um ligando oposto. Este método combina a purificação dos GSTs a partir do citosol por cromatografia de afinidade com uma separação dos GSTs individuais. A separação de homodímeros e de heterodímeros de GST foi previamente realizada usando esta técnica com S-hexil glutationa ou com glutationa como o ligando de -71 -

afinidade ligado a agarose. Devido ao grande diâmetro de partícula e às taxas lentas de fluxo inerentes a geles de agarose, o tempo de fraccionamento para estes estudos foi de aproximadamente 25 horas (Hayes, J. D., et al., (eds.), Glutathione S-Transferases and Drug Resistance. Taylor and Francis, London, 1989, p. 17) que explica a razão pela qual esta técnica não é usada para a análise de rotina de GSTs. Uma coluna HPLC contendo glutationa imobilizada como o ligando de afinidade foi descrita para a purificação preparativa de GSTs (LeCreta, F. P., et al., J Chromatog (1988) 434: 83-93), embora não tenha sido feita qualquer tentativa para separar os isoenzimas individuais.

Este novo método de HPLC deste invento uriliza uma fase estacionária com um ligando de afinidade de GST (por exemplo, S-octil glutationa) ligado de um modo covalente a partículas HPLC contidas numa coluna HPLC analítica.

Matriz de afinidade. A síntese da matriz de afinidade segue o processo geral de Sundberg and Porath (J Chromatogr (1974) 90: 87. HEMA (metacrilato de hidroxietilo) BIO 1000, éter diglicidilico de 1,4-butanodiol e hidróxido de sódio 0,6 M contendo 2 mg/ml de boro-hidreto de sódio (0,03/1/1, p/v/v) foram misturados durante a noite. As partículas foram filtradas e lavadas com água, álcool etílico e acetona. A 700 mg das partículas secas foi adicionado S-octil glutationa (75 mg) dissolvida em 3,5 ml de carbonato de sódio 0,5 Μ. A suspensão foi misturada durante aproximadamente 90 horas. Após filtração as partículas foram lavadas com (i) cloreto de sódio 1 M, fosfato de sódio 0,1M (pH 9), (ii) cloreto de sódio 1 M, acetato de sódio 0,1 (pH 4,5), (iii) água, (iv) álcool etílico e (v) acetona.

Embalagem de colunas de HPLC. O material de afinidade (650 mg) -72- foi transformado em pasta em 20 ml de água e foi embalado sob pressão elevada em colunas de aço inoxidável 0,46 x 5 cm. (Supelco Co.,Bellefonte, PA). As matérias primas da coluna foram de 2 pm (diâmetro médio do poro) de titânio encerrado num anel CTFE (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA). Uma bomba líquida Haskell (Burbank, CA) DSTV-122 foi usada para proporcionar o solvente accionador (água) durante o processo de embalagem. As colunas foram embaladas a 2.000 psi com 50 ml de água e em seguida a 4.000 psi com 50 ml de água.

Uma economia significativa no tempo de análise de GST foi conseguida realizando a separação na nova embalagem de HPLC aqui descrita. Amostras de fígado foram analisadas em 2 horas, mais de dez vezes mais rapidamente do que separações semelhantes usando suportes de afinidade à base de Sepharose-6B. Passos de lavagem e de eluição foram significativamente de duração mais curta com o método HPLC. Na análise de cinco fígados humanos (Quadro 9, mais abaixo) foram tiradas vantagens da estabilidade da pressão da matriz de HPLC conduzindo o passo de lavagem a 1,5 ml/min. Taxas de fluxo de pelo menos 2 ml/min podem ser toleradas neste sistema sem perda de isoenzimas GST ligados por afinidade. A elevada separação de afinidade de resolução dos isoenzimas GST aqui descritos dependem da aplicação simultânea de dois gradientes de concentração. Um gradiente consistia numa concentração aumentando de um modo linear de um parálogo de glutationa, por exemplo TER106 (isto é, γΕ-C(Bz)-/íA=, ou S-butil-glutationa, sendo ambos inibidores competitivos dos GSTs (ver Exemplo 9, mais abaixo). No passo de carga, um complexo GST com um ligando de afinidade ligado de um modo covalente à fase estacionária. Como a concentração do inibidor competitivo (TER106 ou S-butil glutationa) aumenta -73- durante o passo de eluição, a GST distribui-se de um modo crescente para a fase móvel e finalmente é eluída. A ordem de eluição de uma mistura de GSTs é uma função complxa das suas afinidades tanto para o ligando de afinidade imobilizado como para o inibidor competitivo na fase móvel. Por exemplo uma modificação na ordem da eluição foi observada ao comparar a diferença nos perfis de eluição de GST usando dois diferentes ligandos de eluição. A eluição com S-butil glutationa em comparação com a eluição com TER 106 deslocou o isoenzima da classe Mu para um pico retido mais longamente, amplo, em comparação com os picos da classe Alfa. Além disso, a eluição com S-butil glutationa originou uma coeluição de Ax-y e de Ay-y que foram separados com eluição com TER106. Foi necessária uma concentração duas vezes mais elevada de TER106 em comparação com S-butil glutationa para produzir cromatografias semelhantes, reflectindo as suas diferentes afinidades para os isoenzimas. O segundo gradiente foi um gradiente salino que foi aplicado de um modo coincidente com o gradiente de ligando. Sem este gradiente os primeiros três picos foram coeluídos. Assim esta separação dependeu tanto do gradiente de afinidade como do gradiente salino. O gradiente salino poderá ter actuado para ultrapassar interacções iónicas entre as proteínas e o ligando de afinidade ligado à fase estacionária, S-octil glutationa, que se esperava que tivesse uma carga negativa líquida com pH 6,0. A recuperação de actividade de conjugação CDNB eluído com um ligando de afinidade a partir da coluna de afinidade apresentou uma valor médio de 76% para três fígados enquanto que o rendimento médio da actividade total (actividade eluída de ligando de afinidade mais actividade não retida) foi de 83%. O rendimento da actividade de conjugação CDNB a partir da coluna de -74- afinidade aqui descrita foi comparável à descrita em relatórios anteriores usando outros sistemas. A proporção de actividade não retida para três fígados variou entre 3% e 13%. Para assegurar que a reacçâo de actividade não retida não se deva a um problema de sistema tal como saturação de coluna, porções de citosol a partir do mesmo fígado (L005N) foram processados em cinco cromatografías consecutivas. A fracção de actividade não retida teve uma média de 2,7% com valores elevados e baixos de 3,5% e 2,3%. A partir disto concluiu-se que as variações de actividade não retida para diferentes amostras de fígado constituíram uma característica da amostra de fígado.

As identidades de isoenzimas de GST nos picos major foram identificadas por electroforese SDS-PAGE, ELISA e HPLC de fase reversa. LOOóN de fígado parece conter três formas de subunidades Alfa. O cromatograma de fase reversa dos GSTs isolados a partir de fígado L006 apresenta dois picos que são eluídos após Al. Estas últimas proteínas de eluição foram, a título experimental, designadas como subunidades Ax e Ay, tendo como base posteriores análises de subunidades.

Para a análise de fígados humanos, S-butil glutationa foi escolhida como o ligando de eluição visto ter separado GSTs da classe Mu da classe Alfa. Além disso fígados diferentes de LOOóN tinham apenas Al ou nalguns casos Al mais apenas um de entre subunidades Ax ou Ay de modo que a separação dos dímeros da classe Alfa proporcionada por TER 106 não foi requerida. Os cinco fígados humanos foram analisados quanto ao conteúdo dimérico de GST por cromatografía de afinidade e para conteúdo monomérico por cromatografia de fase reversa (Quadro 9). -75-

Quadro 9

Afinidade e Análise de Fase-Reversa de Fígado Humano Separação por Afinidade! Fíaado Pl-1 Ax-y Ay-y Al-y Al-x Al-1 Mlb-lb L006 minor2 + + + + menor L007 menor + + - + - L004 menor + - + + menor L005 menor - - menor + + L002 - - menor - + menor L006 Pi menor Separação de Fase Reversa Mlb AI Ax menor + + Ay + L007 menor - + - + L004 menor menor + + menor L005 menor menor + menor menor L002 menor menor + - menor 1 Tampões de Cromatografia de Afinidade; A, Fosfato de Sódio 10 mM (pH 6,0); B, Cloreto de Sódio 200 mM em A; C, S-butil Glutationa 20 mM em B. Condições: 0-5 minutos, A, 0,lml/minutos; 5-21 minutos, B, 1,5 ml/min; 21-34 minutos, A, 1 ml/min; 34-35 minutos, A, 0,1 ml/minutos; 35-155, 0-42% C, 0,1 ml/min. 2 Símbolos: +, Superior a 10% da área total de pico; menor, Inferior a 10% da área total do pico; -, Não detectado. A quantidade de citosol injectado na coluna de afinidade foi equivalente a aproximadamente 20 g de fígado. Em relatórios prévios as formas -76- predominantes de GST no fígado humano foram monómeros AI e dímeros Al-1. Foi este o caso de cinco fígados aqui examinados. Quando subunidades Ax ou Ay foram detectadas em quantidades apreciáveis os heterodímeros correspondentes foram também encontrados. Para L007N que tinha quantidades apreciáveis de monómero Ay, tanto o homodímero Ay-y e o heterodímero Al-y como Al-1 foram detectados. Fígado humano L005N que apresentava Ax mas apenas uma quantidade menor de Ay apresentou Al-x e Al-1 mas não se detectou Ax-x no caso de LOOóN. Quantidades menor de PI foram detectadas por análise de fase reversa nas cinco amostras e foram também detectadas por análise de afinidade em quatro de entre cinco fígados. Investigações prévias revelaram também que Pi constituia um componente menor no fígado humano. Pequenas quantidades da classe Mu de GSTs foram detectadas pelo método de fase reversa. Devido a um fraco formato de pico na cromatografia de afinidade, a detecção da classe Mu é difícil quando constitua apenas uma porção menor do conteúdo total de GST.

Este novo sistema de cromatografia de afinidade usando tecnologia HPLC apresenta vantagens significativas em relação a sistemas de afinidade convencionais em gel mole para a análise do conteúdo dimérico de GST de tecidos. O tempo de análise é reduzido por um factor de dez. Além disso a sensibilidade para este sistema de afinidade é maior porque os volumes de pico para afinidade HPLC são apenas de cerca de 0,5 mililitros em comparação com 50-100 mililitros ao utilizar geles moles convencionais. Esta técnica também apresenta a vantagem de combinar a limpeza e a análise da amostra num passo único. Outras técnicas tais como HPLC de fase reversa, focagem cromatográfíca ou electroforese requerem um passo de afinidade separado para considerar purificação dos GSTs antes da análise final. -77-

Ctromatografía de afinidade usando gradientes de um ligando oposto no eluente constitui uma técnica de separação poderosa. A variação do ligando biospecífíco no eluente origina separações cromatográficas apresentando selectividades diferentes. As selectividades diferentes observadas são devidas ao conjunto único de constantes de ligação que existem entre ligandos nas suas associações com vários isoenzimas. Foi este o caso para os GSTs ao comparar perfis de eluição usando TER106 ou S-butil glutationa como o ligando oposto. Muitos mais compostos do presente invento, assim como outros ligandos, interactuam com GSTs, e qualquer um deste poderá originar uma separação única permitindo uma separação habitual a ser desenvolvida. Em particular, os métodos analíticos aqui referidos podem ser rapidamente aumentados proporcionalmente para isolamento preparativo de GSTs particulares de interesse. EXEMPLO 11

Utilização dos Compostos do Invento na Potenciação de Agentes Citotóxicos em Células Humanas

Este exemplo descreve a potenciação em células de tumor humano de um agente citotóxico correntemente usado em quimioterapia do cancro por inibidores GST incluindo compostos do presente invento, assim como eficácia intracelular aumentada de formas esterificadas desses compostos. Células HT-29 (adenocarcinoma do colon humano) foram obtidas a partir de Dr. Roberto Ceriani (Câncer Research Fund of Contra Costa County, Walnut Creek, CA) e foram usadas em fase log de crescimento a não ser que seja especificado de um modo diferente. Clorambucil (CMB) foi obtido a partir de Sigma (St. Louis, MO) e foi dissolvido em etanol a 100%. Todos os inibidores de -78- GST foram dissolvidos em etanol, DMSO, ou água umediatamente antes da utilização. A mesma quantidade de solvente adicionado ao meio de cultura serviu como controlo do veículo.

Num ensaio clonogénico modificado para citotoxicidade, células foram suspensas a 2 x 105 células/ml em meio sem soro na presença de veículo ou inibidor. Inibidores foram usados em concentrações que originaram uma sobrevivência de > 90% quando comparada com células tratadas com veículo. Células foram incubadas durante 2 horas, sendo em seguida adicionadas doses variáveis de CMB. No fim de uma segunda incubação de 2 horas, células foram dilui das até 7,5-10 x 103/ml em meio contendo soro e colocadas em placa em quadriplicado a 200 μΐ/recipiente em placas de microtitulação Microtest III.

Placas foram incubadas durante 6 dias e foram avaliadas por um método de azul de metileno modificado. Resumidamente, células foram fixadas com 1,25% de glutaraldeido em PBS sendo então coradas com 0,05% de azul de metileno em água destilada. Placas foram lavadas várias vezes em água destilada a fim de remover corante não retido e corante retido foi solubilizado de novo em HC1 0,03 N. Placas foram lidas várias vezes em água destilada para remover corante não retido e corante retido foi solubilizado de novo em HC1 0,03 N. As placas foram lidas a 650 nm num leitor de placa Molecular Devices Vmax (Molecular Devices, Redwood City, CA). Valores de CI5o (concentração inibidora causando redução de 50% na viabilidade das células) foram determinados para a droga na presença ou ausência de inibidor a partir de curvas de dose-resposta. Um factor de modificação de dose (DMF), uma medida de potenciação de citotoxicidade, foi calculado para cada inibidor dividindo o valor da CI5o de CMB sem tratamento inibidor pelo valor da CI5o para CMB com tratamento inibidor. -79-

Os resultados de testes de potenciação com vários inibidores de GST em culturas de células HT29 são resumidos no Quadro 10.

Quadro 10

Potenciação de Citotoxicidade de Clorambucil em Células Humanas por Inibidores de GST e Seus Ésteres r

Composto Afim Ester Dietílico

Dose Dose testadab testadab Inibidor de GST (Na)! (μΜ) DMFC (μΜ) DMFC γΕ-C (9) N.D. - 5 0,86±0,02 γΕ-C (6) 100 1,1 ±0,02 12,5 1,27±0,02 γΕ-C (4) 100 1,08±0,01 12,5 1,65±0,04 γΕ-C - 200 12,5 1,21 ±0,01 a Número de composto no Quadro 5, Exemplo 9, acima referido. b Dose do teste foi determinada a partir da curva de toxicidade e foram usados análogos na dose em que sobrevivência > 90% ocorreu na presença do análogo isoladamente. c Factor de modificação de dose. Valores são média ± D.P. de 2-3 experimentações.

Os resultados nos Quadros 10-12 revelam que vários análogos de GSH que se verificou serem inibidores de GSH, tal como é indicado no Exemplo 9, Quadro 5, também potenciam a destruição de células tumorais humanas em cultura por CMB que é um substrato para vários GSTs. Além disso, tal como é indicado no Quadro 10, esta potenciação é grandemente aumentada por esterificação que se pretende que aumente a fixação dos inibidores GST. Assim, γ E-C(Bz)-<f>G (composto 4, Quadro 5) a 100 μΜ não aumentou a morte celular por -80- CMB, reduzindo a concentração de CMB necessária para morte celular de 50% por um DMF de 1,08. Pelo contrário, o éster dietilico do composto 4 a apenas 12,5 μΜ aumentou a citotoxicidade de CMB por um factor de 1,65.

Expressão preferencial de PI-1 foi referida numa gama de tumores humanos. No presente estudo a eficácia da potenciação de CMB de vários inibidores GST testados correlacionaram-se directamente com as suas potências como inibidores do isoenzima GST da classe π humano, Pl-1, tal como é indicado no Quadro 11.

Quadro 11

Correlação de Fileira de Factores de Modificação de Dose de Clorambucil de Inibidores GST com valor K para Inibição de GST Humano Pl-1

Inibidor No.a Valor Ki relativo de composto Ordem de DMFb de DEE Ordem de fileira γΕ - C(Bz)-<|>G (4) afim 1 fileira 1 1,65 1 γΕ - C(Hx)-<|>G (6) 2,1 2 1,27 2 γΕ - C(naftil)-G - 3 3 1,21 3 γΕ - C(octil)-G (9) 4,8 4 ,86 4 a Número de composto no Quadro 5, Exemplo 9, acima apresentados b Factor de modificação de dose de éster dietilico. Os valores são média ± D.P. de 2-3 experimentações. O efeito de esterificação ou de amidação dos compostos da Fórmula (1) sobre a sua potenciação de clorambucil e células HT-29 foi também determinado. O factor de modificação da dose foi determinado para o éster -81 - dietílico, a diamida, e o éster/amida de yE-C(Bz)-<|)G em concentrações relevantes. O diéster revelou uma modificação 1,65 μ 0,04 da toxicidade de clorambucil a 12,5 μΜ; a diamida revelou modificação 1,0 numa única experimentação a 200 μΜ; o híbrido éster/amida revelou uma modificação de 1,45 ± 0,16 a uma concentração de 50 μΜ. Os resultados para o éster dietílico e o híbrido éster/amida são apresentados como a média ± D.P. de três experimentações.

Octil G e Benzil PG foram testados num ensaio clonogénico padrão usando três linhagens celulares: HT4-1, um subclone de HT-29; SKOV-3 um carcinoma ovárico, e VLB, uma variante resistente a vinblastina de SKOV-3. Três drogas quimioterapêuticas, clorambucil, adramicina e mitomicina C foram usados como os agentes tóxicos. Nesses ensaios, as células foram semeadas a 300 células/recipiente em 2 ml de meio em placas com 6 recipientes na presença dos compostos do invento como ésteres dietílicos. Os compostos foram usados em concentrações que originaram mais de 85% de sobrevivência em comparação com controlos. Após incubação durante 1-2 horas para permitir que as células se prendessem, foram adicionadas várias doses dos agentes quimioterapêuticos. Pelo menos três recipientes de replicação foram colocados em placas para cada condição de teste e as placas foram incubadas durante duas semanas. Colónias foram fixadas em etanol a 95% e foram coradas com violeta cristal para contagem de colónias. Valores de CI50 foram determinados para o agente quimioterapêutico na presença ou ausência do composto do invento e factores de modificação da dose foram calculados dividindo o valor de CI50 de droga sem o composto do invento pelo valor da CI5o da droga com o composto do invento. Os factores de modificação obtidos em cada protocolo são indicados no Quadro 12. -82-

Quadro 12

Capacidade de análogos de GSH seleccionados para potenciar a toxicidade da droga tal como é demosntrado num ensaio clonogénico

Linhagem Celular Análogo de GSH Clorambucil DMFa para: Adriamicina Mitomicina C HTR - 1 Éster dietílico de benzil-PG (25 μΜ) 3,28 1,2 n.d.b Éster dietílico de octil-G (5 μΜ) 1,74 1,13 1,56 SKOV - 3 Éster dietílico de benzil-PG (25 μΜ) 1,24 1,14 1,03 Éster dietílico de octil-G (2,5 μΜ) 1,03 1,24 (@5 uM)c n.d.b VLB Éster dietílico de benzil-PG (25 μΜ) N.D. d 2,5 ,82 (@5 uM)c Éster dietílico de octil-G (5 μΜ) N.D.d 1,06 1,63 a Factor de modificação da dose. b Sem dados devido a toxicidade do análogo. c Dose do teste foi diferente das doses indicadas à esquerda. d Não determinados. -83-

Tal como é indicado no quadro, foi obtida modificação significativa quando foi usado clorambucil como a droga versus células HT4-1 na presença de 25 μΜ do éster dietílico de benzil-PG. Modificação significativa foi também conseguida em células VLB quando tratadas com adriamicina na presença de 25 μΜ do mesmo composto. A Figura 2a ilustra os resultados para várias doses de clorambucil e o efeito modificador de 25 μΜ de éster dietílico de benzil-PG. Os quadrados abertos (□) representam apenas clorambucil, os circulos fechados (·) clorambucil na presença do composto do invento. Tal como se pode observar na Figura 2a, a taxa de sobrevivência é acentuadamente diminuída quando o composto do invento é adicionado. A Figura 2b confirma que o éster dietílico é necessário para penetrar as células. Células HT4-1 foram testadas quanto a sobrevivência na presença de PG benzilico (quadrados fechados, ) ou do seu éster dietílico (círculos fechados, ·). G dietílico não esterificado não tem, substâncialmente, qualquer efeito sobre essas células enquanto que o éster dietílico é claramente tóxico.

Exemplo 12

Efeitos Metabólicos dos Compostos

Os efeitos metabólicos dos compostos sobre células HT-29, relacionados com toxicidade foram testados usando um Cytosensor Microphysiometer produzido por Molecular Devices, Inc., Menlo Park, CA e descrito em McConnell, H.M. et al. Science (1992) 257: 1906-1912 e por Wada, H.G. et al. AATEX (1992) !: 154-164. Modificações no pH do meio de cultura são medidas como uma função de metabolismo celular. Taxas de acidificação do pequeno volume de líquido fluindo sobre as células correlacionam-se com o -84- número de células vivas na câmara de reacção; uma redução da taxa de acidificação reflete números de células sobreviventes.

Nesta ilustração, células HT-29 foram colocadas em placa a 4xl05 células/câmara num meio contendo 10% de soro de vitelo fetal. Após 16-18 horas o nível de soro foi reduzido para 1% e as células foram mantidas durante mais 18 horas. Células foram então expostas quer a ácido etacrínico (50 μΜ), a éster dietílico de benzil-PG (20 μΜ) quer a um veículo (0,1% de etanol) durante 4 horas. O meio foi então substituído com meio com capacidade de tampão baixo sem soro e foi iniciada análise com Microphysiometer. Metade das câmaras foram expostas a 100 μΜ de clorambucil e a outra metade a veículos (0,1% de etanol). As taxas de acidificação foram monitorizadas durante 16 horas e os dados foram expressos como percentagem das taxas de acidificação basal (100%).

Os resultados são indicados na Figura 3. Nem o éster dietílico de PG fenílico nem o ácido etacrínico isoladamente tiveram qualquer efeito apreciável sobre as taxas de acidificação; contudo, tanto o pretratamento com ácido etacrínico como o pretratamento com o éster dietílico de benzil-PG potenciaram o efeito de clorambucil. Na figura, os símbolos abertos reflectem nenhuma adição de clorambucil; os símbolos fechados refletem adição de clorambucil; os símbolos fechados refletem adição de clorambucil; os quadrados refletem o pretratamento com veículo, os triângulos refletem o pretratamento com ácido etacrínico, e círculos refletem pretratamento com éster dietílico de benzil-PG.

Exemplo 13

Análise GST de Várias Linhagens Celulares

Perfis de GST de linhagens celulares usadas nas análises anteriores foram realizados como se segue: células foram recolhidas, lavadas duas vezes em -85- meio sem soro, lavadas uma vez em PBS sem cálcio magnésio, e em seguida os peletes foram congelados subitamente e armazenados a -80° C. As células congeladas foram homogeneizadas tal como foi descrito por Castro, V.M. et al., Biochem J (1993) 292: 371-377 em fosfato de sódio 10 mM, pH 7,0; KC1 0,16 M, Pefabloc SC 100 μΜ (Central Chem, Inc., Stamford, CT), leupeptin 1 μΜ (Sigma), EDTA 2 mM e ditio-3-itol 2 mM. Os GSTs foram isolados a partir de fracções sistólicas por cromatografía de afinidade usando coluna para HPLC. Análise de fase reversa dos GSTs numa coluna HPLC de octilo (25 cm x 4,6 mm, VWR Scientific), J.T. Baker 7105-00 Wide-Pore, determinações de proteína e determinação de actividade de conjugação de CDNB foram realizadas tal como foi descrito por Castro, V.M. et al. Biochem J (1993) 292: 371-377. Os resultados são apresentados no Quadro 13.

Quadro 13

Análise HPLC de fase reversa de GSTs citosólicos expressa em linhagens de células tumorais apresentando resistência da droga a agentes de alquilacão

Percentagem Total de Proteína GST

Linhagem Celular PI A2 M2 33 kD 27 kD r Area de Proteína Total1 Actividade Total CDNBb HT-29 82,4 0,9 3,0 13,7 - 1.645 4.996 HT4-lc 83,9 - - 16,1 - 1.388 5.021 SKOV-3 48,9 12,0 1,5 34,6 3,0 732 2.815 VLBd 67,5 17,4 - 15,1 - 1.671 4.757 1

Valores são expressos como área de pico = mV-seg/mg de proteína cistosolica. b Valores são expressos como mOD/min/mg de proteína citosólica. c Subclone HT-29 retendo sensibilidade de tipo selvagem a ácido etacrínico. d Subclone resistente a vinblastine de SKOV-3. -86-

Os resultados revelam que todas as linhagens celulares expressam Pl-1 como um isoenzima GST predominante. Células SKOV-3 e VLB também expressam níveis moderados de A2-2 mas verificou-se que este isoenzima existia apenas em quantidades vestigiais em células HT-29. Não foi detectavel em células HT4-1. Níveis muito baixos de MT2-2 foram detectados em HT-29 e SKOV-3. Proteínas 33 kD e 27 kD, identificadas como enoil Co-A isomerase e GST-M3 respectivamente, são também encontradas nestas células.

Exemplo 14

Estimulação de Progenitores deMacrófagos Granulócitos (GM) da Medula Óssea

Os compostos do invento, quando esterifícados de modo a serem capazes de penetrar células, também estimulam a produção de progenitores GM na medula óssea quando administrados a mamíferos. Num ensaio ilustrativo, três ratinhos B6D2Fi foram tratados com várias doses de benzil-PG intraperitonealmente. Medulas ósseas femorais foram recolhidas 24 horas mais tarde e ensaiadas para GM-CFU pelo método de East, C.J. et al. Câncer Chemother Pharmacol (1992) 3L 123-126. Foi obtido um aumento no número de colónias de um modo dependente da dose até uma dosagem de 90 mg/kg de benzil-PG. Estes resultados são apresentados na Figura 4. A 90 mg/kg, aproximadamente 275 colónias/104 células nucleadas de mais de 50 células foram obtidos comparados com cerca de 140/104 colónias de células nucleadas para controlos.

Exemplo 15

Potenciação de Toxicidade de Melfalan in vivo

Em ratinhos scid machos foram implantados tumores HT4-1 a partir de ratinhos dadores. Quando os tumores atingiram aproximadamente 100 -87- mm3, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente por seis grupos de tratamento e foram distribuídos durante sete dias como se segue: 1. 5 mg/kg de melfalan; 2. 10 mg/kg de ácido etacrínico; 3. 69 mg/kg de éster dietilico de benzil-PG; 4. 5 mg/kg de melfalan + 10 mg/kg de ácido etacrínico;

5. 5 mg/kg de melfalan + 60 mg/kg de éster dietilico de benzil-PG 6. apenas veículo.

Os ratinhos foram monitorizados quanto a modificações do peso e quanto a volumes tumorais determinadas por medição com calibradores. O crescimento do tumor foi monitorizado até o tamanho médio do tumor atingir 1.500 mm3 para todos os grupos com excepção de melfalan com ácido etacrínico. Este grupo nâo conseguiu atingir este volume mesmo após 72 dias.

Os resultados foram computorizados em termos de volume do tumor na experimentação como uma percentagem de volume do tumor de controlo (isto é, no grupo que recebeu apenas veículo). No grupo 1, que recebeu apenas melfalan, os tumores apresentaram aproximadamente 75% do volume dos controlos. No grupo 5 quando o éster dietilico de benzil-PG foi administrado juntamente com o melfalan, o volume médio do tumor foi de aproximadamente 55% do volume do controlo. Para o grupo 4 que recebeu uma combinação de melfalan e de ácido etacrínico, os volumes foram aproximadamente 35% do volume de controlo. Assim, tanto o ácido etacrínico como o éster dietilico de benzil-PG potenciaram os efeitos de melfalan. (As medições do volume foram registados na altura em que os tumores de controlo atingiram 1.500 mm .)

JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industriai RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Lisboa, 17 de Agosto de 2000

Claims (22)

1. -1 -

   J REIVINDICAÇÕES 1. Um composto da fórmula íl) Y-CO-NHCHCO-AAç CH2-Z-(X)n; e seus ésteres, amidas e ésteres/amidas misturados do tipo alquilo (1-10C), tipo alquenilo (1-10C), e tipo arilalquilo (7-12C); em que Z é seleccionado de entre o grupo consistindo em S, O, e C; n é 1, 2 ou 3; em que quando ZéOouSené 1, X é uma porção hidrocarbilo (1-20C) mono-ou di-substituída contendo facultativamente 1 ou 2 heteroátomos adjacentes (O, S ou N), e em que a referida substituição é seleccionada de entre o grupo consistindo em halo, -NO, -Ν025 -NR2, OR e SR, em que cada R é, de um modo independente, H ou alquilo inferior (1-4C); em que Z é S e n é 2, um X é tal como acima e o outro X é alquilo inferior (1-4C); e em que quando Z é C e n é 3, um X é tal como foi acima defmdio e os outros dois X são, de um modo independente, H ou alquilo inferior (1-4C); Y-CO é seleccionado de entre o grupo consistindo em y-Glu, β-Asp, Glu, Asp, γ-Glu-Gli, β-Asp-Gli, Glu-Gli, e Asp-Gli, e AAc é fenilglicina. fenilalanina ou fenilalanina substituída acopladas através de uma ligação peptídica à porção restante do composto da Fórmula (1).
2. 2. O composto da reivindicação 1 que é um éster ou amida ou éster/amida misto.
3. 3. O composto da reivindicação 1, em que pelo menos um X e -2- iyíM^ metilo, propilo, hexilo, octilo, benzilo, naftilo ou tritilo substituído ou não substituído.
4. 4. Um composto de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que AAC é fenilglicina.
5. 5. 0 composto de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que Y-CO é γ-Glu.
6. 6. 0 composto de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que ZéS.
7. 7. O composto da reivindicação 1, em que AAC é fenilglicina, Y-CO é γ-Glu, Z é S, X é benzilo, e n é 1.
8. 8. 0 composto de qualquer uma das reivindicações 1-7 que é um éster.
9. 9. 0 éster da reivindicação 8 que é um éster etílico ou um éster benzílico.
10. 10. O composto de qualquer uma das reivindicações 1-7 que é o monoéster ou monoamida.
11. 11. O composto de qualquer uma das reivindicações 1-7 que é o diéster ou diamida ou éster/amida misto.
12. 12. Um método para purificar ou caracterizar um enzima glutationa-S-transferase (GST) humano a partir de uma amostra, método esse que -3- -3-

    compreende fazer contactar a referida amostra com um suporte sólido ao qual está acoplado o composto de qualquer uma das reivindicações 1-11; em condições em que o referido GST humano é adsorvido para o referido suporte, separando o suporte sólido da amostra, e eluindo o referido GST humano a partir do suporte sólido proporcionando uma solução para eluição.
13. 13. O método da reivindicação 12 em que a solução de eluição contem um composto da fórmula de qualquer uma das reivindicações 1-11 diferente do acoplado ao suporte sólido.
14. 14. O método da reivindicação 12 ou 13 em que a amostra compreende células ou tecidos.
15. 15. Um método para detectar a presença ou ausência de um enzima GST numa amostra, método esse que compreende o tratamento da referida amostra com o composto de qualquer uma das reivindicações 1-11; em condições em que um complexo é formado entre o referido enzima GST e o referido composto, e detectando a presença ou ausência do referido complexo.
16. 16. Um painel compreendendo pelo menos cinco diversos análogos de glutationa tripeptídica que são compostos de qualquer uma das reivindicações 1-11, em que os referidos compostos apresentam diversas propriedades.
17. 17. O painel da reivindicação 16, em que as referidas diversas propriedades incluem diversidade numa propriedade seleccionada de entre o -4- grupo consistindo em hidrofobicidade de X, Hammett's Constants de X, e hidrofobicidade de AAC.
18. 18. Um método para determinar o complemento de GST de uma amostra de célula ou tecido suspeita de conter pelo menos um enzima GST, método esse que compreende: determinação de uma característica de eluição no que se refere a cada suporte num painel de suportes cromatográfícos em que o referido painel compreende suportes derivatizados para os compostos do painel da reivindicação 16, para se obter um perfil de análise de características (SC); e comparando o perfil SC resultante obtido a partir do referido tecido ou células com a referência indicada de perfis SC obtidos a partir de tecidos ou células de complementos de GST conhecidos.
19. 19. Utilização de um composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 11 na produção de um medicamento para potenciação do efeito de um agente quimioterapêutico numa célula tumoral.
20. 20. A utilização de um composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 11 na produção de um medicamento para exercer um efeito citotóxico sobre células alvo em comparação com células não alvo em que as referidas células alvo compreendem pelo menos um isoenzima GST cujo nível seja elevado nas referidas células alvo em comparação com células não alvo; em que o referido composto inactiva de um modo selectivo o referido isoenzima.
21. 21. A utilização de um composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 11 na produção de um medicamento para a estimulação da produção de progenitores de macrofagos granulócitos na medula óssea de um indivíduo. -5-
22. 22. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, em que o composto é um diéster de um composto seleccionado de entre o grupo consistindo em octil-G, naftil-G, hexil-PG e benzil-PG. Lisboa, 17 de Agosto de 2000

    RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA