JP4080567B2 - 新規ステロイド化合物およびこれを有効成分とするインターロイキン４産生抑制剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規ステロイド化合物およびこれを有効成分とするインターロイキン４産生抑制剤、および抗アレルギー剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インターロイキン４は、ヒトまたは、動物の免疫応答細胞であるＴリンパ球より産生される物質であり、Ｂリンパ球に作用してＩｇＥやＩｇＧ４といった抗体の産生を増強することが知られている。ＩｇＥは、花粉症、アレルギー性の眼炎および鼻炎、アトピー性皮膚炎、喘息など種々のアレルギー性疾患の患者に多く見出される抗体であり、これらアレルギー性疾患の発症に深く関与していることが古くから知られている。ＩｇＥは、肥満細胞に存在するＩｇＥレセプターに結合し、ＩｇＥがそのレセプターに結合した肥満細胞は、体内に侵入したアレルギー物質、すなわちアレルゲンのＩｇＥへの結合によってヒスタミンなどの炎症性化学物質を遊離する。ヒスタミン遊離は種々のアレルギー症状、すなわち、かゆみ、紅斑、くしゃみ、鼻水などの症状を引き起こす。このようにインターロイキン４は、上述のメカニズムを介することにより、アレルギー性疾患の発症に強く関与している。
【０００３】
また最近の研究により、インターロイキン４はＩｇＥやＩｇＧ４といった抗体の産生増強作用に加えて、炎症部位への炎症性細胞の浸潤促進作用を有することが見出され、アレルギー性疾患の発症における重要性がますます注目されている。また、アレルギー性疾患のひとつであるアトピー性皮膚炎においては、その皮膚や血液中にインターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン１０などの特定のサイトカインを多く産生するタイプのＴリンパ球（タイプ２ヘルパーＴリンパ球、Ｔｈ２細胞）が多く見出されることがわかっており、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患におけるＴｈ２細胞の関与が問題視されている。インターロイキン５は好酸球を活性化し炎症性の物質の産生を促進する物質であり、実際アトピー性皮膚炎患者の皮膚には好酸球浸潤や好酸球由来の炎症性物質が多く見出されている。インターロイキン１０は細菌やウイルスの感染防御に機能するインターフェロンの産生を抑制する作用を有した物質であり、アトピー性皮膚炎患者がしばしば黄色ブドウ球菌に易感染性であることの原因の１つとなっていると考えられる。
【０００４】
インターロイキン４は、上述のように抗体産生や細胞浸潤を促進する働きに加えて、未成熟なＴリンパ球（タイプ０ヘルパーＴリンパ球、Ｔｈ０細胞）をインターロイキン４を多く産生するタイプの成熟Ｔリンパ球（Ｔｈ２細胞）へと分化させる働きをも有している。従って、インターロイキン４産生抑制剤の提供は、ＩｇＥの産生抑制剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩｇＥやヒスタミンの作用の抑制剤などの従来アレルギー性疾患に行われてきた治療法および予防法と比較して、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患を、より根本から、治療および予防する方法を提供するものである。
【０００５】
さらに、インターロイキン４は多機能物質であり、皮膚の様々なトラブルと関係があるものと考えられる。インターロイキン４は角化細胞に作用してインターロイキン６の産生を増強する作用を有しており、皮膚の炎症に関与すると考えられる。またインターロイキン４によって刺激された肥満細胞は、エンドセリンに反応してヒスタミン遊離を起こすことが知られている。エンドセリンは紫外線によって角化細胞から産生されることを考えると、紫外線によるかゆみへの関与も十分考えられる。インターロイキン４は、線維芽細胞に作用してコラーゲン合成能を修飾することも知られており、しわおよびたるみに関与する可能性もある。従って、インターロイキン４産生抑制剤は、アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患の治療及び予防に有効であることに加えて、その他のインターロイキン４の関与するトラブル、すなわち、かゆみ、しわ、しみ、水虫、口内炎等のトラブルの治療および予防に有効であることが期待できる。
【０００６】
インターロイキン４の産生を抑制する物質としては、これまでに唯一、ＩＰＤ１１５１Ｔに代表される一群のスルホニウム誘導体が知られており（Japan. J. Pharmacol. 61. 27-30(1993), Japan. J. Pharmacol. 61. 31-39(1993)）、経口薬に配合されてアトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患の治療に使用されている。しかしながら、その効力は十分ではなく、経皮吸収性や安定性、安全性、価格に優れた、効力の強いインターロイキン４産生抑制剤が必要とされていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的とするところは、経皮吸収性や安定性、安全性、価格に優れた、効力の強いインターロイキン４産生抑制剤を提供することにあり、さらには、特にアトピー性皮膚炎に対して予防あるいは治療効果を有する抗アレルギー剤を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
かかる実情に鑑み、本発明者らは、すでに副作用の心配がなく、古くから漢方薬として用いられている天然物たるバイキセイ（サルノコシカケ科コフキサルノコシカケ、Elfvingia applanata）の抽出物に、インターロイキン４産生抑制効果のあることを見出し特許出願した（特願平８−２１９０８８号）。その後、より強力なインターロイキン４産生抑制効果をもつ物質を得るべくさらに研究を行った結果、バイキセイの抽出物中に強力なインターロイキン４産生抑制効果を有する下記式（１）で表される化合物が存在し、該化合物がエルゴステロールを原料として合成できることを見出し本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、次の式（１）
【００１０】
【化２】
【００１１】
で表される新規ステロイド化合物およびこれを有効成分とするインターロイキン４産生抑制剤を提供するものである。
さらに、本発明は、該ステロイド化合物を有効成分とする抗アレルギー剤を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
バイキセイから、ステロイド化合物（１）を単離するには例えば、上記植物の抽出物よりクロマトグラフィーにて分取することが好ましい。
すなわち乾燥させたバイキセイの子実体を粉砕し、水またはアルコール、グリコール類、アセトンなどの極性有機溶媒、エーテル類、エステル類、ハロゲン化有機溶媒、炭化水素類などの非極性有機溶媒、あるいはこれらの混合溶媒を用いて粗抽出液を得る。粗抽出液から溶媒を除去して得た粗抽出物を、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、アセトン、メチルエチルケトン、クロロホルム、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、石油エーテルより選ばれる少なくとも１種の溶媒を溶出溶媒として、シリカゲル、逆相系シリカゲルなどを担体に用いたクロマトグラフィーなどの分画法に付すことによりステロイド化合物（１）を得る。
【００１３】
また、本発明ステロイド化合物（１）は、化学合成により製造することもできる。
化合物（１）を合成するには例えば、下記反応式に示したような方法により得ることができる。
【００１４】
【化３】
【００１５】
すなわち、エルゴステロールをメタノールの存在下、二酸化セレンで酸化することにより異性体（２）を得て（工程１）、次いで、異性体（２）に、メタノール中で酸触媒を作用させ、３位のメトキシ基を反転させることにより、化合物（１）を得る（工程２）。
【００１６】
工程１は、化合物（１）を合成する方法として、かつてＲｕｆｅｒらが報告したものである（Chem. Ber. 98(7), 2383-93(1965)）。しかし、本発明者らがこの論文の追試を行った結果、Ｒｕｆｅｒらが提示した構造は誤っており、実際に得られる化合物は、本発明化合物（１）と３位の立体配置が異なる立体異性体（２）であることが判明した。
化合物（１）と異性体（２）の立体配置は、1H-NMR の３位のカップリング定数（化合物（１）；Ｊ＝9.9, 6.5, 2.1Hz、異性体（２）；Ｊ＝4.9, 4.3, 1.6Hz）より決定した。また、化合物（１）の１α位と３α位の水素間にＮＯＥが観測されたことも、本立体構造を強く支持している。本発明者らによる追試で得られた異性体（２）が、Ｒｕｆｅｒらによって報告されたものと同一の化合物であることは、1H-NMR 、特に４位のカップリング定数、エーテルの赤外吸収スペクトル、融点より明らかである。また、この異性体（２）には選択的インターロイキン４産生抑制活性はなかった。
【００１７】
かくして得られた化合物（１）は、優れたインターロイキン４産生抑制活性を有し、抗アレルギー剤、特にアトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、気管支喘息等の予防治療剤として有用である。
【００１８】
本発明のインターロイキン４産生抑制剤および抗アレルギー剤は細胞毒性が低く、外用および内服のいずれの方法でも投与可能であるが、外用剤として用いるのが特に好ましい。
本発明の抗アレルギー剤である皮膚外用剤組成物には、前記化合物（１）の他、通常使用される外用基材、他の薬効成分等を配合できる。ここで用いられる外用基材としては、油性基剤をベースとするもの、油／水、水／油型の乳化系基剤をベースとするもの、および、水をベースとするもののいずれでもあっても良い。
【００１９】
油性基剤としては、特に制限はなく例えば、植物油、動物油、合成油脂肪酸、天然／合成のグリセリド等が挙げられる。また、保湿剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート類、pH調整剤、防腐剤、増粘剤、色素、香料等を任意に組み合わせて配合することができる。また、上記薬効成分としては特に制限はなく、例えば鎮痛消炎剤、殺菌消毒剤、ビタミン類、皮膚柔軟化剤等を必要に応じて適宜使用できる。これら皮膚外用組成物の形態としては、軟膏、クリーム、乳液、化粧水、パック、ファンデーション等が挙げられる。前記化合物（１）の配合量、投与量は、化粧品、医薬品、医薬部外品として通常の範囲内のものであれば特に制限はないが、通常は成人１日あたり０．００１〜２０００mgの範囲で用いられる。
【００２０】
【実施例】
次に、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を挙げるが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００２１】
（製造例１）
バイキセイの乾燥粉砕物１kgにメタノール１０Ｌを加え、室温で時々攪拌しながら７日間抽出を行った。得られた粗抽出液を濾過し、濾液をヘキサン１０Ｌで３回抽出し、得られたヘキサン層を減圧濃縮し、抽出物５．９ｇを得た。この抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メルク社製、キーゼルゲル６０、２３０−４００メッシュ、ヘキサン／酢酸エチル系）に供し、ヘキサン：酢酸エチル＝９９：１溶出区を濃縮し、画分０．５２ｇを得た。この画分をさらにＨＰＬＣ（ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＯＤＳ−Ａ １０μｍ ２５０×２０mm、メタノール、検出ＵＶ２８０nm）に供し、単離化合物４４mgを得て、ステロイド化合物（１）と同定した。
ステロイド化合物（１）の物性は次の通りである。
【００２２】
【００２３】
（製造例２）
攪拌装置を備えた５００mlフラスコに、エルゴステロール５．０ｇ、トルエン２５０ml、メタノール５０ml、水２．５mlを仕込み、室温下に攪拌しつつ、これに二酸化セレン５．０ｇを加え、室温下に１晩攪拌した。生じたセレンを濾別した後、反応混合物を水洗し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルショートカラムクロマトグラフィーで精製し、次いでエタノールより再結晶することにより異性体（２）１．６ｇ（収率３２％）を得た。
異性体（２）の物性は次の通りである。
【００２４】
【００２５】
（製造例３）
攪拌装置を備えた１００mlフラスコに、製造例２で得られた異性体（２）０．３６ｇ、メタノール１８ml、クロロホルム１８mlを仕込み、室温下に攪拌しつつ、これに酢酸１．８mlを加え、室温下に６時間攪拌した。反応混合物を水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、ヘキサン１００mlを加えて水洗し、溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＯＤＳ−Ａ １０μｍ ２５０×２０mm、メタノール、検出ＵＶ２８０nm）で精製し、単離化合物０．１６ｇ（収率４４％）を得た。
得られた化合物の物性を測定した結果、製造例１で得られたステロイド化合物（１）と同定した。
【００２６】
つぎに、本発明化合物（１）が優れたインターロイキン４産生抑制活性を有し、抗アレルギー剤、特にアトピー性皮膚炎に予防あるいは治療効果を有する皮膚外用剤等として有用であることについて試験例により具体的に説明する。
【００２７】
（試験例１） インターロイキン４産生抑制能の測定
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、２００μｇの蛋白質抗原（カサガイヘモシアニン）をフロイントの完全アジュバントと共に皮下注射し感作した。７日後、リンパ節を摘出し、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（以下「ＰＢＳ」と略す）中で解して、リンパ球の懸濁液を調製した。調製したリンパ球を９６穴プレートに１ウェル当たり４×１０5 細胞の濃度でまき、化合物（１）を最終濃度０．０００４％となる様に添加した１０％牛血清加ＲＰＭＩ １６４０培地を用いて３７℃、一晩培養した後、蛋白質抗原（カサガイヘモシアニン）を添加した（最終濃度１０μｇ／ml）。さらに３日間の培養の後、その培養上清をＥＬＩＳＡ法による定量に供した。
【００２８】
ＥＬＩＳＡ法による定量は、以下の様にして行った。５０μｌの４μｇ／ml抗インターロイキン４抗体あるいは２μｇ／ml抗インターロイキン２抗体（いずれもＰＢＳ溶液）をＥＬＩＳＡプレートに加えて４℃で一晩インキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、「ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ」と略す）でプレートを洗浄の後、３％Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（以下、「ＢＳＡ」と略す）を含むＰＢＳを加えて、室温で２時間インキュベートしプレートのブロッキングを行った。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄の後、７０μｌのサンプルすなわち培養上清を添加し、室温で４時間インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄の後、１００μｌの２μｇ／mlビオチン標識抗インターロイキン４抗体あるいはビオチン標識抗インターロイキン２抗体（いずれも３％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液）を加えて室温で４５分間インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄の後、１００μｌのＡＢＣ溶液（Avidin-peroxidase とBiotinのComplex、Vectstain 社のＡＢＣキットを使用）を加え、室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄の後、１００μｌの基質溶液（ＡＢＴＳ）を加えて発色反応を行い、プレートリーダーで４０５nmの吸光度を測定した。インターロイキン４およびインターロイキン２産生抑制率を、溶媒コントロールに対する抑制率を算出し、植物抽出物のサイトカイン抑制効果を判定した。すなわちインターロイキン４およびインターロイキン２産生抑制率（％）（以下の表中では、それぞれ「ＩＬ４抑制率」、「ＩＬ２抑制率」と略記する）は、植物抽出物を含有しない抽出溶液のみを加えたときのインターロイキン産生を何％抑制するかを示すものである。
【００２９】
また、化合物（１）の細胞毒性を調べるため、ＭＴＴアッセイを行った。ＭＴＴアッセイには、ＭＴＴアッセイキット（ケミコン社）を使用した。ＭＴＴとは、生細胞のミトコンドリアによって分解されて薄い黄色から濃い青色に変化する物質であり、ＭＴＴアッセイにより化合物（１）の細胞毒性を知ることができる。アッセイは使用説明書に従って行い、溶媒コントロールに対する抑制率を算出し、化合物（１）の細胞毒性を判定した。ＭＴＴ分解活性抑制率（％）は、溶媒のみを加えたときのＭＴＴ分解活性を何％抑制するかを示すものである。すなわち、毒性の高いものほど抑制率は高い。その結果、化合物（１）には、表１に示す通り、インターロイキン４産生抑制効果が認められた。一方、異性体２については、インターロイキン４産生抑制効果が認められなかった。また、化合物（１）にインターロイキン２産生抑制効果は認められず、抑制効果はインターロイキン４に特異的であった。さらに、化合物（１）の細胞毒性は極めて弱いものであった。したがって、化合物（１）は、インターロイキン４の産生によって引き起こされる、アトピー性皮膚炎に対する外用剤や抗アレルギー剤として有用なものである。
【００３０】
【表１】
【００３１】
つぎに、化合物（１）を使用して、各種の製剤を調製した実施例を以下に説明する。
【００３２】
（実施例１）
化合物（１）１ｇ、コレステロール０．５ｇ、コレステリルイソステアレート１ｇ、ポリエーテル変性シリコーン１．５ｇ、環状シリコーン２０ｇ、メチルフェニルポリシロキサン２ｇ、メチルポリシロキサン２ｇ、硫酸マグネシウム０．５ｇ、５５％エタノール５ｇ、カルボキシメチルキサン０．５ｇ、精製水を混合しクリーム１００ｇとした。
【００３３】
（実施例２）
化合物（１）３ｇ、コレステリルイソステアレート３ｇ、流動パラフィン１０ｇ、グリセリルエーテル１ｇ、グリセリン１０ｇ、白色ワセリン７３ｇを混合し、軟膏とした。
【００３４】
（実施例３）
化合物（１）１０ｇ、コーンスターチ４ｇ、結晶セルロース４０ｇ、カルボキシメチルセルロースカルシウム５ｇ、軽質無水ケイ酸０．５ｇ、ステアリン酸マグネシウム０．５ｇを混合し、打錠機にて圧縮成形して直径９mm、重量２００mgの錠剤とした。
【００３５】
（実施例４）
化合物（１）５ｇ、製造例６で得られたサイコ抽出物５ｇ、結晶セルロース５５ｇ、１０％ヒドロキシプロピルセルロースエタノール溶液３５ｇを均一に混合し、捏和した。押出造粒機により造粒後乾燥し、篩別して顆粒剤とした。
【００３６】
【発明の効果】
本発明化合物（１）は、優れたインターロイキン４産生抑制活性を有し、経皮吸収性や安定性、安全性に優れ、強い効力を有する。またかかる化合物（１）を含有する抗アレルギー剤は、アトピー性皮膚炎等のアレルギー性症状に対して予防または治療効果を有する。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規ステロイド化合物およびこれを有効成分とするインターロイキン４産生抑制剤、および抗アレルギー剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インターロイキン４は、ヒトまたは、動物の免疫応答細胞であるＴリンパ球より産生される物質であり、Ｂリンパ球に作用してＩｇＥやＩｇＧ４といった抗体の産生を増強することが知られている。ＩｇＥは、花粉症、アレルギー性の眼炎および鼻炎、アトピー性皮膚炎、喘息など種々のアレルギー性疾患の患者に多く見出される抗体であり、これらアレルギー性疾患の発症に深く関与していることが古くから知られている。ＩｇＥは、肥満細胞に存在するＩｇＥレセプターに結合し、ＩｇＥがそのレセプターに結合した肥満細胞は、体内に侵入したアレルギー物質、すなわちアレルゲンのＩｇＥへの結合によってヒスタミンなどの炎症性化学物質を遊離する。ヒスタミン遊離は種々のアレルギー症状、すなわち、かゆみ、紅斑、くしゃみ、鼻水などの症状を引き起こす。このようにインターロイキン４は、上述のメカニズムを介することにより、アレルギー性疾患の発症に強く関与している。
【０００３】
また最近の研究により、インターロイキン４はＩｇＥやＩｇＧ４といった抗体の産生増強作用に加えて、炎症部位への炎症性細胞の浸潤促進作用を有することが見出され、アレルギー性疾患の発症における重要性がますます注目されている。また、アレルギー性疾患のひとつであるアトピー性皮膚炎においては、その皮膚や血液中にインターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン１０などの特定のサイトカインを多く産生するタイプのＴリンパ球（タイプ２ヘルパーＴリンパ球、Ｔｈ２細胞）が多く見出されることがわかっており、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患におけるＴｈ２細胞の関与が問題視されている。インターロイキン５は好酸球を活性化し炎症性の物質の産生を促進する物質であり、実際アトピー性皮膚炎患者の皮膚には好酸球浸潤や好酸球由来の炎症性物質が多く見出されている。インターロイキン１０は細菌やウイルスの感染防御に機能するインターフェロンの産生を抑制する作用を有した物質であり、アトピー性皮膚炎患者がしばしば黄色ブドウ球菌に易感染性であることの原因の１つとなっていると考えられる。
【０００４】
インターロイキン４は、上述のように抗体産生や細胞浸潤を促進する働きに加えて、未成熟なＴリンパ球（タイプ０ヘルパーＴリンパ球、Ｔｈ０細胞）をインターロイキン４を多く産生するタイプの成熟Ｔリンパ球（Ｔｈ２細胞）へと分化させる働きをも有している。従って、インターロイキン４産生抑制剤の提供は、ＩｇＥの産生抑制剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩｇＥやヒスタミンの作用の抑制剤などの従来アレルギー性疾患に行われてきた治療法および予防法と比較して、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患を、より根本から、治療および予防する方法を提供するものである。
【０００５】
さらに、インターロイキン４は多機能物質であり、皮膚の様々なトラブルと関係があるものと考えられる。インターロイキン４は角化細胞に作用してインターロイキン６の産生を増強する作用を有しており、皮膚の炎症に関与すると考えられる。またインターロイキン４によって刺激された肥満細胞は、エンドセリンに反応してヒスタミン遊離を起こすことが知られている。エンドセリンは紫外線によって角化細胞から産生されることを考えると、紫外線によるかゆみへの関与も十分考えられる。インターロイキン４は、線維芽細胞に作用してコラーゲン合成能を修飾することも知られており、しわおよびたるみに関与する可能性もある。従って、インターロイキン４産生抑制剤は、アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患の治療及び予防に有効であることに加えて、その他のインターロイキン４の関与するトラブル、すなわち、かゆみ、しわ、しみ、水虫、口内炎等のトラブルの治療および予防に有効であることが期待できる。
【０００６】
インターロイキン４の産生を抑制する物質としては、これまでに唯一、ＩＰＤ１１５１Ｔに代表される一群のスルホニウム誘導体が知られており（Japan. J. Pharmacol. 61. 27-30(1993), Japan. J. Pharmacol. 61. 31-39(1993)）、経口薬に配合されてアトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患の治療に使用されている。しかしながら、その効力は十分ではなく、経皮吸収性や安定性、安全性、価格に優れた、効力の強いインターロイキン４産生抑制剤が必要とされていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的とするところは、経皮吸収性や安定性、安全性、価格に優れた、効力の強いインターロイキン４産生抑制剤を提供することにあり、さらには、特にアトピー性皮膚炎に対して予防あるいは治療効果を有する抗アレルギー剤を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
かかる実情に鑑み、本発明者らは、すでに副作用の心配がなく、古くから漢方薬として用いられている天然物たるバイキセイ（サルノコシカケ科コフキサルノコシカケ、Elfvingia applanata）の抽出物に、インターロイキン４産生抑制効果のあることを見出し特許出願した（特願平８−２１９０８８号）。その後、より強力なインターロイキン４産生抑制効果をもつ物質を得るべくさらに研究を行った結果、バイキセイの抽出物中に強力なインターロイキン４産生抑制効果を有する下記式（１）で表される化合物が存在し、該化合物がエルゴステロールを原料として合成できることを見出し本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、次の式（１）
【００１０】
【化２】
で表される新規ステロイド化合物およびこれを有効成分とするインターロイキン４産生抑制剤を提供するものである。
さらに、本発明は、該ステロイド化合物を有効成分とする抗アレルギー剤を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
バイキセイから、ステロイド化合物（１）を単離するには例えば、上記植物の抽出物よりクロマトグラフィーにて分取することが好ましい。
すなわち乾燥させたバイキセイの子実体を粉砕し、水またはアルコール、グリコール類、アセトンなどの極性有機溶媒、エーテル類、エステル類、ハロゲン化有機溶媒、炭化水素類などの非極性有機溶媒、あるいはこれらの混合溶媒を用いて粗抽出液を得る。粗抽出液から溶媒を除去して得た粗抽出物を、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、アセトン、メチルエチルケトン、クロロホルム、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、石油エーテルより選ばれる少なくとも１種の溶媒を溶出溶媒として、シリカゲル、逆相系シリカゲルなどを担体に用いたクロマトグラフィーなどの分画法に付すことによりステロイド化合物（１）を得る。
【００１３】
また、本発明ステロイド化合物（１）は、化学合成により製造することもできる。
化合物（１）を合成するには例えば、下記反応式に示したような方法により得ることができる。
【００１４】
【化３】
すなわち、エルゴステロールをメタノールの存在下、二酸化セレンで酸化することにより異性体（２）を得て（工程１）、次いで、異性体（２）に、メタノール中で酸触媒を作用させ、３位のメトキシ基を反転させることにより、化合物（１）を得る（工程２）。
【００１６】
工程１は、化合物（１）を合成する方法として、かつてＲｕｆｅｒらが報告したものである（Chem. Ber. 98(7), 2383-93(1965)）。しかし、本発明者らがこの論文の追試を行った結果、Ｒｕｆｅｒらが提示した構造は誤っており、実際に得られる化合物は、本発明化合物（１）と３位の立体配置が異なる立体異性体（２）であることが判明した。
化合物（１）と異性体（２）の立体配置は、1H-NMR の３位のカップリング定数（化合物（１）；Ｊ＝9.9, 6.5, 2.1Hz、異性体（２）；Ｊ＝4.9, 4.3, 1.6Hz）より決定した。また、化合物（１）の１α位と３α位の水素間にＮＯＥが観測されたことも、本立体構造を強く支持している。本発明者らによる追試で得られた異性体（２）が、Ｒｕｆｅｒらによって報告されたものと同一の化合物であることは、1H-NMR 、特に４位のカップリング定数、エーテルの赤外吸収スペクトル、融点より明らかである。また、この異性体（２）には選択的インターロイキン４産生抑制活性はなかった。
【００１７】
かくして得られた化合物（１）は、優れたインターロイキン４産生抑制活性を有し、抗アレルギー剤、特にアトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、気管支喘息等の予防治療剤として有用である。
【００１８】
本発明のインターロイキン４産生抑制剤および抗アレルギー剤は細胞毒性が低く、外用および内服のいずれの方法でも投与可能であるが、外用剤として用いるのが特に好ましい。
本発明の抗アレルギー剤である皮膚外用剤組成物には、前記化合物（１）の他、通常使用される外用基材、他の薬効成分等を配合できる。ここで用いられる外用基材としては、油性基剤をベースとするもの、油／水、水／油型の乳化系基剤をベースとするもの、および、水をベースとするもののいずれでもあっても良い。
【００１９】
油性基剤としては、特に制限はなく例えば、植物油、動物油、合成油脂肪酸、天然／合成のグリセリド等が挙げられる。また、保湿剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート類、pH調整剤、防腐剤、増粘剤、色素、香料等を任意に組み合わせて配合することができる。また、上記薬効成分としては特に制限はなく、例えば鎮痛消炎剤、殺菌消毒剤、ビタミン類、皮膚柔軟化剤等を必要に応じて適宜使用できる。これら皮膚外用組成物の形態としては、軟膏、クリーム、乳液、化粧水、パック、ファンデーション等が挙げられる。前記化合物（１）の配合量、投与量は、化粧品、医薬品、医薬部外品として通常の範囲内のものであれば特に制限はないが、通常は成人１日あたり０．００１〜２０００mgの範囲で用いられる。
【００２０】
【実施例】
次に、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を挙げるが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００２１】
（製造例１）
バイキセイの乾燥粉砕物１kgにメタノール１０Ｌを加え、室温で時々攪拌しながら７日間抽出を行った。得られた粗抽出液を濾過し、濾液をヘキサン１０Ｌで３回抽出し、得られたヘキサン層を減圧濃縮し、抽出物５．９ｇを得た。この抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メルク社製、キーゼルゲル６０、２３０−４００メッシュ、ヘキサン／酢酸エチル系）に供し、ヘキサン：酢酸エチル＝９９：１溶出区を濃縮し、画分０．５２ｇを得た。この画分をさらにＨＰＬＣ（ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＯＤＳ−Ａ １０μｍ ２５０×２０mm、メタノール、検出ＵＶ２８０nm）に供し、単離化合物４４mgを得て、ステロイド化合物（１）と同定した。
ステロイド化合物（１）の物性は次の通りである。
【００２２】
（製造例２）
攪拌装置を備えた５００mlフラスコに、エルゴステロール５．０ｇ、トルエン２５０ml、メタノール５０ml、水２．５mlを仕込み、室温下に攪拌しつつ、これに二酸化セレン５．０ｇを加え、室温下に１晩攪拌した。生じたセレンを濾別した後、反応混合物を水洗し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルショートカラムクロマトグラフィーで精製し、次いでエタノールより再結晶することにより異性体（２）１．６ｇ（収率３２％）を得た。
異性体（２）の物性は次の通りである。
【００２４】
（製造例３）
攪拌装置を備えた１００mlフラスコに、製造例２で得られた異性体（２）０．３６ｇ、メタノール１８ml、クロロホルム１８mlを仕込み、室温下に攪拌しつつ、これに酢酸１．８mlを加え、室温下に６時間攪拌した。反応混合物を水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、ヘキサン１００mlを加えて水洗し、溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＯＤＳ−Ａ １０μｍ ２５０×２０mm、メタノール、検出ＵＶ２８０nm）で精製し、単離化合物０．１６ｇ（収率４４％）を得た。
得られた化合物の物性を測定した結果、製造例１で得られたステロイド化合物（１）と同定した。
【００２６】
つぎに、本発明化合物（１）が優れたインターロイキン４産生抑制活性を有し、抗アレルギー剤、特にアトピー性皮膚炎に予防あるいは治療効果を有する皮膚外用剤等として有用であることについて試験例により具体的に説明する。
【００２７】
（試験例１） インターロイキン４産生抑制能の測定
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、２００μｇの蛋白質抗原（カサガイヘモシアニン）をフロイントの完全アジュバントと共に皮下注射し感作した。７日後、リンパ節を摘出し、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（以下「ＰＢＳ」と略す）中で解して、リンパ球の懸濁液を調製した。調製したリンパ球を９６穴プレートに１ウェル当たり４×１０5 細胞の濃度でまき、化合物（１）を最終濃度０．０００４％となる様に添加した１０％牛血清加ＲＰＭＩ １６４０培地を用いて３７℃、一晩培養した後、蛋白質抗原（カサガイヘモシアニン）を添加した（最終濃度１０μｇ／ml）。さらに３日間の培養の後、その培養上清をＥＬＩＳＡ法による定量に供した。
【００２８】
ＥＬＩＳＡ法による定量は、以下の様にして行った。５０μｌの４μｇ／ml抗インターロイキン４抗体あるいは２μｇ／ml抗インターロイキン２抗体（いずれもＰＢＳ溶液）をＥＬＩＳＡプレートに加えて４℃で一晩インキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、「ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ」と略す）でプレートを洗浄の後、３％Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（以下、「ＢＳＡ」と略す）を含むＰＢＳを加えて、室温で２時間インキュベートしプレートのブロッキングを行った。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄の後、７０μｌのサンプルすなわち培養上清を添加し、室温で４時間インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄の後、１００μｌの２μｇ／mlビオチン標識抗インターロイキン４抗体あるいはビオチン標識抗インターロイキン２抗体（いずれも３％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液）を加えて室温で４５分間インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄の後、１００μｌのＡＢＣ溶液（Avidin-peroxidase とBiotinのComplex、Vectstain 社のＡＢＣキットを使用）を加え、室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄の後、１００μｌの基質溶液（ＡＢＴＳ）を加えて発色反応を行い、プレートリーダーで４０５nmの吸光度を測定した。インターロイキン４およびインターロイキン２産生抑制率を、溶媒コントロールに対する抑制率を算出し、植物抽出物のサイトカイン抑制効果を判定した。すなわちインターロイキン４およびインターロイキン２産生抑制率（％）（以下の表中では、それぞれ「ＩＬ４抑制率」、「ＩＬ２抑制率」と略記する）は、植物抽出物を含有しない抽出溶液のみを加えたときのインターロイキン産生を何％抑制するかを示すものである。
【００２９】
また、化合物（１）の細胞毒性を調べるため、ＭＴＴアッセイを行った。ＭＴＴアッセイには、ＭＴＴアッセイキット（ケミコン社）を使用した。ＭＴＴとは、生細胞のミトコンドリアによって分解されて薄い黄色から濃い青色に変化する物質であり、ＭＴＴアッセイにより化合物（１）の細胞毒性を知ることができる。アッセイは使用説明書に従って行い、溶媒コントロールに対する抑制率を算出し、化合物（１）の細胞毒性を判定した。ＭＴＴ分解活性抑制率（％）は、溶媒のみを加えたときのＭＴＴ分解活性を何％抑制するかを示すものである。すなわち、毒性の高いものほど抑制率は高い。その結果、化合物（１）には、表１に示す通り、インターロイキン４産生抑制効果が認められた。一方、異性体２については、インターロイキン４産生抑制効果が認められなかった。また、化合物（１）にインターロイキン２産生抑制効果は認められず、抑制効果はインターロイキン４に特異的であった。さらに、化合物（１）の細胞毒性は極めて弱いものであった。したがって、化合物（１）は、インターロイキン４の産生によって引き起こされる、アトピー性皮膚炎に対する外用剤や抗アレルギー剤として有用なものである。
【００３０】
【表１】
つぎに、化合物（１）を使用して、各種の製剤を調製した実施例を以下に説明する。
【００３２】
（実施例１）
化合物（１）１ｇ、コレステロール０．５ｇ、コレステリルイソステアレート１ｇ、ポリエーテル変性シリコーン１．５ｇ、環状シリコーン２０ｇ、メチルフェニルポリシロキサン２ｇ、メチルポリシロキサン２ｇ、硫酸マグネシウム０．５ｇ、５５％エタノール５ｇ、カルボキシメチルキサン０．５ｇ、精製水を混合しクリーム１００ｇとした。
【００３３】
（実施例２）
化合物（１）３ｇ、コレステリルイソステアレート３ｇ、流動パラフィン１０ｇ、グリセリルエーテル１ｇ、グリセリン１０ｇ、白色ワセリン７３ｇを混合し、軟膏とした。
【００３４】
（実施例３）
化合物（１）１０ｇ、コーンスターチ４ｇ、結晶セルロース４０ｇ、カルボキシメチルセルロースカルシウム５ｇ、軽質無水ケイ酸０．５ｇ、ステアリン酸マグネシウム０．５ｇを混合し、打錠機にて圧縮成形して直径９mm、重量２００mgの錠剤とした。
【００３５】
（実施例４）
化合物（１）５ｇ、製造例６で得られたサイコ抽出物５ｇ、結晶セルロース５５ｇ、１０％ヒドロキシプロピルセルロースエタノール溶液３５ｇを均一に混合し、捏和した。押出造粒機により造粒後乾燥し、篩別して顆粒剤とした。
【００３６】
【発明の効果】
本発明化合物（１）は、優れたインターロイキン４産生抑制活性を有し、経皮吸収性や安定性、安全性に優れ、強い効力を有する。またかかる化合物（１）を含有する抗アレルギー剤は、アトピー性皮膚炎等のアレルギー性症状に対して予防または治療効果を有する。
Claims (5)
- 次の式（１）
- 請求項１記載のステロイド化合物を有効成分とするインターロイキン４産生抑制剤。
- 請求項１記載のステロイド化合物を有効成分とする抗アレルギー剤。
- アトピー性皮膚炎予防治療剤である請求項３記載の抗アレルギー剤。
- 外用剤である請求項３または４記載の抗アレルギー剤。
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