KR20050029785A

KR20050029785A - 신규 세라마이드 유도체, 이의 제조방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20050029785A
Application number: KR1020030065991A
Authority: KR
Inventors: 신종헌; 노정래; 김태윤; 김혜정
Original assignee: 주식회사 바이오씨에스; 김태윤; 신종헌; 노정래
Priority date: 2003-09-23
Filing date: 2003-09-23
Publication date: 2005-03-29
Also published as: KR100570810B1

Abstract

본 발명은 신규 세라마이드 유도체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하기 화학식 2로 표시되는 세라마이드 유도체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 화장료 조성물 및 약학적 조성물에 관한 것이다.

<화학식 2>

상기 식에서,

R₁은 수소 또는 C1-C14의 알킬기이고;

R₂는 수소, 하이드록시기 또는 C1-C11의 알킬기이고;

R₃는 6-메틸 펜타데카-1,5,7-트리엔, 1-하이드록시-노나데카-11-엔 또는 노나데카-1,11-다이엔이고; 및

R₄는 수소 또는 C1-C6의 알콕시기이다.

Description

신규 세라마이드 유도체, 이의 제조방법 및 이의 용도{Novel ceramide derivatives, method for preparing the same and use thereof}

본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 신규 세라마이드 유도체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

<화학식 2>

상기 식에서,

R₁은 수소 또는 C1-C14의 알킬기이고;

R₂는 수소, 하이드록시기 또는 C1-C11의 알킬기이고;

R₄는 수소 또는 C1-C6의 알콕시기이다.

세라마이드는 자연적으로 존재하는 스핑고리피드(sphingolipids)계 화합물로서, 구체적으로는 하기 화학식 1로 표시되는 N-팔미틸 스핑고신(N-palmityl sphingosine)이다. 세라마이드는 지방산 라디칼에 아미노그룹이 존재하는 특징이 있다.

<화학식 1>

세라마이드는 주로 세포막 구성 인지질의 일종인 스핑고마이엘린(sphingomyelin; SM)으로부터 스핑고마이엘리나제(sphingomyelinase; SMase)라는 효소의 가수분해 작용에 의해 생성되며, 피부 각질층에 존재하는 주요 성분이다. 사람의 피부의 표면은 기저층으로부터 분화되어 성숙된 각질형성세포(keratinocytes)가 퇴화된 각질세포(corneocytes)로 보호되어 있으며, 이들 각질세포들은 각질층에 다량 존재하는 세라마이드의 이중 사슬 라멜라 구조에 의하여 피부표면에 결합되어 있어서 피부는 탄력성을 유지한다. 그러나, 나이가 들어 피부의 노화가 진행될수록 각질층 내 세라마이드의 함량이 감소되고, 이로 인해 피부 표면에 대한 각질세포의 결합력이 감소되어 피부는 보호를 받지 못한다. 즉, 각질층 내의 세라마이드의 함량이 감소함에 따라 수분의 손실, 자외선이나 화학물질 등의 외부자극에의 노출 및 각질세포 각리현상이 발생하여 피부 표면은 거칠게 된다. 이러한 경우 세라마이드를 외부에서 보충함으로써 피부의 라멜라 구조를 회복시켜 피부를 정상상태로 회복시킬 수 있음이 보고되고 있다. 또한, 세라마이드는 피부에 수분을 공급할 뿐 아니라 피부의 수분이 외부로 빠져나가지 못하게 한다(보습효과). 또한, 세라마이드는 피부 장벽에 매우 중요한 역할을 하며, 피부에 국소 도포된 세라마이드는 손상된 피부 장벽의 회복을 향상시키는 것으로 알려졌다. 현재 세라마이드는 기능성 화장품, 피부 및 모발 보습제 등의 주요 성분으로서 널리 사용되고 있다.

한편, 세라마이드가 세포의 막 구조를 형성하는 주요지질로서의 단순한 구조적인 기능 이외에 최근에 세포 분화 조절자 및 신호전달체계의 중간 전달 물질로서의 역할 등 다양한 생리활성 기능을 보유하고 있음이 밝혀지고 있다. 세라마이드 및 이의 유도체가 아폽토시스(apoptosis)를 촉진하며, 암세포의 증식을 억제하는 2차 전달 물질로 작용함이 밝혀졌다(Macchia M. et al., Farmaco. 58(3):205-11, 2003; Kimura K. et al., Cell Death Differ. 10(2):240-8, 2003; Kilkus J. et al., J. Neurosci. Res. 1;72(1):65-75, 2003). 세라마이드에 의한 아폽토시스는 크게 2가지 요인에 의하여 이루어지는데, 하나는 TNF와 같은 사이토카인(cytokine)에 의해 활성화된 중성 스핑고마이엘리나아제에 의해 세라마이드가 생성되어서 일어나는 경우와 다른 하나는 방사선, UV, 또는 H₂O₂ 등과 같은 스트레스에 의해 활성화된 산성 스핑고마이엘리나아제에 의해 세라마이드가 생성되어서 일어나는 경우이다. 상기 두 경우 모두 MAP 키나제(kinase) 경로를 조절하여 카스파제(caspase)를 활성화시킴으로써 궁극적으로 아폽토시스를 유도한다.

이와 같이 세라마이드의 다양한 생리학적 기능이 보고됨에 따라 천연 동식물 및 미생물계에서 신규 세라마이드 또는 이의 유도체를 분리하려는 시도가 계속되고 있다. 이에, 본 발명자들은 신규 세라마이드를 분리하기 위해 연구를 거듭하던 중, 불가사리로부터 신규 세라마이드 유도체를 분리하고, 이의 생리학적 기능을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 신규 세라마이드 유도체, 이의 제조방법 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 세라마이드 유도체를 제공한다.

상기 식에서,

R₁은 수소 또는 C1-C14의 알킬기이고;

R₂는 수소, 하이드록시기 또는 C1-C11의 알킬기이고;

R₄는 수소 또는 C1-C6의 알콕시기이다.

또한, 본 발명은 상기 세라마이드 유도체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 상기 세라마이드 유도체 또는 이의 염을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 세라마이드 유도체 또는 이의 염을 함유하는 피부질환 또는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 불가사리로부터 분리된 신규 세라마이드 유도체를 제공한다는 점에 특징이 있다. 본 발명에 따른 세라마이드 유도체는 하기 화학식 2로 표시된다.

<화학식 2>

상기 식에서,

R₁은 수소 또는 C1-C14의 알킬기이고;

R₂는 수소, 하이드록시기 또는 C1-C11의 알킬기이고;

R₄는 수소 또는 C1-C6의 알콕시기이다.

본 발명에 따른 바람직한 화합물은 R₁이 C14의 알킬기, R₂가 하이드록시기, R₃가 6-메틸 펜타데카-1,5,7-트리엔(6-methyl pentadeca-1,5,7-triene), R₄가 수소인 하기 화학식 3으로 표시될 수 있다.

<화학식 3>

상기 화학식 3으로 표시되는 화합물(이하, 'DNC-16-A'라 함)의 물리적/분광학적 특성은 다음과 같다.

1. 분자식: C₃₅H₆₅NO₄

2. 분자량: 563

3. 물질의 성상: 무색의 무정형고체 형태 물질

4. 녹는점: 68-70℃

5. 적외선 흡수대(KBr): 3317, 2918, 2849, 1650, 1540, 1450, 1409 cm^-1

6: 자외선 흡수대(MeOH): λ=235nm (ε 4.52)

7: ¹H 및 ¹³C-NMR: 표 1 참조

8. 용해성: 클로로포름, 아세톤, 메탄올 등의 중정도 극성 및 극성 유기용매에 잘 녹는다.

9. 화학 구조상의 특징: 지방산의 탄소수가 16개이고, 스핑고신 영역에 메틸 부타디엔(methyl butadiene) 기가 있다.

또한, 본 발명에 따른 바람직한 화합물은 R₁이 C14의 알킬기, R₂가 하이드록시기, R₃가 1-하이드록시-노나데카-11-엔(1-hydroxy-nonadeca-11-ene), R₄가 수소인 하기 화학식 4로 표시될 수 있다.

<화학식 4>

상기 화학식 4로 표시되는 화합물(이하, 'DNC-16-B'라 함)의 물리적/분광학적 특성은 다음과 같다.

1. 분자식: C₃₈H₇₅NO₅

2. 분자량: 625

3. 물질의 성상: 무색의 고형물질

4. 녹는점: 135-137℃

5. 적외선 흡수대(KBr): 3313, 2919, 2850, 1634, 1545, 1457 cm^-1

6: 자외선 흡수대(MeOH): 200 - 600nm 범위에서 미검출됨

7: ¹H 및 ¹³C-NMR: 표 2 참조

9. 화학 구조상의 특징: 지방산에 있는 탄소수가 16개이고, 스핑고신 영역에서 탄소 4 위치에 하이드록시기가 있고, 탄소 14 위치에 이중 결합이 있다.

나아가, 본 발명에 따른 바람직한 화합물은 R₁이 C14의 알킬기이고, R₂가 하이드록시기, R₃가 노나데카-1,11-다이엔(nonadeca-1,11-diene), R₄가 수소인 하기 화학식 5로 표시될 수 있다.

<화학식 5>

상기 화학식 5로 표시되는 화합물(이하, 'DNC-16-C'이라 함)의 물리적/분광학적 특성은 다음과 같다.

1. 분자식: C₃₈H₇₃NO₄

2. 분자량: 607

3. 물질의 성상: 무색의 반고형 물질

4. 녹는점: 64-67℃

5. 적외선 흡수대(KBr): 3364, 2921, 2845, 1647, 1450, 1414, 1112 cm^-1

6: 자외선 흡수대(MeOH): 200 - 600nm 범위에서 미검출됨

7: ¹H 및 ¹³C-NMR: 표 3 참조

9. 화학 구조상의 특징: 지방산에 있는 탄소수가 16개이며, 스핑고신 영역에서 탄소 4 및 14 위치에 이중 결합이 있다.

본 발명에 따른 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은, 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한, 상기 무기산은, 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명은 상기 화합물의 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 하기의 단계를 포함한다:

(a) 불가사리를 유기용매로 추출하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 얻은 추출물을 감압농축한 후, 메탄올과 헥산의 혼합용매로 극성에 따라 분획하여 활성분획을 얻는 단계; 및

(c) 상기 활성분획을 크로마토그래피로 분리 정제하는 단계.

상기 (a) 단계는 불가사리로부터 본 발명에 따른 화합물을 추출하는 단계로서, 본 발명에 따른 화합물은 바람직하게는 디스톨아스테리아스 니폰(Distolasterias nipon)으로부터 추출되는 것이 바람직하다. 또한, 추출에 사용되는 유기용매는, 이에 제한되는 것은 아니나, 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 아세톤 및 디클로로메탄으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 바람직한 유기용매는 메탄올이다. 구체적으로 본 발명에서는 디스톨아스테리아스 니폰을 절단한 후, 메탄올을 가하여 48시간 동안 방치함으로써 본 발명에 따른 화합물을 추출하였다.

상기 (b) 단계는 추출물로부터 활성분획을 얻는 단계로서, 상기 혼합용매는 메탄올 50-80%와 헥산 20-50%로 이루어진 용매가 바람직하다. 구체적으로 본 발명에서는 (a) 단계로 얻은 추출물을 메탄올 80%와 헥산 20%으로 이루어진 혼합 용매에 용해시키고 2시간 이상 방치하여 메탄올층과 헥산층으로 분획하였다. 이후, 수소 핵자기 공명 분광 스펙트럼으로 각 층에 함유되어 있는 물질을 확인하였다.

상기 (c) 단계는 본 발명에 따른 화합물을 분리 정제하는 단계로서, 상기 (b) 단계에서 얻은 세라마이드를 포함하고 있는 활성분획(헥산층)을 크로마토그래피로 분리한다. 이 때 크로마토그래피로는 실리카 크로마토그래피(silica vaccum chromatography), 역상 반-분취 고성능 액체 크로마토그래피(reversed-phased semi-preparative HPLC) 및 C₁₈ 역상 반-분취 고성능 액체 크로마토크래피(C₁₈ reversed-phased semi-preparative HPLC)를 순차적으로 행하는 것이 바람직하다. 실리카 크로마토그래피 수행시에는 용리액으로 헥산, 에틸아세테이트, 아세톤 및 메탄올을 순차적으로 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 역상 반-분취 고성능 액체 크로마토 그래피 수행시에는 용리액으로 메탄올을 사용하는 것이 바람직하며, C₁₈ 역상 반-분취 고성능 액체 크로마토크래피 수행시에는 용리액으로 메탄올 80%와 아세톤나이트릴 20%로 이루어진 혼합용매를 사용하는 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명에서는 실리카 크로마토그래피를 통해 아세톤층에 세라마이드 성분이 함유되어 있는 것을 확인하였으며, 상기 아세톤층을 역상 반-분취 고성능 액체 크로마토그래피로 분리한 결과 머무름 시간 17분, 22분 및 27분의 분획에 세라마이드 성분이 함유되어 있는 것을 확인하였다. 상기 세라마이드 성분을 더욱 분리 정제하기 위하여 상기 각 활성분획을 대상으로 C₁₈ 역상 반-분취 고성능 액체 크로마토크래피를 수행한 결과, 머무름 시간 30분, 20분 및 18분에서 무정형고체 형태의 물질(DNC-16-A), 고형물질(DNC-16-B) 및 무색의 반고형 물질(DNC-16-C)을 각각 얻었다. 이후, 핵자기 공명(nuclear magnetic resonance; NMR) 스펙트럼, 적외선 및 자외선 분광 분석, 고해상 질량 분석 등을 수행하여 각 화합물의 구조를 확인하였다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 세라마이드 유도체의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 화합물은 외부자극에 의해 손상된 피부 장벽의 회복 및 피부 보호 효과를 나타낸다. 구체적으로 본 발명의 바람직한 실시예에서는 TEWL(total epidermal water loss) 측정을 통해 본 발명에 따른 화합물이 피부 장벽대(skin barrier) 손상에 의한 경표피 수분 소실을 유의적으로 감소시킴을 확인하였다(도 1 참조). 상기 TEWL 측정은 기능성 표피장벽 연구(functional epidermal barrier research)의 기본으로, 이를 통해 보습력 및 장벽복구기능을 알 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 염을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 아이에센스, 아이크림, 팩 또는 젤 등으로 제형화될 수 있으며, 그 제형은 특별히 제한되지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장료 조성물의 제형 또는 사용목적에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분들, 예컨대, 천연오일, 왁스, 검, 향, 색소 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 세라마이드 유도체는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 1-50중량%, 바람직하게는 10-30중량%의 범위 내에서 제형에 따라 적절하게 배합될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 피부 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약학적 조성물은 피부 장벽에 결함이 있거나 불완전한 피부 장벽이 요인이 되는 임의의 질환 상태를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 피부의 수분 손실에 의해 유발되거나 또는 피부의 수분 손실을 동반하는 임의의 질환 상태를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 이러한 면에서 상기 조성물은 세제, 비누, 및 열수에의 규칙적인 노출; 추위, 바람, UV에의 계절적인 노출; 화학물질, 다른 건조제 또는 손상제에의 직업적 노출로 인한 일반적인 건성 피부 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 각질이 매우 두껍지만 피부 지질 장벽이 부족한 발바닥과 손바닥에서 발생하는 것과 같은 불완전한 피부 장벽의 치료에도 사용될 수 있다. 상기 불완전한 피부 장벽은 종종 화상, 상처, 수포, 울혈성 궤양 및 욕창과 관련되어 일어나며, 본 발명에 따른 조성물은 이러한 손상의 치료에 효과가 있을 것으로 기대할 수 있다. 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염 등의 피부 질환은 피부 건조를 동반하는데, 경표피의 수분손실을 억제할 때 피부질환이 개선된다는 사실이 보고된 바 있다(Berardesca E and Distante F, Contact Dermatitis 31:281-287, 1994; Agner T, Acta Derm Venereol Suppl. 173:1-26, 1992). 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 습진, 건선, 어린선, 아토피성 피부염, 피부염증, 소양증, 세균감염증, 여드름 또는 창상 등과 같은 병리학적 피부 질환의 예방 또는 치료에도 효과적으로 사용될 수 있다. 또한, 건성 피부가 노화와 관련있다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 노화 피부에 대한 추가의 손상을 예방하거나 또는 건성 피부와 관련되는 잔주름과 주름살의 발생 및 노화와 함께 발생하는 각질의 얇아짐을 포함하는 이미 존재하는 피부 손상, 즉 피부노화에 의해 발생하는 여러 피부질환의 치료에 사용될 수 있다.

최근 아폽포시스 촉진제는 암을 치료하는 핵심 표적으로 급부상하고 있다. 아폽토시스와 관련한 암 치료법 중에서 가장 흥미로운 분야 중의 하나는 스핑고리피드 경로를 이용하는 것이다. 많은 연구를 통해 스핑고리피드가 아폽토시스와 관련이 있는 것으로 보고되고 있으며, 특히 스핑고리피드가 일종인 세라마이드가 아폽토시스를 촉진하는 것으로 밝혀지고 있다. 또한, 세포 내 세라마이드 증가에 의해 암세포의 사멸이 유도된다고 보고됨에 따라 현재 천연 세라마이드 뿐만 아니라 세포 내 세라마이드 수준을 높이는 약물들이 항암제로 사용되고 있다(Radin N. S., Biochem. J., 371:243-256, 2003; Sawada, M. et al., Cell Death Differ. 7:761-772, 2000; Myrick, D. et al., Leuk. Res. 23:569-578, 1999; Biswal, S. S. et al., Toxicology 154:45-53, 2000; Ferraro, C. et al., Cell Death Differ. 7:197-206, 2000). 본 발명에 따른 화학식 3 및 4로 표시되는 세라마이드 유도체(DNC-16-A 및 DNA-16-B)는 아폽토시스를 유도하여 세포 독성 효과를 나타낸다(도 2 내지 도 4 참조). 따라서, 본 발명은 화학식 3 또는 4로 표시되는 세라마이드 유도체 또는 이의 염을 함유하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 암에는, 이에 한정되지는 않으나, 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신경세포종/신경교아세포종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종과 같은 암 또는 이들 암의 하나 이상의 조합일 수 있다.

특히, 본 발명에서는 일 실시예에서는 본 발명에 따른 화학식 3 및 4로 표시되는 세라마이드 유도체가 인간 각질 형성 세포주(human keratinocyte cell line)에서 아폽토시스를 유도함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 화학식 3 또는 4로 표시되는 세라마이드 유도체 또는 이의 염은 습진, 건선, 어린선 등과 같은 각질 이상 피부 질환에서 각질세포의 아폽포시스를 유도하여 상기 질환의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는, 경구 투여의 경우에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및/또는 향료를 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 및/또는 안정화제를 사용할 수 있으며, 또한 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및/또는 보존제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트포키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼(wafer)등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 치료학적 또는 예방학적 유효량은 투여대상, 연령, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

불가사리로부터 세라마이드 유도체의 분리 및 정제

불가사리 디스톨아스테리아스 니폰(Distolasterias nipon) 1.2 kg(건조 중량)을 칼로 2-3 cm 길이로 절단하고, 메탄올 3 ℓ를 가하여 48시간 동안 방치한 후, 그 용액을 여과하였다. 상기 과정을 2회 반복한 후 메탄올 여과액을 감압농축하여 추출물 140 g을 수득하였다. 상기 추출물에 메탄올 80%와 헥산 20%로 이루어진 혼합용매를 첨가하고 층이 분리되도록 2시간 이상 방치하여 극성에 따라 용액을 분획하였다. 두 층으로 분리된 분획에서 용매를 감압 증류기로 제거한 후 얻어진 각 분획의 양을 측정한 결과, 헥산층은 약 17 g이었으며 메탄올층은 약 100 g 이었다. 이후, 각 층에 해당되는 물질에 대하여 수소 핵자기 공명 분광기로 스펙트럼을 측정, 분석한 결과 헥산층에 세라마이드가 함유되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

이후, 헥산층에 있는 세라마이드를 분리하기 위하여 실리카 크로마토그래피 를 수행하였다. 이 때 용리액은 100% 헥산, 100% 에틸아세테이트, 100% 아세톤, 100% 메탄올 순으로 사용하였다. 수득된 각 분획의 양은 0.95 g(헥산), 7.77 g(에틸아세테이트), 0.80 g(아세톤), 2.68 g(메탄올)이었다. 각 분획에 있는 물질을 확인하기 위하여 수소 핵자기공명 분광스펙트럼 측정을 하였다. 그 결과, 세라마이드는 아세톤층에 함유되어 있음을 확인할 수 있었다.

아세톤층에 존재하는 세라마이드를 분리하기 위하여, 감압 증류기로 아세톤 용매를 제거한 후 역상 반-분취 HPLC 컬럼(reversed-phased semi-preparative HPLC column)(YMC ODS-C18 입자 직경 5 μm, 250 ×10 mm (길이 ×내경), 용출속도 2.9 ㎖/min, 굴절율 검출기) 상에서 크로마토그래피를 수행하였다. 이 때 100% 메탄올을 용리액으로 사용하였다. 각 분획의 수소 핵자기공명 분광스펙트럼 분석 결과, 머무름 시간 17분, 22분 및 27분에 용출된 반고형 성분들이 세라마이드임을 확인할 수 있었다.

각 세라마이드 성분을 더욱 정제하기 위하여, 먼저 머무름 시간 17분에서 얻어진 반고형 성분을 20% 아세토 나이트릴/80% 메탄올에 녹인 후 다시 100% 메탄올을 용리액으로 하여 C₁₈ 역상 반-분취 HPLC 컬럼(C₁₈reversed-phase semi-preparativeHPLC column)(YMC ODS-A, 입자 직경 5 μm, 250 ×10 mm (길이 ×내경), 용출속도 2 ml/min, 굴절율 검출기) 상에서 크로마토그래피를 수행하였다. 그 결과, 머무름 시간 30분에서 무정형고체 형태의 물질 12.4 mg을 수득하였으며, 이를 'DNC-16-A'라 명명하였다.

또한, 상기 머무름 시간 22분에 얻어진 반고형 성분을 상기와 동일한 조건으로 C₁₈ 역상 반-분취 HPLC를 수행한 결과, 머무름 시간 20분에서 고형성분 32.1 mg을 수득하였으며, 이를 'DNC-16-B'라 명명하였다.

마지막으로, 상기 머무름 시간 27분에 얻어진 성분을 상기와 동일한 조건으로 C₁₈ 역상 반-분취 HPLC를 수행한 결과, 머무름 시간 18분에서 무색의 반고형 물질 13.9 mg을 수득하였으며, 이를 'DNC-16-C'라 명명하였다.

<실시예 2>

구조 및 물리적/분광학적 특성 분석

<2-1> 구조 분석

상기 실시예 1에서 얻어진 3개의 화합물(DNC-16-A, DNC-16-B 및 DNC-16-C)의 구조를 NMR 스펙트럼, 적외선/자외선 분광 분석 및 고해상 질량 분석을 수행하여 결정하였으며, 상기 NMR 스펙트럼에서 ¹H-nmr 시그날과 ¹³C-nmr 시그날에 대한 위치지정(assignment)은 COSY, TOCSY, gradient HSQC, gradient HMBC 등의 다차원 핵자기 공명 실험을 통하여 수행하였다. 이 때 ¹H과 ¹³C NMR 스펙트럼은 메탄올-d ₄ 용매로 각각 500 MHz와 125 MHz에서 측정하였다. 화학전이는 ¹H의 경우에는 테트라메틸실란 피크(0 ppm)를 기준으로 하였으며, ¹³C의 경우에는 메탄올-d₄용매에서 잔여용매 피크(49 ppm)를 기준으로 하였다. 또한, 각 화합물의 스핑고리피드에 있는 지방산과 스핑고신의 탄소수를 결정하기 위하여 기체크로마토그래피-질량분석기를 활용하였다.

a. DNC-16-A의 구조 분석 결과

DNC-16-A는 탄소 3 및 2' 위치에 각각 하이드록시기가 있고, 탄소 4 위치에 이중 결합을 가진 일반적인 세라마이드 형태를 지니고 있는 분자식 C₃₅H₆₅NO ₄의 스핑고리피드계 화합물로 확인되었다. DNC-16-A의 구조를 하기 화학식 3으로 표시하였다.

<화학식 3>

그러나, DNC-16-A는, 상기 화학식 3에서 보는 바와 같이, 지방산의 탄소수가 16개이고 스핑고신 영역에 메틸 부타디엔 기가 존재하는 점에 특징이 있다. 문헌 조사 결과, DNC-16-A는 지방산의 탄소수와 스핑고신에 있는 탄소수면에서 지금까지 알려진 세라마이드류와 전혀 상이한 신규 화합물로 판명되었다. DNC-16-A의 구조에 대한 지정은 하기 표 1과 같다.

DNC-16-A의¹H와¹³C NMR 지정

위치	DNC-16-A
위치	¹H	¹³C
1 23456789101112(CH₂)₅ 18191'2'3'(CH₂)₁₂ 16'	3.66 ( 1H, dd, J = 11.2, 3.9 ),3.78 ( 1H, dd, J = 11.2, 5.4 )3.84 ( 1H, ddd, J = 7.3, 5.4, 3.9 )4.09 ( 1H, dd, J = 7.3, 7.3 )5.50 ( 1H, dd, J = 15.6, 7.3 )5.72 ( 1H, dt, J = 15.6, 6.4 )2.10 ( 2H, dt, J = 6.4, 7.3 )2.20 ( 2H, dt. J = 7.3, 7.3 )5.35 ( 1H, t, J = 7.3 ) 6.02 ( 1H, d, J = 15.6 )5.54 ( 1H, dt, J = 15.6, 7.3 )2.08 ( 2H, dt, J = 7.3, 6.8 )1.29-1.31 ( 10H, m )0.89 ( 3H, t, J = 6.9 )1.71 ( 3H, s ) 3.99 ( 1H, dd, J = 7.8, 3.9 )1.55 ( 1H, m ), 1.71 ( 1H, m )1.29-1.39 ( 24H, m )0.89 ( 3H, t, J = 6.9 )	61.9, t 56.0, d 73.2, d131.5, d134.1, d 33.0, t 28.7, t130.2, d135.1, s136.1, d128.5, d 33.9, t30.9-30.3, t 14.4, q 12.7, q177.1, s 73.0, d 35.9, t30.9-28.7, t 14.4, q

b. DNC-16-B의 구조 분석 결과

DNC-16-B는 탄소 3, 4 및 2' 위치에 각각의 하이드록시기를 가지고 있고 스핑고신 영역에 이중 결합을 한 개 가지고 있는 분자식 C₃₈H₇₅NO₅의 스핑고리피드계 화합물로 확인되었다. DNC-16-B의 구조를 하기 화학식 4로 표시하였다.

<화학식 4>

DNC-16-B는 상기 화학식 4에서 보는 바와 같이, 지방산에 있는 탄소수가 16개이고 스핑고신 영역에서 탄소 4의 위치에 하이드록시기가 있고, 탄소 14 위치에 이중 결합이 있는 점에 특징이 있다. 문헌조사 결과, DNC-16-B는 이중 결합의 위치 및 탄소수 면에서 지금까지 알려진 세라마이드류와 전혀 상이한 신규 물질로 판명되었다. 세라마이드 DNC-16-B의 구조에 대한 지정은 하기 표 2와 같다.

DNC-16-B의¹H와¹³C NMR 지정

위치	DNC-16-B
위치	¹H	¹³C
12345(CH₂)₇ 1314, 1516(CH₂)₅ 181'2'3'(CH₂)₁₂ 16'	3.74 ( 1H, d, J = 4.4 ), 3.75 ( 1H, d, J = 4.4 )4.09 ( 1H, ddd, J = 4.4, 4.4, 5.9 )3.56 ( 1H, dd, J = 5.9, 5.9 )3.51 ( 1H, ddd, J = 8.7, 5.9, 2.9 )1.64 ( 1H, m ), 1.41( 1H, m )1.42-1.28 ( 14H, m )2.02 ( 2H, m )5.33 ( 2H, t, J = 4.9 )2.02 ( 2H, m )1.42-1.28 ( 10H, m )0.89 ( 3H, t, J = 6.4 ) 4.02 ( 1H, dd, J = 7.3, 3.9 )1.58 ( 1H, m ), 1.73 ( 1H, m )1.29-1.39 ( 24H, m )0.89 ( 3H, t, J = 6.4 )	62.0, t 52.9, d 76.0, d 73.2, d 33.0, t30.9-30.5, t 28.2, t130.8, d 28.2, t30.9-30.5, t 14.4, q176.9, s 72.9, d 35.0, t30.9-23.7, t 14.4, q

c. DNC-16-C의 구조 분석 결과

DNC-16-C는 DNC-16-A와 같이 탄소 3 및 2'의 위치에 각각의 하이드록시기를 가지고 있으며 탄소 4 위치에 이중 결합을 한 개 가지고 있는 분자식 C₃₈H₇₃NO ₄의 스핑고리피드계 화합물로 확인되었다. DNC-16-C의 구조를 하기 화학식 5로 표시하였다.

<화학식 5>

DNC-16-C는, 상기 화학식 5에서 보는 바와 같이, DNC-16-A와 같이 지방산에 있는 탄소수가 16개이나, 스핑고신 영역에서 메틸 부타디엔 대신 탄소 14 위치에 이중 결합이 존재한다는 점에 특징이 있다. 문헌조사 결과, DNC-16-B와 마찬가지로 DNC-16-C 또한 이중 결합의 위치 및 탄소수면에서 지금까지 알려진 세라마이드류와 전혀 상이한 신규 화합물로 판명되었다. 세라마이드 DNC-16-C의 구조에 대한 지정은 하기 표 3과 같다.

DNC-16-C의¹H와¹³C NMR 지정

위치	DNC-16-C
위치	¹H	¹³C
1 23456(CH₂)₆ 1314, 1516(CH₂)₅ 181'2'3'(CH₂)₁₂ 16'	3.78 ( 1H, dd, J = 11.2, 4.9 ),3.66 ( 1H, dd, J = 11.2, 3.9 )3.84 ( 1H, ddd, J = 7.3, 4.9, 3.9 )4.07 ( 1H, dd, J = 7.3, 7.3 )5.46 ( 1H, dd, J = 15.1, 7.3 )5.70 ( 1H, dt, J = 15.1, 6.8 )2.01 ( 2H, m )1.42-1.28 ( 12H, m )2.02 ( 2H, m )5.34 ( 2H, t, J = 4.9 )2.02 ( 2H, m )1.42-1.28 ( 10H, m )0.89 ( 3H, t, J = 5.9 ) 3.98 ( 1H, dd, J = 7.8, 3.9 )1.54 ( 1H, m ), 1.70 ( 1H, m )1.28-1.41 ( 24H, m )0.89 ( 3H, t, J = 5.9 )	62.0, t 56.0, d 73.3, d131.1, d134.9, d 33.5, t30.9-30.2, t 28.2, t130.8, d 28.2, t30.9-30.2, t 14.5, q177.1, s 73.0, d 35.9, t30.9-23.7, t 14.5, q

<2-2> 물리적/분광학적 특성 분석 결과

물질 성상, 용해도 등을 분석하여 각 화합물의 특성을 분석한 결과, 본 발명에 따른 화합물들은 모두 무색의 고형물질로서, 실온에서 대체적으로 안정하며, 클로로포름, 아세톤, 메탄올 등 중정도 극성 및 극성 유기용매에 잘 녹는 것으로 확인되었다. 본 발명에 따른 세라마이드 유도체의 특성을 비교한 결과를 하기 표 4에 기재하였다.

본 발명에 따른 세라마이드 유도체의 물리적/분광학적 특성

	DNC-16-A	DNC-16-B	DNC-16-C
분자식	C₃₅H₆₅NO₄	C₃₈H₇₅NO₅	C₃₈H₇₃NO₄
분자량	563	625	607
색	무색	무색	무색
녹는점	68-70℃	135-137℃	64-67℃
적외선 흡수대	3317, 2918, 2849, 1650, 1540, 1450, 1409 cm^-1	3313, 2919, 2850, 1634, 1545, 1457 cm^-1	3364, 2921, 2845, 1647, 1450, 1414, 1112 cm^-1
자외선 흡수대	λ=235nm (ε 4.52)	200 -600nm에서 미검출됨	200 -600nm에서 미검출됨
용해성	클로로포름, 아세톤, 메탄올 등의 중정도 극성 및 극성 유기용매에 잘 녹는다.

<실시예 3>

생리활성 측정

<3-1> 경표피 수분 손실 측정 실험(TEWL)

먼저, 본 발명에 따른 세라마이드 유도체 DNC-16-A, DNC-16-B 및 DNC-16-C를 소량의 70% 에탄올에 용해시킨 후, 이를 백색 페트로라텀(petrolatum)(Sigma Chemicals (St. Louis, MO) 혼합하여 각각 2%의 크림제제(Cream A, Cream B 및 Cream C)를 제조하였다. 실험 생쥐(hairless mice)들을 최소 1시간 전에 측정장소로 옮겨져 환경에 적응하도록 하였다. 각 생쥐의 배부(back)에 고용량(3 minimal erythemal dose, 3MED)의 자외선 B를 조사한 후, 7일 동안 상기 크림제제를 마우스의 배부에 도포하였다. 이후, 경표피 수분 손실 변화를 TWEL(transepidermal water loss) 어세이를 통하여 측정하였다. TWEL 어세이는 온도 20-22℃, 습도 30-32%로 유지되는 항온 항습실에서 수행하였으며, 컴퓨터 프로그램(S. Bagley, personal communication)을 이용하여 수분손실량(g/표피면적/단위시간)을 측정하였다(Nolte et al., Arch. Dermatol. Res. 285:466-474. 1993.; Hanley et al., J. Invest. Dermatol. 106:404-411. 1996; Harman et al., Development 125:1541-1552. 1998). 대조군에는 자외선 조사 후 아무 것도 처리하지 않았다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, 3MED의 자외선 조사 후 본 발명에 따른 화합물들을 포함하는 크림제제를 도포한 실험군 모두에서 대조군에 비해 경표피 수분 손실이 유의하게(p<0.01) 감소되었다. 특히, DNC-16-C를 함유하는 크림제제(Cream C)를 도포한 군에서 가장 유의한 감소를 보였다. 그러나, 실험군 간 유의적 차이는 없었다. 이로부터 본 발명에 따른 세라마이드 유도체들이 모두 자외선 B 조사에 의한 피부장벽대(skin barrier) 손상 후 경표피 수분 손실을 유의하게 감소시킴을 확인할 수 있었다.

<3-2> 세포 독성 효과 조사(MTT 어세이)

본 발명에 따른 화합물들의 세포 독성 효과를 조사하기 위하여 MTT 어세이를 수행하였다. 인간 각질형성 세포주(human keratinocyte cell line, 독일 암 연구소의 N. Fuseng 교수로부터 제공받음)인 HaCaT 세포을 100 mm 디쉬에 1×10⁶ cells/ml의 농도로 분주하여 5% CO₂, 37℃의 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 이 때 배지로는 10% FBS(fetal bovine serum, GIBCO), 100 units/㎖ 페니실린(penicillin) 및 100 μg/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)을 함유하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, GIBCO)을 사용하였다.

이후, 배양된 세포에 트립신(trypsin)을 처리한 후, 세포들을 다시 96-웰 플레이트에 웰(well)당 1-2 ×10⁴ cells/㎖의 농도로 분주하여 무혈청 배지(serum-free medium)에서 배양하였다. 약 3시간 후, DMSO에 용해된 본 발명에 따른 화합물들을 최종농도 0-30 μM로 24시간 동안 각각 처리하였다. 이후, MTT(3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide)(Sigma Chemicals(St. Louis, MO)를 2 ㎎/㎖의 농도로 첨가하여 4시간 동안 더 배양하였다. 배지를 완전히 제거하고 세포를 DMSO에 현탁시켜 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, DNC-16-A는 1-30 μM의 농도에서 각각 24-44%의 세포독성효과를 나타내었으며, DNC-16-B는 33-55%의 세포독성효과를 나타내었다. 반면, DNC-16-C는 거의 세포 독성 효과를 나타내지 않았다. 이로부터 DNC-16-A 및 DNC-16-B가 농도 의존적으로 세포 성장(cell growth)을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

<3-3> 아폽토시스 유도 효과 조사

a. TUNEL 어세이(TdT-mediated dUTP nick end labeling- assay)

인 시투 세포 사멸 검출 키트(in situ cell death detection kit, POD)(Enzo, 1684817, Boeringer Mannhein)를 이용하여 본 발명에 따른 화합물들이 세포의 아폽토시스를 유도하는지 조사하였다. TC 챔버(Lab-TEK chamber Slide w/cover Permanox Slide sterile 1 well, 177410)에 HaCaT 세포를 1 ×10⁶ cells/㎖의 농도로 씨딩(seeding)하여 0.25% FBS를 함유하는 DMEM에서 18시간 이상 배양하였다. 이후, 본 발명에 따른 화합물들을 각각 10 μM의 농도로 처리하였다. 24시간 후 세포를 고정시킨 후, 블로킹 용액(blocking solution)(3% H₂O₂ in MeOH)으로 내인성 퍼옥시다제(peroxidase)를 차단하고 투과성 용액(permeabilization solution)(0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate)으로 세포의 투과성을 증대시켰다. 이후, TUNEL 반응 용액을 이용하여 아폽토틱 세포들(apoptotic cells)을 표지(labeling)한 후, DAB 기질(DAKO, K3465)를 이용하여 발색시켰다. 이후, 현미경을 이용하여 발색된 세포를 관찰하였다. 모든 실험은 수 차례 반복 수행되었다.

그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, DNC-16-A 및 DNC-16-B 처리군에서는 아폽토시스가 관찰된 반면, DNC-16-C 처리군에서는 아폽토시스가 관찰되지 않았다. 이 결과를 통하여 상기 실시예 <3-2>에서 확인된 DNC-16-A 및 DNC-16-B의 세포 독성 효과가 아폽토시스에 기인한 것임을 알 수 있었다.

b. 활성형 카스파제-3(cpp20) 발현 유도

카스파제, 특히 카스파제 3이 아폽토시스의 유도에 중요한 조절인자로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명에 따른 화합물에 의해 카스파제-3가 활성화되는지 조사하였다. 상기 실시예 <3-2>과 동일한 방법으로 HaCaT 세포에 본 발명에 따른 화합물들을 10 μM의 농도로 처리하여 100-mm 디쉬에서 배양한 후, 시간대 별로 수거하였다. 수거된 각 세포에 500 ㎕ RIPA 용해 완충용액(1% Nonidet P-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.15 M SDS, 0.01 M sodium phosphate, pH 7.2, 2 mM EDTA, 50 mM sodium fluoride, 0.2 mM sodium vanadate)을 처리하여 단백질을 추출하였다. 브래드포드(Bradford) 방법으로 단백질 농도를 측정하였다. 이후, 12% 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동을 수행한 후, 니크로셀룰로스 막으로 전이하였다. 5% 논-팻 밀크(non-fat milk)로 블로킹(blocking)한 막을 1차 항체(caspase-3 p20 (cpp20))(Delta Biolabs, Campbell, CA)와 반응시켰다. 막을 세척한 후, HRP-결합 2차 항체(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)와 반응시켰다. ECL 키트(Amersham, Piscataway, NJ)를 이용하여 단백질 강도(protein intensity)를 분석하였다.

그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, DNC-16-A를 처리한 경우, 활성형 카스파제-3(cpp20)의 발현은 시간 경과에 따라 서서히 증가하다가 6시간에 가장 높은 수준을 나타내었으며, 그 이후에는 감소하였다. 또한, DNC-16-B를 처리한 경우, 활성형 카스파제-3(cpp20)의 발현은 1시간부터 증가되어 24시간까지 계속적으로 증가하였다. 반면, DNC-16-C의 경우에는 TUMEL 어세이 결과와 유사하게 활성형 카스파제-3(cpp20)이 활성화되지 않았다. 상기 결과를 통해 본 발명에 따른 DNC-16-A 및 DNC-16-B가 카스파제 활성화를 통하여 아폽토시스를 효과적으로 유도하는 것으로 사료된다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 불가사리로부터 신규 세라마이드 유도체를 분리하고, 이의 생리학적 기능을 규명하였다. 본 발명에 따른 세라마이드 유도체는 손상된 피부 장벽의 회복/피부 보호 효과 및/또는 아폽토시스 유도에 의한 세포 독성 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 세라마이드 유도체는 화장료 조성물, 피부질환 치료 및 예방용 조성물 및/또는 암 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 화합물의 경표피 수분 손실 측정 실험 결과를 나타낸 것이다.

non-UVB: UV 조사하지 않는 경우

UVB: UV 조사 후 무처리

UVB+Cream A: UV 조사 후, 화학식 3으로 표시되는 DNC-16-A를 함유하는 크림 제제 처리

UVB+Cream B: UV 조사 후, 화학식 4로 표시되는 DNC-16-B를 함유하는 크림 제제 처리

UVB+Cream C: UV 조사 후, 화학식 5로 표시되는 DNC-16-C를 함유하는 크림 제제 처리

도 2는 본 발명에 따른 화합물의 세포 독성 효과를 조사하기 위하여, MTT 어세이를 수행한 결과이다.

A: DNC-16-A 처리

B: DNC-16-B 처리

C: DNC-16-C 처리

도 3은 본 발명에 따른 화합물의 아폽토시스 유도 효과를 조사하기 위하여, TUNEL 어세이를 2회 수행한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 화합물의 아폽토시스 유도 효과를 조사하기 위하여, 활성형 카스파제-3의 발현 정도를 웨스턴 블럿으로 측정한 결과이다.

Claims

하기 화학식 2로 표시되는 세라마이드 유도체.

<화학식 2>

상기 식에서,

R₁은 수소 또는 C1-C14의 알킬기이고;

R₂는 수소, 하이드록시기 또는 C1-C11의 알킬기이고;

R₃는 6-메틸 펜타데카-1,5,7-트리엔, 1-하이드록시-노나데카-11-엔 또는 노나데카-1,11-다이엔이고; 및

R₄는 수소 또는 C1-C6의 알콕시기이다.
제 1항에 있어서, 하기 화학식 3으로 표시되는 세라마이드 유도체.

<화학식 3>
제 1항에 있어서, 하기 화학식 4로 표시되는 세라마이드 유도체.

<화학식 4>
제 1항에 있어서, 하기 화학식 5로 표시되는 세라마이드 유도체.

<화학식 5>
(a) 불가사리를 유기용매로 추출하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 얻은 추출물을 감압농축한 후, 메탄올과 헥산의 혼합용매로 극성에 따라 분획하여 활성분획을 얻는 단계; 및

(c) 상기 활성분획을 크로마토그래피로 분리 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항의 세라마이드 유도체의 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 불가사리는 디스톨아스테리아스 니폰(Distolasterias nipon)인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 (a)의 유기용매는 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 아세톤 및 디클로로메탄으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 (c) 단계는 실리카 크로마토그래피, 역상 반-분취 고성능 액체 크로마토그래피 및 C₁₈ 역상 반-분취 고성능 액체 크로마토크래피를 순차적으로 행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 염을 함유하는 화장료 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 피부질환 치료용 약학적 조성물.
제3항 또는 제4항의 세라마이드 유도체, 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물.