KR20180115035A

KR20180115035A - 아무르불가사리 지방산을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20180115035A
Application number: KR1020170047170A
Authority: KR
Inventors: 박우정; 유상권
Original assignee: 강릉원주대학교산학협력단
Priority date: 2017-04-12
Filing date: 2017-04-12
Publication date: 2018-10-22
Also published as: KR102406165B1; KR102406165B9

Abstract

아무르불가사리(Asterias amurensis) 스킨, 생식샘 및 소화샘으로부터 추출된 지방산을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 아무르불가사리 지방산은 세포독성을 나타내지 않으며, NF-κB 및 MAPK 신호 전달 경로의 단백질 인산화를 억제하고, 산화질소 생성 및 염증관련 인자의 발현을 억제하는 효과가 있어 염증 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

아무르불가사리 지방산을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for prevention or treatment of inflammatory disease comprising Asterias amurensis fatty acids}

아무르불가사리(Asterias amurensis) 스킨, 생식샘 및 소화샘으로부터 추출된 지방산을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.

지용성 비타민과 필수 지방산을 함유한 지질(lipids)은 인간의 건강과 발달에 중요한 구성성분이며, 구성(지방산 조성) 변화에 따라 질병들을 예방하는데 중요한 역할을 한다. 특히, 포화 지방산(saturated fatty acid; SFA)과 그 대사 산물의 대사 변화는 심혈관 질환(cardiovascular disease; CVD)과 암(cancer)과 같은 많은 질병을 유발한다. 반면, 팔미톨레산(palmitoleic acid, 16:1)과 같은 단일 불포화 지방산(monounsaturated fatty acid; MUFA)은 관상 동맥성 심장 질환(coronary heart disease), 비알코올성 지방간 질환(nonalcoholic fatty liver disease) 및 심혈관 질환에 유용한 것으로 보고되고 있으며, 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid; EPA, 20:5n-3) 및 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid; DHA, 22:6n-3)과 같은 다중 불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid; PUFA)은 지방간 질환(fatty liver disease), 심혈관 질환, 암 질환 등과 유의한 연관성이 있는 것으로 알려져있다.

특히, 탄소 수 30개 이상을 포함하는 오메가-3(omega-3) 및 오메가-6(omega-6) 다중불포화지방산(PUFA)은 시클로옥시게나제(cyclooxygenases) 또는 리폭시게나제(lipoxygenases)의 촉매 작용에 의해 프로스타글란딘(prostaglandins), 프로스타시클린(prostacyclins), 류코트리엔(leukotriene) 등 에이코사노이드(eicosanoids) 및 도코사노이드(docosanoids)와 같은 다양한 지질 매개체로 전환된다. 이 분자는 생리학에서 염증 및 면역 조절과 관련된 중요한 세포 신호 전달 요소이다. 아라키돈산(Arachidonic acid; ARA, 20:4n-6)은 염증성 에이코사노이드(pro-inflammatory eicosanoids)로 알려져있지만, 에이코사펜타엔산(EPA) 및 디-호모 감마 리놀레닉산(di-homo gamma linolenic acid; DGLA, 20:3n-6)은 항염증성 에이코사노이드(eicosanoids)의 전구체이며, 도코헥사엔산(DHA)은 암 치료를 위한 항 지질 매개체로 알려진 레졸빈(resolvins) 및 프로텍틴(protectins)과 같은 항염증성 도코사노이드(docosanoids)의 전구체이다. 또한, 오메가-3 PUFA, EPA 및 DHA는 긍정적인 면역 조절을 통해 관절염 및 천식과 같은 면역 관련 질병에 유익한 효과를 나타내는 것으로 보고된 바 있다.

불가사리는 몸이 편평한 별모양으로 연안에서 우리가 가장 흔하게 접할 수 있는 해양동물 중의 하나로서, 전국 연안에 30여종의 불가사리가 서식하고 있으며, 번식률은 대단히 높아서 마리당 200만∼300만개를 산란하며, 극피동물문의 바다나리강, 불가사리아강, 거미불가사리아강, 성게강, 해삼강에 포함되는 해산 무척추동물이다. 우리나라에는 불가사리류 47종이 보고되어 있으며 남쪽에 비해 북방계의 종이 풍부하다. 특히 아무르불가사리(Asterias amurensis (Lutken), 불가사리과)는 캄챠카나 홋카이도로부터 유입된 외래종으로서 북태평양뿐만 아니라 우리나라의 전역에 퍼져 있으며 어류에 피해를 주는 해로운 유기체로 알려져있다.

대한민국 공개특허 제10-2003-0064189호 대한민국 등록특허 제10-1640799호

본 발명의 목적은 아무르불가사리(Asterias amurensis)의 스킨(skin), 생식샘(gonad) 및 소화샘(digestive gland; D-gland)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 기관(organ)으로부터 추출된 지방산(fatty acid)을 유효성분으로 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아무르불가사리(Asterias amurensis)의 스킨(skin), 생식샘(gonad) 및 소화샘(digestive gland; D-gland)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 기관(organ)으로부터 추출된 지방산(fatty acid)을 유효성분으로 함유하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아무르불가사리(Asterias amurensis)의 스킨(skin), 생식샘(gonad) 및 소화샘(digestive gland; D-gland)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 기관(organ)으로부터 추출된 지방산(fatty acid)을 유효성분으로 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아무르불가사리 스킨으로부터 추출된 지방산은 스킨 지방산 총 중량 대비 포화 지방산(saturated fatty acid; SFA) 28 내지 34중량%, 단일 불포화 지방산(monounsaturated fatty acid; MUFA) 39 내지 43중량% 및 다중 불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid; PUFA) 24 내지 30중량% 함유하는 것 일 수 있고, 생식샘으로부터 추출된 지방산은 생식샘 지방산 총 중량 대비 포화 지방산(SFA) 24 내지 31중량%, 단일 불포화 지방산(MUFA) 34 내지 46중량% 및 다중 불포화 지방산(PUFA) 28 내지 36중량% 함유하는 것 일 수 있고, 소화샘으로부터 추출된 지방산은 소화샘 지방산 총 중량 대비 포화 지방산(SFA) 23 내지 31중량%, 단일 불포화 지방산(MUFA) 19 내지 29중량% 및 다중 불포화 지방산(PUFA) 41 내지 55중량% 함유하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염증 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증 및 급성 또는 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 핵인자-카파B(nuclear factor-kappa B; NF-κB) 전사활성, 유사분열 활성화 단백질 인산화효소(mitogen-activated protein kinase; MAPK) 인산화, 산화질소(nitric oxide)의 생성 또는 염증관련 인자의 발현을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염증관련 인자는 유도형 산화질소 합성효소(iNOS), 사이클로옥시게나제-2(COX-2), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-1β(IL-1β) 및 종양괴사인자-α(TNF-α)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 아무르불가사리(Asterias amurensis)의 스킨(skin), 생식샘(gonad) 및 소화샘(digestive gland; D-gland)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 기관(organ)으로부터 추출된 지방산(fatty acid)을 유효성분으로 함유하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 아무르불가사리(Asterias amurensis) 지방산은 세포독성을 나타내지 않으며, NF-κB 및 MAPK 신호 전달 경로의 단백질 인산화를 억제하고, 산화질소 생성 및 염증관련 인자의 발현을 억제하는 효과가 있어 염증 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

도 1은 아무르불가사리(Asterias amurensis) 스킨(skin) 지방산(fatty acid)의 조성 및 함량(%)을 나타낸 그래프이다(p<0.01=*).
도 2는 아무르불가사리(A. amurensis) 생식샘(gonad) 지방산(fatty acid)의 조성 및 함량(%)을 나타낸 그래프이다(p<0.01=*).
도 3은 아무르불가사리(A. amurensis) 소화샘(digestive gland; D-gland) 지방산(fatty acid)의 조성 및 함량(%)을 나타낸 그래프이다(p<0.01=*).
도 4는 아무르불가사리(A. amurensis) 스킨, 생식샘 및 소화샘 지방산의 세포 독성 및 LPS로 유도된 산화질소 생성 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다; (A) 아무르불가사리 지방산 처리에 따른 대식세포 증식율(%), (B) 아무르불가사리 지방산 처리에 따른 산화질소(nitric oxide) 생성률(%)(P<0.01 = #, P<0.001 = *, RPMI = LPS 무처리한 RPMI 배지).
도 5는 아무르불가사리(A. Amurensis) 지방산의 LPS에 의해 증가된 면역 유전자 iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6 및 TNF-α 발현 수준(fold) 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다; (A) 스킨 지방산 처리 농도에 따른 면역 유전자 발현 수준 (B) 생식샘 지방산 처리 농도에 따른 면역 유전자 발현 수준, (C) 소화샘 지방산 처리 농도에 따른 면역 유전자 발현 수준.
도 6은 아무르불가사리(A. Amurensis) 지방산 처리에 따른 LPS로 염증 반응이 유도된 RAW 264.7 세포에서의 PGE2 생성량(pg/ml)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(RPMI = LPS 무처리한 RPMI 배지).
도 7은 아무르불가사리(A. Amurensis) 지방산의 NF-κB 및 MAPK 경로 관련 단백질 NF-κB p-65, p38, ERK1/2 및 JNK 인산화 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다; (A) 스킨 지방산 처리 농도에 따른 면역 단백질 및 β-Actin 발현에 대한 웨스턴 블랏 결과, (B) 스킨 지방산 처리 농도에 따른 무처리군(PRMI) 대비 상대적 밴드 강도(relative band intensity), (C) 생식샘 지방산 처리 농도에 따른 면역 단백질 및 β-Actin 발현에 대한 웨스턴 블랏 결과, (D) 생식샘 지방산 처리 농도에 따른 무처리군(PRMI) 대비 상대적 밴드 강도, (E) 소화샘 지방산 처리 농도에 따른 면역 단백질 및 β-Actin 발현에 대한 웨스턴 블랏 결과, (F) 소화샘 지방산 처리 농도에 따른 무처리군(PRMI) 대비 상대적 밴드 강도.

본 발명에서 사용되는 용어 "아무르불가사리(Asterias amurensis)"는 극피동물 차극목 불가사리과의 불가사리로 지름은 30cm 정도이고 팔의 길이는 9cm 내외이며 흰색에서 남빛 자주색까지 개체의 색 변화가 심하다. 제주도 남부를 제외한 우리나라 전 연안에 분포하며 고둥류, 게류 및 따개비류를 포함해 먹을 수 있는 먹이는 모두 먹어치우는 강력한 포식활동으로 패류양식장 등에 심각한 피해를 준다.

아무르불가사리(A. amurensis)를 비롯한 불가사리는 생리활성을 갖는 해양천연물 자원으로 연구되고 있으며, 불가사리로부터 스테로이드(steroids), 사포닌(saponins), 스테로이드성 글리코사이드(steroidal glycosides), 안트라퀴논(anthraquinones), 알칼로이드(alkaloids), 인지질(phospholipids), 펩티드(peptides) 등 다양한 대사 산물이 보고되었다. 이러한 독특한 구조를 갖는 화합물들은 항종양, 항균, 용혈, 항돌연변이, 항바이러스 활성 등을 갖는 것으로 알려져있다. 그러나 아무르불가사리 기관(organs)의 지방산 프로파일(fatty acids profile) 및 대식세포(macrophage cells)내 사이토카인 및 관련 신호 단백질에 대한 아무르불가사리 유래 지방산의 면역 조절 기능은 아직까지 밝혀진 바가 없다. 이에, 본 발명자들은 아무르불가사리 각 기관(organs)의 지방산 프로파일(fatty acids profile) 및 아무르불가사리로부터 추출한 지방산의 LPS로 유도된 대식세포 RAW265.7의 염증에 대한 면역 조절 기능을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 아무르불가사리(Asterias amurensis)의 스킨(skin), 생식샘(gonad) 및 소화샘(digestive gland; D-gland)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 기관(organ)으로부터 추출된 지방산(fatty acid)을 유효성분으로 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아무르불가사리 스킨으로부터 추출된 지방산은 스킨 지방산 총 중량 대비 포화 지방산(saturated fatty acid; SFA) 28 내지 34중량%, 단일 불포화 지방산(monounsaturated fatty acid; MUFA) 39 내지 43중량% 및 다중 불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid; PUFA) 24 내지 30중량% 함유하는 것일 수 있고, 상기 생식샘으로부터 추출된 지방산은 생식샘 지방산 총 중량 대비 포화 지방산(SFA) 24 내지 31중량%, 단일 불포화 지방산(MUFA) 34 내지 46중량% 및 다중 불포화 지방산(PUFA) 28 내지 36중량% 함유하는 것일 수 있고, 상기 소화샘으로부터 추출된 지방산은 소화샘 지방산 총 중량 대비 포화 지방산(SFA) 23 내지 31중량%, 단일 불포화 지방산(MUFA) 19 내지 29중량% 및 다중 불포화 지방산(PUFA) 41 내지 55중량% 함유하는 것일 수 있다.

상기 염증 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증 및 급성 또는 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 약학 조성물은 핵인자-카파B(nuclear factor-kappa B; NF-κB) 전사활성, 유사분열 활성화 단백질 인산화효소(mitogen-activated protein kinase; MAPK) 인산화, 산화질소(nitric oxide)의 생성 또는 염증관련 인자의 발현을 억제하는 효과를 나타낸다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 약학 조성물에서, 상기 염증 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증 및 급성 또는 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 미리세틴을 포함하는 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 아무르 불가사리 지방산에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 함유되는 아무르불가사리 지방산의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 아무르불가사리 지방산은 1일 기준으로 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 아무르불가사리(Asterias amurensis)의 스킨(skin), 생식샘(gonad) 및 소화샘(digestive gland; D-gland)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 기관(organ)으로부터 추출된 지방산(fatty acid)을 유효성분으로 함유하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어컨디셔너, 헤어트리트먼트, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 영양에센스, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클린저 등의 제형을 가질 수 있다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서 아무르불가사리 지방산은 화장료 조성물의 총 액상 중량에 대하여 0.1중량%~10중량%의 양을 화장료에 첨가될 수 있고, 또한 화장료 조성물의 총 건조중량에 대하여 0.001∼5중량%, 바람직하게는 0.01∼3중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본원발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본원발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본원발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 실험 재료 및 방법

<1-1> 아무르불가사리 시료의 준비

아무르불가사리(Asterias amurensis) 시료는 한국(South Korea) 강원지역 근처 동해안에서 채취하였다. 아무르불가사리를 스킨(skin), 생식샘(gonad) 및 소화샘(digestive gonad; d-gonad)의 3개 기관(organs)으로 분리하였고, 각 기관으로부터 지방산(fatty acid)을 추출하여 지방산을 수득하였다.

<1-2> 아무르불가사리 지방산 추출 및 분석

아무르불가사리(Asterias amurensis)의 상기 3개 기관으로부터 지방산(fatty acids)의 추출은 Garces and Mancha(Analytical biochemistry, 1993, 211:139-43)의 방법을 따라 수행하여 각 기관의 지방산을 수득하였다. 지방산 메틸에스테르(fatty acid methyl ester; FAMEs)는 Park et al.(Journal of lipid research, 209, 50:1195-1202)의 one-step 가수분해, 추출 및 메틸화(methylation) 방법을 이용하여 준비하였다. 준비된 3개 기관 각각의 지방산 메틸에스테르(FAMEs)는 가스크로마토그래피(Gas chromatography; GC)-불꽃이온화검출기(flame ionization detector; FID, Perkin Elmer)를 이용하여 분석하였다. 이때 아라키딘산(arachidic acid, 20:0)을 내부표준물질(internal standard)로 사용하였고, 하기 표 1의 지방산 성분의 함량(%)을 측정하였다.

연번	구분	지방산 화합물명	분자식
1	포화 지방산 (saturated fatty acid; SFA)	라우르산(Lauric acid)	C12:0
2		미리스틱산(Myristic acid)	C14:0
3		팔미트산(Palmitic acid)	C16:0
4		스테아리돈산(Stearidonic acid)	C18:0
5		아라키딘산(Arachidic acid)	C20:0
6		헤네이코실산(Heneicosylic acid)	C21:0
7		트라이코실산(Tricosylic acid)	C23:0
8		리그노세르산(Lignoceric acid)	C24:0
9	단일 불포화 지방산 (monounsaturated fatty acid; MUFA)	팔미톨레산(Palmitoleic acid)	C16:1n7
10		헵타디시노익산(Heptadecenoic acid)	C17:1
11		올레산(Oleic acid,n-9)	C18:1n9
12		올레산(Oleic acid,n-7)	C18:1n7
13		파울린산(Paullinic acid)	C20:1
14		곤도익산(Gondoic acid)	C20:1n7-n9
15		에루스산(Erucic acid)	C22:1n9
16		너보닉산(Nervonic acid)	C24:1
17	다중 불포화 지방산 (polyunsaturated fatty acid; PUFA)	리노레익산(Linoleic acid)	C18:2n6
18		리놀레닉산(Linolenic acid)	C18:3n3
19		스테아리도닉산(Stearidonic acid)	C18:4n3
20		에이코사다이엔산(Eicosadienoic acid)	C20:2
21		에이코사다이엔산(Eicosadienoic acidn-6)	C20:2n6
22		감마 리놀레닉산(Gamma linolenic acid; GLA)	C20:3n6
23		에이코사트리엔산(Eicosatrienoic acid)	C20:3n3
24		에이코사펜타엔산(Eicosapentaenoic acid; EPA)	C20:5n3
25		도코사다이엔산(Docosadienoic acid)	C22:2
26		도코사펜타엔산(Docosapentaenoic acid) + 리그노세르산(Lignoceric acid)	C22:5n3+24:0
27		에이코사펜타엔산(Eicosapentaenoic acid: EPA)	EPA
28		도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid; DHA)	C22:6n3

<1-3> 대식세포 증식(macrophage proliferation) 분석

대식세포 RAW264.7 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 RPMI(Robwell Park Memorial Institute)-1640 배지(medium)에 넣어 96-웰 플레이트에 1×10⁵세포/웰 농도로 시딩(seeding)하였다. 24시간 배양한 후, 상기 실시예 <1-2>에서 준비된 3개 기관의 지방산을 각각 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5% 및 4.0%의 농도로 첨가하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 대식세포 증식 시험은 3회 반복 수행하였다. 배양이 완료된 후, 상등액은 버리고, Kim et al.(J Biol Macromol, 2011, 49:1051-1058)의 방법에 따라 EZ-Cytox Cell viability Assay Kit(대일랩서비스, 한국)을 사용하여 대식 세포의 증식 정도를 평가하였다. 대식세포 증식율(macrophage roliferation ratio, %)은 하기의 수학식에 따라 계산하였다.

[수학식 1]

대식세포 증식율(%)=(시료의 흡광도/대조군의 흡광도)×100

<1-4> 산화질소(NO) 생성 분석

지방산의 면역조절 활성(immunomodulatory activity)은 대식세포 배양 상등액에서의 산화질소(nitric oxide; NO) 생산에 기반하여 평가하였다. 대식세포를 지방산 농도를 달리하여 배양한 뒤, LPS(lipopolysaccharide)로 자극하였다. 질산염의 농도는 Griess reagent(Sigma-Aldrich, 미국)를 사용하여 Cao et al.(Int J Biol Macromol, 2014, 67:303-311) 및 Green et al.(Analytical biochemistry, 1982, 126:131-138)의 방법에 따라 평가하였다.

<1-5> RNA 분리 및 cDNA 합성

Tri agent®(molecular research center, Inc., 미국)을 사용하여 대식세포 RAW 264.7 세포로부터 총 RNA를 분리하였다. 100% 이소프로판올(isopropanol)을 사용하여 RNA를 침전시키고, 75% 에탄올로 세척하였다. RNA 펠릿(pellet)을 nuclease-free water에 녹인 후, 추출된 RNA 농도를 nanophotometer(Implen, 독일)를 사용하여 측정하였다. cDNA는 High capacity cDNA reverse transcription kit(Applied biosystems, 미국)를 사용하여 제조자의 설명에 따라 합성하였다.

<1-6> 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)에 의한 면역 유전자 발현 분석

상기 실시예 <1-6>에서 RAW 264.7 세포로부터 분리된 면역 mRNA의 정량은 QuantStudio™ 7 FlexReal-Time PCR System (ThermoFisher scientific, 미국)을 사용하여 SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takara Bio Inc., 일본)의 총 반응 부피 20μL/웰에서 96-웰 포맷으로 수행하였다. 반응 혼합물은 유전자 각각의 특이적 프라이머 쌍 0.4μM 및 cDNA 주형 0.1ng으로 구성하였다(표 2). PCR 증폭은 95℃에서 30초 동안 초기 변성, 95℃에서 5초 동안 변성 및 55℃에서 5초 동안 어닐링 하는 과정을 40번 반복하는 조건으로 수행하였다. 정량 결과는 2-^ΔΔCT 방법(Livak and Schmittgen, 2001)을 이용하였고, 기준 mRNA로서 β-Actin과 비교하여 계산하였다.

유전자	유전자 번호(Accession No.)	염기서열(Sequence)	산물크기(bp)
iNOS	BC062378.1	F: TTCCAGAATCCCTGGACAAG R: TGGTCAAACTCTTGGGGTTC	180
IL-1β	NM_008361.4	F: GGGCCTCAAAGGAAAGAATC R: TACCAGTTGGGGAACTCTGC	183
IL-6	NM_031168.2	F: AGTTGCCTTCTTGGGACTGA R: CAGAATTGCCATTGCACAAC	191
COX-2	NM_011198.4	F: AGAAGGAAATGGCTGCAGAA R: GCTCGGCTTCCAGTATTGAG	194
TNF-α	D84199.2	F: ATGAGCACAGAAAGCATGATC R: TACAGGCTTGTCACTCGAATT	276
β-Actin	NM_007393.5	F: CCACAGCTGAGAGGAAATC R: AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC	193

<1-7> 웨스턴 블랏(Western blot) 분석

RAW 264.7 세포를 여러 농도(0.5, 1.0, 1.5 및 2.0%)의 아무르불가사리 지방산과 함께 배양한 후, 1μg/mL의 LPS를 처리하여 24시간 배양한 뒤, 세포에 RIPA 완충액(Tech & Innovation, 중국)을 넣어 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질의 농도는 Pierce™ BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific, 미국)를 사용하여 측정하였다. 단백질(30μg)을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)으로 분리하고, 이를 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride; PVDF) 막으로 이동시켰다. 웨스턴 블랏 분석은 Narayanan et al.(Cancer research, 2003, 63:972-979)에 따라 수행되었고, 상기 PVDF막을 p-NF-κB p65(R&D systems), p-p38(R&D systems), p-ERK1/2(R&D systems), p-JNK(R&D systems) 및 β-Actin(Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 각각의 특이적 항체와 함께 배양하였다. 단백질 신호는 Pierce® ECL Plus Western Blotting Substrate(Thermo Scientific, 미국)를 사용하여 검출하였다.

<1-8> PGE2 생성량 분석

PGE2(Prostaglandin E2)의 농도는 PGE2 ELISA kit(Enzo Life Sciences, Farmingdale, 뉴욕, 미국)을 사용하여 제조자의 설명에 따라 측정하였다. 착색(colorization)은 p-니트로페닐 포스페이트 기질(p-nitrophenyl phosphate substrate)을 사용하여 전개하였고, 광학 밀도(optical density)는 405nm에서 평가하였다. 2회 반복하여 수행하였으며, 샘플 중의 PGE2 농도는 표준 곡선(standard curve)을 기초로 하여 계산하였다.

<1-9> 통계 분석(Statistical analysis)

본 발명의 실시예에서의 통계 처리는 'Statistix 8.1' 통계 소프트웨어를 사용하였으며, 아라키딘산(C20:0)과 비교하여 일원분산분석(One-way ANOVA)을 수행하였고, 차이가 p<0.01일 경우 유의성이 있는 것으로 고려되었다. 대식세포 증식(machrophage proliferation)과 산화질소(nitric oxide) 생산 결과는 일원분산분석(One-way ANOVA)을 사용하여 분석하였고, 대조군 모델과 비교하여 p<0.01 및 p<0.001인 경우를 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였다.

< 실시예 2> 아무르불가사리 스킨 , 생식샘 및 소화샘 지방산 분석

상기 실시예 <1-2>의 방법을 통해 아무르불가사리의 스킨, 생식샘 및 소화샘으로부터 수득한 지방산의 지방산 메틸에스테르를 분석한 결과, 각 기관의 지방산 조성은 도 1, 2 및 3과 같이 나타났다. 각 기관의 지방산은 포화 지방산(saturated fatty acid; SFA), 단일 불포화 지방산(monounsaturated fatty acid; MUFA) 및 다중 불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid; PUFA) 3가지 그룹으로 구분하였다. 스킨의 SFA는 전체 지방산의 31.6±1.8%로 나타났고, 불포화지방산 MUFA 및 PUFA는 각각 41.2±0.7% 및 27.3±1.7%인 것으로 분석되었다. 생식샘의 경우, 스킨과 유사하게 SFA가 전체 지방산의 27.6±2.2%, MUFA 40.3±4.6% 및 PUFA 32.1±2.7%인 것으로 나타났으며, 소화샘의 SFA는 전체 지방산의 27.4±2.9%, MUFA 및 PUFA는 각각 24.2±3.5% 및 48.2±6.0%인 것으로 분석되었다.

도 1, 2 및 3에 나타난 바와 같이, 대부분의 기관에서 인간, 쥐 등 포유류와 유사하게 SFA 가운데 팔미트산(palmitic acid, 16:0) 및 스테아리돈산(stearidonic acid, 18:0)의 비율이 높은 것으로 나타났다. MUFA 중에서는 스킨과 생식샘의 경우 파울린산(paullinic acid, 20:1)의 비율이 가장 높게 나타났으나, 소화샘의 경우 팔미톨레산(palmitoleic acid, 16:1n-7) 및 올레산(oleic acid, 18:1)의 비율이 파울린산보다 더 높았다. PUFA는 기관에 따라 상당히 다르게 나타났다. 스킨은 감마 리놀레닉산(gamma linolenic acid; GLA, 20:3n-6)과 같은 오메가 6(omega-6) PUFA가 오메가-3(omega-3) PUFA보다 더 높은 비율로 함유된 반면, 생식샘 및 소화샘의 경우, 오메가-3 PUFA 함량이 오메가-6 PUFA 함량보다 더 높은 것으로 나타났다. 생식샘은 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid; EPA, 20:5n-3)보다 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid; DHA, 22:6n-3)을 더 많이 함유하고 있었고, 소화샘은 3개 기관 중 가장 높은 비율의 EPA를 포함하고 있는 것으로 확인되었다.

< 실시예 3> 아무르불가사리 지방산의 RAW 264.7 세포 증식에 대한 효과 분석

RAW 264.7 세포에 대한 아무르불가사리의 3개 기관에서 수득된 지방산의 독성을 평가하기 위하여, EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit(구입처를 기재해주시기 바랍니다.)를 사용하여 실시예 <1-3>에 기재된 방법으로 다양한 농도의 지방산에 대한 세포 생존율을 측정하였다. 스킨, 생식샘 및 소화샘 지방산 모두 지방산 농도 2.0%까지 세포독성을 나타내지 않았고, 스킨 지방산은 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다(도 4A).

< 실시예 4> 아무르불가사리 지방산의 산화질소 생성 억제 효과 분석

산화질소(nitric oxide; NO)는 염증 및 감염과 같은 병리 생리학적 상태에 중요한 역할을 한다. 아무르불가사리 지방산의 잠재적인 항염증 특성을 분석하기 위하여, NO를 생산할 수 있는 쥐(murine) 대식세포(macrophage cells) RAW 264.7을 배양하였고, LPS를 처리하여 염증을 유발하였다. 실시예 <1-4>의 분석 방법을 이용하여 아무르불가사리 지방산의 NO 생성 억제 효과를 확인한 결과, 스킨, 생식샘 및 소화샘 각 기관에서 추출된 지방산은 LPS 처리에 의한 NO 생성을 농도의존적으로 억제하였고, 대부분의 지방산의 농도에서 NO 생성을 유의하게 억제하는 것으로 나타났다(도 4B). 특히, 스킨 지방산을 4.0% 농도로 처리한 경우 가장 큰 NO 생성 억제 효과가 나타났으며, LPS를 처리하지 않은 무처리군(RPMI)과 유사한 정도로 NO 생성을 억제하였다(도 4B).

< 실시예 5> 아무르불가사리 지방산의 면역 관련 유전자 발현 억제 효과 분석

상기 실시예 <1-5> 및 <1-6>의 real-time PCR을 통해 면역 관련 유전자 발현에 대한 아무르불가사리 지방산의 억제 효과를 분석한 결과, LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 아무르불가사리 지방산 대부분 농도의존적으로 면역 관련 유전자의 발현 수준을 억제하였다(도 5). 특히, 아무르불가사리 지방산에 의해 인터루킨-1β(interleukin-1β; IL-1β)의 발현 수준이 현저하게 감소되었고, 다른 사이토카인 유전자 인터루킨-6(interleukin-6; IL-6) 및 종양괴사인자(tumor necrosis factor-α; TNF-α)의 발현 역시 지방산에 의해 농도의존적으로 감소되었다. 또한, 산화질소(NO) 생성의 핵심 요소 중 하나인 유도형 산화질소 합성효소(Inducible nitric oxide synthase; iNOS)의 발현 수준은 스킨, 생식샘 및 소화샘 지방산의 처리에 의해 농도의존적으로 억제되었다. LPS는 RAW 264.7 세포를 자극하여 염증을 유발하였으며, 염증 바이오마커로 알려진 사이클로옥시게나아제(Cyclooxygenase-2; COX-2)의 상향조절을 유도하였으나, LPS에 의해 증가된 COX-2의 발현 수준은 아무르불가사리 지방산의 처리에 따라 농도의존적으로 하향 조절되었다.

< 실시예 6> 아무르불가사리 지방산의 PGE2 생성 억제 효과 분석

RAW 264.7 세포에 LPS를 처리하여 염증 반응을 유발한 후, 상기 실시예 <1-8> PGE2 생성량 분석 방법을 이용하여 전염증성 생물학적 반응과 관련된 면역 바이오마커 중 하나인 PGE2의 수준을 측정하여 아무르불가사리 지방산의 항염증 효과를 평가하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, LPS 처리에 의해 증가된 RAW 264.7 세포의 PGE2의 생성량은 아무르불가사리 지방산의 처리 농도에 따라 농도의존적으로 저해되었으며, 스킨, 생식샘 및 소화샘 지방산을 처리한 경우 PGE2의 수준이 LPS만을 처리한 군에 비해 급격히 감소되는 것으로 나타났다. 아무르불가사리 3개 기관의 지방산 가운데 특히 스킨 지방산이 다른 두 기관에서 추출한 지방산보다 PGE2 수준을 더 많이 억제하였다(도 6).

< 실시예 7> 아무르불가사리 지방산의 MAPK 및 NF - κB 신호 전달 활성 분석

아무르불가사리 지방산의 RAW 264.7 세포에서의 항염증 활성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-7>의 웨스턴 블랏 분석법을 이용하여 핵인자-카파B(nuclear factor-kappa B; NF-κB) 및 유사분열 활성화 단백질 인산화효소(mitogen-activated protein kinase; MAPK)와 같은 면역 신호 전달 활성을 평가하였다. LPS 처리된 RAW 264.7 세포를 양성 대조군(positive control)으로 사용하였으며, 스킨, 생식샘 및 소화샘 지방산은 LPS로 세포를 자극 시킨 후에 각각 처리하였다. 그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 아무르불가사리 지방산은 NF-κB 신호 전달 경로에서 NF-κB p-65의 인산화반응을 농도의존적으로 억제하였다. 반면 IκBα의 수준은 농도의존적으로 증가시켰다. NF-κB 신호 전달 경로에서의 결과와 마찬가지로, 아무르불가사리 지방산은 EPK1/2, JNK 및 p38의 인산화정도를 농도의존적으로 억제하였다. NF-κB p-65의 인산화는 생식샘 지방산보다 스킨 및 소화샘 지방산에 의해 더 많이 감소되었고, p38, ERK1/2 및 JNK의 인산화는 아무르불가사리 기관에 따라 억제되는 비율의 차이가 있는 것으로 확인되었다(도 7).

상기와 같은 결과는 아무르불가사리 스킨, 생식샘 및 소화샘 기관으로부터 추출된 지방산이 LPS 처리된 RAW 264.7 세포에서 MAPK 및 NF-κB 신호전달 경로를 통해 염증을 억제하며, 아무르불가사리 기관에 따라 지방산의 항염증 조절능의 차이가 있음을 보여준다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

아무르불가사리(Asterias amurensis)의 스킨(skin), 생식샘(gonad) 및 소화샘(digestive gland; D-gland)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 기관(organ)으로부터 추출된 지방산(fatty acid)을 유효성분으로 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 아무르불가사리의 스킨으로부터 추출된 지방산은 스킨 지방산 총 중량 대비 포화 지방산(saturated fatty acid; SFA) 28 내지 34중량%, 단일 불포화 지방산(monounsaturated fatty acid; MUFA) 39 내지 43중량% 및 다중 불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid; PUFA) 24 내지 30중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 아무르불가사리의 생식샘으로부터 추출된 지방산은 생식샘 지방산 총 중량 대비 포화 지방산(SFA) 24 내지 31중량%, 단일 불포화 지방산(MUFA) 34 내지 46중량% 및 다중 불포화 지방산(PUFA) 28 내지 36중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 아무르불가사리의 소화샘으로부터 추출된 지방산은 소화샘 지방산 총 중량 대비 포화 지방산(SFA) 23 내지 31중량%, 단일 불포화 지방산(MUFA) 19 내지 29중량% 및 다중 불포화 지방산(PUFA) 41 내지 55중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 염증 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증 및 급성 또는 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 핵인자-카파B(nuclear factor-kappa B; NF-κB) 전사활성, 유사분열 활성화 단백질 인산화효소(mitogen-activated protein kinase; MAPK) 인산화, 산화질소(nitric oxide)의 생성 또는 염증관련 인자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제6항에 있어서,
상기 염증관련 인자는 유도형 산화질소 합성효소(iNOS), 사이클로옥시게나제-2(COX-2), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-1β(IL-1β) 및 종양괴사인자-α(TNF-α)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
아무르불가사리(Asterias amurensis)의 스킨(skin), 생식샘(gonad) 및 소화샘(digestive gland; D-gland)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 기관(organ)으로부터 추출된 지방산(fatty acid)을 유효성분으로 함유하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.