JP4059934B2 - コレステロール低減化ペプチド - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、コレステロールの低減化に関するものであり、更に詳細には、新規コレステロール低減化ペプチドを使用するコレステロール低減システムに関するものである。
【0002】
本発明に係るペプチドは、コレステロール低減剤として医薬品として使用するほか、コレステロール低減用の飲料、食品、栄養食品、機能性食品、特定保健用食品等飲食品として使用し、コレステロールの低減のほか、コレステロール蓄積の予防等に広く利用できるものである。
【0003】
【従来の技術】
ステロールとその誘導体は、生体に必須の構成成分である。トリアシルグリセロールは、エネルギー貯蔵としての役割を果たすだけであるが、コレステロールやその脂肪酸エステルは細胞膜の重要な構成成分であると同時に、胆汁酸・ステロイドホルモン・ビタミンDなどの体内で種々の重要な機能を果たす誘導体を生じる。コレステロールの代謝調節は心血管系を健康に保つ上で重要であり、その異常は動脈硬化症をきたすことになる。
【0004】
近年、食餌性繊維をはじめ、大豆蛋白質、不飽和脂肪酸など、さまざまな食品成分がコレステロール代謝に好ましい影響を及ぼすことが、国内外で活発に研究されている。
【0005】
例えば、キャロルとハミルトンは血漿コレステロール値に対する食餌蛋白質について検討し、大豆蛋白質がカゼイン蛋白質に比べて血漿コレステロール値を低下させることを明らかにしている(K. K. Carrol and R. M. G. Hamilton, J. Food Sci., 40, 18-23(1975))。
【0006】
また、特開昭60−11425によれば、大豆蛋白質を酵素を用いて加水分解して得られた分子量200〜1500のオリゴペプチドに血中コレステロール濃度低下作用があることが示されている。このように大豆蛋白質などを代表とする植物性蛋白質、およびその酵素分解物などには、一般に血清コレステロール低下作用、抗動脈硬化作用を有すると考えられている。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、大豆蛋白質由来の血清コレステロール低下剤の研究、開発がさかんに行われている技術の現状に鑑み、本発明者らは、従来にない全く新規にして効果にすぐれ且つ安全性も高いコレステロール低下剤の開発、しかも大豆蛋白質由来ではなく全く新しいタイプのペプチド系コレステロール低下剤の開発を、新規技術課題として設定した。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を解決するため、発想の根本的転換を行い、新しいタイプのコレステロール低下剤を開発するには新しいスクリーニング法を開発する必要があるとの観点にたち、各方面から検討の結果、CaCo−2細胞を用いる新しいスクリーニング法を開発するのにはじめて成功し、そしてこの新しいスクリーニング法を利用して、数多く合成したペプチドの中からコレステロール低下性にすぐれた新規ペプチドのスクリーニングに成功し、本発明の完成に至ったものである。
【0009】
CaCo−2細胞を利用するコレステロール低下性ペプチドのスクリーニング方法の基本は、コレステロールの吸収は、小腸で胆汁酸とともにミセル化して吸収される点にはじめて着目し、ペプチドによるこのコレステロールのミセル形成の抑制、阻害を小腸上皮細胞モデルのひとつであるCaCo−2細胞を用いて測定し、目的とするペプチドをスクリーニングするものである。
【0010】
更に具体的には、30〜300mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)、合成ペプチド(0.1〜10mg/0.5ml/ウエル)、0.5〜30mMの胆汁酸又は胆汁酸塩を混合しておき、この混合物に、0.01〜1μCi−コレステロール、0.01〜1mMのcoldコレステロール、0.1〜10mMのモノオレイン、0.05〜50mMのホスファチジルコリンを添加混合した後、音波処理(0.5〜10分間)後、得られたミセルをCaCo−2細胞含有ウエルに加えてインキュベートする。5〜60分間反応させた後、CaCo−2細胞内に取り込まれたコレステロールを測定し、コレステロール取込量の低い合成ペプチドを目的ペプチドとして選択するものである。
【0011】
音波処理は、超音波処理を含め、混合、粉砕を行う各種音波処理を広く包含するものであって、市販の装置が適宜使用される。CaCo−2細胞は、DMEM(ダルベッコ変性イーグル培地、Dulbecco's Modified Eagle Medium)で培養し、ついで培地を除去し、このCaco−2細胞含有ウエルに前記ミセルを加えたときに、0.1〜10×106cells/ml程度の濃度(MTT法により測定)となるように調製する。なお、培養液としては、上記のほか、市販の細胞培養液も適宜使用可能である。
【0012】
上記において、コレステロールとしては、放射性同位元素でラベルしたコレステロールを使用したので、コレステロールのCaCo−2細胞内の取込量はその放射強度を測定することにより測定するが、放射ラベルにかえて、酵素や蛍光ラベルしたコレステロールも使用することができる。また、格別に標識しないコレステロールも使用可能であって、その場合の取込量は、細胞を分離、破壊した後、例えば酵素法を用いる市販のコレステロール定量キット(例えば、モノテストコレステロール;スタンダードはプレチセットコレステロール:いずれもベーリンガーマンハイム山之内製)を用いて測定すればよい。
【0013】
合成ペプチドに添加する胆汁酸としては、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸等各種の胆汁酸及びこれらの胆汁酸塩が単用ないし2種以上併用できる。
【0014】
このようにして細胞内へのコレステロールの取込量を測定し、測定値の低いペプチドをコレステロールの吸収を阻害、抑制するペプチドとして分離することにより、目的とするペプチドのスクリーニングを行うことができる。
【0015】
同様にして、ペプチドに代えて他の物質を使用することにより、例えば14C−コレステロールを含むミセル溶液と該他の物質をCaCo−2に添加することにより、ペプチド以外の物質についても、コレステロール吸収阻害性物質、コレステロール吸収抑制性物質等コレステロール低下性を有する物質をスクリーニングすることができ、したがって、本発明は、きわめてすぐれたコレステロール低下剤の微量・迅速スクリーニング方法を提供するものである。
【0016】
本発明に係るスクリーニング方法を利用することにより、コレステロール吸収抑制ペプチドが同定されるだけでなく、新規ペプチド、新規物質はもとより、既知のペプチド、既知の物質の中からコレステロール吸収抑制剤を新たに開発することも可能となり、また、より強力な活性を発現するペプチド(物質)をデザインすることも可能となり、且つより強力に血清コレステロール低下作用を発現するアミノ酸組成の発見等も可能となり、これらの効能をより効率的に発揮することのできる医薬はもとより飲食品の開発も可能となる。
したがって、本発明に係る小腸上皮細胞の機能を発現する培養細胞であるこのCaCo−2細胞を用いる方法は、コレステロール吸収抑制を広く測定する方法を提供するものである。
【0017】
このようにして本発明者らによって新規に開発されたスクリーニング法を利用して、数多く合成したペプチドをスクリーニングしたところ、コレステロール吸収抑制作用にすぐれたペプチドを2種類(C−822及びC−827)発見し、更に検討の結果、コレステロール低下剤ないし低下食品として使用できることを確認して、本発明を完成した。
【0018】
本発明に係るペプチドC−822及びC−827は、それぞれ、次のアミノ酸配列(C−822:配列表の配列番号1、C−827:配列表の配列番号2)からなる。
これらのペプチドは、従来合成、分離されたことはなく、ましてやコレステロール吸収抑制作用を有することなど全く知られていないものであるが、自動合成機等により容易に合成、入手することができる。
【0019】
これらのペプチドは、後記する実施例からも明らかなように、すぐれたコレステロール吸収抑制作用を有するので、この作用を利用した飲食品、特定保健用飲食品、健康飲料、健康食品、栄養食品その他各種タイプの飲食品(なお、本発明において、食品には飲料も包含される)として用いることができるほか、コレステロール吸収抑制剤ないしコレステロール低下剤等医薬品としても用いることができる。
【0020】
飲食品として使用する場合には、本有効成分であるペプチドをそのまま、使用したり、他の食品ないし食品成分と併用したりして適宜常法にしたがって使用できる。本有効成分を用いる本発明に係る飲食品は、固体状(粉末、顆粒状その他)、ペースト状、液状ないし懸濁状のいずれでもよいが、甘味料、酸味料、ビタミン剤その他ドリンク剤製造に常用される各種成分を用いて、健康ドリンクに製剤化すると好適である。
【0021】
医薬品として使用する場合、本有効成分は、種々の形態で投与される。その投与形態としては例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与をあげることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。その使用量は症状、年令、体重、投与方法および剤形等によって異なるが、通常は、成人に対して1回約0.1mg乃至1,500mgを投与することができる。
【0022】
本発明に係る有効成分は、毒性は全くないか又は極めて低く、卓越した安全性を示し、ラットに対して1日当り500mg経口投与したが急性毒性は全く認められなかった。したがって飲食品として使用する場合は、予防用、保健用、飲食品として使用する場合のいずれにおいても有効成分の使用量に格別の限定はないし、医薬として使用する場合でも、患者に応じて上記範囲内で適宜使用すればよい。また、本有効成分は多量に服用しても格別の急性毒性を示さないので、必要あれば上記範囲よりも多量に使用しても差し支えない。
【0023】
以下、本発明の実施例について詳述する。
【0024】
【実施例1】
合成ペプチドとしてC−822及びC−827を用い、それらのコレステロール吸収抑制作用について、CaCo−2細胞を用いて試験を行った。
【0025】
14C−コレステロールを含むミセルとペプチドを下記表1に示すように混合、超音波処理した後、CaCo−2細胞を含有するプラスチック製のウエルに添加して、取り込み実験に供した。
すなわち、ミセル溶液の調製は、最終濃度がそれぞれ、[4−14C]コレステロール(0.02μCi/ml)、コレステロール(0.1mM=0.0387mg/ml)、モノオレイン(1mM=0.357mg/ml)、フォスファチジルコリン(5mM=3.86mg/ml)、タウロコール酸ナトリウム(5mM=2.69mg/ml)と、合成ペプチド2種類(それぞれを5mg/ml)を150mMリン酸緩衝液(pH7.4)に溶解し、3分間ソニケーションして行った。
【0026】
【表1】
【0027】
取り込み実験は、DMEM培地で12日間培養ディッシュ(24穴プレート)に培養した、CaCo−2細胞の培地を吸引除去し、PBSで2回洗浄した後、上記で調製したミセル溶液0.5mlを、プレートの1穴あたり添加し、20分間CO2インキュベーターで、インキュベートした。CaCo−2細胞数は、0.2×106cells/ml(MTT法により測定)であった。インキュベート後、冷PBSで2回洗浄し、0.5mlの0.1%SDS溶液にて、細胞を溶解した。シンチレーションバイアルに細胞を移し、7.5mlのシンチレーター(Aquasol−2)加えて、細胞に取り込まれた14C−コレステロールの量を測定した。得られた結果を図1に示した。なお、controlは、ペプチドを使用しないブランク(対照)を示す。
【0028】
【実施例2】
合成ペプチドは、実施例1と同じC−822とC−827を用い、CaCo−2細胞へのミセル添加量を実施例1の半分(1.25mg/0.5ml/well)とし、細胞数を実施例1の約4倍(0.87×106cells/ml:MTT法により測定)としたほかは、実施例1と同様の処理を行い、14C−コレステロールの取込量を測定した。
【0029】
得られた結果を図2に示した。これら図1及び図2の結果から、ペプチドC−822及びC−827は、いずれもすぐれたコレステロール吸収抑制作用を有することが確認された。
【0030】
【実施例3】
ビタミンC 20g、グラニュー糖 50g、コーンスターチと乳糖の等量混合物30gに、ペプチドC−822を50g加えて充分に混合した。混合物を100等分して袋に詰め、1袋1.5gのスティック状コレステロール低減用栄養健康食品を100袋製造した。
【0031】
【実施例4】
ペプチドC−822(50g)にかえてペプチドC−827(40g)を用い、また、ビタミンC(20g)にかえてビタミンCとクエン酸の等量混合物(30g)を用いたほかは、実施例3と同様の処理をくり返し、充分に乾燥せしめた後、コレステロール低減用栄養健康食品を製造した。
【0032】
【実施例5】
ペプチドC−822粉末100g、糖類150g、蜂蜜15g、アスコルビン酸1g、クエン酸0.5g、香料適量に水を加えて1Kgとし、これを95℃で20分間殺菌し、100mlずつ無菌的にビンに充填して、飲食品タイプの健康ドリンクを製造した。
【0033】
【実施例6】
ペプチドC−827粉末の20%水溶液200g、酢酸トコフェロール5g、硝酸チアミン10g、ニコチン酸アミド20g、無水カフェイン50g、安息香酸塩及び香料適量に脱イオン水を加えて30Lとし、殺菌した後30mlずつ無菌的にビンに充填して、医薬品としての健康ドリンクを製造した。
【0034】
【実施例7】
(1)ペプチドC−822 50g
(2)ラクトース 90g
(3)コーンスターチ 29g
(4)ステアリン酸マグネシウム 1g
(1)、(2)及び(3)(但し17g)を混合し、(3)(但し7g)から調製したペーストとともに顆粒化した。得られた顆粒に(3)(但し5g)と(4)を加えてよく混合し、この混合物を圧縮錠剤機により圧縮して、1錠あたり有効成分(1)を50mg含有する錠剤1000個を製造した。
【0035】
【実施例8】
ペプチドC−822にかえてペプチドC−827を使用したほかは、実施例7と同様に処理して、錠剤を製造した。
【0036】
投与量は、患者の症状、年令によっても異なるが、0.1〜1500mg/kg/dayで1日1〜4回投与する。本発明において用いるペプチドは、既述のように安全性にはほとんど問題はなく、したがって上記用量をこえて投与しても差し支えはない。また、健康の維持、増進、保健、栄養剤等としてこれを利用する場合は、上記用量よりも少ない量を長期間に亘って服用すればよい。
【0037】
【発明の効果】
本発明によれば、血清コレステロール濃度をきわめて効率的に低減せしめることができ、しかも安全性がきわめて高いので、血清コレステロール濃度低減のための予防ないし治療剤として有用であるだけでなく、そのための飲食品としても利用することができる。
【0038】
また更に、本発明によれば、CaCo−2細胞を利用する新規なコレステロール吸収抑制物質の微量・迅速スクリーニング法が提供され、コレステロール吸収抑制物質を効率的にスクリーニングすることができるので、本方法を利用することにより新規なコレステロール低下剤の開発が大いに期待される。
【0039】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】合成ペプチドによるコレステロール吸収抑制を示す。
【図2】合成ペプチドのミセル添加量を変化させた場合のコレステロール吸収抑制を示す。
Claims (3)
- 下記のアミノ酸配列からなるコレステロール低減化ペプチド。
Thr−Pro−Glu−Val−Asp−Asp−Glu−Ala−Leu−Glu−Lys - 請求項1に記載のペプチドを有効成分とするコレステロール低下剤。
- 請求項1に記載のペプチドを含有するコレステロール低下食品。
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JP33991495A JP4059934B2 (ja) | 1995-12-05 | 1995-12-05 | コレステロール低減化ペプチド |
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-
1995
- 1995-12-05 JP JP33991495A patent/JP4059934B2/ja not_active Expired - Lifetime
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