JP3973253B2 - アグレカナーゼのタンパク質分解活性試験用組換え基質（ｒＡＧＧ１） - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、細胞培養系における「アグレカナーゼ」のタンパク質分解活性を試験するための人工組換え基質（ｒＡＧＧ１）および天然アグレカンに関する。
【０００２】
背景技術
結合組織におけるプロテオグリカン分解の機構は複雑であり、複数の化合物および経路が関与している。アグレカンの異化作用の検討では、用いられる実験系主要な軟骨細胞で確立された軟骨細胞系の単層培養物(Hughes CE, Caterson B, Fosang AJ, Roughley PJ, Mort JS., Biochem. J. 1995: 305: 799-804; Lark MW, Gordy JT, Weidner JR ら, J. Biol. Chem. 1995; 270(6): 2550-2556) 、および各種の解剖学的部位および動物種からの軟骨を用いる外植片培養物(Flannery CR, Lark MW, Sandy JD, J. Biol. Chem. 1992; 267: 1008-1014; Sandy JD, Brown HL, Lowther DA, Biochim Biophys Acta 1978; 543: 536-44; Tyler JA, Biochem. J. 1985; 225: 493-507) を含んでいた。ＩＬ−１およびＴＮＦのようなサイトカインの添加が、細胞外マトリックスの分解を促進する化合物として広汎に用いられてきた(Hughes CEら, 1995; Morales TI, Roberts AB, Arch Biochem Biophys 1992; 293 (1): 79-84; Forsang AJ, Tyler JA, Hardingham TE, Matrix 1991; 11: 17-24) 。特に、これら二種類のサイトカインは、アグレカンの異化作用を標的とすることが示されている。数件の研究により、アグレカンのタンパク質コアに沿った特異的開裂部位を定義する多数の重要な発見がなされてきた(Ilic MZ, Handley CJ, Robinson HC, Mok MT, Arch Biochem Biophys 1992; 294(1): 115-22; Loulakis P, Shrikhande A, Davis G, Maniglia CA, 酵素開裂の推定部位(Putative site(s) of enzymic cleavage), Biochem J 1992; 284: 589-593; Sandy JD, Neame PJ, Boynton RE, Flannery CR, J. Biol. Chem. 1991; 266: 8683-8685) 。全体として、少なくとも７個の開裂部位があると思われ、軟骨プロテオグリカン分解生成物のアミノ酸配列分析により、アミノ酸残基Ａｓｎ341 −Ｐｈｅ342 およびＧｌｕ373 −Ａｌａ374 の間に球間(interglobular) ドメイン（ＩＧＤ）内に存在するアグレカンにおけるタンパク質分解開裂の２個の主要な部位が定義されている（ヒト配列表）(Doege KJ, Sasaki M, Kimura T, Yamada Y, J. Biol. Chem. 1991; 266: 894-902) 。前者の開裂部位は、ヒアルロン酸塩と錯体形成した組織に残っている５０〜６０ｋＤａのＧ１ドメインからなるＣ−末端異化断片（... ＤＩＰＥＮ）を生じる(Flannery CRら, 1992) 。最近の研究において、Fosangら(Fosang AJ, Last K, Brown L, Jackson DC, Gardiner P, Trans. Orthop. Res. Soc. 1995; 20: 4)は、多種多様な関節炎疹と診断された患者からの滑液においてこの開裂部位からＮ−末端断片（ＦＦＧ... ）も同定した。同様に、Wittら(Witt M, Fosang AJ, Hughes CE, Hardingham TE, Trans. Orthop. Res. Soc. 1995; 20: 122) は、コントロールおよびＩＬ−１で刺激したブタ外植片培養物からの培地試料中にこれらのグリコースアミノグリカン含有Ｎ−末端断片を見いだした。後者の開裂部位は、関節炎患者の滑液から単離された主要なアグレカン分解生成物と思われ(Lohmander LS, Neame PJ, Sandy JD, Arth. Rheum. 1993; 36: 1214-1222)、かつＩＬ−１またはレチノイン酸で処理した軟骨外植片培養物からの培地にも見られる(Hughes CEら, 1995; Sandy JDら, 1991) グリコースアミノグリカン含有Ｎ−末端断片（ＡＲＧ... ）を生成する。最近の研究(Lark MWら, 1995) では、レチノイン酸で処理したラット軟骨肉腫細胞中のＣ−末端断片（... ＥＧＥ）が同定された。このＧｌｕ373 −Ａｌａ374 の開裂に関与するタンパク質分解活性は同定されていないが、Ｇｌｕ−Ｘａａペプチド結合（但し、ＸａａはＡｌａ、ＧｌｙまたはＬｅｕである）に特異性を有するものと思われる。この今までのところ特定されていない活性は「アグレカナーゼ(Fosang AJ, Neame PJ, Last K, Hardingham TE, Murphy G, Hamilton JA, J. Biol. Chem. 1992; 267: 19470-19474)」と呼ばれている。分子内の開裂の部位は十分に特定されているが、多数の様々なプロテオグリカン分解生成物の生成に関与する化合物の多くは今だ同定されていない。培養系は、プロテオグリカンの異化作用を促進する各種の化合物で操作され、その分解に関与する（複数の）化合物を見いだす努力がなされてきた。しかしながら、これらの研究は、アグレカンの分解に関与する特定の化合物を特定することはできなかった(Flannery CR, Sandy JD, Trans. Orthop. Res. Soc. 1993)。それにも拘らず、精製したアグレカンおよび改変したアグレカンを精製した酵素製剤の基質として用いる実験データーから、これらの酵素の特異的な開裂部位について幾らかの情報が得られている。しかし、このイン・ビトロでの研究は軟骨でのアグレカンの分解に関与する機構を確定しまたは化合物を同定するのに直接役立っていない(Fosang AJら, 1992; Fosang AJ, Neame PJ, Hardingham TE, Murphy G, Hamilton JA, J. Biol. Chem. 1991; 266: 15579-15582; Fosang AJ, Last K, Neame PJ ら, Biochem. J. 1994; 304: 347-351) 。
【０００３】
過去の研究(Hughes CEら, 1995; Hughes CE, Caterson B, White RJ, Roughley PJ, Mort JS, J. Biol. Chem. 1992; 267: 16011-16014) において、本発明者らは特異的なプロテイナーゼによって開裂された生成物（プロテオグリカン凝集体の異化作用生成物）に特異的な多数のモノクローナル抗体を開発した。これらの抗体は、軟骨外植片培養系においてプロテオグリカンの分解機構の研究における手段として有用であることが明らかにされた。この最新の研究の目的は、アグレカンのＩＧＤにおける 374ＡＲＧＳＶＩ... 部位におけるアグレカンの開裂に関与する化合物の同定を一層促進する培養系を更に開発することであった。
【０００４】
【発明の概要】
本明細書において、本発明者らは、固有の内因性プロテオグリカンおよび他の細胞外成分を含まない細胞培養系において人工的組換え基質に対する「アグレカナーゼ」の活性を研究することができるようにするイン・ビトロの培養系の開発を説明する。アグレカンのＩＧＤにおける重要な開裂部位に対する過去に特定されたネオエピトープ抗体を使用することによって、この系における「アグレカナーゼ」のタンパク質分解作用によって精製した生成物の監視が容易になった。
【０００５】
それ故、本発明の一態様は、イン・ビトロ試験系におけるアグレカナーゼの組換え基質であり、好ましくは
a) ＣＤ５のシグナル配列、
b) Ｍ１モノクローナル抗体検出のためのＦＬＡＧ−エピトープ、
c) ヒトアグレカンの球間ドメイン、
d) ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、
e) ヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域、および
f) ヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域
を含んでなる構成要素の群を含む組換え基質である。
【０００６】
本発明の好ましい態様は、配列番号３のアミノ酸配列またはその部分を有するか、または配列番号３のアミノ酸配列またはその部分であって、アミノ酸３４がＡｌａに変異した組換え基質である。
【０００７】
【発明の具体的説明】
本発明のもう一つの態様は、上記の組換え基質をコードするＤＮＡであり、好ましくは配列番号４のヌクレオチド２３５０〜４１１４のヌクレオチド配列またはその部分を有する、配列番号４のヌクレオチド２３５０〜４１１４のヌクレオチド配列またはその部分であって、ヌクレオチド２４４８がＣに変異し、ヌクレオチド２４５０がＣに変異し、ヌクレオチド２４５１がＡに変異したものを有する、またはストリンジュント条件下で配列番号４に示したＤＮＡとハイブリダイゼーションを行う、ＤＮＡである。
【０００８】
本発明によるストリンジュント条件下でのハイブリダイゼーションとは、６×ＳＳＣ（または６×ＳＳＰＥ）、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性したサケ精子ＤＮＡ断片を含むハイブリダイゼーション溶液中で標識したプローブの融点下の２０〜２５℃の温度におけるハイブリダイゼーションを意味する（Sambrookら, 「分子クローニング−実験室便覧(Molecular Cloning - A Laboratory Manual) 」, 第２版, １９８９年、Cold Spring Harbor Laboratory Press,第２巻, 第９章, ９．５２〜９．５５頁）。
【０００９】
本発明の他の態様は、上記のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片を含むベクター、および前記ベクターを含む宿主細胞である。
【００１０】
本発明のもう一つの態様は、アグレカナーゼの活性を試験する目的での細胞培養系での上記の組換え基質の使用であり、好ましくは上記細胞培養系が固有の内因性プロテオグリカンおよび他の細胞外成分を含まない、使用である。
【００１１】
本発明のもう一つの態様は、アグレカナーゼの活性の試験を抗体による開裂生成物の検出によって行う、上記の組換え基質の使用である。
【００１２】
本発明のもう一つの態様は、組換え基質における新規な酵素開裂部位の検出を行うための上記基質の使用である。
【００１３】
本発明のもう一つの態様は、アフィニティークロマトグラフィーによってアグレカナーゼを精製するための、またはアグレカナーゼｃＤＮＡを単離するための機能性クローニング系における上記の組換え基質の使用である。
【００１４】
本発明のもう一つの態様は、骨関節症の開始または進行を監視する方法であって、骨関節症を有することが疑われるまたは知られているヒトからの生物学的流体の試料を、上記の組換え基質によるアグレカナーゼの存在について分析を行い、上記生物学的流体が、滑液、尿、血清およびリンパ液からなる群から選択されることを特徴とする方法である。
【００１５】
本発明のもう一つの態様は、疾病の進行を観察して治療の有効性を決定することに使用する、上記の方法である。
【００１６】
本発明のもう一つの態様は、アグレカナーゼ阻害剤をスクリーニングする目的での上記の組換え基質の使用である。
【００１７】
本発明のもう一つの態様は、上記の組換え基質および抗体を含み、アグレカナーゼ開裂生成物を検出するための診断助剤である。
【００１８】
以下において、本発明を実施例、および図面によって詳細に説明する。
なお、図６および７のアミノ酸配列は配列番号３の配列と、図８〜１１の塩基配列は配列番号４の配列と、それぞれ対応する。
【００１９】
【実施例】
材料
アルカリホスファターゼと結合した第二の抗体およびウェスターンブロット分析に用いられる基質は、Protoblot Western blot AP 系（カタログ番号Ｗ３９２０）としてPromega から得た。ニトロセルロース（孔径０．２μｍ）は、Schleicher and Schnellから入手した。モノクローナル抗体Ｍ１および抗−ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルは、いずれもKodak から入手した。抗ヒトＩｇモノクローナル抗体は、Capell、Durhamから入手した。モノクローナル抗体ＢＣ−３、２−Ｂ−６および３−Ｂ−３は、腹水として調製した(Hughes CEら, 1995) 。Ｒｘ細胞系は、Dr. Jim Kimura, Bone Research Center, Henry Ford Hospital,デトロイト, ミシガン州の好意により提供を受けた。
【００２０】
実施例１ ｒＡＧＧ１遺伝子構築物の調製
ｒＡＧＧ１の遺伝子構築物は、リンパ細胞糖タンパク質Ｔ１／Ｌｅｕ−１（ＣＤ５）のシグナル配列、長さが８個のアミノ酸のＦＬＡＧ（商標名）エピトープ(Prickett KS, Amberg DC, Hopp TP, Bio Techniques 1989; 7: 580-589)、ヒト軟骨大の凝集性プロテオグリカンアグレカンの長さが１２７個のアミノ酸の球間ドメイン（ 350Ｔ− 476Ｇ）(Doege KJ ら, 1991) 、長さが２個のアミノ酸のグリシンスペーサー、およびヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３不変領域をコードすることにより、予想分子質量が４１．０５９ｄの融合タンパク質を生じる。球間ドメインをコードするアグレカンｃＤＮＡ配列を、この領域の近接(flanking)配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドとヒトヒザ軟骨の総ＲＮＡとを用いる逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）(Beverly SM,分子生物学における最新のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)、カナダ：John Wiley and Sons, 1992)によって増幅した。総ＲＮＡは、Adams ら(Adams ME, Huang DQ, Yao LY, Sandell LJ, Anal. Biochemistry 1992; 202: 89-95) により、関節交換手術から得たヒト軟骨組織から抽出した。オリゴヌクレオチドは、ＦＬＡＧエピトープおよびｇ−スペーサーに関する追加配列情報を含み、かつ増幅したｃＤＮＡセグメントの５′および３′末端に制限酵素開裂部位を有し、続いて３′Ｎｈｅｌ部位を含むように改変したＣＤ５−ＩｇＧ１発現ベクターに挿入し易くなるように設計した(Aruffo A, Stamenkovic I, Melcick M, Underhill CB, Seed B, Cell 1990; 61: 1303-1313)。ＦＬＡＧエピトープおよび球間ドメインのアミノ末端開始をコードし且Ｎｈｅｌ部位を含むプライマーを、下記の配列：5´-CGC GGG GCT AGC CGA CTA CAA GGA CGA CGA TGA CAA GAC AGG TGA AGA CTT TGT GGA C（配列番号：１）を用いて合成した。球間ドメインのカルボキシ末端、Ｇ−スペーサー、ＢａｍＨＩ部位を含むスプライスドナー部位をコードするリバースプライマーは、配列：5´-CGC GGG GGA TCC CCT CCC CCT GGC AAA TGC GGC TGC CC （配列番号：２）を有する。ＰＣＲ生成物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ切断ベクターＣＤ５−ＩｇＧ(Aruffo A ら, 1990) に連結した。
【００２１】
実施例２ ＣＯＳ細胞におけるｒＡＧＧの生産および精製
構築物を、ＤＥＡＥ−デキストランを介してＣＯＳ細胞にトランスフェクションした(Hollenbaugh D, Aruffo A, 分子生物学における最新のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)、カナダ：John Wiley and Sons, 1994)。トランスフェクションから１２時間後に、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ中で成育した細胞をトリプシン処理して、新たな皿に播種し、５日間成育させた。３日目に、新たな培地および１０％ＦＣＳを加えた。上清を回収して非付着細胞および破片を除いて、４℃で貯留して保存した。融合タンパク質を、抗−ＦＬＡＧ（商標名）Ｍ１アフィニティーゲル(Kodak、ニューヘブン）を用いて、製造業者のプロトコールに従ってアフィニティー精製した。通常は、収率は、培養物上清１ｍｌ当たり１〜５μｇ融合タンパク質であった。
【００２２】
実施例３ 組換えＩＧＤ基質および天然アグレカンの異化作用の試験のためのレチノイン酸の存在下または非存在下でのアガロース中でのラット軟骨肉腫細胞の培養
ラット軟骨肉腫細胞を７５ｃｍ２フラスコで培養し、５％ＦＣＳおよび５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ培地に保持した。７５ｃｍ２フラスコ中のコンフルエント単層を３７℃で１５〜２０分間攪拌しながらトリプシン処理（ＥＤＴＡを含むＤＭＥＭ中０．２５％トリプシン）を行った後、ＤＭＥＭ中０．０５％コラゲナーゼで１〜２時間消化した。次いで、細胞を４×１０６個／ｍｌの濃度でＤＭＥＭに再懸濁した。２４ウェルの培養プレートにFMC Seaplaque アガロース／ＤＭＥＭの１％（重量／容量）溶液を「コーティング」し（２００μｌ／ウェル）、アガロースを４℃で３０分間インキュベーションして固化した(Aydelotte MB, Juettner KE, Conn. tissue Res. 1988; 18: 205-222)。次に、プレートを３７℃に平衡にした。ラット軟骨細胞懸濁液（上記）をSeaplaque アガロース／ＤＭＥＭの２％溶液で希釈して、最終細胞濃度を２×１０６個／ｍｌとなるようにした。アガロース細胞懸濁液２００μｌ（０．４×１０６個）を前もって調製したアガロースプラグに重層し、この直後に組換えＩＧＤ基質（ｒＡＧＧ１）または天然のウシアグレカン（Ａ１Ｄ１）５０μｇを適当なウェルに加え、攪拌混合した。次に、プレートを４℃で１５分間インキュベーションして、アガロースを固化した。次に、（レチノイン酸を含むまたは含まない）実験培地を、組換えＩＧＤ構築物、天然のウシアグレカン（Ａ１Ｄ１）および細胞のみを含む三つ組ウェルに下記のようにして加えた。コントロール培養物、ＤＭＥＭ＋ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）および処理済み培養物、ＤＭＥＭ＋ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）＋１０-6Ｍレチノイン酸（Hughes CE ら, 1995) 。次に、アガロース細胞培養物を５％ＣＯ２中で３７℃で９６時間保持した後、培地およびアガロース細胞マトリックス抽出物を更に分析した。
【００２３】
実施例４ コントロールおよびレチノイン酸で刺激したアガロース培養物からの実験的培地の分析
組換えＩＧＤ基質培養物からの培地および細胞のみを含む培養物を、蒸留水に対して徹底的に透析し、凍結乾燥し、１０％（容量／容量）メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液の等容に再構成した。Ａ１Ｄ１培養物および細胞のみを含む培養物からの培地試料を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．５に透析し、以前に報告した方法を用いて脱グリコシル化した(Hughes CEら, 1995) 。次に、試料を蒸留水に対して徹底的に透析して、凍結乾燥し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液の等容に再構成した。次に、試料（等容／ウェル）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロースに移し、下記の操作を用いてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体で免疫局在化を行った(immunolocated) 。
【００２４】
実施例５ コントロールおよびレチノイン酸で刺激した培養物からのアガロース−細胞マトリックスの抽出
組換えＩＧＤ基質培養物、ウシＡ１Ｄ１培養物、および細胞のみを含む培養物からのアガロースプラグを、下記の酵素阻害剤を含む４Ｍ塩化グアニジニウムで４℃で２４時間抽出した。１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭベンズアミジン塩酸塩、０．１Ｍ ６−アミノヘキサン酸、および１ｍＭフッ化フェネチルメタンスルホニル。アガロースゲルの残渣を遠心分離によって除去した後、上清を上記の基質のそれぞれについて処理した。次に、試料（等容／ウェル）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロースに移し、下記の手続きを用いてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体で免疫局在化を行った。
【００２５】
実施例６ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスターンブロット分析
天然の組換えＩＧＤ基質およびその異化作用生成物を含む試料を、Laemmli によって記載された操作を用いてＳＤＳ中１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行った(Laemmli UK, Nature 1970; 227: 680-685) 。電気泳動の後、分画したタンパク質を電気泳動によりニトロセルロースに移し、以前に記載した手続きを用いて(Hughes CEら, 1995) 、抗−ＦＬＡＧモノクローナルまたは抗ヒト免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体ＢＣ−３（いずれも１：１０００の希釈度）で免疫局在化を行った。天然のウシＡ１Ｄ１およびその異化作用生成物を含む試料を３〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動を行い、ニトロセルロース膜に移し、モノクローナル３−Ｂ−３、２−Ｂ−６およびＢＣ−３の１：１０００希釈物で免疫局在化した。通常は、免疫ブロットを基質と室温で５〜１５分間インキュベーションして最適な色を展開した。
【００２６】
実施例７ 組換えＩＧＤ構築物の特徴
組換えＩＧＤ構築物のＣＯＳ細胞へのトランスフェクションの結果、細胞が発現し、続いて組換えＩＧＤ生成物が培地へ分泌された。抗−ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルの使用により、トランスフェクションした細胞培地からのその精製が促進された。トランスフェクションしたＣＯＳ細胞培地１リットルは、組換えＩＧＤ基質１〜５ｍｇを生じた。非還元条件下では、この組換えＩＧＤ基質は、分子の免疫グロブリンドメインにおける不均一な数のシステイン残基の存在により高分子量の凝集体が形成された。この凝集体の形成により、アガロース培養物中の組換えＩＧＤ基質の固定が促進された。還元条件下では、組換えＩＧＤ構築物は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した後に見られるように、概算Ｍｒが７２ｋＤａおよび３９ｋＤａの２種類の分子量成分として存在した。組換えＩＧＤ基質の２種類の形態が存在する理由は、現在のところは不明であるが、（構築物のＦＬＡＧ領域におけるエピトープを認識する）抗Ｍ１モノクローナルおよび（構築物の免疫グロブリン領域におけるエピトープを認識する）抗Ｉｇモノクローナル抗体はいずれも組換えＩＧＤ構築物の両方の形態を認識した(immunolocated) 。分離した組換えＩＧＤ構築物をクーマシー染色したゲルをデンシトメーターで分析したところ、７２ｋＤａ対３９ｋＤａのバンドの比率は約１０：１であることを示していた（結果は図示せず）。
【００２７】
実施例８ レチノイン酸で処理したおよび処理しなかったアガロース培養物からのＩＧＤ組換え構築物の免疫化学分析
組換えＩＧＤ基質を、レチノイン酸を用いてまたは用いずにラット軟骨肉腫の軟骨細胞を含むアガロース細胞培養物中で９６時間固定した。培養液中でのＩＧＤ組換え基質およびその代謝物の分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスターンブロット分析によって検討した。（組換え基質のＮ−末端においてＦＬＡＧドメインにおけるエピトープを認識する）抗Ｍ１で免疫したところ、コントロール培養物またはレチノイン酸で処理した培養物からの培地に含まれるｒＡＧＧ−１代謝物のパターンに差は見られなかった。しかしながら、組換え基質のＣ−末端において免疫グロブリンドメインにおけるエピトープを認識する）抗Ｉｇで免疫したところ、６５ｋＤａで移動する追加バンドが存在することが示されており、７２ｋＤａの未消化組換え基質の部分異化が起こったことを示唆していた。この結果は、（Ｎ−末端における）Ｍ１エピトープは、ＩＧＤ組換え基質の７２ｋＤａ形から開裂して６５ｋＤａの異化生成物を生じることを示している。７２ｋＤａのバンドについて抗Ｍ１での陽性の免疫染色が見られないことは、この結論を裏付けている。ＩＧＤ構築物のこの開裂が組換え基質の「アグレカナーゼ」部位で起こっていることを確かめるため、レチノイン酸で処理したおよび処理しなかった軟骨細胞培養物の培地試料を、モノクローナル抗体ＢＣ−３（抗ＡＲＧ... ）を用いる免疫ブロッティングによって検討した。ＢＣ−３で免疫したところ、レチノイン酸なしの培養物には反応性は見られず、レチノイン酸で処理した培養物では６５ｋＤａに唯一の免疫陽性のバンドが見られた。この結果は、ＩＧＤ組換え基質の７２ｋＤａ形の「アグレカナーゼ」異化作用が起きたことを示している。しかしながら、３９ｋＤａのアイソフォームが異化作用を受けたという証拠はなかった。陽性の３９ｋＤａ形の異化生成物についてＢＣ−３による免疫染色が見られないことは、ｒＡＧＧ−１製剤には７２ｋＤａ形が１０倍も多くあるので、これらの異化生成物は低濃度で存在することによると思われる。６５ｋＤａの異化生成物はｒＡＧＧ−１の７２ｋＤａ形から誘導されることを確かめるため、ＢＣ−３免疫ブロットを抗Ｍ１抗体で再プローブした。
【００２８】
実施例９ レチノイン酸で処理したおよび処理しなかったアガロース培養物からの天然のウシＡ１Ｄ１の分析
この培養系における天然基質の使用についても評価を行い、これを人工の組換え基質と比較した。天然のウシアグレカン（Ａ１Ｄ１）を、レチノイン酸で処理したおよび処理しなかったラット軟骨細胞を含むアガロースと混合した。ウシＡ１Ｄ１を加えなかったアガロース細胞培養物も分析して、培養の９６時間中に合成された内因性プロテオグリカン（潜在的基質）の寄与について分析を行った。培地試料をモノクローナル抗体２−Ｂ−６で免疫したところ、細胞のみを含むアガロース培養物から採取した培地には染色は見られなかった。この結果は、培養期間に新たに合成された内因性基質の著しい寄与はなかったことを示している。レチノイン酸でおよびなしで保持された外部から添加されたウシアグレカン基質を含む培養物は、過去に幾つかの研究によって記載されたようにタンパク質コアの予想可能な配置「梯子」を示している(Hughes CEら, 1995; Ilic MZ,Handley CJ, Robinson HC, Biochem. Internat. 1990; 21: 977-986)。同様な結果は、モノクローナル抗体３−Ｂ−３を用いても見られた（図２、レーン４、５および６）。対照的に、Ｎ−末端配列ＡＲＧＳＶ... を有する「アグレカナーゼ」によって生成したアグレカン異化生成物について抗体ＢＣ−３を用いる免疫染色は、レチノイン酸処理を施した培養物のみで観察された。このＢＣ−３陽性アグレカン異化生成物の総体分子量は約１６０ｋＤａであり、他の培養系で見られるものと同様である(Hughes CEら, 1995) 。
【００２９】
組換え基質および天然のウシアグレカンを有する培養物からの培地および抽出物試料は、ＭＭＰ１、２、３、７、８または９によるアグレカンＩＧＤのタンパク質加水分解によって生成するＮ−末端ネオエピトープＦＦＧＶ... を認識する新たに開発された抗体（ＢＣ−１４）でも精査した。ＢＣ−１４を用いる免疫ブロッティングは、いずれの培養系でも陰性であった（データ省略）。この結果は、この部位におけるＩＧＤの異化作用は起きず、この知見は他の研究室からの報告と一致することを示している(Lark MWら, 1995) 。
【００３０】
実施例１０
更に検討を行うため、本発明者らは組換え基質ｒＡＧＧ−１ｍｕｔ、本発明者らの融合タンパク質ｒＡＧＧ−１の一変形であって、ＩＧＤのアミド末端における代替スプライスドナーを突然変異して、別のスプライシングを防止するものを用いた。その親構築物として、ｒＡＧＧ−１ｍｕｔは、アミノ末端タグとしてＦＬＡＧエピトープ、ヒトアグレカンのＩＧＤ、およびカルボキシ末端タグとしてヒトＩｇＧ分子の不変領域を含む。一時トランスフェクションの結果、ｒＡＧＧ−１ｍｕｔは融合タンパク質としてのＣＯＳ細胞によって培養物上清に分泌され、還元条件下では７２ｋＤのバンドとして、また非還元条件下では１４０ｋＤのバンドとして移動し、構築物のＣ−末端におけるヒト免疫グロブリン成分のヒンジ領域における不対システインの存在による二量体化を反映しているものと思われる。
【００３１】
レチノイン酸（ＲＡ）でシミュレーションすると、ラット軟骨肉腫細胞系ＲＸのアガロースを埋設した細胞はアグレカナーゼを生成する。ｒＡＧＧ−１ｍｕｔは、ｒＡＧＧ−１について記載されたようにアグレカナーゼ部位で異化し、これはモノクローナル抗体ＢＣ−３を用いる免疫検出によって示される。この異化生成物の６６ｋＤのサイズは、アグレカナーゼ部位での開裂の後の５．８ｋＤの予想された損失と一致している。
【００３２】
ｒＡＧＧ−１ｍｕｔのアミノ酸配列は、ｒＡＧＧ−１のアミノ酸配列と位置３４だけが異なり、ｒＡＧＧ−１ｍｕｔはＡｌａ３４を含み、ｒＡＧＧ−１はＧｌｙ３４を含む。
【００３３】
ｒＡＧＧ−１ｍｕｔをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列は、ｒＡＧＧ−１をコードするＤＮＡと３個の位置で異なり、２４４８ではＡがＣに、２４５０ではＧがＣに、２４５１ではＴがＡに置換されている。
【００３４】
一般的検討
これらの結果は、「アグレカナーゼ」活性の検討のための組換え基質の生産および使用の最初の報告である。また、本発明者らは、基質として作用する複雑な内因性アグレカン無しで「アグレカナーゼ」活性を監視するための新規な細胞培養物を開発した。この人工基質（ｒＡＧＧ１）の独特な凝集特性により、アガロース細胞培養系におけるその固定が容易になる。更に、本発明者らは、内因性細胞外マトリックスを確立して、任意の「アグレカナーゼ」活性の基質として作用させる必要なしに新たに単離した軟骨細胞を用いることができた。組換えＩＧＤ構築物で得られた結果は、「アグレカナーゼ」部位における開裂のアグレカンのＥＧＤについてＧ１および／またはＧ２ドメインを必要としないことを示している。更に、天然のアグレカン分子ではこの領域に剛性を与えることができるＩＧＤ内では、（ｒＡＧＧ−１構築物は抗硫酸ケラタン抗体５−Ｄ−４を用いるウェスターンブロット分析では陽性染色を示さないので）硫酸ケラタン鎖は必要ないと思われる（結果省略）。この新たに開発された培養系は、「アグレカナーゼ」によるアグレカン分解に関与した分子機構を更に検討するのに有用であることが明らかになるであろう。組換え基質およびネオエピトープ抗体が利用可能であるとすれば、新しい実験法が他のマトリックス高分子の異化作用の研究用に考えられる。
【００３５】
【配列表】
【００３６】
【００３７】
【００３８】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｒＡＧＧ−１の構造を示した図である。
ｒＡＧＧ−１は、ＣＤ５のシグナル配列：ＳＳ、Ｍ１モノクローナル抗体検出のためのＦＬＡＧ−エピトープ：ＦＬＡＧ、ヒトアグレカンの球間ドメイン：ＩＧＤ、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域：Ｈ、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域：ＣＨ２、およびヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域：ＣＨ３からなっている。
【図２】モノクローナル抗体Ｍ１（Ｍ１−ＭｏＡｂ）を用いたＣＯＳ細胞におけるｒＡＧＧ−１発現の検出の結果を示した写真である。
【図３】ＦＬＡＧエピトープにより精製したｒＡＧＧ−１の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）写真である。レーンＡ：クーマシー染色、レーンＢ：モノクローナル抗体Ｍ１を用いるウェスターンブロット検出、レーンＣ：抗ヒトＩｇＧ抗血清。
【図４】ラット軟骨肉腫細胞からの細胞培養液中のｒＡＧＧ−１のＢＣ−３反応性を示した電気泳動写真である。
レーンＡ：未刺激ラット軟骨肉腫細胞の培養物からのｒＡＧＧ−１はウェスターンブロット上ではＢＣ−３モノクローナル抗体では検出されないが、レチノイン酸出刺激した細胞の培養物からのｒＡＧＧ−１は検出される。レーンＢ、レーンＣ：モノクローナル抗体Ｍ１で再プロービングした後の同様なブロット。ＢＣ−３反応性断片は元の７２ｋＤバンドより約５．６ｋＤ小さく、「アグレカナーゼ」部位におけるｒＡＧＧ−１の開裂を示している。
【図５】「アグレカナーゼ」活性を検出するための可能な９６ウェルのフォーマットスクリーニング分析用の構造（ピン蓋を有する）を示した図である。
【図６】ｒＡＧＧ−１のアミノ酸配列（アミノ酸残基１〜２２４番）を示した図である。アミノ酸１〜２４はＣＤ５シグナル配列を、アミノ酸２５〜３２はＦｌａｇ−配列を、アミノ酸３３〜１６０はヒトアグレカン球間ドメインを、アミノ酸１６１〜１６４はスペーサー配列を、アミノ酸１６５〜１７９はヒトＩｇＧ１のヒンジ配列を、アミノ酸１８０〜２８９はヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域を、アミノ酸２９０〜３９６はヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域を、それぞれ示す。
【図７】ｒＡＧＧ−１のアミノ酸配列（アミノ酸残基２２５〜３９６番）を示した図である。図６の続きである。
【図８】ｒＡＧＧ−１の真核細胞における発現のためのベクターｐＣＤＭ８−ｒＡＧＧ−１のヌクレオチド配列を示した図である。
【図９】ｒＡＧＧ−１の真核細胞における発現のためのベクターｐＣＤＭ８−ｒＡＧＧ−１のヌクレオチド配列を示した図である。図８の続きである。
【図１０】ｒＡＧＧ−１の真核細胞における発現のためのベクターｐＣＤＭ８−ｒＡＧＧ−１のヌクレオチド配列を示した図である。図９の続きである。
【図１１】ｒＡＧＧ−１の真核細胞における発現のためのベクターｐＣＤＭ８−ｒＡＧＧ−１のヌクレオチド配列を示した図である。図１０の続きである。
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、細胞培養系における「アグレカナーゼ」のタンパク質分解活性を試験するための人工組換え基質（ｒＡＧＧ１）および天然アグレカンに関する。
【０００２】
背景技術
結合組織におけるプロテオグリカン分解の機構は複雑であり、複数の化合物および経路が関与している。アグレカンの異化作用の検討では、用いられる実験系主要な軟骨細胞で確立された軟骨細胞系の単層培養物(Hughes CE, Caterson B, Fosang AJ, Roughley PJ, Mort JS., Biochem. J. 1995: 305: 799-804; Lark MW, Gordy JT, Weidner JR ら, J. Biol. Chem. 1995; 270(6): 2550-2556) 、および各種の解剖学的部位および動物種からの軟骨を用いる外植片培養物(Flannery CR, Lark MW, Sandy JD, J. Biol. Chem. 1992; 267: 1008-1014; Sandy JD, Brown HL, Lowther DA, Biochim Biophys Acta 1978; 543: 536-44; Tyler JA, Biochem. J. 1985; 225: 493-507) を含んでいた。ＩＬ−１およびＴＮＦのようなサイトカインの添加が、細胞外マトリックスの分解を促進する化合物として広汎に用いられてきた(Hughes CEら, 1995; Morales TI, Roberts AB, Arch Biochem Biophys 1992; 293 (1): 79-84; Forsang AJ, Tyler JA, Hardingham TE, Matrix 1991; 11: 17-24) 。特に、これら二種類のサイトカインは、アグレカンの異化作用を標的とすることが示されている。数件の研究により、アグレカンのタンパク質コアに沿った特異的開裂部位を定義する多数の重要な発見がなされてきた(Ilic MZ, Handley CJ, Robinson HC, Mok MT, Arch Biochem Biophys 1992; 294(1): 115-22; Loulakis P, Shrikhande A, Davis G, Maniglia CA, 酵素開裂の推定部位(Putative site(s) of enzymic cleavage), Biochem J 1992; 284: 589-593; Sandy JD, Neame PJ, Boynton RE, Flannery CR, J. Biol. Chem. 1991; 266: 8683-8685) 。全体として、少なくとも７個の開裂部位があると思われ、軟骨プロテオグリカン分解生成物のアミノ酸配列分析により、アミノ酸残基Ａｓｎ341 −Ｐｈｅ342 およびＧｌｕ373 −Ａｌａ374 の間に球間(interglobular) ドメイン（ＩＧＤ）内に存在するアグレカンにおけるタンパク質分解開裂の２個の主要な部位が定義されている（ヒト配列表）(Doege KJ, Sasaki M, Kimura T, Yamada Y, J. Biol. Chem. 1991; 266: 894-902) 。前者の開裂部位は、ヒアルロン酸塩と錯体形成した組織に残っている５０〜６０ｋＤａのＧ１ドメインからなるＣ−末端異化断片（... ＤＩＰＥＮ）を生じる(Flannery CRら, 1992) 。最近の研究において、Fosangら(Fosang AJ, Last K, Brown L, Jackson DC, Gardiner P, Trans. Orthop. Res. Soc. 1995; 20: 4)は、多種多様な関節炎疹と診断された患者からの滑液においてこの開裂部位からＮ−末端断片（ＦＦＧ... ）も同定した。同様に、Wittら(Witt M, Fosang AJ, Hughes CE, Hardingham TE, Trans. Orthop. Res. Soc. 1995; 20: 122) は、コントロールおよびＩＬ−１で刺激したブタ外植片培養物からの培地試料中にこれらのグリコースアミノグリカン含有Ｎ−末端断片を見いだした。後者の開裂部位は、関節炎患者の滑液から単離された主要なアグレカン分解生成物と思われ(Lohmander LS, Neame PJ, Sandy JD, Arth. Rheum. 1993; 36: 1214-1222)、かつＩＬ−１またはレチノイン酸で処理した軟骨外植片培養物からの培地にも見られる(Hughes CEら, 1995; Sandy JDら, 1991) グリコースアミノグリカン含有Ｎ−末端断片（ＡＲＧ... ）を生成する。最近の研究(Lark MWら, 1995) では、レチノイン酸で処理したラット軟骨肉腫細胞中のＣ−末端断片（... ＥＧＥ）が同定された。このＧｌｕ373 −Ａｌａ374 の開裂に関与するタンパク質分解活性は同定されていないが、Ｇｌｕ−Ｘａａペプチド結合（但し、ＸａａはＡｌａ、ＧｌｙまたはＬｅｕである）に特異性を有するものと思われる。この今までのところ特定されていない活性は「アグレカナーゼ(Fosang AJ, Neame PJ, Last K, Hardingham TE, Murphy G, Hamilton JA, J. Biol. Chem. 1992; 267: 19470-19474)」と呼ばれている。分子内の開裂の部位は十分に特定されているが、多数の様々なプロテオグリカン分解生成物の生成に関与する化合物の多くは今だ同定されていない。培養系は、プロテオグリカンの異化作用を促進する各種の化合物で操作され、その分解に関与する（複数の）化合物を見いだす努力がなされてきた。しかしながら、これらの研究は、アグレカンの分解に関与する特定の化合物を特定することはできなかった(Flannery CR, Sandy JD, Trans. Orthop. Res. Soc. 1993)。それにも拘らず、精製したアグレカンおよび改変したアグレカンを精製した酵素製剤の基質として用いる実験データーから、これらの酵素の特異的な開裂部位について幾らかの情報が得られている。しかし、このイン・ビトロでの研究は軟骨でのアグレカンの分解に関与する機構を確定しまたは化合物を同定するのに直接役立っていない(Fosang AJら, 1992; Fosang AJ, Neame PJ, Hardingham TE, Murphy G, Hamilton JA, J. Biol. Chem. 1991; 266: 15579-15582; Fosang AJ, Last K, Neame PJ ら, Biochem. J. 1994; 304: 347-351) 。
【０００３】
過去の研究(Hughes CEら, 1995; Hughes CE, Caterson B, White RJ, Roughley PJ, Mort JS, J. Biol. Chem. 1992; 267: 16011-16014) において、本発明者らは特異的なプロテイナーゼによって開裂された生成物（プロテオグリカン凝集体の異化作用生成物）に特異的な多数のモノクローナル抗体を開発した。これらの抗体は、軟骨外植片培養系においてプロテオグリカンの分解機構の研究における手段として有用であることが明らかにされた。この最新の研究の目的は、アグレカンのＩＧＤにおける 374ＡＲＧＳＶＩ... 部位におけるアグレカンの開裂に関与する化合物の同定を一層促進する培養系を更に開発することであった。
【０００４】
【発明の概要】
本明細書において、本発明者らは、固有の内因性プロテオグリカンおよび他の細胞外成分を含まない細胞培養系において人工的組換え基質に対する「アグレカナーゼ」の活性を研究することができるようにするイン・ビトロの培養系の開発を説明する。アグレカンのＩＧＤにおける重要な開裂部位に対する過去に特定されたネオエピトープ抗体を使用することによって、この系における「アグレカナーゼ」のタンパク質分解作用によって精製した生成物の監視が容易になった。
【０００５】
それ故、本発明の一態様は、イン・ビトロ試験系におけるアグレカナーゼの組換え基質であり、好ましくは
a) ＣＤ５のシグナル配列、
b) Ｍ１モノクローナル抗体検出のためのＦＬＡＧ−エピトープ、
c) ヒトアグレカンの球間ドメイン、
d) ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、
e) ヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域、および
f) ヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域
を含んでなる構成要素の群を含む組換え基質である。
【０００６】
本発明の好ましい態様は、配列番号３のアミノ酸配列またはその部分を有するか、または配列番号３のアミノ酸配列またはその部分であって、アミノ酸３４がＡｌａに変異した組換え基質である。
【０００７】
【発明の具体的説明】
本発明のもう一つの態様は、上記の組換え基質をコードするＤＮＡであり、好ましくは配列番号４のヌクレオチド２３５０〜４１１４のヌクレオチド配列またはその部分を有する、配列番号４のヌクレオチド２３５０〜４１１４のヌクレオチド配列またはその部分であって、ヌクレオチド２４４８がＣに変異し、ヌクレオチド２４５０がＣに変異し、ヌクレオチド２４５１がＡに変異したものを有する、またはストリンジュント条件下で配列番号４に示したＤＮＡとハイブリダイゼーションを行う、ＤＮＡである。
【０００８】
本発明によるストリンジュント条件下でのハイブリダイゼーションとは、６×ＳＳＣ（または６×ＳＳＰＥ）、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性したサケ精子ＤＮＡ断片を含むハイブリダイゼーション溶液中で標識したプローブの融点下の２０〜２５℃の温度におけるハイブリダイゼーションを意味する（Sambrookら, 「分子クローニング−実験室便覧(Molecular Cloning - A Laboratory Manual) 」, 第２版, １９８９年、Cold Spring Harbor Laboratory Press,第２巻, 第９章, ９．５２〜９．５５頁）。
【０００９】
本発明の他の態様は、上記のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片を含むベクター、および前記ベクターを含む宿主細胞である。
【００１０】
本発明のもう一つの態様は、アグレカナーゼの活性を試験する目的での細胞培養系での上記の組換え基質の使用であり、好ましくは上記細胞培養系が固有の内因性プロテオグリカンおよび他の細胞外成分を含まない、使用である。
【００１１】
本発明のもう一つの態様は、アグレカナーゼの活性の試験を抗体による開裂生成物の検出によって行う、上記の組換え基質の使用である。
【００１２】
本発明のもう一つの態様は、組換え基質における新規な酵素開裂部位の検出を行うための上記基質の使用である。
【００１３】
本発明のもう一つの態様は、アフィニティークロマトグラフィーによってアグレカナーゼを精製するための、またはアグレカナーゼｃＤＮＡを単離するための機能性クローニング系における上記の組換え基質の使用である。
【００１４】
本発明のもう一つの態様は、骨関節症の開始または進行を監視する方法であって、骨関節症を有することが疑われるまたは知られているヒトからの生物学的流体の試料を、上記の組換え基質によるアグレカナーゼの存在について分析を行い、上記生物学的流体が、滑液、尿、血清およびリンパ液からなる群から選択されることを特徴とする方法である。
【００１５】
本発明のもう一つの態様は、疾病の進行を観察して治療の有効性を決定することに使用する、上記の方法である。
【００１６】
本発明のもう一つの態様は、アグレカナーゼ阻害剤をスクリーニングする目的での上記の組換え基質の使用である。
【００１７】
本発明のもう一つの態様は、上記の組換え基質および抗体を含み、アグレカナーゼ開裂生成物を検出するための診断助剤である。
【００１８】
以下において、本発明を実施例、および図面によって詳細に説明する。
なお、図６および７のアミノ酸配列は配列番号３の配列と、図８〜１１の塩基配列は配列番号４の配列と、それぞれ対応する。
【００１９】
【実施例】
材料
アルカリホスファターゼと結合した第二の抗体およびウェスターンブロット分析に用いられる基質は、Protoblot Western blot AP 系（カタログ番号Ｗ３９２０）としてPromega から得た。ニトロセルロース（孔径０．２μｍ）は、Schleicher and Schnellから入手した。モノクローナル抗体Ｍ１および抗−ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルは、いずれもKodak から入手した。抗ヒトＩｇモノクローナル抗体は、Capell、Durhamから入手した。モノクローナル抗体ＢＣ−３、２−Ｂ−６および３−Ｂ−３は、腹水として調製した(Hughes CEら, 1995) 。Ｒｘ細胞系は、Dr. Jim Kimura, Bone Research Center, Henry Ford Hospital,デトロイト, ミシガン州の好意により提供を受けた。
【００２０】
実施例１ ｒＡＧＧ１遺伝子構築物の調製
ｒＡＧＧ１の遺伝子構築物は、リンパ細胞糖タンパク質Ｔ１／Ｌｅｕ−１（ＣＤ５）のシグナル配列、長さが８個のアミノ酸のＦＬＡＧ（商標名）エピトープ(Prickett KS, Amberg DC, Hopp TP, Bio Techniques 1989; 7: 580-589)、ヒト軟骨大の凝集性プロテオグリカンアグレカンの長さが１２７個のアミノ酸の球間ドメイン（ 350Ｔ− 476Ｇ）(Doege KJ ら, 1991) 、長さが２個のアミノ酸のグリシンスペーサー、およびヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３不変領域をコードすることにより、予想分子質量が４１．０５９ｄの融合タンパク質を生じる。球間ドメインをコードするアグレカンｃＤＮＡ配列を、この領域の近接(flanking)配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドとヒトヒザ軟骨の総ＲＮＡとを用いる逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）(Beverly SM,分子生物学における最新のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)、カナダ：John Wiley and Sons, 1992)によって増幅した。総ＲＮＡは、Adams ら(Adams ME, Huang DQ, Yao LY, Sandell LJ, Anal. Biochemistry 1992; 202: 89-95) により、関節交換手術から得たヒト軟骨組織から抽出した。オリゴヌクレオチドは、ＦＬＡＧエピトープおよびｇ−スペーサーに関する追加配列情報を含み、かつ増幅したｃＤＮＡセグメントの５′および３′末端に制限酵素開裂部位を有し、続いて３′Ｎｈｅｌ部位を含むように改変したＣＤ５−ＩｇＧ１発現ベクターに挿入し易くなるように設計した(Aruffo A, Stamenkovic I, Melcick M, Underhill CB, Seed B, Cell 1990; 61: 1303-1313)。ＦＬＡＧエピトープおよび球間ドメインのアミノ末端開始をコードし且Ｎｈｅｌ部位を含むプライマーを、下記の配列：5´-CGC GGG GCT AGC CGA CTA CAA GGA CGA CGA TGA CAA GAC AGG TGA AGA CTT TGT GGA C（配列番号：１）を用いて合成した。球間ドメインのカルボキシ末端、Ｇ−スペーサー、ＢａｍＨＩ部位を含むスプライスドナー部位をコードするリバースプライマーは、配列：5´-CGC GGG GGA TCC CCT CCC CCT GGC AAA TGC GGC TGC CC （配列番号：２）を有する。ＰＣＲ生成物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ切断ベクターＣＤ５−ＩｇＧ(Aruffo A ら, 1990) に連結した。
【００２１】
実施例２ ＣＯＳ細胞におけるｒＡＧＧの生産および精製
構築物を、ＤＥＡＥ−デキストランを介してＣＯＳ細胞にトランスフェクションした(Hollenbaugh D, Aruffo A, 分子生物学における最新のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)、カナダ：John Wiley and Sons, 1994)。トランスフェクションから１２時間後に、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ中で成育した細胞をトリプシン処理して、新たな皿に播種し、５日間成育させた。３日目に、新たな培地および１０％ＦＣＳを加えた。上清を回収して非付着細胞および破片を除いて、４℃で貯留して保存した。融合タンパク質を、抗−ＦＬＡＧ（商標名）Ｍ１アフィニティーゲル(Kodak、ニューヘブン）を用いて、製造業者のプロトコールに従ってアフィニティー精製した。通常は、収率は、培養物上清１ｍｌ当たり１〜５μｇ融合タンパク質であった。
【００２２】
実施例３ 組換えＩＧＤ基質および天然アグレカンの異化作用の試験のためのレチノイン酸の存在下または非存在下でのアガロース中でのラット軟骨肉腫細胞の培養
ラット軟骨肉腫細胞を７５ｃｍ２フラスコで培養し、５％ＦＣＳおよび５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ培地に保持した。７５ｃｍ２フラスコ中のコンフルエント単層を３７℃で１５〜２０分間攪拌しながらトリプシン処理（ＥＤＴＡを含むＤＭＥＭ中０．２５％トリプシン）を行った後、ＤＭＥＭ中０．０５％コラゲナーゼで１〜２時間消化した。次いで、細胞を４×１０６個／ｍｌの濃度でＤＭＥＭに再懸濁した。２４ウェルの培養プレートにFMC Seaplaque アガロース／ＤＭＥＭの１％（重量／容量）溶液を「コーティング」し（２００μｌ／ウェル）、アガロースを４℃で３０分間インキュベーションして固化した(Aydelotte MB, Juettner KE, Conn. tissue Res. 1988; 18: 205-222)。次に、プレートを３７℃に平衡にした。ラット軟骨細胞懸濁液（上記）をSeaplaque アガロース／ＤＭＥＭの２％溶液で希釈して、最終細胞濃度を２×１０６個／ｍｌとなるようにした。アガロース細胞懸濁液２００μｌ（０．４×１０６個）を前もって調製したアガロースプラグに重層し、この直後に組換えＩＧＤ基質（ｒＡＧＧ１）または天然のウシアグレカン（Ａ１Ｄ１）５０μｇを適当なウェルに加え、攪拌混合した。次に、プレートを４℃で１５分間インキュベーションして、アガロースを固化した。次に、（レチノイン酸を含むまたは含まない）実験培地を、組換えＩＧＤ構築物、天然のウシアグレカン（Ａ１Ｄ１）および細胞のみを含む三つ組ウェルに下記のようにして加えた。コントロール培養物、ＤＭＥＭ＋ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）および処理済み培養物、ＤＭＥＭ＋ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）＋１０-6Ｍレチノイン酸（Hughes CE ら, 1995) 。次に、アガロース細胞培養物を５％ＣＯ２中で３７℃で９６時間保持した後、培地およびアガロース細胞マトリックス抽出物を更に分析した。
【００２３】
実施例４ コントロールおよびレチノイン酸で刺激したアガロース培養物からの実験的培地の分析
組換えＩＧＤ基質培養物からの培地および細胞のみを含む培養物を、蒸留水に対して徹底的に透析し、凍結乾燥し、１０％（容量／容量）メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液の等容に再構成した。Ａ１Ｄ１培養物および細胞のみを含む培養物からの培地試料を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．５に透析し、以前に報告した方法を用いて脱グリコシル化した(Hughes CEら, 1995) 。次に、試料を蒸留水に対して徹底的に透析して、凍結乾燥し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液の等容に再構成した。次に、試料（等容／ウェル）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロースに移し、下記の操作を用いてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体で免疫局在化を行った(immunolocated) 。
【００２４】
実施例５ コントロールおよびレチノイン酸で刺激した培養物からのアガロース−細胞マトリックスの抽出
組換えＩＧＤ基質培養物、ウシＡ１Ｄ１培養物、および細胞のみを含む培養物からのアガロースプラグを、下記の酵素阻害剤を含む４Ｍ塩化グアニジニウムで４℃で２４時間抽出した。１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭベンズアミジン塩酸塩、０．１Ｍ ６−アミノヘキサン酸、および１ｍＭフッ化フェネチルメタンスルホニル。アガロースゲルの残渣を遠心分離によって除去した後、上清を上記の基質のそれぞれについて処理した。次に、試料（等容／ウェル）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロースに移し、下記の手続きを用いてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体で免疫局在化を行った。
【００２５】
実施例６ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスターンブロット分析
天然の組換えＩＧＤ基質およびその異化作用生成物を含む試料を、Laemmli によって記載された操作を用いてＳＤＳ中１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行った(Laemmli UK, Nature 1970; 227: 680-685) 。電気泳動の後、分画したタンパク質を電気泳動によりニトロセルロースに移し、以前に記載した手続きを用いて(Hughes CEら, 1995) 、抗−ＦＬＡＧモノクローナルまたは抗ヒト免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体ＢＣ−３（いずれも１：１０００の希釈度）で免疫局在化を行った。天然のウシＡ１Ｄ１およびその異化作用生成物を含む試料を３〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動を行い、ニトロセルロース膜に移し、モノクローナル３−Ｂ−３、２−Ｂ−６およびＢＣ−３の１：１０００希釈物で免疫局在化した。通常は、免疫ブロットを基質と室温で５〜１５分間インキュベーションして最適な色を展開した。
【００２６】
実施例７ 組換えＩＧＤ構築物の特徴
組換えＩＧＤ構築物のＣＯＳ細胞へのトランスフェクションの結果、細胞が発現し、続いて組換えＩＧＤ生成物が培地へ分泌された。抗−ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルの使用により、トランスフェクションした細胞培地からのその精製が促進された。トランスフェクションしたＣＯＳ細胞培地１リットルは、組換えＩＧＤ基質１〜５ｍｇを生じた。非還元条件下では、この組換えＩＧＤ基質は、分子の免疫グロブリンドメインにおける不均一な数のシステイン残基の存在により高分子量の凝集体が形成された。この凝集体の形成により、アガロース培養物中の組換えＩＧＤ基質の固定が促進された。還元条件下では、組換えＩＧＤ構築物は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した後に見られるように、概算Ｍｒが７２ｋＤａおよび３９ｋＤａの２種類の分子量成分として存在した。組換えＩＧＤ基質の２種類の形態が存在する理由は、現在のところは不明であるが、（構築物のＦＬＡＧ領域におけるエピトープを認識する）抗Ｍ１モノクローナルおよび（構築物の免疫グロブリン領域におけるエピトープを認識する）抗Ｉｇモノクローナル抗体はいずれも組換えＩＧＤ構築物の両方の形態を認識した(immunolocated) 。分離した組換えＩＧＤ構築物をクーマシー染色したゲルをデンシトメーターで分析したところ、７２ｋＤａ対３９ｋＤａのバンドの比率は約１０：１であることを示していた（結果は図示せず）。
【００２７】
実施例８ レチノイン酸で処理したおよび処理しなかったアガロース培養物からのＩＧＤ組換え構築物の免疫化学分析
組換えＩＧＤ基質を、レチノイン酸を用いてまたは用いずにラット軟骨肉腫の軟骨細胞を含むアガロース細胞培養物中で９６時間固定した。培養液中でのＩＧＤ組換え基質およびその代謝物の分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスターンブロット分析によって検討した。（組換え基質のＮ−末端においてＦＬＡＧドメインにおけるエピトープを認識する）抗Ｍ１で免疫したところ、コントロール培養物またはレチノイン酸で処理した培養物からの培地に含まれるｒＡＧＧ−１代謝物のパターンに差は見られなかった。しかしながら、組換え基質のＣ−末端において免疫グロブリンドメインにおけるエピトープを認識する）抗Ｉｇで免疫したところ、６５ｋＤａで移動する追加バンドが存在することが示されており、７２ｋＤａの未消化組換え基質の部分異化が起こったことを示唆していた。この結果は、（Ｎ−末端における）Ｍ１エピトープは、ＩＧＤ組換え基質の７２ｋＤａ形から開裂して６５ｋＤａの異化生成物を生じることを示している。７２ｋＤａのバンドについて抗Ｍ１での陽性の免疫染色が見られないことは、この結論を裏付けている。ＩＧＤ構築物のこの開裂が組換え基質の「アグレカナーゼ」部位で起こっていることを確かめるため、レチノイン酸で処理したおよび処理しなかった軟骨細胞培養物の培地試料を、モノクローナル抗体ＢＣ−３（抗ＡＲＧ... ）を用いる免疫ブロッティングによって検討した。ＢＣ−３で免疫したところ、レチノイン酸なしの培養物には反応性は見られず、レチノイン酸で処理した培養物では６５ｋＤａに唯一の免疫陽性のバンドが見られた。この結果は、ＩＧＤ組換え基質の７２ｋＤａ形の「アグレカナーゼ」異化作用が起きたことを示している。しかしながら、３９ｋＤａのアイソフォームが異化作用を受けたという証拠はなかった。陽性の３９ｋＤａ形の異化生成物についてＢＣ−３による免疫染色が見られないことは、ｒＡＧＧ−１製剤には７２ｋＤａ形が１０倍も多くあるので、これらの異化生成物は低濃度で存在することによると思われる。６５ｋＤａの異化生成物はｒＡＧＧ−１の７２ｋＤａ形から誘導されることを確かめるため、ＢＣ−３免疫ブロットを抗Ｍ１抗体で再プローブした。
【００２８】
実施例９ レチノイン酸で処理したおよび処理しなかったアガロース培養物からの天然のウシＡ１Ｄ１の分析
この培養系における天然基質の使用についても評価を行い、これを人工の組換え基質と比較した。天然のウシアグレカン（Ａ１Ｄ１）を、レチノイン酸で処理したおよび処理しなかったラット軟骨細胞を含むアガロースと混合した。ウシＡ１Ｄ１を加えなかったアガロース細胞培養物も分析して、培養の９６時間中に合成された内因性プロテオグリカン（潜在的基質）の寄与について分析を行った。培地試料をモノクローナル抗体２−Ｂ−６で免疫したところ、細胞のみを含むアガロース培養物から採取した培地には染色は見られなかった。この結果は、培養期間に新たに合成された内因性基質の著しい寄与はなかったことを示している。レチノイン酸でおよびなしで保持された外部から添加されたウシアグレカン基質を含む培養物は、過去に幾つかの研究によって記載されたようにタンパク質コアの予想可能な配置「梯子」を示している(Hughes CEら, 1995; Ilic MZ,Handley CJ, Robinson HC, Biochem. Internat. 1990; 21: 977-986)。同様な結果は、モノクローナル抗体３−Ｂ−３を用いても見られた（図２、レーン４、５および６）。対照的に、Ｎ−末端配列ＡＲＧＳＶ... を有する「アグレカナーゼ」によって生成したアグレカン異化生成物について抗体ＢＣ−３を用いる免疫染色は、レチノイン酸処理を施した培養物のみで観察された。このＢＣ−３陽性アグレカン異化生成物の総体分子量は約１６０ｋＤａであり、他の培養系で見られるものと同様である(Hughes CEら, 1995) 。
【００２９】
組換え基質および天然のウシアグレカンを有する培養物からの培地および抽出物試料は、ＭＭＰ１、２、３、７、８または９によるアグレカンＩＧＤのタンパク質加水分解によって生成するＮ−末端ネオエピトープＦＦＧＶ... を認識する新たに開発された抗体（ＢＣ−１４）でも精査した。ＢＣ−１４を用いる免疫ブロッティングは、いずれの培養系でも陰性であった（データ省略）。この結果は、この部位におけるＩＧＤの異化作用は起きず、この知見は他の研究室からの報告と一致することを示している(Lark MWら, 1995) 。
【００３０】
実施例１０
更に検討を行うため、本発明者らは組換え基質ｒＡＧＧ−１ｍｕｔ、本発明者らの融合タンパク質ｒＡＧＧ−１の一変形であって、ＩＧＤのアミド末端における代替スプライスドナーを突然変異して、別のスプライシングを防止するものを用いた。その親構築物として、ｒＡＧＧ−１ｍｕｔは、アミノ末端タグとしてＦＬＡＧエピトープ、ヒトアグレカンのＩＧＤ、およびカルボキシ末端タグとしてヒトＩｇＧ分子の不変領域を含む。一時トランスフェクションの結果、ｒＡＧＧ−１ｍｕｔは融合タンパク質としてのＣＯＳ細胞によって培養物上清に分泌され、還元条件下では７２ｋＤのバンドとして、また非還元条件下では１４０ｋＤのバンドとして移動し、構築物のＣ−末端におけるヒト免疫グロブリン成分のヒンジ領域における不対システインの存在による二量体化を反映しているものと思われる。
【００３１】
レチノイン酸（ＲＡ）でシミュレーションすると、ラット軟骨肉腫細胞系ＲＸのアガロースを埋設した細胞はアグレカナーゼを生成する。ｒＡＧＧ−１ｍｕｔは、ｒＡＧＧ−１について記載されたようにアグレカナーゼ部位で異化し、これはモノクローナル抗体ＢＣ−３を用いる免疫検出によって示される。この異化生成物の６６ｋＤのサイズは、アグレカナーゼ部位での開裂の後の５．８ｋＤの予想された損失と一致している。
【００３２】
ｒＡＧＧ−１ｍｕｔのアミノ酸配列は、ｒＡＧＧ−１のアミノ酸配列と位置３４だけが異なり、ｒＡＧＧ−１ｍｕｔはＡｌａ３４を含み、ｒＡＧＧ−１はＧｌｙ３４を含む。
【００３３】
ｒＡＧＧ−１ｍｕｔをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列は、ｒＡＧＧ−１をコードするＤＮＡと３個の位置で異なり、２４４８ではＡがＣに、２４５０ではＧがＣに、２４５１ではＴがＡに置換されている。
【００３４】
一般的検討
これらの結果は、「アグレカナーゼ」活性の検討のための組換え基質の生産および使用の最初の報告である。また、本発明者らは、基質として作用する複雑な内因性アグレカン無しで「アグレカナーゼ」活性を監視するための新規な細胞培養物を開発した。この人工基質（ｒＡＧＧ１）の独特な凝集特性により、アガロース細胞培養系におけるその固定が容易になる。更に、本発明者らは、内因性細胞外マトリックスを確立して、任意の「アグレカナーゼ」活性の基質として作用させる必要なしに新たに単離した軟骨細胞を用いることができた。組換えＩＧＤ構築物で得られた結果は、「アグレカナーゼ」部位における開裂のアグレカンのＥＧＤについてＧ１および／またはＧ２ドメインを必要としないことを示している。更に、天然のアグレカン分子ではこの領域に剛性を与えることができるＩＧＤ内では、（ｒＡＧＧ−１構築物は抗硫酸ケラタン抗体５−Ｄ−４を用いるウェスターンブロット分析では陽性染色を示さないので）硫酸ケラタン鎖は必要ないと思われる（結果省略）。この新たに開発された培養系は、「アグレカナーゼ」によるアグレカン分解に関与した分子機構を更に検討するのに有用であることが明らかになるであろう。組換え基質およびネオエピトープ抗体が利用可能であるとすれば、新しい実験法が他のマトリックス高分子の異化作用の研究用に考えられる。
【００３５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｒＡＧＧ−１の構造を示した図である。
ｒＡＧＧ−１は、ＣＤ５のシグナル配列：ＳＳ、Ｍ１モノクローナル抗体検出のためのＦＬＡＧ−エピトープ：ＦＬＡＧ、ヒトアグレカンの球間ドメイン：ＩＧＤ、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域：Ｈ、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域：ＣＨ２、およびヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域：ＣＨ３からなっている。
【図２】モノクローナル抗体Ｍ１（Ｍ１−ＭｏＡｂ）を用いたＣＯＳ細胞におけるｒＡＧＧ−１発現の検出の結果を示した写真である。
【図３】ＦＬＡＧエピトープにより精製したｒＡＧＧ−１の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）写真である。レーンＡ：クーマシー染色、レーンＢ：モノクローナル抗体Ｍ１を用いるウェスターンブロット検出、レーンＣ：抗ヒトＩｇＧ抗血清。
【図４】ラット軟骨肉腫細胞からの細胞培養液中のｒＡＧＧ−１のＢＣ−３反応性を示した電気泳動写真である。
レーンＡ：未刺激ラット軟骨肉腫細胞の培養物からのｒＡＧＧ−１はウェスターンブロット上ではＢＣ−３モノクローナル抗体では検出されないが、レチノイン酸出刺激した細胞の培養物からのｒＡＧＧ−１は検出される。レーンＢ、レーンＣ：モノクローナル抗体Ｍ１で再プロービングした後の同様なブロット。ＢＣ−３反応性断片は元の７２ｋＤバンドより約５．６ｋＤ小さく、「アグレカナーゼ」部位におけるｒＡＧＧ−１の開裂を示している。
【図５】「アグレカナーゼ」活性を検出するための可能な９６ウェルのフォーマットスクリーニング分析用の構造（ピン蓋を有する）を示した図である。
【図６】ｒＡＧＧ−１のアミノ酸配列（アミノ酸残基１〜２２４番）を示した図である。アミノ酸１〜２４はＣＤ５シグナル配列を、アミノ酸２５〜３２はＦｌａｇ−配列を、アミノ酸３３〜１６０はヒトアグレカン球間ドメインを、アミノ酸１６１〜１６４はスペーサー配列を、アミノ酸１６５〜１７９はヒトＩｇＧ１のヒンジ配列を、アミノ酸１８０〜２８９はヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域を、アミノ酸２９０〜３９６はヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域を、それぞれ示す。
【図７】ｒＡＧＧ−１のアミノ酸配列（アミノ酸残基２２５〜３９６番）を示した図である。図６の続きである。
【図８】ｒＡＧＧ−１の真核細胞における発現のためのベクターｐＣＤＭ８−ｒＡＧＧ−１のヌクレオチド配列を示した図である。
【図９】ｒＡＧＧ−１の真核細胞における発現のためのベクターｐＣＤＭ８−ｒＡＧＧ−１のヌクレオチド配列を示した図である。図８の続きである。
【図１０】ｒＡＧＧ−１の真核細胞における発現のためのベクターｐＣＤＭ８−ｒＡＧＧ−１のヌクレオチド配列を示した図である。図９の続きである。
【図１１】ｒＡＧＧ−１の真核細胞における発現のためのベクターｐＣＤＭ８−ｒＡＧＧ−１のヌクレオチド配列を示した図である。図１０の続きである。
Claims (16)
- 基質が、
a) ＣＤ５のシグナル配列、
b) Ｍ１モノクローナル抗体検出のためのＦＬＡＧ（登録商標）−エピトープ、
c) ヒトアグレカンの球間ドメイン、
d) ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、
e) ヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域、および
f) ヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域
を含んでなる構成要素の群を含む、イン・ビトロでの試験系におけるアグレカナーゼの組換え基質。 - a) 基質が配列番号３のアミノ酸配列を有するか、または
b) 配列番号３のアミノ酸配列であって、アミノ酸３４がＡｌａに変異したものである、
請求項１に記載の組換え基質。 - 請求項１または２に記載の組換え基質をコードするＤＮＡ。
- a) ＤＮＡが配列番号４のヌクレオチド２３５０〜４１１４のヌクレオチド配列を有する、
b) ＤＮＡが配列番号４のヌクレオチド２３５０〜４１１４のヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド２４４８がＣに変異し、ヌクレオチド２４５０がＣに変異し、ヌクレオチド２４５１がＡに変異したものを有する、または
c) ＤＮＡがストリンジェント条件下で配列番号４に示したＤＮＡとハイブリダイズする、
請求項３に記載のＤＮＡ。 - 請求項４に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片を含むベクター。
- 請求項５に記載のベクターを含む宿主細胞。
- アグレカナーゼの活性を試験するための細胞培養系における、請求項１または２に記載の組換え基質の使用。
- 細胞培養系が固有の内因性プロテオグリカンおよび他の細胞外成分を含まない、請求項７に記載の組換え基質の使用。
- アグレカナーゼの活性を抗体による開裂生成物の検出によって試験する、請求項７または８に記載の組換え基質の使用。
- 基質における新規な酵素開裂部位を検出するための、請求項１または２に記載の組換え基質の使用。
- アフィニティクロマトグラフィによってアグレカナーゼを精製するための、請求項１または２に記載の組換え基質の使用。
- アグレカナーゼ阻害剤をスクリーニングするための請求項１または２に記載の組換え基質の使用。
- 骨関節症の開始または進行を監視する方法であって、骨関節症を有することが疑われるまたは知られているヒトからの生物学的流体の試料を、請求項１または２に記載の組換え基質によってアグレカナーゼの存在について分析を行う方法。
- 上記生物学的流体が、滑液、尿、血清およびリンパ液からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
- 上記方法を、疾病の進行を観察して治療の有効性を決定するのに使用する、請求項１３または１４に記載の方法。
- 請求項１または２に記載の組換え基質および抗体を含み、アグレカナーゼ開裂生成物を検出するための診断助剤。
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- 2000-10-20 GR GR20000402336T patent/GR3034649T3/el unknown
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