JPH09191889A - アグレカナーゼのタンパク質分解活性試験用組換え基質（ｒＡＧＧ１） - Google Patents
アグレカナーゼのタンパク質分解活性試験用組換え基質（ｒＡＧＧ１）Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アグレカナーゼ活性の試験用組換え基質の提
供。 【解決手段】 ＣＤ５のシグナル配列、Ｍ１モノクロー
ン性抗体検出のためのＦＬＡＧ−エピトープ、ヒトアグ
レカンの球間ドメイン、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、ヒ
トＩｇＧ１のＣＨ２領域、およびヒトＩｇＧ１のＣＨ３
領域を含むイン・ビトロでの試験系におけるアグレカナ
ーゼの組換え基質。
供。 【解決手段】 ＣＤ５のシグナル配列、Ｍ１モノクロー
ン性抗体検出のためのＦＬＡＧ−エピトープ、ヒトアグ
レカンの球間ドメイン、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、ヒ
トＩｇＧ１のＣＨ２領域、およびヒトＩｇＧ１のＣＨ３
領域を含むイン・ビトロでの試験系におけるアグレカナ
ーゼの組換え基質。
Description
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、細胞培養系における「アグレカナーゼ」のタ
ンパク質分解活性を試験するための人工組換え基質（ｒ
ＡＧＧ１）および天然アグレカンに関する。
ンパク質分解活性を試験するための人工組換え基質（ｒ
ＡＧＧ１）および天然アグレカンに関する。
【０００２】背景技術 結合組織におけるプロテオグリカン分解の機構は複雑で
あり、複数の化合物および経路が関与している。アグレ
カンの異化作用の検討では、用いられる実験系主要な軟
骨細胞で確立された軟骨細胞系の単層培養物(Hughes C
E, Caterson B,Fosang AJ, Roughley PJ, Mort JS., Bi
ochem. J. 1995: 305: 799-804; Lark MW, Gordy JT, W
eidner JR ら, J. Biol. Chem. 1995; 270(6): 2550-25
56) 、および各種の解剖学的部位および動物種からの軟
骨を用いる外植片培養物(Flannery CR, Lark MW, Sandy
JD, J. Biol. Chem. 1992; 267: 1008-1014; Sandy J
D,Brown HL, Lowther DA, Biochim Biophys Acta 1978;
543: 536-44; Tyler JA,Biochem. J. 1985; 225: 493-
507) を含んでいた。ＩＬ−１およびＴＮＦのようなサ
イトカインの添加が、細胞外マトリックスの分解を促進
する化合物として広汎に用いられてきた(Hughes CEら,
1995; Morales TI, Roberts AB, Arch Biochem Biophys
1992; 293 (1): 79-84; Forsang AJ, Tyler JA, Hardi
ngham TE, Matrix 1991; 11: 17-24) 。特に、これら二
種類のサイトカインは、アグレカンの異化作用を標的と
することが示されている。数件の研究により、アグレカ
ンのタンパク質コアに沿った特異的開裂部位を定義する
多数の重要な発見がなされてきた(Ilic MZ, Handley C
J, Robinson HC, Mok MT, Arch Biochem Biophys 1992;
294(1): 115-22; Loulakis P, Shrikhande A, Davis G,
Maniglia CA, 酵素開裂の推定部位(Putative site(s)
of enzymic cleavage), Biochem J 1992; 284: 589-59
3; Sandy JD, Neame PJ, Boynton RE, Flannery CR, J.
Biol. Chem. 1991; 266: 8683-8685) 。全体として、
少なくとも７個の開裂部位があると思われ、軟骨プロテ
オグリカン分解生成物のアミノ酸配列分析により、アミ
ノ酸残基Ａｓｎ341 −Ｐｈｅ342 およびＧｌｕ373 −Ａ
ｌａ374 の間に球間(interglobular)ドメイン（ＩＧ
Ｄ）内に存在するアグレカンにおけるタンパク質分解開
裂の２個の主要な部位が定義されている（ヒト配列表）
(Doege KJ, Sasaki M, Kimura T,Yamada Y, J. Biol. C
hem. 1991; 266: 894-902) 。前者の開裂部位は、ヒア
ルロン酸塩と錯体形成した組織に残っている５０〜６０
ｋＤａのＧ１ドメインからなるＣ−末端異化断片（...
ＤＩＰＥＮ）を生じる(Flannery CRら, 1992) 。最近の
研究において、Fosangら(Fosang AJ, Last K, Brown L,
Jackson DC, Gardiner P, Trans. Orthop. Res. Soc.
1995; 20: 4)は、多種多様な関節炎疹と診断された患者
からの滑液においてこの開裂部位からＮ−末端断片（Ｆ
ＦＧ... ）も同定した。同様に、Wittら(Witt M, Fosan
g AJ, Hughes CE, Hardingham TE, Trans. Orthop. Re
s. Soc. 1995; 20: 122) は、コントロールおよびＩＬ
−１で刺激したブタ外植片培養物からの培地試料中にこ
れらのグリコースアミノグリカン含有Ｎ−末端断片を見
いだした。後者の開裂部位は、関節炎患者の滑液から単
離された主要なアグレカン分解生成物と思われ(Lohmand
er LS, Neame PJ, Sandy JD, Arth. Rheum. 1993; 36:
1214-1222)、かつＩＬ−１またはレチノイン酸で処理し
た軟骨外植片培養物からの培地にも見られる(Hughes CE
ら, 1995; Sandy JDら, 1991) グリコースアミノグリカ
ン含有Ｎ−末端断片（ＡＲＧ... ）を生成する。最近の
研究(Lark MWら, 1995) では、レチノイン酸で処理した
ラット軟骨肉腫細胞中のＣ−末端断片（... ＥＧＥ）が
同定された。このＧｌｕ373 −Ａｌａ374 の開裂に関与
するタンパク質分解活性は同定されていないが、Ｇｌｕ
−Ｘａａペプチド結合（但し、ＸａａはＡｌａ、Ｇｌｙ
またはＬｅｕである）に特異性を有するものと思われ
る。この今までのところ特定されていない活性は「アグ
レカナーゼ(Fosang AJ, Neame PJ, Last K, Hardingham
TE, Murphy G, HamiltonJA, J. Biol. Chem. 1992; 26
7: 19470-19474)」と呼ばれている。分子内の開裂の部
位は十分に特定されているが、多数の様々なプロテオグ
リカン分解生成物の生成に関与する化合物の多くは今だ
同定されていない。培養系は、プロテオグリカンの異化
作用を促進する各種の化合物で操作され、その分解に関
与する（複数の）化合物を見いだす努力がなされてき
た。しかしながら、これらの研究は、アグレカンの分解
に関与する特定の化合物を特定することはできなかった
(Flannery CR, Sandy JD, Trans. Orthop. Res. Soc. 1
993)。それにも拘らず、精製したアグレカンおよび改変
したアグレカンを精製した酵素製剤の基質として用いる
実験データーから、これらの酵素の特異的な開裂部位に
ついて幾らかの情報が得られている。しかし、このイン
・ビトロでの研究は軟骨でのアグレカンの分解に関与す
る機構を確定しまたは化合物を同定するのに直接役立っ
ていない(Fosang AJら, 1992; Fosang AJ, Neame PJ, H
ardingham TE, Murphy G, Hamilton JA, J.Biol. Chem.
1991; 266: 15579-15582; Fosang AJ, Last K, Neame
PJ ら, Biochem. J. 1994; 304: 347-351) 。
あり、複数の化合物および経路が関与している。アグレ
カンの異化作用の検討では、用いられる実験系主要な軟
骨細胞で確立された軟骨細胞系の単層培養物(Hughes C
E, Caterson B,Fosang AJ, Roughley PJ, Mort JS., Bi
ochem. J. 1995: 305: 799-804; Lark MW, Gordy JT, W
eidner JR ら, J. Biol. Chem. 1995; 270(6): 2550-25
56) 、および各種の解剖学的部位および動物種からの軟
骨を用いる外植片培養物(Flannery CR, Lark MW, Sandy
JD, J. Biol. Chem. 1992; 267: 1008-1014; Sandy J
D,Brown HL, Lowther DA, Biochim Biophys Acta 1978;
543: 536-44; Tyler JA,Biochem. J. 1985; 225: 493-
507) を含んでいた。ＩＬ−１およびＴＮＦのようなサ
イトカインの添加が、細胞外マトリックスの分解を促進
する化合物として広汎に用いられてきた(Hughes CEら,
1995; Morales TI, Roberts AB, Arch Biochem Biophys
1992; 293 (1): 79-84; Forsang AJ, Tyler JA, Hardi
ngham TE, Matrix 1991; 11: 17-24) 。特に、これら二
種類のサイトカインは、アグレカンの異化作用を標的と
することが示されている。数件の研究により、アグレカ
ンのタンパク質コアに沿った特異的開裂部位を定義する
多数の重要な発見がなされてきた(Ilic MZ, Handley C
J, Robinson HC, Mok MT, Arch Biochem Biophys 1992;
294(1): 115-22; Loulakis P, Shrikhande A, Davis G,
Maniglia CA, 酵素開裂の推定部位(Putative site(s)
of enzymic cleavage), Biochem J 1992; 284: 589-59
3; Sandy JD, Neame PJ, Boynton RE, Flannery CR, J.
Biol. Chem. 1991; 266: 8683-8685) 。全体として、
少なくとも７個の開裂部位があると思われ、軟骨プロテ
オグリカン分解生成物のアミノ酸配列分析により、アミ
ノ酸残基Ａｓｎ341 −Ｐｈｅ342 およびＧｌｕ373 −Ａ
ｌａ374 の間に球間(interglobular)ドメイン（ＩＧ
Ｄ）内に存在するアグレカンにおけるタンパク質分解開
裂の２個の主要な部位が定義されている（ヒト配列表）
(Doege KJ, Sasaki M, Kimura T,Yamada Y, J. Biol. C
hem. 1991; 266: 894-902) 。前者の開裂部位は、ヒア
ルロン酸塩と錯体形成した組織に残っている５０〜６０
ｋＤａのＧ１ドメインからなるＣ−末端異化断片（...
ＤＩＰＥＮ）を生じる(Flannery CRら, 1992) 。最近の
研究において、Fosangら(Fosang AJ, Last K, Brown L,
Jackson DC, Gardiner P, Trans. Orthop. Res. Soc.
1995; 20: 4)は、多種多様な関節炎疹と診断された患者
からの滑液においてこの開裂部位からＮ−末端断片（Ｆ
ＦＧ... ）も同定した。同様に、Wittら(Witt M, Fosan
g AJ, Hughes CE, Hardingham TE, Trans. Orthop. Re
s. Soc. 1995; 20: 122) は、コントロールおよびＩＬ
−１で刺激したブタ外植片培養物からの培地試料中にこ
れらのグリコースアミノグリカン含有Ｎ−末端断片を見
いだした。後者の開裂部位は、関節炎患者の滑液から単
離された主要なアグレカン分解生成物と思われ(Lohmand
er LS, Neame PJ, Sandy JD, Arth. Rheum. 1993; 36:
1214-1222)、かつＩＬ−１またはレチノイン酸で処理し
た軟骨外植片培養物からの培地にも見られる(Hughes CE
ら, 1995; Sandy JDら, 1991) グリコースアミノグリカ
ン含有Ｎ−末端断片（ＡＲＧ... ）を生成する。最近の
研究(Lark MWら, 1995) では、レチノイン酸で処理した
ラット軟骨肉腫細胞中のＣ−末端断片（... ＥＧＥ）が
同定された。このＧｌｕ373 −Ａｌａ374 の開裂に関与
するタンパク質分解活性は同定されていないが、Ｇｌｕ
−Ｘａａペプチド結合（但し、ＸａａはＡｌａ、Ｇｌｙ
またはＬｅｕである）に特異性を有するものと思われ
る。この今までのところ特定されていない活性は「アグ
レカナーゼ(Fosang AJ, Neame PJ, Last K, Hardingham
TE, Murphy G, HamiltonJA, J. Biol. Chem. 1992; 26
7: 19470-19474)」と呼ばれている。分子内の開裂の部
位は十分に特定されているが、多数の様々なプロテオグ
リカン分解生成物の生成に関与する化合物の多くは今だ
同定されていない。培養系は、プロテオグリカンの異化
作用を促進する各種の化合物で操作され、その分解に関
与する（複数の）化合物を見いだす努力がなされてき
た。しかしながら、これらの研究は、アグレカンの分解
に関与する特定の化合物を特定することはできなかった
(Flannery CR, Sandy JD, Trans. Orthop. Res. Soc. 1
993)。それにも拘らず、精製したアグレカンおよび改変
したアグレカンを精製した酵素製剤の基質として用いる
実験データーから、これらの酵素の特異的な開裂部位に
ついて幾らかの情報が得られている。しかし、このイン
・ビトロでの研究は軟骨でのアグレカンの分解に関与す
る機構を確定しまたは化合物を同定するのに直接役立っ
ていない(Fosang AJら, 1992; Fosang AJ, Neame PJ, H
ardingham TE, Murphy G, Hamilton JA, J.Biol. Chem.
1991; 266: 15579-15582; Fosang AJ, Last K, Neame
PJ ら, Biochem. J. 1994; 304: 347-351) 。
【０００３】過去の研究(Hughes CEら, 1995; Hughes C
E, Caterson B, White RJ, Roughley PJ, Mort JS, J.
Biol. Chem. 1992; 267: 16011-16014) において、本発
明者らは特異的なプロテイナーゼによって開裂された生
成物（プロテオグリカン凝集体の異化作用生成物）に特
異的な多数のモノクローナル抗体を開発した。これらの
抗体は、軟骨外植片培養系においてプロテオグリカンの
分解機構の研究における手段として有用であることが明
らかにされた。この最新の研究の目的は、アグレカンの
ＩＧＤにおける 374ＡＲＧＳＶＩ... 部位におけるアグ
レカンの開裂に関与する化合物の同定を一層促進する培
養系を更に開発することであった。
E, Caterson B, White RJ, Roughley PJ, Mort JS, J.
Biol. Chem. 1992; 267: 16011-16014) において、本発
明者らは特異的なプロテイナーゼによって開裂された生
成物（プロテオグリカン凝集体の異化作用生成物）に特
異的な多数のモノクローナル抗体を開発した。これらの
抗体は、軟骨外植片培養系においてプロテオグリカンの
分解機構の研究における手段として有用であることが明
らかにされた。この最新の研究の目的は、アグレカンの
ＩＧＤにおける 374ＡＲＧＳＶＩ... 部位におけるアグ
レカンの開裂に関与する化合物の同定を一層促進する培
養系を更に開発することであった。
【０００４】
【発明の概要】本明細書において、本発明者らは、固有
の内因性プロテオグリカンおよび他の細胞外成分を含ま
ない細胞培養系において人工的組換え基質に対する「ア
グレカナーゼ」の活性を研究することができるようにす
るイン・ビトロの培養系の開発を説明する。アグレカン
のＩＧＤにおける重要な開裂部位に対する過去に特定さ
れたネオエピトープ抗体を使用することによって、この
系における「アグレカナーゼ」のタンパク質分解作用に
よって精製した生成物の監視が容易になった。
の内因性プロテオグリカンおよび他の細胞外成分を含ま
ない細胞培養系において人工的組換え基質に対する「ア
グレカナーゼ」の活性を研究することができるようにす
るイン・ビトロの培養系の開発を説明する。アグレカン
のＩＧＤにおける重要な開裂部位に対する過去に特定さ
れたネオエピトープ抗体を使用することによって、この
系における「アグレカナーゼ」のタンパク質分解作用に
よって精製した生成物の監視が容易になった。
【０００５】それ故、本発明の一態様は、イン・ビトロ
試験系におけるアグレカナーゼの組換え基質であり、好
ましくは a) ＣＤ５のシグナル配列、 b) Ｍ１モノクローナル抗体検出のためのＦＬＡＧ−エ
ピトープ、 c) ヒトアグレカンの球間ドメイン、 d) ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、 e) ヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域、および f) ヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域を含んでなる構成要素の
群を含む組換え基質である。
試験系におけるアグレカナーゼの組換え基質であり、好
ましくは a) ＣＤ５のシグナル配列、 b) Ｍ１モノクローナル抗体検出のためのＦＬＡＧ−エ
ピトープ、 c) ヒトアグレカンの球間ドメイン、 d) ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、 e) ヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域、および f) ヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域を含んでなる構成要素の
群を含む組換え基質である。
【０００６】本発明の好ましい態様は、配列番号３のア
ミノ酸配列またはその部分を有するか、または配列番号
３のアミノ酸配列またはその部分であって、アミノ酸３
４がＡｌａに変異した組換え基質である。
ミノ酸配列またはその部分を有するか、または配列番号
３のアミノ酸配列またはその部分であって、アミノ酸３
４がＡｌａに変異した組換え基質である。
【０００７】
【発明の具体的説明】本発明のもう一つの態様は、上記
の組換え基質をコードするＤＮＡであり、好ましくは配
列番号４のヌクレオチド２３５０〜４１１４のヌクレオ
チド配列またはその部分を有する、配列番号４のヌクレ
オチド２３５０〜４１１４のヌクレオチド配列またはそ
の部分であって、ヌクレオチド２４４８がＣに変異し、
ヌクレオチド２４５０がＣに変異し、ヌクレオチド２４
５１がＡに変異したものを有する、またはストリンジュ
ント条件下で配列番号４に示したＤＮＡとハイブリダイ
ゼーションを行う、ＤＮＡである。
の組換え基質をコードするＤＮＡであり、好ましくは配
列番号４のヌクレオチド２３５０〜４１１４のヌクレオ
チド配列またはその部分を有する、配列番号４のヌクレ
オチド２３５０〜４１１４のヌクレオチド配列またはそ
の部分であって、ヌクレオチド２４４８がＣに変異し、
ヌクレオチド２４５０がＣに変異し、ヌクレオチド２４
５１がＡに変異したものを有する、またはストリンジュ
ント条件下で配列番号４に示したＤＮＡとハイブリダイ
ゼーションを行う、ＤＮＡである。
【０００８】本発明によるストリンジュント条件下での
ハイブリダイゼーションとは、６×ＳＳＣ（または６×
ＳＳＰＥ）、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの
変性したサケ精子ＤＮＡ断片を含むハイブリダイゼーシ
ョン溶液中で標識したプローブの融点下の２０〜２５℃
の温度におけるハイブリダイゼーションを意味する（Sa
mbrookら, 「分子クローニング−実験室便覧(Molecular
Cloning - A Laboratory Manual) 」, 第２版, １９８
９年、Cold Spring Harbor Laboratory Press,第２巻,
第９章, ９．５２〜９．５５頁）。
ハイブリダイゼーションとは、６×ＳＳＣ（または６×
ＳＳＰＥ）、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの
変性したサケ精子ＤＮＡ断片を含むハイブリダイゼーシ
ョン溶液中で標識したプローブの融点下の２０〜２５℃
の温度におけるハイブリダイゼーションを意味する（Sa
mbrookら, 「分子クローニング−実験室便覧(Molecular
Cloning - A Laboratory Manual) 」, 第２版, １９８
９年、Cold Spring Harbor Laboratory Press,第２巻,
第９章, ９．５２〜９．５５頁）。
【０００９】本発明の他の態様は、上記のヌクレオチド
配列を有するＤＮＡ断片を含むベクター、および前記ベ
クターを含む宿主細胞である。
配列を有するＤＮＡ断片を含むベクター、および前記ベ
クターを含む宿主細胞である。
【００１０】本発明のもう一つの態様は、アグレカナー
ゼの活性を試験する目的での細胞培養系での上記の組換
え基質の使用であり、好ましくは上記細胞培養系が固有
の内因性プロテオグリカンおよび他の細胞外成分を含ま
ない、使用である。
ゼの活性を試験する目的での細胞培養系での上記の組換
え基質の使用であり、好ましくは上記細胞培養系が固有
の内因性プロテオグリカンおよび他の細胞外成分を含ま
ない、使用である。
【００１１】本発明のもう一つの態様は、アグレカナー
ゼの活性の試験を抗体による開裂生成物の検出によって
行う、上記の組換え基質の使用である。
ゼの活性の試験を抗体による開裂生成物の検出によって
行う、上記の組換え基質の使用である。
【００１２】本発明のもう一つの態様は、組換え基質に
おける新規な酵素開裂部位の検出を行うための上記基質
の使用である。
おける新規な酵素開裂部位の検出を行うための上記基質
の使用である。
【００１３】本発明のもう一つの態様は、アフィニティ
ークロマトグラフィーによってアグレカナーゼを精製す
るための、またはアグレカナーゼｃＤＮＡを単離するた
めの機能性クローニング系における上記の組換え基質の
使用である。
ークロマトグラフィーによってアグレカナーゼを精製す
るための、またはアグレカナーゼｃＤＮＡを単離するた
めの機能性クローニング系における上記の組換え基質の
使用である。
【００１４】本発明のもう一つの態様は、骨関節症の開
始または進行を監視する方法であって、骨関節症を有す
ることが疑われるまたは知られているヒトからの生物学
的流体の試料を、上記の組換え基質によるアグレカナー
ゼの存在について分析を行い、上記生物学的流体が、滑
液、尿、血清およびリンパ液からなる群から選択される
ことを特徴とする方法である。
始または進行を監視する方法であって、骨関節症を有す
ることが疑われるまたは知られているヒトからの生物学
的流体の試料を、上記の組換え基質によるアグレカナー
ゼの存在について分析を行い、上記生物学的流体が、滑
液、尿、血清およびリンパ液からなる群から選択される
ことを特徴とする方法である。
【００１５】本発明のもう一つの態様は、疾病の進行を
観察して治療の有効性を決定することに使用する、上記
の方法である。
観察して治療の有効性を決定することに使用する、上記
の方法である。
【００１６】本発明のもう一つの態様は、アグレカナー
ゼ阻害剤をスクリーニングする目的での上記の組換え基
質の使用である。
ゼ阻害剤をスクリーニングする目的での上記の組換え基
質の使用である。
【００１７】本発明のもう一つの態様は、上記の組換え
基質および抗体を含み、アグレカナーゼ開裂生成物を検
出するための診断助剤である。
基質および抗体を含み、アグレカナーゼ開裂生成物を検
出するための診断助剤である。
【００１８】以下において、本発明を実施例、および図
面によって詳細に説明する。なお、図６および７のアミ
ノ酸配列は配列番号３の配列と、図８〜１１の塩基配列
は配列番号４の配列と、それぞれ対応する。
面によって詳細に説明する。なお、図６および７のアミ
ノ酸配列は配列番号３の配列と、図８〜１１の塩基配列
は配列番号４の配列と、それぞれ対応する。
【００１９】
【実施例】材料 アルカリホスファターゼと結合した第二の抗体およびウ
ェスターンブロット分析に用いられる基質は、Protoblo
t Western blot AP 系（カタログ番号Ｗ３９２０）とし
てPromega から得た。ニトロセルロース（孔径０．２μ
ｍ）は、Schleicher and Schnellから入手した。モノク
ローナル抗体Ｍ１および抗−ＦＬＡＧＭ１アフィニティ
ーゲルは、いずれもKodak から入手した。抗ヒトＩｇモ
ノクローナル抗体は、Capell、Durhamから入手した。モ
ノクローナル抗体ＢＣ−３、２−Ｂ−６および３−Ｂ−
３は、腹水として調製した(Hughes CEら, 1995) 。Ｒｘ
細胞系は、Dr. Jim Kimura, Bone Research Center, He
nry Ford Hospital,デトロイト, ミシガン州の好意によ
り提供を受けた。
ェスターンブロット分析に用いられる基質は、Protoblo
t Western blot AP 系（カタログ番号Ｗ３９２０）とし
てPromega から得た。ニトロセルロース（孔径０．２μ
ｍ）は、Schleicher and Schnellから入手した。モノク
ローナル抗体Ｍ１および抗−ＦＬＡＧＭ１アフィニティ
ーゲルは、いずれもKodak から入手した。抗ヒトＩｇモ
ノクローナル抗体は、Capell、Durhamから入手した。モ
ノクローナル抗体ＢＣ−３、２−Ｂ−６および３−Ｂ−
３は、腹水として調製した(Hughes CEら, 1995) 。Ｒｘ
細胞系は、Dr. Jim Kimura, Bone Research Center, He
nry Ford Hospital,デトロイト, ミシガン州の好意によ
り提供を受けた。
【００２０】実施例１ ｒＡＧＧ１遺伝子構築物の調製 ｒＡＧＧ１の遺伝子構築物は、リンパ細胞糖タンパク質
Ｔ１／Ｌｅｕ−１（ＣＤ５）のシグナル配列、長さが８
個のアミノ酸のＦＬＡＧ（商標名）エピトープ(Pricket
t KS, Amberg DC, Hopp TP, Bio Techniques 1989; 7:
580-589)、ヒト軟骨大の凝集性プロテオグリカンアグレ
カンの長さが１２７個のアミノ酸の球間ドメイン（ 350
Ｔ− 476Ｇ）(Doege KJ ら, 1991) 、長さが２個のアミ
ノ酸のグリシンスペーサー、およびヒトＩｇＧ１ヒン
ジ、ＣＨ２およびＣＨ３不変領域をコードすることによ
り、予想分子質量が４１．０５９ｄの融合タンパク質を
生じる。球間ドメインをコードするアグレカンｃＤＮＡ
配列を、この領域の近接(flanking)配列に相補的な合成
オリゴヌクレオチドとヒトヒザ軟骨の総ＲＮＡとを用い
る逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）(B
everly SM,分子生物学における最新のプロトコール(Cur
rent Protocols in Molecular Biology)、カナダ：John
Wiley and Sons, 1992)によって増幅した。総ＲＮＡ
は、Adams ら(Adams ME, Huang DQ, Yao LY, Sandell L
J, Anal. Biochemistry 1992; 202: 89-95) により、関
節交換手術から得たヒト軟骨組織から抽出した。オリゴ
ヌクレオチドは、ＦＬＡＧエピトープおよびｇ−スペー
サーに関する追加配列情報を含み、かつ増幅したｃＤＮ
Ａセグメントの５′および３′末端に制限酵素開裂部位
を有し、続いて３′Ｎｈｅｌ部位を含むように改変した
ＣＤ５−ＩｇＧ１発現ベクターに挿入し易くなるように
設計した(Aruffo A, Stamenkovic I, Melcick M, Under
hill CB, Seed B, Cell 1990; 61: 1303-1313)。ＦＬＡ
Ｇエピトープおよび球間ドメインのアミノ末端開始をコ
ードし且Ｎｈｅｌ部位を含むプライマーを、下記の配
列：5'-CGC GGG GCT AGC CGA CTA CAA GGA CGA CGA TGA
CAA GAC AGG TGAAGA CTT TGT GGA C（配列番号：１）
を用いて合成した。球間ドメインのカルボキシ末端、Ｇ
−スペーサー、ＢａｍＨＩ部位を含むスプライスドナー
部位をコードするリバースプライマーは、配列：5'-CGC
GGG GGA TCC CCT CCC CCT GGC AAATGC GGC TGC CC
（配列番号：２）を有する。ＰＣＲ生成物をＮｈｅＩお
よびＢａｍＨＩで消化して、ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ
切断ベクターＣＤ５−ＩｇＧ(Aruffo A ら, 1990) に連
結した。
Ｔ１／Ｌｅｕ−１（ＣＤ５）のシグナル配列、長さが８
個のアミノ酸のＦＬＡＧ（商標名）エピトープ(Pricket
t KS, Amberg DC, Hopp TP, Bio Techniques 1989; 7:
580-589)、ヒト軟骨大の凝集性プロテオグリカンアグレ
カンの長さが１２７個のアミノ酸の球間ドメイン（ 350
Ｔ− 476Ｇ）(Doege KJ ら, 1991) 、長さが２個のアミ
ノ酸のグリシンスペーサー、およびヒトＩｇＧ１ヒン
ジ、ＣＨ２およびＣＨ３不変領域をコードすることによ
り、予想分子質量が４１．０５９ｄの融合タンパク質を
生じる。球間ドメインをコードするアグレカンｃＤＮＡ
配列を、この領域の近接(flanking)配列に相補的な合成
オリゴヌクレオチドとヒトヒザ軟骨の総ＲＮＡとを用い
る逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）(B
everly SM,分子生物学における最新のプロトコール(Cur
rent Protocols in Molecular Biology)、カナダ：John
Wiley and Sons, 1992)によって増幅した。総ＲＮＡ
は、Adams ら(Adams ME, Huang DQ, Yao LY, Sandell L
J, Anal. Biochemistry 1992; 202: 89-95) により、関
節交換手術から得たヒト軟骨組織から抽出した。オリゴ
ヌクレオチドは、ＦＬＡＧエピトープおよびｇ−スペー
サーに関する追加配列情報を含み、かつ増幅したｃＤＮ
Ａセグメントの５′および３′末端に制限酵素開裂部位
を有し、続いて３′Ｎｈｅｌ部位を含むように改変した
ＣＤ５−ＩｇＧ１発現ベクターに挿入し易くなるように
設計した(Aruffo A, Stamenkovic I, Melcick M, Under
hill CB, Seed B, Cell 1990; 61: 1303-1313)。ＦＬＡ
Ｇエピトープおよび球間ドメインのアミノ末端開始をコ
ードし且Ｎｈｅｌ部位を含むプライマーを、下記の配
列：5'-CGC GGG GCT AGC CGA CTA CAA GGA CGA CGA TGA
CAA GAC AGG TGAAGA CTT TGT GGA C（配列番号：１）
を用いて合成した。球間ドメインのカルボキシ末端、Ｇ
−スペーサー、ＢａｍＨＩ部位を含むスプライスドナー
部位をコードするリバースプライマーは、配列：5'-CGC
GGG GGA TCC CCT CCC CCT GGC AAATGC GGC TGC CC
（配列番号：２）を有する。ＰＣＲ生成物をＮｈｅＩお
よびＢａｍＨＩで消化して、ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ
切断ベクターＣＤ５−ＩｇＧ(Aruffo A ら, 1990) に連
結した。
【００２１】実施例２ ＣＯＳ細胞におけるｒＡＧＧの
生産および精製 構築物を、ＤＥＡＥ−デキストランを介してＣＯＳ細胞
にトランスフェクションした(Hollenbaugh D, Aruffo
A, 分子生物学における最新のプロトコール(Current Pr
otocols in Molecular Biology)、カナダ：John Wiley
and Sons, 1994)。トランスフェクションから１２時間
後に、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ中で成育した細胞をトリ
プシン処理して、新たな皿に播種し、５日間成育させ
た。３日目に、新たな培地および１０％ＦＣＳを加え
た。上清を回収して非付着細胞および破片を除いて、４
℃で貯留して保存した。融合タンパク質を、抗−ＦＬＡ
Ｇ（商標名）Ｍ１アフィニティーゲル(Kodak、ニューヘ
ブン）を用いて、製造業者のプロトコールに従ってアフ
ィニティー精製した。通常は、収率は、培養物上清１ｍ
ｌ当たり１〜５μｇ融合タンパク質であった。
生産および精製 構築物を、ＤＥＡＥ−デキストランを介してＣＯＳ細胞
にトランスフェクションした(Hollenbaugh D, Aruffo
A, 分子生物学における最新のプロトコール(Current Pr
otocols in Molecular Biology)、カナダ：John Wiley
and Sons, 1994)。トランスフェクションから１２時間
後に、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ中で成育した細胞をトリ
プシン処理して、新たな皿に播種し、５日間成育させ
た。３日目に、新たな培地および１０％ＦＣＳを加え
た。上清を回収して非付着細胞および破片を除いて、４
℃で貯留して保存した。融合タンパク質を、抗−ＦＬＡ
Ｇ（商標名）Ｍ１アフィニティーゲル(Kodak、ニューヘ
ブン）を用いて、製造業者のプロトコールに従ってアフ
ィニティー精製した。通常は、収率は、培養物上清１ｍ
ｌ当たり１〜５μｇ融合タンパク質であった。
【００２２】実施例３ 組換えＩＧＤ基質および天然ア
グレカンの異化作用の試験のためのレチノイン酸の存在
下または非存在下でのアガロース中でのラット軟骨肉腫
細胞の培養 ラット軟骨肉腫細胞を７５ｃｍ２フラスコで培養し、５
％ＦＣＳおよび５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むＤ
ＭＥＭ培地に保持した。７５ｃｍ２フラスコ中のコンフ
ルエント単層を３７℃で１５〜２０分間攪拌しながらト
リプシン処理（ＥＤＴＡを含むＤＭＥＭ中０．２５％ト
リプシン）を行った後、ＤＭＥＭ中０．０５％コラゲナ
ーゼで１〜２時間消化した。次いで、細胞を４×１０６
個／ｍｌの濃度でＤＭＥＭに再懸濁した。２４ウェルの
培養プレートにFMC Seaplaque アガロース／ＤＭＥＭの
１％（重量／容量）溶液を「コーティング」し（２００
μｌ／ウェル）、アガロースを４℃で３０分間インキュ
ベーションして固化した(Aydelotte MB, Juettner KE,
Conn. tissue Res. 1988; 18: 205-222)。次に、プレー
トを３７℃に平衡にした。ラット軟骨細胞懸濁液（上
記）をSeaplaque アガロース／ＤＭＥＭの２％溶液で希
釈して、最終細胞濃度を２×１０６個／ｍｌとなるよう
にした。アガロース細胞懸濁液２００μｌ（０．４×１
０６個）を前もって調製したアガロースプラグに重層
し、この直後に組換えＩＧＤ基質（ｒＡＧＧ１）または
天然のウシアグレカン（Ａ１Ｄ１）５０μｇを適当なウ
ェルに加え、攪拌混合した。次に、プレートを４℃で１
５分間インキュベーションして、アガロースを固化し
た。次に、（レチノイン酸を含むまたは含まない）実験
培地を、組換えＩＧＤ構築物、天然のウシアグレカン
（Ａ１Ｄ１）および細胞のみを含む三つ組ウェルに下記
のようにして加えた。コントロール培養物、ＤＭＥＭ＋
ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）および処理済み培養
物、ＤＭＥＭ＋ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）＋１
０-6Ｍレチノイン酸（Hughes CE ら, 1995) 。次に、ア
ガロース細胞培養物を５％ＣＯ２中で３７℃で９６時間
保持した後、培地およびアガロース細胞マトリックス抽
出物を更に分析した。
グレカンの異化作用の試験のためのレチノイン酸の存在
下または非存在下でのアガロース中でのラット軟骨肉腫
細胞の培養 ラット軟骨肉腫細胞を７５ｃｍ２フラスコで培養し、５
％ＦＣＳおよび５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むＤ
ＭＥＭ培地に保持した。７５ｃｍ２フラスコ中のコンフ
ルエント単層を３７℃で１５〜２０分間攪拌しながらト
リプシン処理（ＥＤＴＡを含むＤＭＥＭ中０．２５％ト
リプシン）を行った後、ＤＭＥＭ中０．０５％コラゲナ
ーゼで１〜２時間消化した。次いで、細胞を４×１０６
個／ｍｌの濃度でＤＭＥＭに再懸濁した。２４ウェルの
培養プレートにFMC Seaplaque アガロース／ＤＭＥＭの
１％（重量／容量）溶液を「コーティング」し（２００
μｌ／ウェル）、アガロースを４℃で３０分間インキュ
ベーションして固化した(Aydelotte MB, Juettner KE,
Conn. tissue Res. 1988; 18: 205-222)。次に、プレー
トを３７℃に平衡にした。ラット軟骨細胞懸濁液（上
記）をSeaplaque アガロース／ＤＭＥＭの２％溶液で希
釈して、最終細胞濃度を２×１０６個／ｍｌとなるよう
にした。アガロース細胞懸濁液２００μｌ（０．４×１
０６個）を前もって調製したアガロースプラグに重層
し、この直後に組換えＩＧＤ基質（ｒＡＧＧ１）または
天然のウシアグレカン（Ａ１Ｄ１）５０μｇを適当なウ
ェルに加え、攪拌混合した。次に、プレートを４℃で１
５分間インキュベーションして、アガロースを固化し
た。次に、（レチノイン酸を含むまたは含まない）実験
培地を、組換えＩＧＤ構築物、天然のウシアグレカン
（Ａ１Ｄ１）および細胞のみを含む三つ組ウェルに下記
のようにして加えた。コントロール培養物、ＤＭＥＭ＋
ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）および処理済み培養
物、ＤＭＥＭ＋ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）＋１
０-6Ｍレチノイン酸（Hughes CE ら, 1995) 。次に、ア
ガロース細胞培養物を５％ＣＯ２中で３７℃で９６時間
保持した後、培地およびアガロース細胞マトリックス抽
出物を更に分析した。
【００２３】実施例４ コントロールおよびレチノイン
酸で刺激したアガロース培養物からの実験的培地の分析 組換えＩＧＤ基質培養物からの培地および細胞のみを含
む培養物を、蒸留水に対して徹底的に透析し、凍結乾燥
し、１０％（容量／容量）メルカプトエタノールを含む
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液の等容に再構成した。Ａ１
Ｄ１培養物および細胞のみを含む培養物からの培地試料
を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ
６．５に透析し、以前に報告した方法を用いて脱グリコ
シル化した(Hughes CEら, 1995) 。次に、試料を蒸留水
に対して徹底的に透析して、凍結乾燥し、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ試料緩衝液の等容に再構成した。次に、試料（等容
／ウェル）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロー
スに移し、下記の操作を用いてポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体で免疫局在化を行った(immunoloc
ated) 。
酸で刺激したアガロース培養物からの実験的培地の分析 組換えＩＧＤ基質培養物からの培地および細胞のみを含
む培養物を、蒸留水に対して徹底的に透析し、凍結乾燥
し、１０％（容量／容量）メルカプトエタノールを含む
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液の等容に再構成した。Ａ１
Ｄ１培養物および細胞のみを含む培養物からの培地試料
を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ
６．５に透析し、以前に報告した方法を用いて脱グリコ
シル化した(Hughes CEら, 1995) 。次に、試料を蒸留水
に対して徹底的に透析して、凍結乾燥し、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ試料緩衝液の等容に再構成した。次に、試料（等容
／ウェル）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロー
スに移し、下記の操作を用いてポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体で免疫局在化を行った(immunoloc
ated) 。
【００２４】実施例５ コントロールおよびレチノイン
酸で刺激した培養物からのアガロース−細胞マトリック
スの抽出 組換えＩＧＤ基質培養物、ウシＡ１Ｄ１培養物、および
細胞のみを含む培養物からのアガロースプラグを、下記
の酵素阻害剤を含む４Ｍ塩化グアニジニウムで４℃で２
４時間抽出した。１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭベンズア
ミジン塩酸塩、０．１Ｍ ６−アミノヘキサン酸、およ
び１ｍＭフッ化フェネチルメタンスルホニル。アガロー
スゲルの残渣を遠心分離によって除去した後、上清を上
記の基質のそれぞれについて処理した。次に、試料（等
容／ウェル）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロ
ースに移し、下記の手続きを用いてポリクローナル抗体
またはモノクローナル抗体で免疫局在化を行った。
酸で刺激した培養物からのアガロース−細胞マトリック
スの抽出 組換えＩＧＤ基質培養物、ウシＡ１Ｄ１培養物、および
細胞のみを含む培養物からのアガロースプラグを、下記
の酵素阻害剤を含む４Ｍ塩化グアニジニウムで４℃で２
４時間抽出した。１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭベンズア
ミジン塩酸塩、０．１Ｍ ６−アミノヘキサン酸、およ
び１ｍＭフッ化フェネチルメタンスルホニル。アガロー
スゲルの残渣を遠心分離によって除去した後、上清を上
記の基質のそれぞれについて処理した。次に、試料（等
容／ウェル）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロ
ースに移し、下記の手続きを用いてポリクローナル抗体
またはモノクローナル抗体で免疫局在化を行った。
【００２５】実施例６ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動およびウェスターンブロット分析 天然の組換えＩＧＤ基質およびその異化作用生成物を含
む試料を、Laemmli によって記載された操作を用いてＳ
ＤＳ中１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行
った(Laemmli UK, Nature 1970; 227: 680-685) 。電気
泳動の後、分画したタンパク質を電気泳動によりニトロ
セルロースに移し、以前に記載した手続きを用いて(Hug
hes CEら, 1995) 、抗−ＦＬＡＧモノクローナルまたは
抗ヒト免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体ＢＣ−
３（いずれも１：１０００の希釈度）で免疫局在化を行
った。天然のウシＡ１Ｄ１およびその異化作用生成物を
含む試料を３〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳
動を行い、ニトロセルロース膜に移し、モノクローナル
３−Ｂ−３、２−Ｂ−６およびＢＣ−３の１：１０００
希釈物で免疫局在化した。通常は、免疫ブロットを基質
と室温で５〜１５分間インキュベーションして最適な色
を展開した。
ル電気泳動およびウェスターンブロット分析 天然の組換えＩＧＤ基質およびその異化作用生成物を含
む試料を、Laemmli によって記載された操作を用いてＳ
ＤＳ中１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行
った(Laemmli UK, Nature 1970; 227: 680-685) 。電気
泳動の後、分画したタンパク質を電気泳動によりニトロ
セルロースに移し、以前に記載した手続きを用いて(Hug
hes CEら, 1995) 、抗−ＦＬＡＧモノクローナルまたは
抗ヒト免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体ＢＣ−
３（いずれも１：１０００の希釈度）で免疫局在化を行
った。天然のウシＡ１Ｄ１およびその異化作用生成物を
含む試料を３〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳
動を行い、ニトロセルロース膜に移し、モノクローナル
３−Ｂ−３、２−Ｂ−６およびＢＣ−３の１：１０００
希釈物で免疫局在化した。通常は、免疫ブロットを基質
と室温で５〜１５分間インキュベーションして最適な色
を展開した。
【００２６】実施例７ 組換えＩＧＤ構築物の特徴 組換えＩＧＤ構築物のＣＯＳ細胞へのトランスフェクシ
ョンの結果、細胞が発現し、続いて組換えＩＧＤ生成物
が培地へ分泌された。抗−ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティ
ーゲルの使用により、トランスフェクションした細胞培
地からのその精製が促進された。トランスフェクション
したＣＯＳ細胞培地１リットルは、組換えＩＧＤ基質１
〜５ｍｇを生じた。非還元条件下では、この組換えＩＧ
Ｄ基質は、分子の免疫グロブリンドメインにおける不均
一な数のシステイン残基の存在により高分子量の凝集体
が形成された。この凝集体の形成により、アガロース培
養物中の組換えＩＧＤ基質の固定が促進された。還元条
件下では、組換えＩＧＤ構築物は、１０％ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲル上で分離した後に見られるように、概算Ｍｒが
７２ｋＤａおよび３９ｋＤａの２種類の分子量成分とし
て存在した。組換えＩＧＤ基質の２種類の形態が存在す
る理由は、現在のところは不明であるが、（構築物のＦ
ＬＡＧ領域におけるエピトープを認識する）抗Ｍ１モノ
クローナルおよび（構築物の免疫グロブリン領域におけ
るエピトープを認識する）抗Ｉｇモノクローナル抗体は
いずれも組換えＩＧＤ構築物の両方の形態を認識した(i
mmunolocated) 。分離した組換えＩＧＤ構築物をクーマ
シー染色したゲルをデンシトメーターで分析したとこ
ろ、７２ｋＤａ対３９ｋＤａのバンドの比率は約１０：
１であることを示していた（結果は図示せず）。
ョンの結果、細胞が発現し、続いて組換えＩＧＤ生成物
が培地へ分泌された。抗−ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティ
ーゲルの使用により、トランスフェクションした細胞培
地からのその精製が促進された。トランスフェクション
したＣＯＳ細胞培地１リットルは、組換えＩＧＤ基質１
〜５ｍｇを生じた。非還元条件下では、この組換えＩＧ
Ｄ基質は、分子の免疫グロブリンドメインにおける不均
一な数のシステイン残基の存在により高分子量の凝集体
が形成された。この凝集体の形成により、アガロース培
養物中の組換えＩＧＤ基質の固定が促進された。還元条
件下では、組換えＩＧＤ構築物は、１０％ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲル上で分離した後に見られるように、概算Ｍｒが
７２ｋＤａおよび３９ｋＤａの２種類の分子量成分とし
て存在した。組換えＩＧＤ基質の２種類の形態が存在す
る理由は、現在のところは不明であるが、（構築物のＦ
ＬＡＧ領域におけるエピトープを認識する）抗Ｍ１モノ
クローナルおよび（構築物の免疫グロブリン領域におけ
るエピトープを認識する）抗Ｉｇモノクローナル抗体は
いずれも組換えＩＧＤ構築物の両方の形態を認識した(i
mmunolocated) 。分離した組換えＩＧＤ構築物をクーマ
シー染色したゲルをデンシトメーターで分析したとこ
ろ、７２ｋＤａ対３９ｋＤａのバンドの比率は約１０：
１であることを示していた（結果は図示せず）。
【００２７】実施例８ レチノイン酸で処理したおよび
処理しなかったアガロース培養物からのＩＧＤ組換え構
築物の免疫化学分析 組換えＩＧＤ基質を、レチノイン酸を用いてまたは用い
ずにラット軟骨肉腫の軟骨細胞を含むアガロース細胞培
養物中で９６時間固定した。培養液中でのＩＧＤ組換え
基質およびその代謝物の分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びウェスターンブロット分析によって検討した。（組換
え基質のＮ−末端においてＦＬＡＧドメインにおけるエ
ピトープを認識する）抗Ｍ１で免疫したところ、コント
ロール培養物またはレチノイン酸で処理した培養物から
の培地に含まれるｒＡＧＧ−１代謝物のパターンに差は
見られなかった。しかしながら、組換え基質のＣ−末端
において免疫グロブリンドメインにおけるエピトープを
認識する）抗Ｉｇで免疫したところ、６５ｋＤａで移動
する追加バンドが存在することが示されており、７２ｋ
Ｄａの未消化組換え基質の部分異化が起こったことを示
唆していた。この結果は、（Ｎ−末端における）Ｍ１エ
ピトープは、ＩＧＤ組換え基質の７２ｋＤａ形から開裂
して６５ｋＤａの異化生成物を生じることを示してい
る。７２ｋＤａのバンドについて抗Ｍ１での陽性の免疫
染色が見られないことは、この結論を裏付けている。Ｉ
ＧＤ構築物のこの開裂が組換え基質の「アグレカナー
ゼ」部位で起こっていることを確かめるため、レチノイ
ン酸で処理したおよび処理しなかった軟骨細胞培養物の
培地試料を、モノクローナル抗体ＢＣ−３（抗ＡＲ
Ｇ... ）を用いる免疫ブロッティングによって検討し
た。ＢＣ−３で免疫したところ、レチノイン酸なしの培
養物には反応性は見られず、レチノイン酸で処理した培
養物では６５ｋＤａに唯一の免疫陽性のバンドが見られ
た。この結果は、ＩＧＤ組換え基質の７２ｋＤａ形の
「アグレカナーゼ」異化作用が起きたことを示してい
る。しかしながら、３９ｋＤａのアイソフォームが異化
作用を受けたという証拠はなかった。陽性の３９ｋＤａ
形の異化生成物についてＢＣ−３による免疫染色が見ら
れないことは、ｒＡＧＧ−１製剤には７２ｋＤａ形が１
０倍も多くあるので、これらの異化生成物は低濃度で存
在することによると思われる。６５ｋＤａの異化生成物
はｒＡＧＧ−１の７２ｋＤａ形から誘導されることを確
かめるため、ＢＣ−３免疫ブロットを抗Ｍ１抗体で再プ
ローブした。
処理しなかったアガロース培養物からのＩＧＤ組換え構
築物の免疫化学分析 組換えＩＧＤ基質を、レチノイン酸を用いてまたは用い
ずにラット軟骨肉腫の軟骨細胞を含むアガロース細胞培
養物中で９６時間固定した。培養液中でのＩＧＤ組換え
基質およびその代謝物の分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びウェスターンブロット分析によって検討した。（組換
え基質のＮ−末端においてＦＬＡＧドメインにおけるエ
ピトープを認識する）抗Ｍ１で免疫したところ、コント
ロール培養物またはレチノイン酸で処理した培養物から
の培地に含まれるｒＡＧＧ−１代謝物のパターンに差は
見られなかった。しかしながら、組換え基質のＣ−末端
において免疫グロブリンドメインにおけるエピトープを
認識する）抗Ｉｇで免疫したところ、６５ｋＤａで移動
する追加バンドが存在することが示されており、７２ｋ
Ｄａの未消化組換え基質の部分異化が起こったことを示
唆していた。この結果は、（Ｎ−末端における）Ｍ１エ
ピトープは、ＩＧＤ組換え基質の７２ｋＤａ形から開裂
して６５ｋＤａの異化生成物を生じることを示してい
る。７２ｋＤａのバンドについて抗Ｍ１での陽性の免疫
染色が見られないことは、この結論を裏付けている。Ｉ
ＧＤ構築物のこの開裂が組換え基質の「アグレカナー
ゼ」部位で起こっていることを確かめるため、レチノイ
ン酸で処理したおよび処理しなかった軟骨細胞培養物の
培地試料を、モノクローナル抗体ＢＣ−３（抗ＡＲ
Ｇ... ）を用いる免疫ブロッティングによって検討し
た。ＢＣ−３で免疫したところ、レチノイン酸なしの培
養物には反応性は見られず、レチノイン酸で処理した培
養物では６５ｋＤａに唯一の免疫陽性のバンドが見られ
た。この結果は、ＩＧＤ組換え基質の７２ｋＤａ形の
「アグレカナーゼ」異化作用が起きたことを示してい
る。しかしながら、３９ｋＤａのアイソフォームが異化
作用を受けたという証拠はなかった。陽性の３９ｋＤａ
形の異化生成物についてＢＣ−３による免疫染色が見ら
れないことは、ｒＡＧＧ−１製剤には７２ｋＤａ形が１
０倍も多くあるので、これらの異化生成物は低濃度で存
在することによると思われる。６５ｋＤａの異化生成物
はｒＡＧＧ−１の７２ｋＤａ形から誘導されることを確
かめるため、ＢＣ−３免疫ブロットを抗Ｍ１抗体で再プ
ローブした。
【００２８】実施例９ レチノイン酸で処理したおよび
処理しなかったアガロース培養物からの天然のウシＡ１
Ｄ１の分析 この培養系における天然基質の使用についても評価を行
い、これを人工の組換え基質と比較した。天然のウシア
グレカン（Ａ１Ｄ１）を、レチノイン酸で処理したおよ
び処理しなかったラット軟骨細胞を含むアガロースと混
合した。ウシＡ１Ｄ１を加えなかったアガロース細胞培
養物も分析して、培養の９６時間中に合成された内因性
プロテオグリカン（潜在的基質）の寄与について分析を
行った。培地試料をモノクローナル抗体２−Ｂ−６で免
疫したところ、細胞のみを含むアガロース培養物から採
取した培地には染色は見られなかった。この結果は、培
養期間に新たに合成された内因性基質の著しい寄与はな
かったことを示している。レチノイン酸でおよびなしで
保持された外部から添加されたウシアグレカン基質を含
む培養物は、過去に幾つかの研究によって記載されたよ
うにタンパク質コアの予想可能な配置「梯子」を示して
いる(Hughes CEら, 1995; Ilic MZ,HandleyCJ, Robinso
n HC, Biochem. Internat. 1990; 21: 977-986)。同様
な結果は、モノクローナル抗体３−Ｂ−３を用いても見
られた（図２、レーン４、５および６）。対照的に、Ｎ
−末端配列ＡＲＧＳＶ... を有する「アグレカナーゼ」
によって生成したアグレカン異化生成物について抗体Ｂ
Ｃ−３を用いる免疫染色は、レチノイン酸処理を施した
培養物のみで観察された。このＢＣ−３陽性アグレカン
異化生成物の総体分子量は約１６０ｋＤａであり、他の
培養系で見られるものと同様である(Hughes CEら, 199
5) 。
処理しなかったアガロース培養物からの天然のウシＡ１
Ｄ１の分析 この培養系における天然基質の使用についても評価を行
い、これを人工の組換え基質と比較した。天然のウシア
グレカン（Ａ１Ｄ１）を、レチノイン酸で処理したおよ
び処理しなかったラット軟骨細胞を含むアガロースと混
合した。ウシＡ１Ｄ１を加えなかったアガロース細胞培
養物も分析して、培養の９６時間中に合成された内因性
プロテオグリカン（潜在的基質）の寄与について分析を
行った。培地試料をモノクローナル抗体２−Ｂ−６で免
疫したところ、細胞のみを含むアガロース培養物から採
取した培地には染色は見られなかった。この結果は、培
養期間に新たに合成された内因性基質の著しい寄与はな
かったことを示している。レチノイン酸でおよびなしで
保持された外部から添加されたウシアグレカン基質を含
む培養物は、過去に幾つかの研究によって記載されたよ
うにタンパク質コアの予想可能な配置「梯子」を示して
いる(Hughes CEら, 1995; Ilic MZ,HandleyCJ, Robinso
n HC, Biochem. Internat. 1990; 21: 977-986)。同様
な結果は、モノクローナル抗体３−Ｂ−３を用いても見
られた（図２、レーン４、５および６）。対照的に、Ｎ
−末端配列ＡＲＧＳＶ... を有する「アグレカナーゼ」
によって生成したアグレカン異化生成物について抗体Ｂ
Ｃ−３を用いる免疫染色は、レチノイン酸処理を施した
培養物のみで観察された。このＢＣ−３陽性アグレカン
異化生成物の総体分子量は約１６０ｋＤａであり、他の
培養系で見られるものと同様である(Hughes CEら, 199
5) 。
【００２９】組換え基質および天然のウシアグレカンを
有する培養物からの培地および抽出物試料は、ＭＭＰ
１、２、３、７、８または９によるアグレカンＩＧＤの
タンパク質加水分解によって生成するＮ−末端ネオエピ
トープＦＦＧＶ... を認識する新たに開発された抗体
（ＢＣ−１４）でも精査した。ＢＣ−１４を用いる免疫
ブロッティングは、いずれの培養系でも陰性であった
（データ省略）。この結果は、この部位におけるＩＧＤ
の異化作用は起きず、この知見は他の研究室からの報告
と一致することを示している(Lark MWら, 1995) 。
有する培養物からの培地および抽出物試料は、ＭＭＰ
１、２、３、７、８または９によるアグレカンＩＧＤの
タンパク質加水分解によって生成するＮ−末端ネオエピ
トープＦＦＧＶ... を認識する新たに開発された抗体
（ＢＣ−１４）でも精査した。ＢＣ−１４を用いる免疫
ブロッティングは、いずれの培養系でも陰性であった
（データ省略）。この結果は、この部位におけるＩＧＤ
の異化作用は起きず、この知見は他の研究室からの報告
と一致することを示している(Lark MWら, 1995) 。
【００３０】実施例１０ 更に検討を行うため、本発明者らは組換え基質ｒＡＧＧ
−１ｍｕｔ、本発明者らの融合タンパク質ｒＡＧＧ−１
の一変形であって、ＩＧＤのアミド末端における代替ス
プライスドナーを突然変異して、別のスプライシングを
防止するものを用いた。その親構築物として、ｒＡＧＧ
−１ｍｕｔは、アミノ末端タグとしてＦＬＡＧエピトー
プ、ヒトアグレカンのＩＧＤ、およびカルボキシ末端タ
グとしてヒトＩｇＧ分子の不変領域を含む。一時トラン
スフェクションの結果、ｒＡＧＧ−１ｍｕｔは融合タン
パク質としてのＣＯＳ細胞によって培養物上清に分泌さ
れ、還元条件下では７２ｋＤのバンドとして、また非還
元条件下では１４０ｋＤのバンドとして移動し、構築物
のＣ−末端におけるヒト免疫グロブリン成分のヒンジ領
域における不対システインの存在による二量体化を反映
しているものと思われる。
−１ｍｕｔ、本発明者らの融合タンパク質ｒＡＧＧ−１
の一変形であって、ＩＧＤのアミド末端における代替ス
プライスドナーを突然変異して、別のスプライシングを
防止するものを用いた。その親構築物として、ｒＡＧＧ
−１ｍｕｔは、アミノ末端タグとしてＦＬＡＧエピトー
プ、ヒトアグレカンのＩＧＤ、およびカルボキシ末端タ
グとしてヒトＩｇＧ分子の不変領域を含む。一時トラン
スフェクションの結果、ｒＡＧＧ−１ｍｕｔは融合タン
パク質としてのＣＯＳ細胞によって培養物上清に分泌さ
れ、還元条件下では７２ｋＤのバンドとして、また非還
元条件下では１４０ｋＤのバンドとして移動し、構築物
のＣ−末端におけるヒト免疫グロブリン成分のヒンジ領
域における不対システインの存在による二量体化を反映
しているものと思われる。
【００３１】レチノイン酸（ＲＡ）でシミュレーション
すると、ラット軟骨肉腫細胞系ＲＸのアガロースを埋設
した細胞はアグレカナーゼを生成する。ｒＡＧＧ−１ｍ
ｕｔは、ｒＡＧＧ−１について記載されたようにアグレ
カナーゼ部位で異化し、これはモノクローナル抗体ＢＣ
−３を用いる免疫検出によって示される。この異化生成
物の６６ｋＤのサイズは、アグレカナーゼ部位での開裂
の後の５．８ｋＤの予想された損失と一致している。
すると、ラット軟骨肉腫細胞系ＲＸのアガロースを埋設
した細胞はアグレカナーゼを生成する。ｒＡＧＧ−１ｍ
ｕｔは、ｒＡＧＧ−１について記載されたようにアグレ
カナーゼ部位で異化し、これはモノクローナル抗体ＢＣ
−３を用いる免疫検出によって示される。この異化生成
物の６６ｋＤのサイズは、アグレカナーゼ部位での開裂
の後の５．８ｋＤの予想された損失と一致している。
【００３２】ｒＡＧＧ−１ｍｕｔのアミノ酸配列は、ｒ
ＡＧＧ−１のアミノ酸配列と位置３４だけが異なり、ｒ
ＡＧＧ−１ｍｕｔはＡｌａ３４を含み、ｒＡＧＧ−１は
Ｇｌｙ３４を含む。
ＡＧＧ−１のアミノ酸配列と位置３４だけが異なり、ｒ
ＡＧＧ−１ｍｕｔはＡｌａ３４を含み、ｒＡＧＧ−１は
Ｇｌｙ３４を含む。
【００３３】ｒＡＧＧ−１ｍｕｔをコードするＤＮＡの
ヌクレオチド配列は、ｒＡＧＧ−１をコードするＤＮＡ
と３個の位置で異なり、２４４８ではＡがＣに、２４５
０ではＧがＣに、２４５１ではＴがＡに置換されてい
る。
ヌクレオチド配列は、ｒＡＧＧ−１をコードするＤＮＡ
と３個の位置で異なり、２４４８ではＡがＣに、２４５
０ではＧがＣに、２４５１ではＴがＡに置換されてい
る。
【００３４】一般的検討 これらの結果は、「アグレカナーゼ」活性の検討のため
の組換え基質の生産および使用の最初の報告である。ま
た、本発明者らは、基質として作用する複雑な内因性ア
グレカン無しで「アグレカナーゼ」活性を監視するため
の新規な細胞培養物を開発した。この人工基質（ｒＡＧ
Ｇ１）の独特な凝集特性により、アガロース細胞培養系
におけるその固定が容易になる。更に、本発明者らは、
内因性細胞外マトリックスを確立して、任意の「アグレ
カナーゼ」活性の基質として作用させる必要なしに新た
に単離した軟骨細胞を用いることができた。組換えＩＧ
Ｄ構築物で得られた結果は、「アグレカナーゼ」部位に
おける開裂のアグレカンのＥＧＤについてＧ１および／
またはＧ２ドメインを必要としないことを示している。
更に、天然のアグレカン分子ではこの領域に剛性を与え
ることができるＩＧＤ内では、（ｒＡＧＧ−１構築物は
抗硫酸ケラタン抗体５−Ｄ−４を用いるウェスターンブ
ロット分析では陽性染色を示さないので）硫酸ケラタン
鎖は必要ないと思われる（結果省略）。この新たに開発
された培養系は、「アグレカナーゼ」によるアグレカン
分解に関与した分子機構を更に検討するのに有用である
ことが明らかになるであろう。組換え基質およびネオエ
ピトープ抗体が利用可能であるとすれば、新しい実験法
が他のマトリックス高分子の異化作用の研究用に考えら
れる。
の組換え基質の生産および使用の最初の報告である。ま
た、本発明者らは、基質として作用する複雑な内因性ア
グレカン無しで「アグレカナーゼ」活性を監視するため
の新規な細胞培養物を開発した。この人工基質（ｒＡＧ
Ｇ１）の独特な凝集特性により、アガロース細胞培養系
におけるその固定が容易になる。更に、本発明者らは、
内因性細胞外マトリックスを確立して、任意の「アグレ
カナーゼ」活性の基質として作用させる必要なしに新た
に単離した軟骨細胞を用いることができた。組換えＩＧ
Ｄ構築物で得られた結果は、「アグレカナーゼ」部位に
おける開裂のアグレカンのＥＧＤについてＧ１および／
またはＧ２ドメインを必要としないことを示している。
更に、天然のアグレカン分子ではこの領域に剛性を与え
ることができるＩＧＤ内では、（ｒＡＧＧ−１構築物は
抗硫酸ケラタン抗体５−Ｄ−４を用いるウェスターンブ
ロット分析では陽性染色を示さないので）硫酸ケラタン
鎖は必要ないと思われる（結果省略）。この新たに開発
された培養系は、「アグレカナーゼ」によるアグレカン
分解に関与した分子機構を更に検討するのに有用である
ことが明らかになるであろう。組換え基質およびネオエ
ピトープ抗体が利用可能であるとすれば、新しい実験法
が他のマトリックス高分子の異化作用の研究用に考えら
れる。
【００３５】
配列番号：１ 配列の長さ：５８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．５８ 配列 CGCGGGGCTA GCCGACTACA AGGACGACGA TGACAAGACA GGTGAAGACT TTGTGGAC 58
【００３６】配列番号：２ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．３８ 配列 CGCGGGGGAT CCCCTCCCCC TGGCAAATGC GGCTGCCC 38
【００３７】配列番号：３ 配列の長さ：３９６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly 1 5 10 15 Met Leu Val Ala Ser Val Leu Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 20 25 30 Thr Gly Glu Asp Phe Val Asp Ile Pro Glu Asn Phe Phe Gly Val Gly 35 40 45 Gly Glu Glu Asp Ile Thr Val Gln Thr Val Thr Trp Pro Asp Met Glu 50 55 60 Leu Pro Leu Pro Arg Asn Ile Thr Glu Gly Glu Ala Arg Gly Ser Val 65 70 75 80 Ile Leu Thr Val Lys Pro Ile Phe Glu Val Ser Pro Ser Pro Leu Glu 85 90 95 Pro Glu Glu Pro Phe Thr Phe Ala Pro Glu Ile Gly Ala Thr Ala Phe 100 105 110 Ala Glu Val Glu Asn Glu Thr Gly Glu Ala Thr Arg Pro Trp Gly Phe 115 120 125 Pro Thr Pro Gly Leu Gly Pro Ala Thr Ala Phe Thr Ser Glu Asp Leu 130 135 140 Val Val Gln Val Thr Ala Val Pro Gly Gln Pro His Leu Pro Gly Gly 145 150 155 160 Gly Asp Pro Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 165 170 175 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 180 185 190 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 195 200 205 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 210 215 220 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 225 230 235 240 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 245 250 255 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 260 265 270 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 275 280 285 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 290 295 300 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 305 310 315 320 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 325 330 335 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 340 345 350 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 355 360 365 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 370 375 380 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390 395
【００３８】配列番号：４ 配列の長さ：５３３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．５３３７ 配列 GGCGTAATCT GCTGCTTGCA AACAAAAAAA CCACCGCTAC CAGCGGTGGT TTGTTTGCCG 60 GATCAAGAGC TACCAACTCT TTTTCCGAAG GTAACTGGCT TCAGCAGAGC GCAGATACCA 120 AATACTGTCC TTCTAGTGTA GCCGTAGTTA GGCCACCACT TCAAGAACTC TGTAGCACCG 180 CCTACATACC TCGCTCTGCT AATCCTGTTA CCAGTGGCTG CTGCCAGTGG CGATAAGTCG 240 TGTCTTACCG GGTTGGACTC AAGACGATAG TTACCGGATA AGGCGCAGCG GTCGGGCTGA 300 ACGGGGGGTT CGTGCACACA GCCCAGCTTG GAGCGAACGA CCTACACCGA ACTGAGATAC 360 CTACAGCGTG AGCATTGAGA AAGCGCCACG CTTCCCGAAG GGAGAAAGGC GGACAGGTAT 420 CCGGTAAGCG GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CGCACGAGGG AGCTTCCAGG GGGAAACGCC 480 TGGTATCTTT ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC CACCTCTGAC TTGAGCGTCG ATTTTTGTGA 540 TGCTCGTCAG GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCAAGCTA GCTTCTAGCT 600 AGAAATTGTA AACGTTAATA TTTTGTTAAA ATTCGCGTTA AATTTTTGTT AAATCAGCTC 660 ATTTTTTAAC CAATAGGCCG AAATCGGCAA AATCCCTTAT AAATCAAAAG AATAGCCCGA 720 GATAGGGTTG AGTGTTGTTC CAGTTTGGAA CAAGAGTCCA CTATTAAAGA ACGTGGACTC 780 CAACGTCAAA GGGCGAAAAA CCGTCTATCA GGGCGATGGC CGCCCACTAC GTGAACCATC 840 ACCCAAATCA AGTTTTTTGG GGTCGAGGTG CCGTAAAGCA CTAAATCGGA ACCCTAAAGG 900 GAGCCCCCGA TTTAGAGCTT GACGGGGAAA GCCGGCGAAC GTGGCGAGAA AGGAAGGGAA 960 GAAAGCGAAA GGAGCGGGCG CTAGGGCGCT GGCAAGTGTA GCGGTCACGC TGCGCGTAAC 1020 CACCACACCC GCCGCGCTTA ATGCGCCGCT ACAGGGCGCG TACTATGGTT GCTTTGACGA 1080 GCACGTATAA CGTGCTTTCC TCGTTGGAAT CAGAGCGGGA GCTAAACAGG AGGCCGATTA 1140 AAGGGATTTT AGACAGGAAC GGTACGCCAG CTGGACCGCG GTCTTTCTCA ACGTAACACT 1200 TTACAGCGGC GCGTCATTTG ATATGATGCG CCCCGCTTCC CGATAAGGGA GCAGGCCAGT 1260 AAAAGCATTA CCCGTGGTGG GGTTCCCGAG CGGCCAAAGG GAGCAGACTC TAAATCTGCC 1320 GTCATCGACT TCGAAGGTTC GAATCCTTCC CCCACCACCA TCACTTTCAA AAGTCCGAAA 1380 GCTGCTCCCT GCTTGTGTGT TGGAGGTCGC TGAGTAGTGC GCGAGTAAAA TTTAAGCTAC 1440 AACAAGGCAA GGCTTGACCG ACAATTGCAT GAAGAATCTG CTTAGGGTTA GGCGTTTTGC 1500 GCTGCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA 1560 ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA 1620 ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT 1680 AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA 1740 CTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC 1800 CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT 1860 ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT 1920 GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG 1980 TCTCCACCCC ATTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC 2040 AAAATGTCGT AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGAATTCCTG GGCGGGACTG 2100 GGGAGTGGCG AGCCCTCAGA TGCTGCATAT AAGCAGCTGC TTTTTGCCTG TACTGGGTCT 2160 CTCTGGTTAG ACCAGATCTG AGCCTGGGAG CTCTCTGGCT AACTAGAGAA CCCACTGCTT 2220 AAGCCTCAAT AAAGCTTCTA GAGATCCCTC GACCTCGAGA TCCATTGTGC TCTAAAGGAG 2280 ATACCCGGCC AGACACCCTC ACCTGCGGTG CCCAGCTGCC CAGGCTGAGG CAAGAGAAGG 2340 CCAGAAACCA TGCCCATGGG GTCTCTGCAA CCGCTGGCCA CCTTGTACCT GCTGGGGATG 2400 CTGGTCGCTT CCGTGCTAGC CGACTACAAG GACGACGATG ACAAGACAGG TGAAGACTTT 2460 GTGGACATCC CAGAAAACTT CTTTGGAGTG GGGGGTGAGG AGGACATCAC CGTCCAGACA 2520 GTGACCTGGC CTGACATGGA GCTGCCACTG CCTCGAAACA TCACTGAGGG TGAAGCCCGA 2580 GGCAGCGTGA TCCTTACCGT AAAGCCCATC TTCGAGGTCT CCCCCAGTCC CCTGGAACCC 2640 GAGGAGCCCT TCACGTTTGC CCCTGAAATA GGGGCCACTG CCTTCGCTGA GGTTGAGAAT 2700 GAGACTGGAG AGGCCACCAG GCCCTGGGGC TTTCCCACAC CTGGCCTGGG CCCTGCCACG 2760 GCATTCACCA GTGAGGACCT CGTCGTGCAG GTGACCGCTG TCCCTGGGCA GCCGCATTTG 2820 CCAGGGGGAG GGGATCCCGA GGGTGAGTAC TAAGCTTCAG CGCTCCTGCC TGGACGCATC 2880 CCGGCTATGC AGCCCCAGTC CAGGGCAGCA AGGCAGGCCC CGTCTGCCTC TTCACCCGGA 2940 GGCCTCTGCC CGCCCCACTC ATGCTCAGGG AGAGGGTCTT CTGGCTTTTT CCCCAGGCTC 3000 TGGGCAGGCA CAGGCTAGGT GCCCCTAACC CAGGCCCTGC ACACAAAGGG GCAGGTGCTG 3060 GGCTCAGACC TGCCAAGAGC CATATCCGGG AGGACCCTGC CCCTGACCTA AGCCCACCCC 3120 AAAGGCCAAA CTCTCCACTC CCTCAGCTCG GACACCTTCT CTCCTCCCAG ATTCCAGTAA 3180 CTCCCAATCT TCTCTCTGCA GAGCCCAAAT CTTGTGACAA AACTCACACA TGCCCACCGT 3240 GCCCAGGTAA GCCAGCCCAG GCCTCGCCCT CCAGCTCAAG GCGGGACAGG TGCCCTAGAG 3300 TAGCCTGCAT CCAGGGACAG GCCCCAGCCG GGTGCTGACA CGTCCACCTC CATCTCTTCC 3360 TCAGCACCTG AACTCCTGGG GGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA ACCCAAGGAC 3420 ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACATGCGTGG TGGTGGACGT GAGCCACGAA 3480 GACCCTGAGG TCAAGTTCAA CTGGTACGTG GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA 3540 AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA CAACAGCACG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG 3600 CACCAGGACT GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGCCCTCCCA 3660 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGTGGGA CCCGTGGGGT GCGAGGGCCA 3720 CATGGACAGA GGCCGGCTCG GCCCACCCTC TGCCCTGAGA GTGACCGCTG TACCAACCTC 3780 TGTCCCTACA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCGGGATGA 3840 GCTGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTATC CCAGCGACAT 3900 CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT 3960 GCTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG 4020 GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA ACCACTACAC 4080 GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA ATGAGTGCGA CGGCCGCGAC TCTAGAGGAT 4140 CTTTGTGAAG GAACCTTACT TCTGTGGTGT GACATAATTG GACAAACTAC CTACAGAGAT 4200 TTAAAGCTCT AAGGTAAATA TAAAATTTTT AAGTGTATAA TGTGTTAAAC TACTGATTCT 4260 AATTGTTTGT GTATTTTAGA TTCCAACCTA TGGAACTGAT GAATGGGAGC AGTGGTGGAA 4320 TGCCTTTAAT GAGGAAAACC TGTTTTGCTC AGAAGAAATG CCATCTAGTG ATGATGAGGC 4380 TACTGCTGAC TCTCAACATT CTACTCCTCC AAAAAAGAAG AGAAAGGTAG AAGACCCCAA 4440 GGACTTTCCT TCAGAATTGC TAAGTTTTTT GAGTCATGCT GTGTTTAGTA ATAGAACTCT 4500 TGCTTGCTTT GCTATTTACA CCACAAAGGA AAAAGCTGCA CTGCTATACA AGAAAATTAT 4560 GGAAAAATAT TCTGTAACCT TTATAAGTAG GCATAACAGT TATAATCATA ACATACTGTT 4620 TTTTCTTACT CCACACAGGC ATAGAGTGTC TGCTATTAAT AACTATGCTC AAAAATTGTG 4680 TACCTTTAGC TTTTTAATTT GTAAAGGGGT TAATAAGGAA TATTTGATGT ATAGTGCCTT 4740 GACTAGAGAT CATAATCAGC CATACCACAT TTGTAGAGGT TTTACTTGCT TTAAAAAACC 4800 TCCCACACCT CCCCCTGAAC CTGAAACATA AAATGAATGC AATTGTTGTT GTTAACTTGT 4860 TTATTGCAGC TTATAATGGT TACAAATAAA GCAATAGCAT CACAAATTTC ACAAATAAAG 4920 CATTTTTTTC ACTGCATTCT AGTTGTGGTT TGTCCAAACT CATCAATGTA TCTTATCATG 4980 TCTGGATCCT GTGGAATGTG TGTCAGTTAG GGTGTGGAAA GTCCCCAGGC TCCCCAGCAG 5040 GCAGAAGTAT GCAAAGCATG CATCTCAATT AGTCAGCAAC CAGGTGTGGA AAGTCCCCAG 5100 GCTCCCCAGC AGGCAGAAGT ATGCAAAGCA TGCATCTCAA TTAGTCAGCA ACCATAGTCC 5160 CGCCCCTAAC TCCGCCCATC CCGCCCCTAA CTCCGCCCAG TTCCGCCCAT TCTCCGCCCC 5220 ATGGCTGACT AATTTTTTTT ATTTATGCAG AGGCCGAGGC CGCCTCGGCC TCTGAGCTAT 5280 TCCAGAAGTA GTGAGGAGGC TTTTTTGGAG GCCTAGGCTT TTGCAAAAAG CTAATTC 5337
【図１】ｒＡＧＧ−１の構造を示した図である。ｒＡＧ
Ｇ−１は、ＣＤ５のシグナル配列：ＳＳ、Ｍ１モノクロ
ーナル抗体検出のためのＦＬＡＧ−エピトープ：ＦＬＡ
Ｇ、ヒトアグレカンの球間ドメイン：ＩＧＤ、ヒトＩｇ
Ｇ１のヒンジ領域：Ｈ、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域：Ｃ
Ｈ２、およびヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域：ＣＨ３からな
っている。
Ｇ−１は、ＣＤ５のシグナル配列：ＳＳ、Ｍ１モノクロ
ーナル抗体検出のためのＦＬＡＧ−エピトープ：ＦＬＡ
Ｇ、ヒトアグレカンの球間ドメイン：ＩＧＤ、ヒトＩｇ
Ｇ１のヒンジ領域：Ｈ、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域：Ｃ
Ｈ２、およびヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域：ＣＨ３からな
っている。
【図２】モノクローナル抗体Ｍ１（Ｍ１−ＭｏＡｂ）を
用いたＣＯＳ細胞におけるｒＡＧＧ−１発現の検出の結
果を示した写真である。
用いたＣＯＳ細胞におけるｒＡＧＧ−１発現の検出の結
果を示した写真である。
【図３】ＦＬＡＧエピトープにより精製したｒＡＧＧ−
１の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）写真である。レーン
Ａ：クーマシー染色、レーンＢ：モノクローナル抗体Ｍ
１を用いるウェスターンブロット検出、レーンＣ：抗ヒ
トＩｇＧ抗血清。
１の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）写真である。レーン
Ａ：クーマシー染色、レーンＢ：モノクローナル抗体Ｍ
１を用いるウェスターンブロット検出、レーンＣ：抗ヒ
トＩｇＧ抗血清。
【図４】ラット軟骨肉腫細胞からの細胞培養液中のｒＡ
ＧＧ−１のＢＣ−３反応性を示した電気泳動写真であ
る。 レーンＡ：未刺激ラット軟骨肉腫細胞の培養物からのｒ
ＡＧＧ−１はウェスターンブロット上ではＢＣ−３モノ
クローナル抗体では検出されないが、レチノイン酸出刺
激した細胞の培養物からのｒＡＧＧ−１は検出される。
レーンＢ、レーンＣ：モノクローナル抗体Ｍ１で再プロ
ービングした後の同様なブロット。ＢＣ−３反応性断片
は元の７２ｋＤバンドより約５．６ｋＤ小さく、「アグ
レカナーゼ」部位におけるｒＡＧＧ−１の開裂を示して
いる。
ＧＧ−１のＢＣ−３反応性を示した電気泳動写真であ
る。 レーンＡ：未刺激ラット軟骨肉腫細胞の培養物からのｒ
ＡＧＧ−１はウェスターンブロット上ではＢＣ−３モノ
クローナル抗体では検出されないが、レチノイン酸出刺
激した細胞の培養物からのｒＡＧＧ−１は検出される。
レーンＢ、レーンＣ：モノクローナル抗体Ｍ１で再プロ
ービングした後の同様なブロット。ＢＣ−３反応性断片
は元の７２ｋＤバンドより約５．６ｋＤ小さく、「アグ
レカナーゼ」部位におけるｒＡＧＧ−１の開裂を示して
いる。
【図５】「アグレカナーゼ」活性を検出するための可能
な９６ウェルのフォーマットスクリーニング分析用の構
造（ピン蓋を有する）を示した図である。
な９６ウェルのフォーマットスクリーニング分析用の構
造（ピン蓋を有する）を示した図である。
【図６】ｒＡＧＧ−１のアミノ酸配列（アミノ酸残基１
〜２２４番）を示した図である。アミノ酸１〜２４はＣ
Ｄ５シグナル配列を、アミノ酸２５〜３２はＦｌａｇ−
配列を、アミノ酸３３〜１６０はヒトアグレカン球間ド
メインを、アミノ酸１６１〜１６４はスペーサー配列
を、アミノ酸１６５〜１７９はヒトＩｇＧ１のヒンジ配
列を、アミノ酸１８０〜２８９はヒトＩｇＧ１のＣＨ２
領域を、アミノ酸２９０〜３９６はヒトＩｇＧ１のＣＨ
３領域を、それぞれ示す。
〜２２４番）を示した図である。アミノ酸１〜２４はＣ
Ｄ５シグナル配列を、アミノ酸２５〜３２はＦｌａｇ−
配列を、アミノ酸３３〜１６０はヒトアグレカン球間ド
メインを、アミノ酸１６１〜１６４はスペーサー配列
を、アミノ酸１６５〜１７９はヒトＩｇＧ１のヒンジ配
列を、アミノ酸１８０〜２８９はヒトＩｇＧ１のＣＨ２
領域を、アミノ酸２９０〜３９６はヒトＩｇＧ１のＣＨ
３領域を、それぞれ示す。
【図７】ｒＡＧＧ−１のアミノ酸配列（アミノ酸残基２
２５〜３９６番）を示した図である。図６の続きであ
る。
２５〜３９６番）を示した図である。図６の続きであ
る。
【図８】ｒＡＧＧ−１の真核細胞における発現のための
ベクターｐＣＤＭ８−ｒＡＧＧ−１のヌクレオチド配列
を示した図である。
ベクターｐＣＤＭ８−ｒＡＧＧ−１のヌクレオチド配列
を示した図である。
【図９】ｒＡＧＧ−１の真核細胞における発現のための
ベクターｐＣＤＭ８−ｒＡＧＧ−１のヌクレオチド配列
を示した図である。図８の続きである。
ベクターｐＣＤＭ８−ｒＡＧＧ−１のヌクレオチド配列
を示した図である。図８の続きである。
【図１０】ｒＡＧＧ−１の真核細胞における発現のため
のベクターｐＣＤＭ８−ｒＡＧＧ−１のヌクレオチド配
列を示した図である。図９の続きである。
のベクターｐＣＤＭ８−ｒＡＧＧ−１のヌクレオチド配
列を示した図である。図９の続きである。
【図１１】ｒＡＧＧ−１の真核細胞における発現のため
のベクターｐＣＤＭ８−ｒＡＧＧ−１のヌクレオチド配
列を示した図である。図１０の続きである。
のベクターｐＣＤＭ８−ｒＡＧＧ−１のヌクレオチド配
列を示した図である。図１０の続きである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 フランク、ビュットナー ドイツ連邦共和国ルートビッヒスハーフェ ン、ベルダー、シュトラーセ、10 (72)発明者 ブルース、カッターソン イギリス国ウェールズ、ポントカンナ、カ ーディフ、スニード、ストリート、１ (72)発明者 クレアー、ヒューズ イギリス国ウェールズ、ポントカンナ、カ ーディフ、スニード、ストリート、１
Claims (18)
- 【請求項１】イン・ビトロでの試験系におけるアグレカ
ナーゼの組換え基質。 - 【請求項２】基質が、 a) ＣＤ５のシグナル配列、 b) Ｍ１モノクローナル抗体検出のためのＦＬＡＧ−エ
ピトープ、 c) ヒトアグレカンの球間ドメイン、 d) ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、 e) ヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域、および f) ヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域を含んでなる構成要素の
群を含む、請求項１に記載の組換え基質。 - 【請求項３】a) 基質が配列番号３のアミノ酸配列また
はその部分を有するか、または b) 配列番号３のアミノ酸配列またはその部分であっ
て、アミノ酸３４がＡｌａに変異したものである、請求
項１または２に記載の組換え基質。 - 【請求項４】請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換
え基質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項５】a) ＤＮＡが配列番号４のヌクレオチド２
３５０〜４１１４のヌクレオチド配列またはその部分を
有する、 b) ＤＮＡが配列番号４のヌクレオチド２３５０〜４１
１４のヌクレオチド配列またはその部分であって、ヌク
レオチド２４４８がＣに変異し、ヌクレオチド２４５０
がＣに変異し、ヌクレオチド２４５１がＡに変異したも
のを有する、または c) ＤＮＡがストリンジュント条件下では配列番号４に
示したＤＮＡとハイブリダイズする、請求項４に記載の
ＤＮＡ。 - 【請求項６】請求項５に記載のヌクレオチド配列を有す
るＤＮＡ断片を含むベクター。 - 【請求項７】請求項６に記載のベクターを含む宿主細
胞。 - 【請求項８】アグレカナーゼの活性を試験するための細
胞培養系における、請求項１〜３のいずれか一項に記載
の組換え基質の使用。 - 【請求項９】細胞培養系が固有の内因性プロテオグリカ
ンおよび他の細胞外成分を含まない、請求項８に記載の
組換え基質の使用。 - 【請求項１０】アグレカナーゼの活性を抗体による開裂
生成物の検出によって試験する、請求項８または９に記
載の組換え基質の使用。 - 【請求項１１】基質における新規な酵素開裂部位を検出
するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換
え基質の使用。 - 【請求項１２】アフィニティクロマトグラフィによって
アグレカナーゼを精製するための、請求項１〜３のいず
れか一項に記載の組換え基質の使用。 - 【請求項１３】アグレカナーゼｃＤＮＡを単離するため
の機能性クローニング系における請求項１〜３のいずれ
か一項に記載の組換え基質の使用。 - 【請求項１４】アグレカナーゼ阻害剤をスクリーニング
するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え
基質の使用。 - 【請求項１５】骨関節症の開始または進行を監視する方
法であって、骨関節症を有することが疑われるまたは知
られているヒトからの生物学的流体の試料を、請求項１
〜３のいずれか一項に記載の組換え基質によってアグレ
カナーゼの存在について分析を行う方法。 - 【請求項１６】上記生物学的流体が、滑液、尿、血清お
よびリンパ液からなる群から選択される、請求項１５に
記載の方法。 - 【請求項１７】上記方法を、疾病の進行を観察して治療
の有効性を決定するのに使用する、請求項１５または１
６に記載の方法。 - 【請求項１８】請求項１〜３のいずれか一項に記載の組
換え基質および抗体を含み、アグレカナーゼ開裂生成物
を検出するための診断助剤。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02097097A Expired - Fee Related JP3973253B2 (ja) | 1996-01-18 | 1997-01-20 | アグレカナーゼのタンパク質分解活性試験用組換え基質（ｒＡＧＧ１） |
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| DK (1) | DK0785274T3 (ja) |
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| AU8513098A (en) * | 1998-07-24 | 2000-02-14 | Du Pont Pharmaceuticals Company | Assays and peptide substrate for determining aggrecan degrading metallo proteaseactivity |
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| CA2460539C (en) | 2001-09-15 | 2013-10-29 | Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center | Stratified cartilage tissue and methods to engineer same |
| US20030165473A1 (en) * | 2001-11-09 | 2003-09-04 | Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center | Engineered intervertebral disc tissue |
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| DE102005005972A1 (de) | 2005-02-09 | 2006-08-17 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Verwendung von Thiopeptoliden zur Aktivitätsbestimmung von ADAM-T8 Proteasen |
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