DE102004029470A1

DE102004029470A1 - Verfahren zur Bestimmung von Aggrekanase-Aktivitäten

Info

Publication number: DE102004029470A1
Application number: DE200410029470
Authority: DE
Inventors: Horst Prof. Dr. Will; Matthias Dr. Dettloff; Torsten Stroh; Monique Oswald; Peter Dr. Bendzko
Original assignee: Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH
Current assignee: Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH
Priority date: 2004-06-18
Filing date: 2004-06-18
Publication date: 2006-01-05
Also published as: WO2005124352B1; EP1761778A2; WO2005124352A2; WO2005124352A3

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung rekombinanter und chemisch modifizierter Aggrekanfragmente als Substrate zur Bestimmung von Aggrekanase-Aktivitäten. Sie betrifft weiterhin die Gewinnung von Antikörpern gegen Spaltprodukte der Aggrekanfragmente sowie einem Assay zur Messung von Aggrekanase-Aktivität. DOLLAR A Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung rekombinanter und chemisch modifizierter Aggrekanfragmente als Substrate zur Bestimmung von Aggrekanase-Aktivitäten. Sie betrifft weiterhin die Gewinnung von Antikörpern gegen Spaltprodukte der Aggrekanfragmente sowie einem Assay zur Messung von Aggrekanase-Aktivität. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Aggrekan ist eine Hauptkomponente von Gelenkknorpel. Das Proteoglycan mit dem Molekulargewicht von 2,2 – 3 × 10⁶ Dalton ist auch in der extrazellulären Matrix von Aortenwand, Zwischenknorpelscheiben und Sehnen sowie in dem perineuronalen Netzwerk vertreten [1,2,3]. Die Polypeptidkette von reifem Aggrekan ist in drei globuläre Domänen, G1, G2 und G3, gefaltet. Der Abschnitt zwischen den globulären Domänen G1 und G2 wird als interglobuläre Domäne (Aggrekan-IGD) bezeichnet. Er weist einen hohen Gehalt an Asp-, Glu- und Pro-Resten auf. In dem Bereich zwischen den globulären Domänen G2 und G3 sind bis zu 130 Glycosaminoglycanketten, überwiegend Keratansulfate und Chondroitinsulfate, angelagert. Die negative Ladung der Glycosaminoglycane bewirkt eine starke Hydratation des Moleküls, die für die druckelastischen Eigenschaften von Aggrekan in Gelenkknorpel essentiell ist. Aggrekan bindet über die G1-Domäne zusammen mit 2 Linkerproteinen an Hyaluronsäure. Dabei entstehen Aggregate aus Hyaluronsäure und bis zu 100 Aggrekanmonomeren [1,4].
Aggrekan wird durch Matrix-Metalloproteinasen und Proteinasen der ADAMTS-Familie (A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin Motif) hydrolysiert. Von den ADAMTS-Proteasen sind insbesondere ADAMTS4 (Aggrekanase 1) und ADAMTS5 (Aggrekanase 2) am proteolytischen Abbau von Aggrekan beteiligt. Die zwei Proteasen spalten mindestens 5 verschiedene Peptidbindungen des Aggrekanmoleküls in vitro und in vivo [5,6,7,8]. Vier Spaltorte sind in dem Bereich zwischen den globulären Domänen G2 und G3 lokalisiert (Peptidbindungen E₁₆₆₇ – G₁₆₆₈, E₁₄₈₀ – G₁₄₈₁, E₁₇₇₁ – A₁₇₇₂, E₁₈₇₁ – L₁₈₇₂). Ein Spaltort befindet sich in der interglobulären Domäne (Peptidbindung E₃₇₃ – A₃₇₄). Die Hydrolyse des letzteren Spaltortes wird bereits in frühen Stadien der Knorpelschädigung bei Osteoarthrose beobachtet. Eine weitere Protease der ADAMTS-Familie, ADAMTS1, hydrolysiert in vitro ebenfalls mehrere Peptidbindungen von Aggrekan, darunter die Bindung E₃₇₃ – A₃₇₄ in der interglobulären Domäne [9]. Die Hydrolyse dieser letzteren Bindung erfordert jedoch hohe ADAMTS1-Konzentrationen.
Für das Verständnis und die Beurteilung des Abbaus von Aggrekan bei der Knorpeldestruktion und weiteren pathologischen Prozessen ist die Bestimmung der Aktivität Aggrekan-spaltender Proteinasen unerläßlich. Die Aktivität von Aggrekanasen wurde bisher mit Hilfe isolierter Aggrekanpräparate [10], mit rekombinanten Aggrekanfragmenten [11,12] und synthetischen Polypeptiden [13] ermittelt.
Stand der Technik:
Aktivitätsmessungen mit isoliertem Aggrekan sind aufwendig. Aggrekanspaltfragmente müssen zunächst deglykosyliert werden. Sie werden anschließend elektrophoretisch getrennt und in Western Blots mit Antikörpern gegen Aggrekan-G1-Domäne und Aggrekanpeptide sichtbar gemacht. Für die Quantifizierung werden die Western Blots densitometrisch ausgewertet [10].
In Aktivitätsmessungen mit rekombinantem Aggrekanfragment [11,12] wurde ein Fusionsprotein aus Aggrekan-IGD und konstanten Regionen von humanem IgG 1 als Substrat für Aggrekanasen verwendet. Die Bestimmung von Spaltprodukten der Aggrekanasereaktion erfolgte mit einem Neoepitop-Antikörper (BC-3) gegen die N-terminale Sequenz ARGSVIL aus dem Aggrekanasespaltort.
Die Nachteile dieser Methode sind:

a) Der Neoepitop-Antikörper BC-3 ist nicht für effektive direkte Beschichtungen von Mikrotestplatten geeignet. Die Beschichtung erfordert einen Sekundärantikörper.
b) In dem als Substrat verwendeten Fusionsprotein wird der größere Anteil der Polypeptidsequenz nicht von dem eigentlichen Substrat, Aggrekan-IGD, sondern von Fremdprotein gestellt (Aggrekan-IGD: 127 Aminosäurereste, IgG1-Sequenz: 232 Aminosäurereste). Es ist nicht bekannt, ob die Fusion mit konstanten Regionen von IgG1 die Substrateigenschaften von Aggrekan-IGD verändert. Die Analyse von Strukturvarianten von Aggrekan-IGD ist bei dem überwiegenden Sequenzanteil des Fusionspartners erschwert. Gezielte chemische Modifikationen von Aggrekan-IGD in dem Fusionsprotein können nicht oder nur mit hohem Aufwand durchgeführt werden.

J. A. Miller und Mitarbeiter [13] erprobten ein synthetisches biotinyliertes Polypeptid aus 41 Aminosäuren für die Messung von Aggrekanaseaktivität. Das Peptid wurde an Streptavidin in Mikrotestplatten gebunden. Bei Einwirkung von Aggrekanase entstehen N-terminale Sequenzen ARGSVIL, die mit Hilfe des Neoepitop-Antikörpers BC-3 und eines POD-markierten Sekundärantikörpers bestimmt werden können. Nach Angabe der Autoren kann die Aggrekanasereaktion und die anschließende Produktbestimmung nur mit trägerfixiertem Peptid und nicht in homogener Lösung ausgeführt werden. Darüberhinaus wurde ein ungünstig hoher K_m-Wert von 0,48 mM für das Peptidsubstrat ermittelt.
Die vorliegende Erfindung hat das Ziel, neuartige Aggrekanasesubstrate und optimierte Antikörper gegen Spaltprodukte der Substrate herzustellen. Die Aggrekanasesubstrate und Antikörper werden für sensitive, quantitative Methoden zur Bestimmung von Aggrekanase-Aktivität genutzt.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen 1–30 realisiert. Kernpunkt der Erfindung ist die Verwendung von Varianten und Mutanten vom Aggrekan-IGD als Substrat sowie die Bindung und die Bestimmung des entstandenen Spaltstücks ARGSVIL-Peptid mit neuartigen monoklonalen Antikörpern.
Die Erfindung wird nachfolgend im einzelnen erläutert.
1. Herstellung und Charakterisierung von Substraten für Aggrekanasen
Als Substrate von Aggrekanasen werden rekombinante Fragmente ihrer physiologischen Substrate (Aggrekan, Versikan, Brevikan u. a.) hergestellt, die neben einer Aggrekanasespaltstelle weitere Erkennungsorte für Aggrekanasen aufweisen. Die Substrate können zusätzlich modifiziert sein. Ein Beispiel ist die Expression der interglobulären Domäne von humanem Aggrekan (Aggrekan-IGD) mit der Aminosäuresequenz:
(Nachgestellte Zahlen bei Aminosäureresten entsprechen den Positionen dieser Reste in der vollständigen Sequenz von reifem humanem Aggrekan).
Der Aggrekanase-Schnittort (P7–P1–P1'–P7') in Aggrekan-IGD ist
Bei der Proteolyse in Gegenwart von Aggrekanase entstehen 2 Polypeptide. Das Polypeptid mit der N-terminalen Sequenz ARGSVIL wird im weiteren Text als ARGSVIL-Peptid bezeichnet. Für die Herstellung des Substrates Aggrekan-IGD wird die kodierende DNA-Sequenz mit oder ohne zusätzliche Codone für Peptid-"tags", z. B. His-"tag", in einen geeigneten Expressionsvektor für Bakterien, Hefen, Insekten- oder Säugerzellen eingefügt. Nach Expression des Proteins erfolgt die Reinigung. Durch die Reinigung werden Fremdproteine abgetrennt und Strukturvarianten der Polypeptidsubstrate isoliert. Die Polypeptidsubstrate können durch in vitro Mutagenese oder chemische Reaktionen modifiziert werden.
Erfindungsgemäß sind folgende Aggrekan-IGD-Varianten neuartige Substrate für Aggrekanasen:
a) Strukturvarianten von Aggrekan-IGD
Bei rekombinanter Expression von Aggrekan-IGD z. B. in Bakterien E. coli werden Strukturvarianten des Aggrekanasesubstrates erhalten. Durch Gelchromatografie können zwei Hauptvarianten voneinander getrennt werden, eine Variante mit einem geringeren Elutionsvolumen (geringerer Verteilungkoeffizient) und eine Variante mit einem höheren Elutionsvolumen (größerer Verteilungskoeffizient). Die zwei Varianten und Spaltprodukte der Varianten durch Aggrekanasen weisen unterschiedliche Affinität gegen Antikörper auf. Die unterschiedliche Antikörperaffinität der Substrat- und Spaltproduktvarianten wird bei der Ausarbeitung von Assays zur Bestimmung von Aggrekanase-Aktivität berücksichtigt. Sie gestattet Optimierungen der Assays.
b) Aggrekan-IGD mit modifiziertem Aggrekanasespaltort
Für eine beschleunigte Hydrolyse von Aggrekanasesubstrat werden Aminosäurereste des Aggrekanasespaltortes (Reste P7–P1–P1'–PT) und/oder weitere Aminosäurereste, die an der Substratbindung von Aggrekanasen beteiligt sind (Exo-sites) durch in vitro Mutagenese ausgetauscht. Ein Beispiel ist der Austausch von Gly-Rest gegen Glu-Rest in Position P2 des Aggrekanasespaltortes. Der Austausch bewirkt eine schnellere Hydrolyse des Substrates in Gegenwart von Aggrekanasen.
c) Aggrekan-IGD ohne primäre Aminogruppen im Bereich C-terminal vom Aggrekanasespaltort
Durch Austausch des Lys-Restes in Position P10' des Aggrekanasespaltortes gegen einen anderen Aminosäurerest werden Aggrekansubstrate erhalten, die keine primären Aminogruppen in der C-terminalen Sequenz aufweisen. Der Austausch kann mit der Einführung zusätzlicher Lysinreste N-terminal von dem Aggrekanasespaltort verbunden werden. Durch Austausch des Lys-Restes in Position P10' können anschließende Modifizierungen von Aminogruppen in Aggrekanasesubstraten ohne Beeinträchtigung der Proteolyse durch Aggrekanase ausgeführt werden. Kopplungen von Fluoreszenzmarkern und anderen Verbindungen an Aminogruppen erfolgen nach Austausch des Lys-Restes in P10' auschließlich in dem N-terminal vom Aggrekanasespaltort gelegenen Teil des Aggrekanasesubstrates.
d) Aggrekan-IGD mit Cys-Resten
Durch in vitro Mutagenese werden ein oder mehrere Cys-Reste entweder N-terminal oder C-terminal von dem Aggrekanasespaltort eingeführt. Die Positionen für Cys-Reste werden so gewählt, daß die Aggrekanasereaktion nicht beeinträchtigt ist. Ein unikaler Cys-Rest gefolgt von einem Ala-Rest kann zum Beispiel an den C-Terminus von Aggrekan-IGD angefügt werden. Nach Einführung, von Cys-Resten können durch Modifizierung der SH-Gruppen Fluoreszenzmarker, Biotin und andere für den Nachweis von Spaltprodukten geeignete Verbindungen in ausgewählten Positionen des Aggrekanasesubstrates fixiert werden.
2. Gewinnung und Charakterisierung von Antikörpern gegen proteolytische Spaltprodukte von Aggrekanasesubstraten
Gegen Epitope und Neoepitope von Spaltprodukten, die durch Hydrolyse von Aggrekanasesubstraten entstehen, werden mit bekannten Methoden Antikörper erzeugt. Mindestens ein Antikörper muß gegen ein Neoepitop des Spaltortes gerichtet sein (N- oder C-terminales Neoepitop, Neoepitop innerhalb der Polypeptidkette). Die Affinität des Antikörpers für das Neoepitop muß hoch sein. Der Neoepitop-Antikörper darf nur eine geringe Affinität für das nichthydrolysierte Aggrekanasesubstrat aufweisen. Das Verhältnis der Affinitäten des Antikörpers für das Spaltprodukt und das Ausgangssubstrat muß größer als 10², vorzugsweise größer als 10³ sein.
Ein geeigneter Neoepitop-Antikörper für Spaltprodukt von Aggrekan-IGD mit der N-terminalen Sequenz ARGSVIL ist Neoepitop-Antikörper N38. Der Antikörper ist ein monoklonaler Maus-Antikörper der Immmunoglobulinklasse IgG1. Seine Wechselwirkung mit N-terminalem Neoepitop ARGSVIL ist durch eine Dissoziationskonstante (K_diss) von ca 10^–8 M charakterisiert. Antikörper N38 ist als Fangantikörper von ARGSVIL-Peptid für eine direkte Adsorption an Träger, z. B. Mikrotestplatten, geeignet. Er wurde in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen hinterlegt und unter der Nr. DSM ACC2596 registriert.
Ein Antikörper gegen die C-terminale Sequenz von Aggrekan-IGD ist Antikörper T42. Dieser Antikörper ist ein monoklonaler Maus-Antikörper der Klasse IgG2a.
Neoepitop-Antikörper N38 und Sequenz-Antikörper T42 können gleichzeitig an Spaltprodukt von Aggrekan-IGD mit der N-terminalen Sequenz ARGSVIL binden.
3. Quantifizierung proteolytischer Spaltprodukte von Aggrekanasesubstraten
Spaltpeptide, die durch Aggrekanasen aus Aggrekansubstraten freigesetzt werden, können mit verschiedenen Methoden quantifiziert werden.
a) Immunchemische Methoden an Festphasen:
Mit Hilfe von Neoepitop-Antikörper N38, der spezifisch ARGSVIL-Peptid bindet, kann das Spaltprodukt aus dem Reaktionsansatz an einen Träger gebunden und anschließend quantifiziert werden. Eine einfache Ausführung ist ein Sandwich-ELISA. ARGSVIL-Peptid wird durch den Neoepitop-Antikörper an eine Mikrotestplatte fixiert und anschließend mit einem zweiten Antikörper, z. B. Aggrekansequenz-Antikörper T42, der gleichzeitig mit dem Neoepitop-Antikörper an das Spaltprodukt bindet, quantifiziert. Neben Antikörper T42 können andere Antikörper gegen die C-terminale Sequenz von Aggrekan-IGD, sowie Antikörper gegen Peptid-"tags" und Markierungen, die in dem Spaltprodukt vorhanden sind, als zweite Antikörper dienen. Für die Quantifizierung von ARGSVIL-Peptid wird der zweite Antikörper mit einem Detektionsenzym gekoppelt. Die immunchemische Bestimmung von ARGSVIL-Peptid mit dem Neoepitop-Antikörper N38 kann auch mit anderen bekannten ELISA-Formaten ausgeführt werden.
b) Immunchemische Methoden in homogener Phase:
Eine geeignete Methode für die Bestimmung von ARGSVIL-Peptid mit Antikörpern in homogener Phase ist Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) bzw. zeitaufgelöster Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (TR-FRET).
Für FRET/TR-FRET müssen Donor und Akzeptorfluorophor gleichzeitig an das Spaltprodukt binden. In einer Variante wird das Donorfluorophor an den Neoepitop-Antikörper N38 und das Akzeptorfluorophor an einen zweiten Anti-Spaltprodukt-Antikörper, z. B. Aggrekansequenz-Antikörper T42, fixiert. In einer anderen Variante wird das Akzeptorfluorophor unmittelbar in den Teil des Aggrekanasesubstrates eingeführt, der nach Aggrekanasehydrolyse von Neoepitop-Antikörper N38 erkannt wird. Für eine Modifizierung mit Akzeptorfluorophor ist insbesondere Aggrekan-IGD mit Cys-Rest C-terminal von dem Aggrekanasespaltort geeignet.
Neben FRET/TR-FRET können auch andere auf enger Nachbarschaft von 2 Sonden beruhende Methoden wie z. B. AlphaScreen zur Bestimmung von ARGSVIL-Peptid mit dem Neoepitop-Antikörper N38 in homogener Phase genutzt werden.
4. Aggrekanaseaktivitätstest
Die Messung der Konzentration des Spaltproduktes von Aggrekan-IGD erlaubt die Bestimmung von Aggrekanase-Aktivität unter definierten Bedingungen. In einem ersten Schritt werden Substrat und Aggrekanase zusammen inkubiert, wobei die Konzentration der Reagenzien, Puffer und Zusätze, die Reaktionstemperatur und die Dauer der Reaktion frei gewählt werden können. In einem zweiten Schritt wird das gebildete Spaltprodukt, ARGSVIL-Peptid quantifiziert.
Der Aggrekanaseaktivitätstest hat folgende Anwendungen:

– Messung der Aktivität verschiedener Aggrekanasen (ADAMTS4, ADAMTS5, ADAMTS1) in Zellkulturüberständen, angereicherten Fraktionen und isolierten Enzympräparaten.
– Messung von Aggrekanase-Aktivität in Körperflüssigkeiten und Gewebeextrakten. Da Körperflüssigkeiten und Gewebeextrakte Inhibitoren für Aggrekanasen enthalten, ist die meßbare Aktivität gering. Sie hängt von den jeweiligen Konzentrationen der Aggrekanasen und Inhibitoren ab. In jedem Fall müssen die Aktivitätsteste eine hohe Sensitivität aufweisen. In einer Ausführungsvariante werden die Inhibitoren vor Messung der Aggrekanase-Aktivität aus Körperflüssigkeiten und Gewebeextrakten entfernt. In einer anderen Ausführungsvariante werden Aggrekanasen aus Körperflüssigkeiten und Gewebeextrakten zuerst isoliert, z. B. durch Bindung an einen Antikörper, bevor ihre Aktivität gemessen wird.
– Screening und Charakterisierung natürlicher und synthetischer Inhibitoren von Aggrekanaseaktivität.

Mit der vorliegenden Erfindung wird eine wesentliche Steigerung der Empfindlichkeit von Aggrekanasebestimmungen gegenüber dem Stand der Technik erreicht. Überraschenderweise wird durch die Verwendung eines modifizierten Aggrekan-IGD die Sensitivität der Messung von Aggrekanase-Aktivität um mehr als Faktor 10 erhöht. Auf Grund der hohen Sensitivität kann die Aggrekanasereaktion, die nach üblichen Methoden mehrere Stunden in Anspruch nimmt, in der kurzen Zeit von 10–15 Minuten ausgeführt werden (vgl. Beispiel F).
Darüberhinaus ist es möglich, sehr geringe Konzentrationen von Aggrekanase nachzuweisen. Mit dem erfindungsgemäßen Substrat können Aggrekanasekonzentrationen unter 1 fmol/ml bestimmt werden. Die hohe Sensitivität des erfindungsgemäßen Aggrekanase-Aktivitätstestes erlaubt erstmals die Messung von geringen Aggrekanase-Aktivitäten in Körperflüssigkeiten, z. B. Gelenkflüssigkeit. Da Aggrekanasen durch Abbau von Knorpelaggrekan zur Entstehung und Progression von Gelenkerkrankungen, insbesondere Osteoarthrose, beitragen, ist die Erfindung für die Diagnostik und die Therapiekontrolle dieser Krankheiten geeignet. Es ist weiterhin möglich mit dem erfindungsgemäßen Substrat eine Charakterisierung von Tiermodellen für Gelenkerkrankungen vorzunehmen.
Die Erfindung wird durch folgende Anwendungsbeispiele weiter ergänzt:
A) Expression und Reinigung rekombinanter Aggrekanfragmente
A1) Expression und Reinigung von Aggrekan-IGD mit einem C-terminalen His-"tag" (Aggrekan-IGD-His)
cDNA für Aggrekan-IGD (Aggrekan-Aminosäuren T331 – G458) wurde mit folgenden Primern amplifiziert:
5'-CAT ACC ATG GCC ACC GCA GAA GAC TTT GTG GAC ATC
5'-CCT CTC GAG GTG ATG GTG ATG GTG ATG TCC CCC TGG CAA ATG CGG CTG
Die Primer ergänzen die cDNA in 5'-Position mit einem Nco I-Ort und in 3'-Position mit Codonen für ein His-"tag" und einen Xho I-Ort. Nach Restriktion mit Nco I und Xho I wurde das DNA-Fragment in einen modifizierten pET-Vektor eingefügt, der die DNA um ein weiteres His-"tag" und ein Stop-Codon verlängerte. Der erhaltene Vektor erhielt die Bezeichnung pETAgg-IGD-His. Er wurde in E. coli Bakterien BL21(DE3) transfiziert.
Die Kultur rekombinanter Bakterien mit pETAgg-IGD-His erfolgte nach Standardvorschriften. Die Reinigung von Aggrekan-IGD-His aus Bakteriensediment wurde bei 0–4°C ausgeführt. Bakteriensediment von 4 L Kultur wurde zunächst in Lysepuffer suspendiert (Lysepuffer: 1 mg/ml Lysozym, 1 mM PMSF, 1 μg/ml Aprotinin, 1 μg/ml Leupeptin, 5% Ethylenglykol, 1 mM Imidazol, 0,3 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Anschließend wurden 1,5 ml Triton X-100 und 1,5 μl Benzonase zugegeben und eine Ultraschallbehandlung durchgeführt. Das erhaltene Homogenat wurde 30 min bei 50 000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und an den Metall-Chelatträger Talon (Clontech), der vorher in 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 equilibriert worden war, chromatographiert. Die Elution von Aggrekan-IGD-His erfolgte mit 100 mM Imidazol in Equilibrierungspuffer. Elutionsfraktionen mit Aggrekan-IGD-His wurden gegen Equilibrierungspuffer dialysiert und anschließend auf eine Proteinkonzentration von 0,5 mg/ml eingeengt. Das berechnete M_r von Aggrekan-IGD-His beträgt 15,5 Dalton. Das scheinbare M_r in der SDS-PAGE (verglichen mit Markerproteinen) beträgt ca 21 Dalton (siehe 2).
A2) Expression und Reinigung von Aggrekan-IGD mit verändertem Aggrekanasespaltort (Aggrekan-IGD-3E)
Die Mutagenase des Aggrekanasespaltortes wurde mit der PCR-Methode "Overlap-Extension" und folgenden Oligonukleotiden ausgeführt:
5'- CCT ACT AGT TTT AAG GAG GAA GAA GCC CGA GGC AGC GTG
5'- TTC TTC CTC CTT AAA ACT AGT AGG CAG TGG CAG CTC CAT
Die Oligonukleotide verändern die Sequenz des Aggrekanasespaltortes von PRNITEGEARGSVIL zu PTSFKEEEARGSVIL. Die Klonierung von Aggrekan-IGD mit abgewandeltem Aggrekanasespaltort in einen pET-Vektor, die Transformation von E. coli BL21(DE3), die Bakterienkultur und die Reinigung des rekombinanten Proteins wurden wie oben für die Expression und Reinigung von Aggrekan-IGD-His beschrieben ausgeführt.
A3) Expression und Reinigung von Aggrekan-IGD mit N-terminalem His-"tag" und C-terminalem Cys-Rest (His-Aggrekan-IGD-C)
cDNA für Aggrekan-IGD wurde mit folgenden Primern amplifiziert:
5'- CAT GCC ATG GGC CAC CAC CAC CAC CAC CAT GCT GCT CAT CAT CAT CAT CAT CAC ACC GCA GAA GAC TTT GTG GAC ATC
5'- CCG CTC GAG TTA TGC GCA TCC CCC TGG CAA ATG CGG CTG
Die Oligonukleotide fügen in 5'-Position einen Nco I-Ort und Sequenzen für zwei aufeinanderfolgende His-"tags", in 3'-Position Codone für einen Cys-Rest und einen Ala-Rest, ein Stop-Codon und einen Xho I-Ort an die cDNA an. Die amplifizierte DNA wurde mit den Restriktionsenzymen Nco I und Xho I verdaut und in den Vektor pET19 (Novagen) kloniert. Nach Transfektion des Vektors in E. coli BL21(DE3) wurden die Expression und Reinigung des rekombinanten Proteins wie oben für Aggrekan-IGD-His beschrieben ausgeführt.
B) Isolierung von Strukturvarianten von Aggrekan-IGD
Aggrekan-IGD-His wurde in einer Konzentration von 1,5 mg/ml auf eine Gelfiltrationsäule HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade aufgetragen. Die Säule war mit 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 equilibriert. Als Molekulargewichtsmarker dienten Dextranblau 2000, Rinderserumalbumin (BSA) und α-Chymotrypsin. Bei der Elution von Aggrekan-IGD-His wurden 2 Hauptfraktionen erhalten (1), die als Aggrekan-IGD-H1 und Aggrekan-IGD-H2 bezeichnet wurden. Aggrekan-IGD-H1 eluierte unmittelbar nach dem Ausschlußvolumen der Säule. Aggrekan-IGD-H2 eluierte zwischen den Elutionsgipfeln von BSA (M_r 66 kDa) und α-Chymotrypsin (M_r 25 kDa).
C) Proteolyse von Aggrekan-IGD durch Aggrekanasen
Aggrekan-IGD-His und die 2 Strukturvarianten Aggrekan-IGD-H1 und Aggrekan-IGD-H2 wurden in einer Konzentration von jeweils 10 μM mit 0,1 μM rekombinanter Aggrekanase 1 (ADAMTS4, Δ580–837) bei 37°C in 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 inkubiert. Nach festgelegten Zeitintervallen wurden aus den Inkubationsansätzen Proben entnommen und mittels SDS-PAGE analysiert (2). Im Verlauf von 5 h wurden Aggrekan-IGD und die 2 Strukturvarianten nahezu vollständig hydrolysiert. Bei der Proteolyse entstand ein Spaltprodukt, das in der Elektrophorese ein M_r von ca 13 kDa aufwies. Als N-terminale Sequenz des Spaltproduktes wurde die Sequenz ARGSVIL ermittelt. 2 belegt, daß die 2 Strukturvarianten keine oder nur geringe Unterschiede in ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit und ihrer Proteolyse durch Aggrekanase 1 aufweisen. Eine Analyse der Proteolyse von Aggrekanasesubstrat mit modifiziertem Spaltort, Aggrekan-IGD-3E, ergab eine beschleunigte Hydrolyse dieses Substrates durch Aggrekanase 1 (3). Bei einer Aggrekanasekonzentration von 0,1 μM wurden 10 μM Aggrekan-IGD-3E ca. 8-fach schneller hydrolysiert als 10 μM Aggrekan-IGD-H2 (und Aggrekan-IGD-H1, nicht gezeigt). Das Experiment belegt, daß Aggrekan-IGD-3E für den Nachweis geringer Aggrekanase-Aktivität besser geeignet ist als Aggrekan-IGD-His.
D) Western Blot von Aggrekanasesubstrat und ARGSVIL-Peptid mit Neoepitop-Antikörper N38
Mit Standardmethoden wurde ein monoklonaler Antikörper gegen die Peptidsequenz ARGSVIL gewonnen. Der Antikörper mit der Bezeichnung N38 wurde für Western Blots von Spaltprodukten von Aggrekan-IGD eingesetzt.
Aliquote von Aggrekan-IGD-His (100 ng) und Spaltprodukten (100 ng, 25 ng) wurden in der SDS-PAGE getrennt und anschließend auf Nitrozellulose übertragen. Die Nitrozellulose wurde in einem ersten Schritt entweder mit Anti-His-"tag"-Antikörper (Penta-His, Qiagen, Verdünnung 1/2000) oder mit Neoepitop-Antikörper N38 (1 μg/ml) und in einem zweiten Schritt mit mit einem Peroxidase-Konjugat von Ziege-Anti-Maus-IgG (Dianova, Verdünnung 1:3000) inkubiert. Der Nachweis der Peroxidasereaktion wurde mit dem ECL-System von Amersham Biosciences geführt.
Die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse (4) belegten, daß der Neoepitop-Antikörper N38 eine hohe Spezifität für das Aggrekanase-Spaltprodukt mit der N-terminalen Sequenz ARGSVIL aufweist. Anti-His-"tag"-Antikörper reagieren dagegen sowohl mit dem ungespaltenen Substrat als auch mit dem Spaltprodukt.
E) ELISA für Aggrekan-IGD und Spaltprodukte
Neben Neoepitop-Antikörper N38 wurde ein zweiter monoklonaler Antikörper gewonnen, der gegen die C-terminal von dem Aggrekanasespaltort gelegene Aggrekansequenz gerichtet ist. Der Antikörper erhielt die Bezeichnung T42. Antikörper N38 und Antikörper T42 wurden als Fang- und Detektionsantikörper in einem ELISA zur Bestimmung von Aggrekan-IGD und von Spaltprodukten der Substrate eingesetzt. Der ELISA wurde nach folgender Methode ausgeführt:
Antikörper N38 wurde mit Beschichtungspuffer (15 mM Na₂CO₃, 35 mM NaHCO₃, pH 9,6) auf eine Konzentration von 4 μg/ml verdünnt. Je 100 μl Antikörperlösung wurden in die Vertiefungen einer Mikrotestplatte eingetragen. Die Platte wurde 16–18 h bei 4°C gehalten. Alle weiteren Schritte wurden bei Raumtemperatur ausgeführt. Die Antikörperlösung wurde ausgeschlagen und durch 200 μl Blockierungslösung (1% BSA, 150 mM NaCl, 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 7,2) ersetzt. Die Mikroplatte wurde 1 h auf einem Schüttler bewegt und anschließend 2 mal mit Waschpuffer (0,05% Tween 20, 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 7,2) gewaschen. In die Vertiefungen wurden je 100 μl Aggrekanasesubstrat oder Spaltprodukt des Substrates eingetragen. Nach 1,5 h Inkubation auf einem Schüttler wurde die Platte 3 mal mit Waschpuffer gewaschen. Danach wurden je 100 μl eines Konjugates von Antikörper T42 mit Peroxidase eingetragen. Nach weiteren 1,5 h Schütteln wurde die Platte 5 mal mit Waschpuffer gewaschen. Die Peroxidasereaktion wurde 30 min mit 100 μl TMB/H₂O₂-Lösung (TMB: 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) ausgeführt. Die Reaktion wurde mit 100 μl 0,25 M Schwefelsäure gestoppt. Anschließend wurde die Absorption bei 450 nm gemessen.
Die Ergebnisse des ELISA für die Strukturvarianten Aggrekan-IGD-H1 und Aggrekan-IGD-H2 sowie die ARGSVIL-Peptide dieser Substrate sind in den 5 und 6 dargestellt.
Die Abbildungen belegen die unterschiedliche Detektion von Substraten und Spaltprodukten in dem ELISA mit Antikörpern N38 und T42. Während der ELISA für Aggrekan-IGD-H1 im Konzentrationsbereich 100–1000 nM gut messbare Absorptionswerte anzeigt, wird für Aggrekan-IGD-H2 in dem gleichen Konzentrationsbereich nur sehr geringe Absorption gemessen. Die Spaltprodukte beider Substrate werden bereits in Konzentrationen unter 10 nM mit hohen Absorptionswerten angezeigt, wobei die Nachweisempfindlichkeit für Spaltprodukt aus Aggrekan-IGD-H1 (ARGSVIL-Peptid-1) wiederum bedeutend höher ist, als für Spaltprodukt aus Aggrekan-IGD-H2 (ARGSVIL-Peptid-2).
Für die Messung von Spaltprodukten in Proteolyseansätzen ist das Verhältnis der Absorptionen für die Spaltprodukte einerseits und die ungespaltenen Substrate Aggrekan-IGD andererseits wesentlich. Der ELISA liefert vergleichbare Absorptionswerte für das Spaltprodukt ARGSVIL-Peptid-1 und das Substrat Aggrekan-IGD-H1, wenn die Konzentration des Spaltproduktes 1/1000 der Substratkonzentration ist. Für das Spaltprodukt ARGSVIL-Peptid-2 und das Substrat Aggrekan-IGD-H2 beträgt das Verhältnis 1/10 000.
F) Messung von Aggrekanaseaktivität
Die Messung von Aggrekanase-Aktivität wurde in zwei aufeinanderfolgenden Teilschritten ausgeführt (7). In dem 1. Teilschritt wurde Aggrekan-IGD durch Aggrekanase hydrolysiert. Die Proteolyse wurde in 100 μl Ansätzen folgender Zusammensetzung durchgeführt: 0,1 μM Aggrekan-IGD-H2, 0,4 mM Pefabloc, 1 μM Pepstatin, 1 μM Leupeptin, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 10 μM ZnCl₂, 0,05% Brij 35, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0–1,5 nM ADAMTS4,Δ580-837. Alle Komponenten der Ansätze mit Ausnahme von ADAMTS4 wurden gemischt und 5 min bei 37°C vorinkubiert. Die Aggrekanasereaktion wurde anschließend durch Zugabe verschiedener Konzentrationen ADAMTS4 gestartet und nach 15 min bei 37°C mit 150 μl 10 mM EDTA, 1% BSA, 150 mM NaCl, 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 7,2 gestoppt.
In dem 2. Teilschritt wurde das in der Proteolysereaktion gebildete Spaltprodukt ARGSVIL-Peptid-H2 mittels Sandwich-ELISA (siehe Punkt E) bestimmt. Die Ergebnisse des ELISA sind in 8 dargestellt. Die gezeigte Abhängigkeit der Absorption bei 450 nm von der ADAMTS4-Konzentration in den Proteolyseansätzen ist eine Standardkurve für die Messung unbekannter Aggrekanase-Aktivität und für Untersuchungen zum Einfluß von Inhibitoren auf Aggrekanasen. Aus der Standardkurve für ADAMTS4 (8) und der Standardkurve für ARGSVIL-Peptid-2 (6) wurde eine spezifische Aktivität von 0.7 nM ARGSVIL-Peptide-2/min × nM ADAMTS4 für Aggrekanase berechnet.
Wenn anstelle des Substrates Aggrekan-IGD-H2 das Substrat Aggrekan-IGD-3E für die Messung von Aggrekanase-Aktivität verwendet wird, können unter den gleichen Bedingungen bis zu 10-fach geringere Aktivitäten bzw. Konzentrationen von Aggrekanase ermittelt werden (Die experimentellen Daten sind nicht dargestellt).
G) Einfluß von Serum und Synovialflüssigkeit auf Aggrekanase-Aktivität
Um den Einfluß von Serum und Gelenkflüssigkeit auf die Aktivität von Aggrekanasen zu bestimmen, wurde zunächst der Einfluß der Körperflüssigkeiten auf die Absorptionsmessung des ELISA für ARGSVIL-Peptid geprüft. Dabei wurde festgestellt, daß in Gegenwart von 10% (V/V) Serum oder Gelenkflüssigkeit die Absorptionswerte nur gering (< 20%) abnehmen. Serum und Gelenkflüssigkeit üben dagegen bereits in viel geringeren Konzentrationen eine starke Hemmwirkung auf Aggrekanasen aus.
Die Bestimmung der Aggrekanase-Aktivität wurde wie in Punkt F beschrieben ausgeführt, wobei die Konzentration von ADAMTS4 in allen Ansätzen 1 nM betrug. Die Konzentrationen von Serum und Synovialflüssigkeit variierten von 0,0013–10% (V/V).
9 belegt, daß 1% Serum die Aktivität von 1 nM ADAMTS4 bereits nahezu vollständig inhibiert. Die Hemmung durch Synovialflüssigkeit ist geringer. Erst in Gegenwart von 4% Synovialflüssigkeit sinkt die Aggrekanase-Aktivität unter 10% ihres Ausgangswertes.
H) Messung von Aggrekanase-Aktivität in Gelenkflüssigkeit von Patienten mit Osteoarthrose
Obwohl die Aktivität von Aggrekanase in Gelenkflüssigkeit durch die vorhandenen Inhibitoren gehemmt wird, kann Aggrekanase-Aktivität mit Hilfe des Substrates Aggrekan-IGD-3E in Gelenkflüssigkeit von Patienten mit Osteoarthrose nachgewiesen werden (Tabelle 1).
Für die Messung der Aggrekanase-Aktivität in Gelenkflüssigkeit wurden die Substrate Aggrekan-IGD-H1 (0,1 μM), Aggrekan-IGD-H2 (0,1 μM) und Aggrekan-IGD-3E (0,25 μM) in Abwesenheit und in Gegenwart von 5% Gelenkflüssigkeit eines Patienten mit Osteoarthrose 15 und 30 min bei 37°C inkubiert. Die übrigen Bedingungen der Messungen waren wie in Punkt F beschrieben. Aus den Angaben in Tabelle 1 ist ersichtlich, daß in Gegenwart von Gelenkflüssigkeit aus dem Substrat Aggrekan-IGD-3E genügend ARGSVIL-Peptid für ELISA-Messungen freigesetzt wurde. Der ELISA zeigte auch geringe Absorptionen bei Verwendung des Substrates Aggrekan-IGD-H1 an. Das Substrat Aggrekan-IGD-H2 erwies sich dagegen für Messungen von Aggrekanase-Aktivität in Gelenkflüssigkeit nicht geeignet.
Tabelle 1: Messung von Aggrekanase-Aktivität in Gelenkflüssigkeit eines Patienten mit Osteoarthrose
Literatur

1. Knudsen, C. B. et al. (2001) Seminars Cell & Developm. Biol. 12, 69–78
2. Watanabe, H. et. al. (1998) J. Biochem. 124, 687–693
3. Matthews, R. T. (2002) J. Neuroscience 22, 7536–7547
4. Hardingham, T. E. und Fosang, A. J. (1992) FASEB J. 6, 861–870
5. Tortorella, M. D. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 18566–18573
6. Tortorella, M. D. et al. (2002) Matrix Biology 21, 499–511
7. Lohmander, L. S. et al. (1993) Arthritis Rheumat. 36, 1214–1222
8. Malfait, A. -M. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 22201–22208
9. Rodriguez-Manzaneque, J. C. et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Communs. 293, 501–508
10. Gao, G. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 11034–11041
11. Hughes, C. E. et. al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 20269–20274
12. Bartnik, E. et al. (2001) US Patent 6,180,334
13. Miller, J. A. et al. (2003) Analyt. Biochem. 314, 260–265

Legende zu den Abbildungen
1: Gelfiltration von Aggrekan-IGD-His
Auf eine Säule HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade (Amersham Biosciences) wurden 3 mg Aggrekan-IGD-His aufgetragen und eluiert. Weitere Angaben im Text.
2: Proteolyse von Strukturvarianten von Aggrekan-IGD-His in Gegenwart von Aggrekanase 1
Aggrekan-IGD-H1 (10 μM) und Aggrekan-IGD-H2 (10 μM) wurden mit 0,1 μM rekombinanter Aggrekanase 1 (ADAMTS4, Δ580-837) bei 37°C in 150 mM NaCl, 5 CaCl₂, 50 mM Tris-HCL, pH 7,5, inkubiert. Vor Beginn der Inkubation und nach 0,5, 1,5 und 5 h Inkubation wurden gleiche Aliquote aus den Inkubationsansätzen entnommen und mittels SDS-PAGE analysiert.

Bahnen 1–4: Proteolyse von Aggrekan-IGD-H1, Bahnen 5–8: Proteolyse von Aggrekan-IGD-H2

3: Proteolyse von Aggrekan-IGD-H1 und Aggrekan-IGD-3E durch Aggrekanase 1
Die Inkubationen von 10 μM Aggrekan-IGD-3E und 10 μM Aggrekan-IGD-H2 mit 0,1 μM ADAMTS4, Δ580-837 wurden wie in der Legende von 2 beschrieben ausgeführt.

Bahnen 1–4: Proteolyse von Aggrekan-IGD-H1
Bahnen 5–8: Proteolyse von Aggrekan-IGD-3E

4: Western Blot von Aggrekanasesubstrat Aggrekan-IGD-His und Spaltprodukten

Bahnen 1: 100 ng Aggrekan-IGD-His, Bahnen 2: 100 ng ARGSVIL-Peptid,
Bahnen 3: 25 ng ARGSVIL-Peptid

Weitere experimentelle Details sind im Text beschrieben.
5: ELISA für Strukturvarianten Aggrekan-IGD-H1 und Aggrekan-IGD-H2
Die Ausführung der Experimente ist im Text beschrieben.
6: ELISA für Spaltprodukte aus Strukturvarianten Aggrekan-IGD-H1 (ARGSVIL-Peptid-H1) und Aggrekan-IGD-H2 (ARGSVIL-Peptid-H2).
Die Spaltprodukte wurden durch vollständige Proteolyse der Substrate Aggrekan- IGD-H1 und -H2 mit ADAMTS4, Δ580-837 erhalten.
7: Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Aggrekanase-Aktivitätstestes
8: ELISA für Proteolyseansätze von Substrat Aggrekan-IGD-H2 mit Aggrekanase 1
0,1 μM Aggrekan-IGD-H2 wurden 15 min bei 37°C mit verschiedenen Konzentrationen rekombinanter ADAMTS4,Δ580-837 inkubiert. Die Reaktionsansätze wurden anschließend 2,5-fach mit EDTA-haltigem Puffer verdünnt und in einem ELISA mit Antikörpern N38 und T42 analysiert.
Weitere Angaben zu Substratproteolyse und ELISA werden im Text gemacht.
9: Hemmung von Aggrekanase-Aktivität durch Serum und Synovialflüssigkeit
0,1 μM Aggrekan-IGD-H2 wurden mit 1 nM ADAMTS4, Δ580-837 in Abwesenheit und in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Serum oder Synovialflüssigkeit inkubiert. Die Reaktionsansätze wurden anschließend 2,5 fach mit EDTA-haltigem Puffer verdünnt und in einem ELISA mit Antikörpern N38 und T42 analysiert.

Claims

Verfahren zur Bestimmung von Aggrekanase-Aktivität durch Inkubation von Fragmenten von Aggrekan-Bruchstücken (IGD) des Menschen und verschiedener Tierspezies mit Aggrekanase enthaltenden Lösungen, wie Zellkulturüberständen, Zellextrakten, Körperflüssigkeiten und Gewebeextrakten, Bindung des entstandenen Spaltstücks ARGSVIL-Peptid an einen an eine feste Phase gebundenen Antikörper und nachfolgender quantitativer Bestimmung mit einem 2. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass Varianten oder Mutanten des Aggrekan-IGD als Substrat eingesetzt werden und die Bindung und die Bestimmung mit monoklonalen Antikörpern erfolgen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Struktur-Variante 1 von Aggrekan-IGD (mit einem geringen Verteilungskoeffizienten in der Gelfiltration) zur Bestimmung eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Struktur-Variante 2 von Aggrekan-IGD (mit einem höheren Verteilungskoeffizienten in der Gelfiltration) zur Bestimmung eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein an den Positionen P7–P1–P1'–P7' der Aggrekanasespaltstelle durch Mutation verändertes Aggrekan-IGD eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein an den Positionen P7–P1 der Aggrekanasespaltstelle durch Mutation verändertes Aggrekan-IGD eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein an Position P2 der Aggrekanasespaltstelle durch Mutation (Gly → Glu) verändertes Aggrekan-IGD eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mutante von Aggrekan-IGD eingesetzt wird, welche die Aminosäuresequenz TSFKEEE in den Positionen P7–P1 des Aggrekanasespaltortes enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Aggrekan-IGD mit verkürzten N- und/oder C-Termini eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Aggrekan-IGD mit zusätzlichen Peptidsequenzen eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Aggrekan-IGD, in welchem der Lysinrest in Position P10' des Aggrekanasespaltortes gegen einen anderen Aminosäurerest ausgetauscht ist, eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Aggrekan-IGD mit modifizierten Aminosäuregruppen eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Aggrekan-IGD mit einem oder mehreren Cys-Resten eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Aggrekan-IGD mit modifizierten Cys-Resten eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung der Varianten und Mutanten von Aggrekan-IGD mit Fluorophoren, Fluoreszenzquenchgruppen oder Biotin durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein monoklonaler Maus-Antikörper, vorzugsweise N38, zur Bindung der N-terminalen Aminosäuresequenz ARGSVILT eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der monoklonale Antikörper N38 DSM ACC2596 eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein monoklonaler Anti-Aggrekan-Antikörper zur quantitativen Bestimmung des an die feste Phase gebundenen Spaltstücks eingesetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der monoklonale Maus-Antikörper T42 eingesetzt wird.
Monoklonaler Antikörper N38 DSM ACC2596.
Strukturvariante des Aggrekan-IGD mit einem geringen Verteilungskoeffizienten in der Gelfiltration.
Strukturvariante des Aggrekan-IGD mit einem höheren Verteilungskoeffizienten in der Gelfiltration.
Aggrekan-IGD mit Mutationen in den Positionen P7–P1–P1'–P7'
Aggrekan-IGD mit Mutationen in den Positionen P7–P1
Aggrekan-IGD mit der Mutation in P2 (Gly → Glu)
Aggrekan-IGD mit der Mutation in P7–P1: TSFKEEE
Testkit zur Bestimmung der Aggrekanase-Aktivität, umfassend – Aggrekan-IGD (Strukturvarianten, Mutanten, Aggrekan-IGD mit modifizierten Aminosäureresten) als Aggrekanasesubstrat – Aggrekanase (ADAMTS1, ADAMTS4, ADAMTS5) als Enzymstandard – ARGSVIL-Peptid als Standard für ein Spaltprodukt der Aggrekanasereaktion – monoklonaler Antikörper N38 gegen die N-terminale Sequenz ARGSVIL – monoklonaler Antikörper T42 gegen die Aggrekansequenz, die C-terminal von dem Aggrekanasespaltort gelegen ist – Puffer, Proteaseinhibitoren, Detektionsenzyme wie z. B. Peroxidase, alkalische Phosphatase und ihre Substrate
Messung von Aggrekanase-Aktivität in Zellkulturüberständen, Zellextrakten, Körperflüssigkeiten und Gewebeextrakten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Entfernung von Aggrekanaseinhibitoren erfolgt.
Messung von Aggrekanase-Aktivität in Zellkulturüberständen, Zellextrakten, Körperflüssigkeiten und Gewebeextrakten entsprechend Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Aggrekanase aus den genannten Medien abgetrennt und die Aktivität der abgetrennten Aggrekanase ermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Screening und Charakterisierung von Aggrekanaseinhibitoren mit für die Therapie von Gelenkerkrankungen erfolgt.
Nutzung von Aggrekanase-IGD nach Ansprüchen 20–25 und des monoklonalen Antikörpers DSM ACC2596 nach Anspruch 19 für die Diagnostik von Gelenkerkrankungen und die Charakterisierung von Tiermodellen für Gelenkerkrankungen.