PT785274E

PT785274E - Substrato recombinante artificial (ragg 1) e agrecano nativo para estudar a actividade proteolitica de `agrecanase´ em sistemas de cultura de celulas

Info

Publication number: PT785274E
Application number: PT96120949T
Authority: PT
Inventors: Eckart Bartnik; Bernd Eidenmueller; Frank Buettner; Bruce Caterson; Clare Hughes
Original assignee: Aventis Pharma Gmbh
Priority date: 1996-01-18
Filing date: 1996-12-27
Publication date: 2001-01-31
Also published as: ATE196652T1; DE69610483T2; GR3034649T3; JPH09191889A; EP0785274A1; US5872209A; CA2195385C; CA2195385A1; US6180334B1; DE69610483D1; EP0785274B1; ES2150064T3; AU1019997A; AU713828B2; DK0785274T3; JP3973253B2

Description

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DESCRIÇÃO "SUBSTRATO RECOMBINANTE ARTIFICIAL (rAGG 1) E AGRECANO NATIVO PARA ESTUDAR A ACTIVIDADE PROTEOLÍTICA DE 'AGRECANASE' EM SISTEMAS DE CULTURA DE CÉLULAS " A presente invenção refere-se a um substrato recombinante artificial (rAGG 1) e agrecano nativo para o estudo da actividade proteolitica de "Agrecanase" em sistemas de cultura de células.

Os mecanismos de degradação de proteoglicano em tecido conjuntivo são complexos e envolvem múltiplos agentes e vias. Em estudos de investigação do catabolismo de agrecano, os sistemas experimentais utilizados incluíram culturas em monocamada de linhas celulares de condrócitos estabelecidas de condrócitos primários (Hughes CE, Caterson B, Fosang AJ, Roughley PJ, Mort JS. , Biochem. J. 1995; 305:799-804; Lark MW, Gordy JT, Weidner JR, et al., J. Biol. Chem. 1995; 270(6):2550-2556) e culturas de explantes utilizando cartilagem de uma variedade de sítios anatómicos e espécies animais (Flannery CR, Lark MW, Sandy JD, J. Biol. Chem. 1992; 267:1008-1014; Sandy JD, Brown HL, Lowther DA, Biochem Biophys Acta 1978;543:536-44; Tyler JA, Biochem. J. 1985; 225:493-507). A adição de citoquinas tais como IL-1 e TNF foram utilizadas extensivamente como agentes que promovem a degradação da matriz extracelular (Hughes CE et al., 1995; Morales TI, Roberts AB, Arch Biochem Biophys 1992; 293(1):79-84,-Fosang AJ, Tyler JA, Hardingham TE, Matrix 1991; 11:17-24). Em particular, estas duas citoquinas demonstraram ter como alvo o catabolismo de agrecano. Vários estudos levaram agora a um número de descobertas importantes que definiram sítios de clivagem específicos ao longo do núcleo da proteína de agrecano (Ilic MZ, Handley CJ, Robinson HC, Mok MT, Arch Biochem Biophys 1992; 294(1):115-22,- Loulakis P., Shrikhande A, Davis G, 1

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Maniglia CA, Putative site(s) of enzymic cleavage. Biochem J 1992; 284:589-593; Sandy JD, Neame PJ, Boynton RE, Flannary CR, J. Biol. Chem. 1991; 266:8683-8685). No total parecem existir pelo menos sete sítios de clivagem e a análise da sequência de aminoácidos dos produtos de degradação do proteoglicano de cartilagem definiu dois sítios principais de clivagem proteolítica em agrecano, que ocorrem dentro do domínio interglobular (IGD) entre os resíduos de aminoácidos Asn341-Phe342 e Glu373-Ala374 (enumeração da sequência humana) (Doege KJ, Sasaki M, Kimura T, Yamada Y, J. Biol. Chem. 1991; 266:894-902). Um sítio de clivagem anterior gera um fragmento catabólico do terminal C (...DIPEN) consistindo no domínio G1 de 50-60 kDa que permanece no tecido complexado com hialuronato (Flannery CR, et al., 1992). Em estudos recentes Fosang et al. (Fosang AJ, Last K, Brown L, Jackson DC, Gardiner P, Trans. Orthop: Res. Soc. 1995; 20:122) também identificaram fragmentos do terminal N (FFG...) deste sítio de clivagem em fluidos sinoviais de doentes diagnosticados com uma variedade de diferentes artrites. De modo semelhante, Witt et al. (Witt M, Fosang AJ, Hughes CE, Hardingham TE, Trans. Orthop. Res. Soc. 1995;20:122) verificaram que estes fragmentos dos terminais N contendo glicosaminoglicano em amostras do meio de culturas controlo e IL-1 estimulavam culturas de explante porcino. Este último sítio de clivagem produz fragmentos do terminal N contendo glicosaminoglicano (ARG...) que aparecem como os principais produtos de degradação de agrecano isolados de fluido sinovial de doentes com artrite (Lohmander LS, Neame PJ, Sandy JD, Arth. Rheum. 1993;36:1214-1222) e são também encontrados em meios de culturas de explante de cartilagem tratados com IL-1 ou ácido retinóico (Hughes CE et al., 1995;Sandy JD, et al., 1991). W093/22429 revela novos materiais e métodos para a detecção, tratamento e prevenção de osteoartrite humana. Especificamente, é identificado o sítio de clivagem onde a agrecanase cliva o agrecano. A identificação deste sítio, bem como a natureza da enzima, facilita os 2 r~ ^ tratamentos específicos que bloqueiam ou diminuem a actividade da enzima. Outro aspecto de W093/22429 refere-se a métodos para detectar evidência de osteoartrite. Um estudo recente (Lark MW, et al., 1995) identificou o fragmento do terminal C (...EGE) em células de condrossarcoma de rato tratadas com ácido retinóico. A actividade proteolítica responsável por esta clivagem Glu373-Ala374 não foi identificada, mas parece ter especificidade para ligações peptídicas Glu-Xaa, em que Xaa é Ala, Gly ou Leu. Esta actividade, ainda não caracterizada, tem sido denominada 'agrecanase (Fosang AJ, Neame PJ, Las K, Hardingham TE-, Murphy G, Hamilton JA, J. Biol. Chem. 1991;267:19470-19474)'. Embora os sítios de clivagem dentro da molécula tenham sido bem caracterizados, muitos dos agentes responsáveis por gerar o maior número de diferentes produtos de degradação de proteoglicano permanecem não identificados. Os sistemas de cultura têm sido manipulados com uma variedade de agentes que aumentam o catabolismo de proteoglicano, esforços para descobrir o(s) agente (s) responsáveis pela sua quebra. Contudo, estes estudos não têm sido bem sucedidos na definição de qualquer agente responsável pela degradação de agrecano (Flannery CR, Sandy JD, Trans. Orthop. Res. Soc. 1993). Contudo, dados experimentais utilizando agrecano purificado e agrecano modificado como um substrato para preparações de enzima purificada produziram alguma informação sobre os sítios específicos de clivagem destas enzimas, mas este trabalho in vitro não ajudou directamente no esclarecimento do mecanismo ou da identidade dos agentes envolvidos na degradação de agrecano na cartilagem (Fosang AJ, et al. , 1992 ; Fosang AJ, Neame PJ, Hardingham TE , Murphy G, Hamilton JA, J. Biol. Chem. 1991;266:15579- •15582; Fosang AJ, Last K, Neame PJ, et al.,

Biochem. J. 1994; 304:347-351).

Em estudos prévios (Hughes CE, et al., 1995; Hughes CE, Caterson B, White RJ, Roughley PJ, Mort JS, J. Biol. Chem. 3

r 1992;267:16011-16014) desenvolvemos um número de anticorpos monoclonais específicos para os produtos (catabolitos de agregado de proteoglicano) que foram clivados por proteinases específicas. Estes anticorpos provaram ser úteis como ferramentas no estudo dos mecanismos de quebra de proteoglicano em sistemas de cultura de explante de cartilagem. O objectivo deste trabalho corrente foi o de refinar mais sistemas de cultura que ajudariam a facilitar a identificação dos agentes responsáveis pela clivagem de agrecano no sitio 374ARGSVI... no IGD de agrecano. Neste estudo, descrevemos o desenvolvimento de um sistema de cultura in vitro que nos permitiu estudar a actividade de 'agrecanase' contra um substrato recombinante artificial num sistema de cultura que não contém proteoglicanos endógenos inerentes e outros componentes extracelulares. A utilização de anticorpos com neoepitopos previamente caracterizados contra sítios chave de clivagem no IGD de agrecano facilitou a monitorização de produtos gerados através da acção proteolítica de 'agrecanase' no sistema.

Assim, uma realização da presente invenção é um substrato recombinante para sistemas de teste da Agrecanase in vitro, preferencialmente um substrato recombinante que contém um grupo de elementos estruturais compreendendo a) a sequência sinal de CD5, b) o epitopo-FLAG para detecção de Ml por anticorpo monoclonal, c) o domínio interglobular de agrecano humano, d) a região de charneira de IgGl humano, e) a região CH2 de IgGl humano e f) a região CH3 de IgGl humano.

Uma realização preferida da presente invenção é um substrato recombinante que possui a sequência de aminoácidos da Tabela 1 4

U ou partes desta, ou que possui a sequência de aminoamidas da Tabela 1 ou partes desta, em que o aminoácido 34 é mutado para Ala.

Outra realização da presente invenção é um ADN, codificando um substrato recombinante como acima descrito, preferencialmente um ADN que possui a sequência nucleotidica dos nucleótidos 2350 a 4114 da Tabela 2 ou partes desta, que possui a sequência nucleotidica dos nucleótidos 2350 a 4114 da Tabela 2 ou partes desta, em que o nucleótido 2448 é mutado para C, o nucleótido 2450 é mutado para C e o nucleótido 2451 é mutado para A; ou que híbrida em condições de severidade com o ADN apresentado na Tabela 2. A hibridação em condições de severidade de acordo com a invenção significa hibridação a uma temperatura de 20 a 25°C abaixo do ponto de fusão da sonda marcada numa solução de hibridação contendo 6 x SSC (ou alternativamente 6 x SSPE) , SDS a 0,5% e 100 pg/ml de ADN de esperma de salmão fragmentado, desnaturado (Sambrook et al.r "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Segunda Edição, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Volume 2, capítulo 9, páginas 9.52-9.55).

Outras realizações da presente invenção são um vectór contendo um fragmento de ADN com a sequência nucleotidica como acima descrita e uma célula hospedeira contendo o referido vector.

Outra realização da presente invenção é a utilização de um substrato recombinante como acima descrito num sistema de cultura celular para estudar a actividade de agrecanase, preferencialmente em que o referido sistema de cultura celular não possui proteoglicanos endógenos inerentes nem outros componentes extracelulares. 5

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Outra realização da presente invenção é a utilização de um substrato recombinante, como acima descrito, em que o estudo da actividade de agrecanase é realizado por detecção de produtos de clivagem através de anticorpos.

Outra realização da presente invenção é a utilização de um substrato recombinante, como acima descrito, para a detecção de novos sítios de clivagem enzimática no referido substrato.

Realizações adicionais da presente invenção são a utilização de um substrato recombinante, como acima descrito, para a purificação de agrecanase por meio de cromatografia de afinidade ou num sistema de clonagem funcional para o isolamento de ADNc de agrecanase.

Ainda outra realização da presente invenção é um método para monitorizar o início da progressão de osteoartrite, compreendendo o referido método ensaiar uma amostra de fluido biológico de um humano suspeito ou conhecido como sofrendo de osteoartrite, para a presença de agrecanase por meio do substrato recombinante, como acima descrito, em que o referido fluido biológico é seleccionado do grupo consistindo em fluido sinovial, urina, soro e fluido da linfa.

Uma realização adicional da presente invenção é um método, como acima descrito, em que o referido método é utilizado para seguir a progressão da doença para determinar a eficiência de um tratamento.

Outra realização da presente invenção é a utilização de um substrato recombinante, como acima descrito, para a pesquisa de um inibidor de agrecanase. 6

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Outra realização da presente invenção é um dispositivo de diagnóstico contendo um substrato recombinante, como acima descrito e anticorpos para a detecção de produtos de clivagem de agrecanase.

Em seguida a invenção é descrita em particular através dos exemplos, tabelas e figuras:

Tab. 1 Sequência de aminoácidos de rAGG-1

Aminoácidos 1-24: Sequência sinal de CD5

Aminoácidos 25-32: Sequência-FLAG

Aminoácidos 33-160: Domínio interglobular de agrecano

Humano

Aminoácidos 161-164:Sequência de espaçador Aminoácidos 165-179:Região de charneira de IgGl humano Aminoácidos 180-289:Região CH2 de IgGl humano Aminoácidos 290-396:Região CH3 de IgGl humano

Tab. 2 Sequência de nucleótidos do vector pCDM8-rAGG-1 para expressão eucariótica de rAGG-1

Fig. 1 Estrutura de rAGG-1 rAGG-1 consiste em: Sequência sinal de CD5: SS; epitopo-FLAG para detecção de Ml por anticorpo molecular: FLAG; domínio interglobular de agrecano humano: IGD; região de charneira de IgGl humano: H; região CH2 de IgGl humano: CH2; região CH3 de IgGl humano: CH3.

Fig. 2 Detecção de expressão de rAGG-1 em células COS com anticorpo monoclonal Ml.

Fig. 3 SDS-PAGE de rAGG-1 purificado. Pista A: Coloração com Coomassie; pista B: detecção por transferência de 7

Western com anticorpo monoclonal Ml e anti-soro anti-

IgG humano, pista C.

Fig. 4 Reactividade a BC-3 de rAGG-1 em meio de cultura de células de células de condrossarcoma de rato.

Pista A: rAGG-1 de uma cultura de células de condrossarcoma de rato não estimuladas não é detectado com anticorpo monoclonal BC-3 numa transferência de Western, enquanto que rAGG-1 de uma cultura de células estimuladas com ácido retinóico é detectado: pista B. Pista C: Uma transferência semelhante, após re- pesquisa com anticorpo monoclonal Ml. 0 fragmento reactivo BC-3 é aproximadamente 5,6 kD mais pequeno do que a banda de 72 kD original, indicando a clivagem de rAGG-1 no sitio de "Agrecanase".

Fig. 5 Estabelecimento um possível ensaio de pesquisa num formato de 96 poços (com tampa) para detectar actividade de "Agrecanase".

Materiais: O segundo anticorpo conjugado com fosfatase alcalina e o substrato utilizado em análise de transferência de Western foram obtidos de Promega como Protoblot Western blot AP system (número de catálogo W3920) . A nitrocelulose (tamanho do poro 0,2 μπι) foi obtida de Scleicher and Schuell. O anticorpo monoclonal Ml e o gel de afinidade Anti-FLAG Ml foram ambos obtidos da Kodak. O monoclonal Ig anti-humano foi obtido de Capell, Durham. Os anticorpos monoclonais BC-3, 2-B-6 e 3-B-3 foram preparados como fluido ascítico (Hughes CE, et al.r 1995). A linha celular Rx foi gentilmente cedida pelo Dr. Jim Kimura, Bone Research Center, Henry Ford Hospital, Detroit, MI.

Exemplo 1: Preparação da construção genética rAGGl 8 A construção genética para rAGGl codifica para a sequência sinal da glicoproteína de linfócito Tl/Leu-1 (CD5), o epitopo FLAG™ de oito aminoácidos de comprimento (Prickett KS, Amberg DC, Hopp TP, BioTechniques 1989; 7:580-589), o domínio interglobular de 127 aminoácidos de comprimento do agrecano de proteoglicano agregador da cartilagem grande humana (350t - 476G) (Doege KJ, et al., 1991), um espaçador de glicina de dois aminoácidos de comprimento e a região de charneira de IgGl humana, regiões constantes CH2 e CH3, originando assim uma proteína de fusão com uma massa molecular esperada de 41,059 d. Sequências de ADNc de agrecano que codificam o domínio interglobular foram amplificadas pela reacção da polimerase em cadeia após transcriptase reversa (RT-PCR) (Beverly SM, Current Protocols in Molecular Biology. Canadá: John Wiley and Sons, 1992) com oligonucleótidos sintéticos complementares a sequências que flanqueiam esta região e ARN total da cartilagem do joelho humana. O ARN total foi extraído a partir de tecido de cartilagem humana, obtidos a partir de cirurgia de substituição da articulação, de acordo com Adams et al (Adams ME, Huang DQ, Yao LY, Sandell LJ, Anal. Biochemistry 1992; 202:89-95).

Os oligonucleótidos foram construídos de modo a conter informação de sequência adicional em relação ao epitopo FLAG e ao espaçador g e para permitir a criação de sítios de clivagem por enzimas de restrição nas extremidades 5' e 3' dos segmentos de ADNc amplificados para facilitar inserção subsequente no vector de expressão CD5-IgGl, modificado de modo a conter o sítio Nhel na extremidade 3' (Aruffo A, Stamenkovic I, Melcick M, Underhill CB, Seed B, Cell 1990; 61:1303-1313). O iniciador que codifica o epitopo FLAG e o início do terminal amino do domínio interglobular e incluindo um sítio Nhel foi sintetizado com a seguinte sequência: —CGC GGG GCT AGC CGA CTA CAA GGA CGA CGA TGA CAA GAC AGG TGA AGA CTT TGT GGA C (SEQ ID NO: 1) . Um 9 p L·, ^^ iniciador em sentido contrário codificando a extremidade do terminal carboxilo do domínio interglobular, o espaçador G, um sítio do dador de ' separação contendo um sítio BamHl tinha a sequência: 5'-CGC GGG GGA TCC CCT CCC CCT GGC AAA TGC GGC TGC CC (SEQ ID NO: 2). 0 produto de PCR foi digerido com NheI e BamHI e ligado ao vector CD5-IgG cortado com NheI e BamHI (Aruffo A, et al., 1990).

Exemplo 2: Produção e Purificação de rAGG em células COS A construção foi transfectada em células COS via DEAE-dextrano (Hollenbaugh D, Aruffo A, Current protocols in molecular biology. Canadá: John Wiley and Sons, 1994). Doze horas após transfecção as células crescidas em DMEM, FCS a 10%, foram tratadas com tripsina, semeadas em placas frescas e deixadas a crescer durante cinco dias. No terceiro dia foi adicionado meio fresco e FCS a 10%. Os sobrenadantes foram recolhidos, centrifugados para remover células não aderentes e resíduos, reunidos e armazenados a 4°C. As proteínas de fusão foram purificadas por afinidade via gel de afinidade anti-FLAG™ Ml (Kodak, New Haven) de acordo com o protocolo dos fabricantes. Usualmente a produção foi de 1-5 μg de proteína de fusão por ml de sobrenadante de cultura.

Exemplo 3: Cultura de células de condrossarcoma de rato em agarose na presença ou ausência de ácido retinóico para estudos do catabolismo do substrato de IGD recombinante e agrecano nativo. Células de condrossarcoma de rato foram plaqueadas em frascos de 75 cm2 e mantidas em meio DMEM contendo FCS a 5% e gentamicina a 50 μg/ml. As monocamadas confluentes em frascos de 75 cm2 foram recolhidas por tratamento com tripsina (tripsina a 0,25% em DMEM contendo EDTA) durante 15-20 minutos a 37°C com agitação, 10

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t seguido de digestão em colagenase a 0,05% em DMEM durante 1-2 horas. As células foram então ressuspendidas em DMEM a 4 x 106 células/ml. Placas de cultura de 24 poços foram 'revestidas' (200 μΐ/poço) com uma solução de agarose FMC Seaplaque a 1% (p/v) em DMEM e a agarose foi solidificada por incubação a 4°C durante 30 minutos (Aydelotte MB, Juttner KE, Conn. Tissue Res. 1988; 18:205-222). As placas foram então equilibradas a 37°C. A suspensão de células de condrócito de rato (descrita acima) foi diluída com uma solução de agarose Seaplaque a 2% em DMEM de modo a que a concentração celular final foi de 2 x 106 células/ml. Foram sobrepostos 200 μΐ (0,4 x 106 células) da suspensão celular em agarose sobre as rolhas de agarose previamente preparadas e imediatamente depois disto 50 μg de substrato de IGD recombinante (rAGGl) ou agrecano bovino nativo (A1D1) foram adicionados aos poços apropriados e misturados por agitação. As placas foram então incubadas a 4°C durante 15 minutos para solidificar a agarose. Foi então adicionado meio experimental (com ou sem ácido retinóico) a poços em triplicado contendo a construção de IGD recombinante, agrecano bovino nativo (A1D1) e células isoladas como se segue: Culturas controlo, DMEM + gentamicina (50 μg/ml) e culturas tratadas, DMEM + gentamicina (50 μg/ml) + ácido retinóico a IO-6 M (Hughes CE, et al., 1995). As culturas de células em agarose foram então mantidas a 37°C em CO2 a 5% durante 96 horas após as quais os meios e extractos de matriz agarose-célula foram ainda analisados.

Exemplo 4: Análise de meios experimentais de culturas em agarose de controlo e estimuladas por ácido retinóico

Os meios das culturas do substrato IGD recombinante e as culturas contendo apenas células foram dialisados exaustivamente contra H2O destilada, liofilizados e reconstituídos num volume 11

igual de tampão de amostra de SDS-PAGE contendo mercaptoetanol a 10% (v/v) . As amostras de meios das culturas de A1D1 e as culturas contendo apenas células foram dialisados contra Tris a 0,1 M, acetato de sódio a 50 mM, pH 6,5 e desglicosilados utilizando métodos previamente descritos (Hughes CE, et al., 1995). As amostras foram então dializadas exaustivamente contra H20 destilada, liofilizadas e reconstituídas num volume igual de tampão de amostra em SDS-PAGE. As amostras (volumes iguais/poço) foram então sujeitas a SDS-PAGE, transferidas para nitrocelulose e localizadas imunologicamente com anticorpos policlonais ou monoclonais utilizando procedimentos descritos abaixo.

Exemplo 5: Extracção da matriz agarose-célula de culturas controlo e estimuladas com ácido retinóico

As camadas superiores de agarose de culturas de substrato IGD recombinante, culturas de A1D1 de bovino e culturas contendo apenas células foram extraídas durante 24 horas a 4°C com cloreto de guanidina a 4 M contendo os seguintes inibidores enzimáticos: EDTA a 10 mM, cloridrato de benzamidina a 5 mM, ácido β-aminohexóico a 0,1 M e fluoreto de fenilmetanosulfonilo a 1 mM. 0 resíduo do gel de agarose foi removido por centrifugação e os sobrenadantes foram então processados para cada um dos substratos como descrito acima. As amostras (volumes iguais/poço) foram então sujeitas a SDS-PAGE, transferidas para nitrocelulose e localizadas imunologicamente com anticorpos policlonais e monoclonais utilizando procedimentos descritos abaixo.

Exemplo 6: Electroforese em gel de Poliacrilamida na Presença de SDS e .análise de Transferência de Western

As amostras contendo substrato IGD nativo recombinante e os seus catabolitos foram sujeitos a electroforese em géis em placa de 12

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poliacrilamida a 10% em SDS utilizando procedimentos descritos por Laemmli (Laemmli UK, Nature 1970; 227:680-685). Após electroforese as proteínas fraccionadas foram transferidas electroforeticamente para nitrocelulose e localizadas imunologicamente com anticorpo monoclonal anti-FLAG ou imunoglobulina anti-humana ou anticorpo monoclonal BC-3 (todos a uma diluição de 1:1000) utilizando procedimentos previamente descritos (Hughes CE, et al., 1995). As amostras contendo A1D1 bovina nativa e seus catabolitos foram sujeitos a electroforese em géis de SDS-PAGE a 3-15% e transferidos para membranas de nitrocelulose para localização imunológica com uma diluição de 1:1000 de anticorpos monoclonais 3-B-3; 2-B-6 e BC-3. Em geral as transferências imunológicas foram incubadas com substrato durante 5-15 min à temperatura ambiente para atingir um desenvolvimento óptimo de cor.

Exemplo 7: Características da construção de IGD recombinante A transfecção da IGD recombinante em células COS resultou na expressão celular e subsequente excreção do produto de IGD recombinante no meio. A utilização de um gel de afinidade anti-FLAG Ml facilitou a sua purificação a partir de meios de células transfectadas. Um litro de meio de células COS transfectadas produziu 1-5 mg de substrato de IGD recombinante. Em condições de não redução este substrato de IGD recombinante formou agregados de grande peso molecular devido á presença de um número impar de resíduos de cisteína no domínio de imunoglobulina da molécula. Esta formação de agregado facilitou a imobilização do substrato de IGD recombinante nas culturas de agarose. Em condições de redução a construção de IGD recombinante ocorreu como dois componentes de peso molecular possuindo Mr estimados de 72 kDa e 39 kDa, como observado após separação em géis de SDS-PAGE a 10%. As razões para a ocorrência de duas formas do substrato de IGD recombinante são 13 p Lc, ^^ correntemente desconhecidas, contudo, ambos o monoclonal anti-Ml (reconhecendo um epitopo na região FLAG da construção) e o monoclonal anti-Ig (reconhecendo um epitopo na região de imunoglobulina da construção) localizaram imunologicamente ambas as formas da construção de IGD recombinante. A análise densitométrica de um gel corado com Coomassie da construção de IGD recombinante separada mostrou que a razão da banda de 72 kDa para a de 39 kDa foi de aproximadamente 10:1 (resultados não apresentados).

Exemplo 8: Análise Imunoquimica da construção recombinante de IGD de culturas em agarose tratadas com e sem ácido retinóico O substrato de IGD recombinante foi imobilizado em culturas de células em agarose contendo condrócitos de condrossarcoma de rato, com ou sem ácido retinóico, durante 96 horas. A análise do substrato de IGD recombinante e dos seus metabolitos no meio de cultura foi examinada por SDS-PAGE e análise por transferência de Western. A localização imunológica com anti-Ml (reconhecendo um epitopo no domínio FLAG no terminal N do substrato recombinante) não apresentou diferenças no padrão de metabolitos de rAGG-1 presentes no meio de qualquer das culturas controlo ou tratadas com ácido retinóico. Contudo, a localização imunológica com anti-Ig (reconhecendo um epitopo no domínio de imunoglobulina no terminal C do substrato recombinante) mostrou a presença de uma banda adicional migrando a 65 kDA sugerindo que tenha ocorrido catabolismo parcial do substrato recombinante não digerido de 72 kDa. Este resultado indica que o epitopo Ml (no terminal N) foi clivado a partir da forma de 72 kDa do substrato recombinante IGD para gerar um catabolito de 65 kDa. A ausência de coloração imunológica positiva para a banda a 72 kDa com anti-Ml confirma esta conclusão. De modo a verificar se esta clivagem da construção IGD ocorria no sítio de 'agrecanase' das 14

U amostras de meios de substrato recombinante de culturas de condrócito tratadas com e sem ácido retinóico foram examinadas por transferência imunológica com anticorpo monoclonal BC-3 (anti ARG...)· A localização imunológica com. BC-3 não apresentou reactividade em culturas sem ácido retinóico e apenas uma banda imunopositiva a 65 kDa nas culturas tratadas com ácido retinóico. Este resultado indica que ocorreu o catabolismo de 'agrecanase' da forma de 72kDa do substrato IGD recombinante. Contudo, não houve evidência que a isoforma de 39 kDa tenha sido catabolizada. A ausência de coloração imunológica com BC-3 para catabolitos de forma de 39 kDa positivos pode ser devida a esses catabolitos estarem presentes em concentrações mais baixas uma vez que havia dez vezes mais da forma 72 kDa na preparação de rAGG-1. De modo a confirmar que o catabolito de 65 kDa era derivado da forma de 72 kDa de rAGG-1 a transferência imunológica de BC-3 foi re-pesquisada com o anticorpo anti-Ml.

Exemplo 9: Análise de A1D1 bovino nativo de culturas em agarose tratadas com e sem ácido retinóico

Também avaliámos a utilização de um substrato nativo neste sistema de cultura para o comparar com substrato recombinante artificial. Agrecano bovino nativo (A1D1) foi misturado com agarose contendo condrócitos de rato tratados com e sem ácido retinóico. As culturas de células em agarose, sem A1D1 bovino adicionado, foram também analisadas de modo a ensaiar para qualquer contribuição de proteoglicano endógeno (substrato potencial) sintetizado durante as 96 horas de cultura. Quando as amostras de meios foram localizadas imunologicamente com o anticorpo monoclonal 2-B-6 não foi observada coloração nos meios retirados de culturas em agarose contendo apenas células. Este resultado mostra que não havia contribuição significativa de substrato endógeno sintetizado de novo no período de cultura. As culturas contendo substrato de agrecano bovino adicionado 15 exogenamente mantido com e sem ácido retinóico mostram o conjunto previsível de núcleos de proteína, 'marcadores em escada', como previamente descritos em vários estudos (Hughes CE, et al., 1995; Ilic MZ, Handley CJ, Robinson HC, Biochem. Internat. 1990; 21:977-986). Resultados semelhantes foram também observados utilizando o anticorpo monoclonal 3-B-3 (Fig 2, pistas 4, 5 e 6). Em contraste, a coloração imunológica utilizando anticorpo BC-3, para o catabolito de agrecano gerado pela 'agrecanase' com a sequência do terminal N ARGSV... foi apenas observada nas culturas que foram sujeitas a tratamento com ácido retinóico. O peso molecular relativo deste catabolito de agrecano positivo de BC-3 foi ~160 kDa e é semelhante ao observado noutros sistemas de cultura (Hughes CE, et al., 1995).

Os meios e amostras de extracto de culturas com ambos o substrato recombinante e agrecano bovino nativo foram também pesquisados com um anticorpo desenvolvido de novo (BC-14) que reconhece a sequência do neoepitopo do terminal N FFGV... que é gerada por proteólise de agrecano IGD com MMP's 1, 2, 3, 7, 8 ou 9. A transferência imunológica com BC-14 foi negativa em ambos os sistemas de cultura (resultados não apresentados). Este resultado indica que o catabolismo do IGD neste sítio não ocorria, uma descoberta consistente com a relatada por outros laboratórios (Lark MW, et al., 1995).

Exemplo 10:

Para estudos posteriores empregámos o substrato recombinante rAGG-lmut, uma versão da nossa proteína de fusão rAGG-1, na qual um sítio dador de separação na extremidade aminoterminal do IGD foi mutada para evitar separação alternativa. Como sua construção de origem, rAGG-lmut contém um epitopo FLAG como marcador aminoterminal, o IGD do agrecano humano e a região constante de uma molécula de IgG humana como um marcador do 16 lí ’ terminal carboxilo. Após a transfecção transiente, o rAGG-lmut é excretado pelas células COS como uma proteína de fusão para o sobrenadante da cultura e surge como uma banda de 72 kDa em condições de redução e como uma banda de 140 kDa em condições de não redução, provavelmente reflectindo uma dimerisação devida à presença de cisteína não emparelhada na região de charneira da componente de imunoglobulina humana no terminal C da construção.

Após estimulação com ácido retinóico (RA), as células embebidas em agarose na linha celular de condrossarcoma de rato RX produzem agrecanase. O rAGG-lmut é catabolisado no sítio de agrecanase como tem sido descrito para rAGG-1, que é apresentado através da imunodetecção com o anticorpo monoclonal BC-3. O tamanho de 66 kD deste produto catabólico está de acordo com a perda prevista de 5,8 kD após clivagem no sítio de agrecanase. A sequência de aminoácidos de rAGG-lmut difere apenas na posição 34 da sequência de aminoácidos de rAGG-1: rAGG-lmut contém Ala 34, enquanto que rAGG-1 contém um Gly 34. A sequência de nucleótidos do ADN codificando rAGG-lmut difere em três posições do ADN codificando rAGG-1: A para C, 2450: G para C e 2451: T para A. DISCUSSÃO GERAL: Estes resultados são o primeiro relato da produção e utilização de um substrato recombinante para o estudo de actividade de 'agrecanase'. Adicionalmente, desenvolvemos um novo sistema de cultura de células para monitorizar a actividade de 'agrecanase' sem a complicação de agrecano endógeno actuando como um substrato. As propriedade únicas de agregação deste substrato artificial ( rAGGl) facilitou a sua imobilização no sistema de cultura de células em agarose. Além disso, somos capazes de utilizar condrócitos isolados de fresco sem a necessidade de estabelecer uma matriz extracelular endógena para actuar como um substrato para qualquer actividade de 17 r u 'agrecanase'. Os resultados obtidos com a construção de IGD recombinante demonstram que não há uma necessidade para um domínio G1 e/ou G2 na IGD de agrecano para clivagem no sítio da 'agrecanase'. Além disso, parece não existir necessidade para cadeias de sulfato de queratano, (na medida em que a construção de rAGG-1 não apresentou coloração positiva na análise de transferência de Western com um anticorpo contra sulfato de queratano 5-D-4, resultados não apresentados) na IGD, o que pode proporcionar rigidez a esta região na molécula nativa de agrecano. Este sistema de cultura desenvolvido de novo mostrar-se-á útil para estudos posteriores dos mecanismos moleculares envolvidos na degradação de agrecano por 'agrecanase'. É também uma nova abordagem experimental que poderia ser considerada para estudos do catabolismo de outras macromoléculas matriz dada a disponibilidade de substratos recombinantes e anticorpos para novos epitopos. 18 \ Γ u

Tabela 1: Sequência de aminoácidos de rAGG-1 (SEQ ID NO: 3)

Met Pro Met Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly 15 10 15

Met Leu Vai Ala Ser Vai Leu Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 20 25 30

Thr Gly Glu Asp Phe Vai Asp Ile Pro Glu Asn Phe Phe Gly Vai Gly 35 40 45

Gly Glu Glu Asp Ile Thr Vai Gin Thr Vai Thr Trp Pro Asp Met Glu 50 55 60

Leu Pro Leu Pro Arg Asn Ile Thr Glu Gly Glu Ala Arg Gly Ser Vai 65 70 75 80

Ile Leu Thr Vai Lys Pro Ile Phe Glu Vai Ser Pro Ser Pro Leu Glu 85 90* 95

Pro Glu Glu Pro Phe Thr Phe Ala Pro Glu Ile Gly Ala Thr Ala Phe 100 105 110

Ala Glu Vai Glu Asn Glu Thr Gly Glu Ala Thr Arg Pro Trp Gly Phe 115 120 125

Pro Thr Pro Gly Leu Gly Pro Ala Thr Ala Phe Thr Ser Glu Asp Leu 130 135 140

Vai Vai Gin Vai Thr Ala Vai Pro Gly Gin Pro His Leu Pro Gly Gly 145 150 155 160

Gly Asp Pro Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 165 170 175 19 ) _ I—

Γ

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe 180 185 190

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai 195 200 205

Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe 210 215 220

Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 225 230 235 240

Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr 245 250 255

Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai 260 265 270

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 275 280 285

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 290 295 300

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly 305 310 315 320

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 325 330 335

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser 340 345 350 20

C t

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 355 360 365

Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His 370 375 380

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390 395 Tabela 2: Sequência de rAGG-1 (SEQ ID NC >: 4) GGCGTAATCT GCTGCTTGCA AACAAAAAAA CCACCGCTAC CAGCGGTGGT TTGTTTGCCG 60 GATCAAGAGC TACCAACTCT TTTTCCGAAG GTAACTGGCT TCAGCAGAGC GCAGATACCA 120 AATACTGTCC TTCTAGTGTA GCCGTAGTTA GGCCACCACT TCAAGAACTC TGTAGCACCG 180 CCTACATACC TCGCTCTGCT AATCCTGTTA CCAGTGGCTG CTGCGAGTGG CGATAAGTCG 240 TGTCTTACCG GGTTGGACTC AAGACGATAG TTACCGGATA AGGCGCAGCG GTCGGGCTGA 300 ACGGGGGGTT CGTGCACACA GCCCAGCTTG GAGCGAACGA CCTACACCGA ACTGAGATAC 360 CTACAGCGTG AGCATTGAGA AAGCGCCACG. CTTCCCGAAG GGAGAAAGGC GGACAGGTAT 420 CCGGTAAGCG GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CGCACGAGGG AGCTTCCAGG GGGAAACGCC 480 TGGTATCTTT ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC CACCTCTGAC TTGAGCGTCG ATTTTTGTGA 540 TGCTCGTCAG GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCAAGCTA GCTTCTAGCT 600 AGAAATTGTA AACGTTAATA TTTTGTTAAA ATTCGCGTTA AATTTTTGTT AAATCAGCTC 660 21 ^ 1—^ ^^ ATTTTTTAAC CAATAGGCCG AAATCGGCAA AATCCCTTAT AAATCAAAAG AATAGCCCGA 720 GATAGGGTTG AGTGTTGTTC CAGTTTGGAA CAAGAGTCCA CTATTAAAGA ACGTGGACTC 780 CAACGTCAAA GGGCGAAAAA CCGTCTATCA GGGCGATGGC CGCCCACTAC GTGAACCATC 840 ACCCAAATCA AGTTTTTTGG GGTCGAGGTG CCGTAAAGCA CTAAATCGGA ACCCTAAAGG 900 GAGCCCCCGA TTTAGAGCTT GACGGGGAAA GCCGGCGAAC GTGGCGAGAA AGGAAGGGAA 960 GAAAGCGAAA GGAGCGGGCG CTAGGGCGCT GGCAAGTGTA GCGGTCACGC TGCGCGTAAC 1020 CACCACACCC GCCGCGCTTA ATGCGCCGCT ACAGGGCGCG TACTATGGTT GCTTTGACGA 1080 GCACGTATAA CGTGCTTTCC TCGTTGGAAT CAGAGCGGGA GCTAAACAGG AGGCCGATTA 1140 AAGGGATTTT AGACAGGAAC GGTACGCCAG CTGGACCGCG GTCTTTCTCA ACGTAACACT 1200 TTACAGCGGC GCGTCATTTG ATATGATGCG CCCCGCTTCC CGATAAGGGA GCAGGCCAGT 1260 AAAAGCATTA CCCGTGGTGG GGTTCCCGAG CGGCCAAAGG GAGCAGACTC TAAATCTGCC 1320 GTCATCGACT TCGAAGGTTC GAATCCTTCC CCCACCACCA TCACTTTCAA AAGTCCGAAA 1380 GCTGCTCCCT GCTTGTGTGT TGGAGGTCGC TGAGTAGTGC GCGAGTAAAA TTTAAGCTAC 1440 AACAAGGCAA GGCTTGACCG ACAATTGCAT GAAGAATCTG CTTAGGGTTA GGCGTTTTGC 1500 GCTGCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA 1560 ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA 1620 ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT 1680 AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA 1740 22 CTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC 1800 CCCTATTGAC gtcaatgacg GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT 1860 ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT 1920 GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG 1980 TCTCCACCCC ATTGACGTCA ATGGGAGTTT gttttggcac CAAAATCAAC GGGACTTTCC 2040 AAAATGTCGT AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGAATTCCTG GGCGGGACTG 2100 GGGAGTGGCG AGCCCTCAGA TGCTGCATAT AAGCAGCTGC TTTTTGCCTG TACTGGGTCT 2160 CTCTGGTTAG ACCAGATCTG AGCCTGGGAG CTCTCTGGCT AACTAGAGAA CCCACTGCTT 2220 AAGCCTCAAT AAAGCTTCTA GAGATCCCTC GACCTCGAGA TCCATTGTGC TCTAAAGGAG 2280 ATACCCGGCC AGACACCCTC ACCTGCGGTG CCCAGCTGCC CAGGCTGAGG CAAGAGAAGG 2340 CCAGAAACCA TGCCCATGGG GTCTCTGCAA CCGCTGGCCA CCTTGTACCT GCTGGGGATG 2400 CTGGTCGCTT CCGTGCTAGC CGACTACAAG GACGACGATG ACAAGACAGG TGAAGACTTT 2460 GTGGACATCC CAGAAAACTT CTTTGGAGTG GGGGGTGAGG AGGACATCAC CGTCCAGACA 2520 GTGACCTGGC CTGACATGGA GCTGCCACTG CCTCGAAACA TCACTGAGGG TGAAGCCCGA 2580 GGCAGCGTGA TCCTTACCGT AAAGCCCATC TTCGAGGTCT CCCCCAGTCC CCTGGAACCC 2640 GAGGAGCCCT TCACGTTTGC CCCTGAAATA GGGGCCACTG CCTTCGCTGA GGTTGAGAAT 2700 GAGACTGGAG AGGCCACCAG GCCCTGGGGC TTTCCCACAC CTGGCCTGGG CCCTGCCACG 2760 GCATTCACCA GTGAGGACCT CGTCGTGCAG GTGACCGCTG TCCCTGGGCA GCCGCATTTG 2820 CCAGGGGGAG GGGATCCCGA GGGTGAGTAC TAAGCTTCAG CGCTCCTGCC TGGACGCATC 2880 23 \

t CCGGCTATGC AGCCCCAGTC CAGGGCAGCA AGGCAGGCCC CGTCTGCCTC TTCACCCGGA 2940 GGCCTCTGCC CGCCCCACTC ATGCTCAGGG AGAGGGTCTT CTGGCTTTTT CCCCAGGCTC 3000 TGGGCAGGCA CAGGCTAGGT GCCCCTAACC CAGGCCCTGC ACACAAAGGG GCAGGTGCTG 3060 GGCTCAGACC TGCCAAGAGC CATATCCGGG AGGACCCTGC CCCTGACCTA AGCCCACCCC 3120 AAAGGCCAAA CTCTCCACTC CCTCAGCTCG GACACCTTCT CTCCTCCCAG ATTCCAGTAA 3180 CTCCCAATCT TCTCTCTGCA GAGCCCAAAT CTTGTGACAA AACTCACACA TGCCCACCGT 3240 GCCCAGGTAA GCCAGCCCAG GCCTCGCCCT CCAGCTCAAG GCGGGACAGG TGCCCTAGAG 3300 TAGCCTGCAT CCAGGGACAG GCCCCAGCCG GGTGCTGACA CGTCCACCTC CATCTCTTCC 3360 TCAGCACCTG AACTCCTGGG GGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA ACCCAAGGAC 3420 ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACATGCGTGG TGGTGGACGT GAGCCACGAA 3480 GACCCTGAGG TCAAGTTCAA CTGGTACGTG GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA 3540 AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA CAACAGCACG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG 3600 CACCAGGACT GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGCCCTCCCA 3660 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGTGGGA CCCGTGGGGT GCGAGGGCCA 3720 CATGGACAGA GGCCGGCTCG GCCCACCCTC TGCCCTGAGA GTGACCGCTG TACCAACCTC 3780 TGTCCCTACA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCGGGATGA 3840 GCTGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTATC CCAGCGACAT 3900 CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT 3960 24 Γ L·, Κ GCTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG 4020 GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA ACCACTACAC 4080 GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA ATGAGTGCGA CGGCCGCGAC TCTAGAGGAT 4140 CTTTGTGAAG GAACCTTACT TCTGTGGTGT GACATAATTG GACAAACTAC CTACAGAGAT 4200 TTAAAGCTCT AAGGTAAATA TAAAATTTTT AAGTGTATAA TGTGTTAAAC TACTGATTCT 4260 AATTGTTTGT GTATTTTAGA TTCCAACCTA TGGAACTGAT GAATGGGAGC AGTGGTGGAA 4320 TGCCTTTAAT GAGGAAAACC TGTTTTGCTC AGAAGAAATG CCATCTAGTG ATGATGAGGC 4380 TACTGCTGAC TCTCAACATT CTACTCCTCC AAAAAAGAAG AGAAAGGTAG AAGACCCCAA 4440 GGACTTTCCT TCAGAATTGC TAAGTTTTTT GAGTCATGCT GTGTTTAGTA ATAGAACTCT 4500 TGCTTGCTTT GCTATTTACA CCACAAAGGA AAAAGCTGCA CTGCTATACA AGAAAATTAT 4560 GGAAAAATAT TCTGTAACCT TTATAAGTAG GCATAACAGT TATAATCATA ACATACTGTT 4620 TTTTCTTACT CCACACAGGC ATAGAGTGTC TGCTATTAAT AACTATGCTC AAAAATTGTG 4680 TACCTTTAGC TTTTTAATTT GTAAAGGGGT TAATAAGGAA TATTTGATGT ATAGTGCCTT 4740 GACTAGAGAT CATAATCAGC C AT AC C AC AT TTGTAGAGGT TTTACTTGCT TTAAAAAACC 4800 TCCCACACCT CCCCCTGAAC CTGAAACATA AAATGAATGC AATTGTTGTT GTTAACTTGT 4860 TTATTGCAGC TTATAATGGT TACAAATAAA GCAATAGCAT CACAAATTTC ACAAATAAAG 4920 CATTTTTTTC ACTGCATTCT AGTTGTGGTT TGTCCAAACT CATCAATGTA TCTTATCATG 4980 TCTGGATCCT GTGGAATGTG TGTCAGTTAG GGTGTGGAAA GTCCCCAGGC TCCCCAGCAG 5040 GCAGAAGTAT GCAAAGCATG CATCTCAATT AGTCAGCAAC CAGGTGTGGA AAGTCCCCAG 5100 25 GCTCCCCAGC AGGCAGAAGT ATGCAAAGCA TGCATCTCAA TTAGTCAGCA ACCATAGTCC 5160

CGCCCCTAAC ATGGCTGACT TCCAGAAGTA TCCGCCCATC CCGCCCCTAA CTCCGCCCAG TTCCGCCCAT TCTCCGCCCC 5220 AATTTTTTTT ATTTATGCAG AGGCCGAGGC CGCCTCGGCC TCTGAGCTAT 5280 GTGAGGAGGC TTTTTTGGAC GCCTAGGCTT TTGCAAAAG CTAATTC 5337

Lisboa, 6 de Novembro de 2000

O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Substrato recombinante para sistemas de teste ín vitro de Agrecanase, em que o referido substrato contém um grupo de elementos estruturais compreendendo a) a sequência sinal de CD5, b) o epitopo-FLAG para detecção com anticorpo monoclonal Ml, c) o domínio interglobular de agrecano humano, d) a região de charneira de IgGl humano, e) a região CH2 de IgGl humano e f) a região CH3 de IgGl humano.
2. Substrato recombinante, de acordo com a reivindicação 1, em que a) o referido substrato possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:3 ou partes desta, ou b) possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou partes desta, em que o aminoácido 34 está mutado para Ala.
3. ADN, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, codificando um substrato recombinante.
4. ADN, de acordo com a reivindicação 3, em que a) o referido ADN possui a Sequência de nucleótidos dos nucleótidos 2350 a 4114 de SEQ ID NO:4 ou partes desta b) o referido ADN possui a sequência de nucleótidos dos nucleótidos 2350 a 4114 de SEQ ID NO: 4 ou partes desta, em que o nucleótido 2448 está mutado para C, o nucleótido 2450 está mutado para C e o nucleótido 2451 está mutado 1 u para A; ou o referido ADN híbrida em condições de severidade com o ADN de SEQ ID NO:4.
5. Vector contendo um fragmento de ADN com a sequência de nucleótidos de acordo com a reivindicação 4.
6. Célula hospedeira contendo um vector de acordo com a reivindicação 5.
7. Utilização de um substrato recombinante, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, num sistema de cultura celular para estudar a actividade de agrecanase.
8. Utilização de um substrato recombinante, de acordo com a reivindicação 7, em que o referido sistema de cultura de linha celular está isento de proteoglicanos inerentes endógenos e outros componentes extracelulares.
9. Utilização de um substrato recombinante, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que o estudo da actividade de agrecanase é realizado através de detecção de produtos de clivagem por anticorpos.
10. Utilização de um substrato recombinante, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, para a detecção de novos sítios de clivagem enzimática no referido substrato.
11. Utilização de um substrato recombinante, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, para a purificação de agrecanase por meio de cromatografia de afinidade.
12. Utilização de um substrato recombinante, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, num sistema de clonagem funcional, para o isolamento de ADNc de agrecanase. 2
13. Utilização de um substrato recombinante, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, para a pesquisa de um inibidor de agrecanase.
14. Método para monitorização do inicio da progressão de osteoartrite, compreendendo o referido método ensaiar uma amostra de fluido biológico, de um humano suspeito ou. do qual se sabe possuir osteoartrite, quanto à presença de agrecanase por meio do substrato recombinante, de acordo com as reivindicações 1 ou 2.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que o referido fluido biológico é seleccionado a partir do grupo consistindo em fluido sinovial, urina, soro e fluido linfático.
16. Método, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, em que o referido método é utilizado para seguir a progressão da doença para determinar a eficiência de um tratamento.
17. Conjunto de diagnóstico contendo um substrato recombinante de acordo com as reivindicações 1 ou 2 e anticorpos para a detecção de produtos da clivagem da agrecanase. Lisboa, 6 de Novembro de 2000 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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