JP3914983B2 - Yil169c遺伝子を利用した醸造用酵母の判別法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母の判別に関するものであり、更に詳細には、醸造用酵母の判別、分類、同定に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
醸造用酵母としては、ブドウ酒酵母、清酒酵母、焼酎酵母等いくつかの種類の酵母が使用されており、また更にこれらの各酵母の内、例えばブドウ酒酵母としては協会ブドウ酒酵母1号、3号、4号等が使用され、また清酒酵母も協会7号、9号、10号酵母等が使用され、焼酎酵母も鹿児島酵母K2、宮崎酵母MK.泡盛酵母等が使用されている。
【0003】
しかしながら、これらの醸造用酵母はいずれもサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に分類されるものであって、同一種に属し醸造に使用されるため、通常の菌学的性質は共通しており、これらの酵母を短時間に且つ正確にそれぞれ区別することはきわめて困難である。したがって、現時点においては、酵母を小仕込試験するなどとして、その醸造特性から判別したり、薬剤や培養条件を変えることで酵母を判別したりする方法で酵母の判別を行わざる得ないのが実情である。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの判別方法は、酵母を実際に培養したり、実際に仕込みを行ってその醸造特性を確認したりする必要があるため、判別に相当の時間を要することは不可避であり、当業界においてその改善が求められている。
【0005】
このように、実際の酒類製造の現場において、そしてまた試験研究機関において、短期間で正確且つ簡易な酵母の判別システムの確立は従来より重要な課題である。本発明は、このような技術の現状に鑑み、例えばブドウ酒酵母と焼酎酵母、ブドウ酒酵母と清酒酵母といった異なった用途の酵母間だけでなく、その判別が非常デリケートで難しい、例えば協会ブドウ酒酵母1号、3号、4号といった同一用途の酵母間においても、それを短期間で正確且つ簡易に判別できるシステムの開発というきわめて解決困難な技術的課題をあえて新規に設定した。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであって、本発明者らは、各方面から検討を行い、遺伝子を利用する方法に着目した。そして、本発明者らは、既に報告されている(Miguel. B. L. Alison, S. Paul, A. H, and Peter L. Applied and Enviromental Microbiology (1996) P4514-4520) LA-1 primer(GCGACGGTGTACTAAC)を用いて焼酎酵母のゲノムDNAに対してPCR法により増幅したところ、500bp付近に増幅されたDNAのバンドに特徴を認めた。更にこのDNA断片をクローニングし、塩基配列情報を決定したところ、YIL169C遺伝子の一部であることをはじめて見出した。この新知見に着目して、本発明者らは更に研究を続けた結果、YIL169C遺伝子が醸造用酵母で異なることを発見した。
【0007】
このように、本発明は、YIL169C遺伝子が醸造用酵母で異なることを発見し、これら有用な新知見に基づき、更に検討の結果完成されたものであって、YIL169C遺伝子に基づいた醸造用醸母の判別、確認、検出システムにも関与するものである。YIL169C遺伝子自体は既知であるが(文献名Lye,G.,Bowman,S.and Churcher,C.unpublished.ただし、インターネットにて公表)、YIL169C遺伝子に着目した酵母の判別は行われておらず、また、YIL169C遺伝子が醸造用酵母間で異なることも報告されていない。ましてや、異なった種類の醸造用酵母はもとより、同一種類の酵母さえもきめ細かく判別することができることなど全く報告されておらず、本発明が最先である。
【0008】
すなわち、本発明は、サッカロマイセス(Saccharomyces)属セレビシエ(cerevisiae)に属する醸造酵母のゲノムDNAを用いて、PCR法によりYIL169C遺伝子の一部又は全部を増幅させ、その増幅される断片の長さ、数の違いにより、その醸造用酵母の判別を行う点を基本的技術思想とするものである。
【0009】
本発明においては、醸造用酵母のゲノムDNAをYIL169C遺伝子の一部又は全部を増幅させるプライマーを用いて、PCR法にて増幅させ、それら増幅させた遺伝子断片を直接アガロースゲル電気泳動又は制限酵素処理したのちアガロースゲル電気泳動することで、その泳動パターンを観察すればよいので、作業が容易かつシンプルである。また、特定の遺伝子(この場合YIL169C遺伝子の一部又は全部)を増幅させるプライマーを用いることで、PCR法での増幅で得られるDNA断片の種類も安定している点など、優れた点が多い。
【0010】
本発明の実施にあたり、プライマーとして、今回本発明者らがはじめて開発するのに成功したプライマーA〜F(それらの塩基配列を配列表の配列番号1〜6(図1)に示す。)を選択、使用し、酵母のゲノムDNAを鋳型にしてPCRを行うのであるが、プライマーとしては、上記したプライマーを合成して用いてもよい。YIL169C遺伝子は、実験室用酵母 S288C strain(Invitrogen(株)より購入)より得ることができ、これより切り出してもよい。 プライマーとしては、判別しようとする酵母に応じたものを適宜選択して使用すればよく、酵母によってはA〜F以外のプライマーをYIL169C遺伝子から設計し、合成して用いてもよい。PCRは常法にしたがって行えばよく、その結果、目的とする遺伝子断片を得ることができる。
【0011】
このようにして増幅して得た遺伝子断片は、これを直接アガロースゲル電気泳動して、その泳動パターンを観察することにより、酵母の判別をすることができる。プライマーの種類、組み合わせを選択することにより、酵母に特有な明確な泳動パターンが得られる。また、所望するのであれば、PCRにて増殖された遺伝子断片を制限酵素で切断し、これを電気泳動してその泳動パターンを観察することによっても、酵母の判別を簡便且つ明確に行うことができる。
【0012】
したがって、本発明によれば、プライマー、鋳型に用いるゲノムDNA、増幅されたDNA断片、その制限酵素消化物の少なくともひとつについて、その種類を変えることによって、各種の醸造用酵母の判別、同定が可能となり、あるいは逆に、特定の醸造用酵母を判別、同定するためには、プライマー等を選別すればよく、酵母のバリエーションが出るようにあるいはそれに対応するようにプライマー等についてもバリエーション設計をすればよい。
【0013】
このようにして本発明によれば、醸造用酵母の判別、同定、分類の少なくともひとつが可能となるので、上記したプライマー等の少なくともひとつを用いて酵母の判別、同定、分類用キットを組むことができる。したがって、例えばプライマーA及びBを用いて、あるいは、これらのプライマーのPCR産物を用いて、協会ブドウ酒酵母3号の判別、同定、分類用キットを組むことができる。
【0014】
本発明において、酵母としては、サッカロマイセス(Saccharomyces)属セレビシエ(cerevisiae)に属する酵母であればすべての酵母が使用可能であり、例えば、清酒酵母(協会7号酵母、協会9号酵母、協会10号酵母等)、ワイン酵母(協会ブドウ酒1号酵母、協会ブドウ酒3号酵母、協会ブドウ酒4号酵母等)、焼酎酵母(鹿児島酵母K2、宮崎酵母MK、協会焼酎酵母SH−4、泡盛酵母1号等)等の実用酵母に使用できる。本発明は、清酒酵母とワイン酵母の判別、ワイン酵母と焼酎酵母の判別といった異なった用途の酵母間の判別が可能であることはもとより、同じワイン酵母であって、協会ブドウ酒1号酵母と同2号酵母、同2号酵母と同3号酵母の判別といった同一用途の酵母間の判別も可能であるという著効も奏するものである。特に後者については、判別自体が困難であって非常にデリケートな要件が必要とされ、従来、簡便にして正確な方法で満足できる方法は報告されていなかったのである。
【0015】
以下、本発明の実施例について述べる。
【0016】
【実施例1】
(協会ブドウ酒1号酵母、協会ブドウ酒3号酵母、協会ブドウ酒4号の判別法)
サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に属する協会ブドウ酒1号酵母、協会ブドウ酒3号酵母、協会ブドウ酒4号、実験実酵母X2180B株より宝酒造(株)の「じぇんとる君」を用いて精製したゲノムDNAを、プライマ−A(配列番号1、図1)とプライマーB(配列番号2、図1)、プライマ−A(配列番号1、図1)とプライマーC(配列番号3、図1)、プライマ−D(配列番号4、図1)とプライマーE(配列番号5、図1)、の各々の組み合わせでPCR法にて増幅したのち、アガロースゲル電気泳動を行った。(電気泳動結果を図2に示す)を得た。
【0017】
図2において、各レーンはそれぞれ次のことを表わす。
1:ラムダHindIII Digested Marker
2:協会ブドウ酒酵母1号ゲノムDNAをプライマーA及びBでPCR法にて増幅
3:協会ブドウ酒酵母3号ゲノムDNAをプライマーA及びBでPCR法にて増幅
4:協会ブドウ酒酵母4号ゲノムDNAをプライマーA及びBでPCR法にて増幅
5:X2180B株ゲノムDNAをプライマーA及びBでPCR法にて増幅
6:協会ブドウ酒酵母1号ゲノムDNAをプライマーA及びCでPCR法にて増幅
7:協会ブドウ酒酵母3号ゲノムDNAをプライマーA及びCでPCR法にて増幅
8:協会ブドウ酒酵母4号ゲノムDNAをプライマーA及びCでPCR法にて増幅
9:X2180B株ゲノムDNAをプライマーA及びCでPCR法にて増幅
10:協会ブドウ酒酵母1号ゲノムDNAをプライマーD及びEでPCR法にて増幅
11:協会ブドウ酒酵母3号ゲノムDNAをプライマーD及びEでPCR法にて増幅
12:協会ブドウ酒酵母4号ゲノムDNAをプライマーD及びEでPCR法にて増幅
13:X2180B株ゲノムDNAをプライマーD及びEでPCR法にて増幅
【0018】
PCRは、上記プライマーを用いて上記ゲノムDNAに対して行った。反応条件は、次のとおりである。
(PCR条件)
1サイクル
94℃ 3min 1cycle
94℃ 1min \
60℃ 1min >25cycle
72℃ 2min /
72℃ 3min 1cycle
【0019】
以上の図2の結果から、実験室株X2180B株のゲノムDNAを用いた場合、いずれのプライマーでもDNA断片が増幅されたが、プライマーA及びBでPCR法の増幅の結果、協会ブドウ酒酵母3号のみが、プライマーA及びCでPCR法の増幅の結果、協会ブドウ酒酵母1号のみが、プライマーD及びEではPCR法の増幅の結果、いずれの酵母からもDNA断片が増幅されたが、その長さは、全て実験室株X2180B株のものと異なっていた。これらの結果から、協会ブドウ酒酵母間の判別法として有効であることが確認された。
【0020】
【実施例2】
(鹿児島酵母K2、宮崎酵母MK、協会焼酎酵母SH−4、泡盛酵母1号の判別法)
サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に属し、焼酎酵母として用いられている鹿児島酵母K2、宮崎酵母MK、協会焼酎酵母SH−4、泡盛酵母1号、実験室酵母X2180B株より宝酒造(株)の「じぇんとる君」を用いて精製したゲノムDNAを、プライマ−D(配列番号4、図1)とプライマーB(配列番号2、図1)、の各々の組み合わせでPCR法にて増幅したのち、アガロースゲル電気泳動を行った。(電気泳動結果を図3に示す)を得た。
【0021】
図3において、各レーンはそれぞれ次のことを表わす。
1:ラムダHindIII Digested Marker
2:鹿児島酵母K2ゲノムDNAをプライマーD及びBでPCR法にて増幅
3:協会焼酎酵母SH−4ゲノムDNAをプライマーD及びBでPCR法にて増幅
4:宮崎酵母MKゲノムDNAをプライマーD及びBでPCR法にて増幅
5:泡盛酵母1号ゲノムDNAをプライマーD及びBでPCR法にて増幅
6:X2180B株ゲノムDNAをプライマーD及びBでPCR法にて増幅
【0022】
PCRは、上記プライマーを用いて上記ゲノムDNAに対して行った。反応条件は、次のとおりである。
(PCR条件)
1サイクル
94℃ 2min 1cycle
94℃ 1min \
60℃ 1min 〉25cycle
72℃ 1.5min /
72℃ 3min 1cycle
【0023】
以上の図3の結果から、プライマーD及びBではPCR法の増幅の結果、いずれの酵母からもDNA断片が増幅されたが、その長さ・パターンは、いずれとも異なっていた。これらの結果から、焼酎酵母間の判別法としても有効であることが確認された。
【0024】
【実施例3】
(協会焼酎酵母SH−4、協会ブドウ酒1号酵母の判別法)
サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に属する協会焼酎酵母SH−4、協会ブドウ酒1号酵母より宝酒造(株)の「じぇんとる君」を用いて精製したゲノムDNAを、プライマ−C(配列番号3、図1)とプライマーF(配列番号6、図1)、の各々の組み合わせでPCR法にて増幅したのち、制限酵素RsaIで増幅されたDNAを切断し、アガロースゲル電気泳動を行った。(電気泳動結果を図4に示す)を得た。
【0025】
図4において、各レーンはそれぞれ次のことを表わす。
1:ラムダHindIII Digested Marker
2:協会ブドウ酒酵母1号ゲノムDNAをプライマーC及びFでPCR法にて増幅
3:協会焼酎酵母SH−4ゲノムDNAをプライマーC及びFでPCR法にて増幅
4:2のDNAを制限酵素RsaIで切断したもの
5:3のDNAを制限酵素RsaIで切断したもの
【0026】
PCRは、上記プライマーを用いて上記ゲノムDNAに対して行った。反応条件は、次のとおりである。
(PCR条件)
1サイクル
94℃ 3min 1cycle
94℃ 1min \
60℃ 1min 〉25cycle
72℃ 3.5min /
72℃ 3min 1cycle
【0027】
以上の図4の結果から、プライマーC及びFではPCR法の増幅の結果、両酵母からもDNA断片が増幅されたが、その長さはほぼ同じであった。しかし更に増幅されたDNA断片を制限酵素RsaIで切断することで、両遺伝子の電気泳動パターンに差が認められた。これらの結果から両酵母間の判別法として、増幅されたYIL169C遺伝子の制限酵素処理も有効であることが確認された。
【0028】
【発明の効果】
本発明によれば、小仕込試験、薬剤や培養条件を変えて判別する等従来の方法に比して、短時間に判別できるという著効が奏され、しかも明確に判別することができ、安定的な結果が得られ、再現性を有するものであり、操作も簡単という著効が奏される。
【0029】
更に本発明によれば、異なった醸造用酵母間の判別はもとより、非常に困難でデリケートな同一の醸造用酵母間の判別、例えばブドウ酒酵母間の判別も可能であって、本発明は、酒類製造業、試験研究機関等において、短期間に簡易にして正確な酵母の分類・同定・判別を可能とするものであり、野生酵母ともろみ中の酵母の明確な判別も可能である。
【0030】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】プライマーA〜Fの塩基配列を示す。
【図2】ブドウ酒酵母の判別を示す電気泳動パターンの写真である(図面代用写真)。
【図3】焼酎酵母及び泡盛酵母の判別を示す電気泳動パターンの写真である(図面代用写真)。
【図4】ブドウ酒酵母、焼酎酵母、及びこれらのRsaI消化物の判別を示す電気泳動パターンの写真である(図面代用写真)。
Claims (6)
- 醸造用酵母のゲノムDNAを、配列番号1(プライマーA)及び配列番号2(プライマーB)で示される塩基配列からなるDNA断片をプライマーとして用いて、PCR法にて増幅させ、増幅された遺伝子断片を直接アガロースゲル電気泳動して、その電気泳動パターンの違いによって酵母を判別すること、を特徴とする醸造用酵母の判別方法。
- 醸造用酵母のゲノムDNAを、配列番号1(プライマーA)及び配列番号3(プライマーC)で示される塩基配列からなるDNA断片をプライマーとして用いて、PCR法にて増幅させ、増幅された遺伝子断片を直接アガロースゲル電気泳動して、その電気泳動パターンの違いによって酵母を判別すること、を特徴とする醸造用酵母の判別方法。
- 醸造用酵母のゲノムDNAを、配列番号4(プライマーD)及び配列番号5(プライマーE)で示される塩基配列からなるDNA断片をプライマーとして用いて、PCR法にて増幅させ、増幅された遺伝子断片を直接アガロースゲル電気泳動して、その電気泳動パターンの違いによって酵母を判別すること、を特徴とする醸造用酵母の判別方法。
- 醸造用酵母のゲノムDNAを、配列番号4(プライマーD)及び配列番号2(プライマーB)で示される塩基配列からなるDNA断片をプライマーとして用いて、PCR法にて増幅させ、増幅された遺伝子断片を直接アガロースゲル電気泳動して、その電気泳動パターンの違いによって酵母を判別すること、を特徴とする醸造用酵母の判別方法。
- 醸造用酵母のゲノムDNAを、配列番号3(プライマーC)及び配列番号6(プライマーF)で示される塩基配列からなるDNA断片をプライマーとして用いて、PCR法にて増幅させ、増幅された遺伝子断片を制限酵素処理した後にアガロースゲル電気泳動して、その電気泳動パターンの違いによって酵母を判別すること、を特徴とする醸造用酵母の判別方法。
- 制限酵素としてRsaIを使用すること、を特徴とする請求項5に記載の醸造用酵母の判別方法。
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