JP3819847B2 - 細胞培養による蛋白質生産プラントにおける蛋白質計測方法及びその装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養プラントなどにおける蛋白質定量方法及びその装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗体等の高分子蛋白質医薬品は培養槽内で生体細胞を培養して生産される。この後、培養液から生産物である医薬品を分離・精製し出荷される。これら医薬品は品質および安全性を保証する必要があるため、生体細胞の培養工程のみでなく、それ以降の分離工程、精製工程においても実際に医薬品が正常処理されているか確認することが要求される。特に近年、ＧＭＰ（医薬品の優良製造規範）が施行されたため品質保証のニーズが高まっている。
【０００３】
従来、これら高分子医薬品は作業員が各処理工程から培養液もしくは試料液を手作業で採取し、マイクロウェルプレートを用いたＥＬＩＳＡ（酵素標識免疫吸着分析）法により定量されていた。この分析作業は「免疫学イラストレイテッド（多田富雄監訳、南江堂発行、２０００年１月）」に記載される通り、処理プロセスが多い。
【０００４】
また、培養工程以降の複数の製造工程から一定時間毎に採取される多数の試料液に対して手作業で定量する必要があるため、測定作業者の負担は非常に大きかった。また、培養槽から手作業により採取を行うため、採取時に外界の細菌、ウイルスが培養槽に混入し、培養細胞が死滅する危険性があった。
【０００５】
更に、この方式では深さ数ｍｍ程度の比較的大きな反応場で、拡散律速である抗原抗体反応を行うため、試料を採取してから分析結果を得るまでの測定所要時間が３時間以上を要し、培養状態の監視や製品の品質管理を行うには十分なものではなかった。培養状態の監視、高品質な製品管理を行うためには測定所要時間を約２０分以下に低減する必要がある。
【０００６】
高速測定が可能であり、かつ作業者の負担を軽減する方法としては、「高速液体クロマトグラフィハンドブック、改訂２版（日本分析化学会関東支部編、丸善発行）」に記載されているような高速液体クロマトグラフを用いた自動定量方法が考えられる。
【０００７】
この方法はカラムへの蛋白の吸着・脱離を利用して分離・定量するものであるが、試料液を微細な吸着カラムに送液する必要があるため、高圧ポンプが必要となる。また配管類に耐圧部品を使用する必要があるので、装置が大型化する問題があった。
【０００８】
特開２００１−４６２８号公報には、ガラス基板にマイクロチャンネル反応部とマイクロチャンネル流入部を形成した免疫分析マイクロチップが開示されている。このマイクロチャンネル反応部には固体粒子が充填され、この固体粒子上で抗原抗体反応を行わせ、光熱変換分析により分析する。
【０００９】
高速測定できる方法としては、特開２００２−１４８２５８号公報に記載されているようなＳＰＲセンサを用いた測定方法がある。この方法は、金属薄膜表面に物質が付着する事により表面プラズモンの励起角がシフトする事を利用して付着量を測定するものである。
【００１０】
しかし、励起角は温度依存性が非常に強いため、ペルチェ素子等を用いた±０．１℃以下の厳密な温度管理が必要となる問題があり、温度管理が出来ない場合はセンサを2つ用意してリファレンス測定しなければならない。また、不純物の影響を受けやすいため測定毎にセンサを校正する必要あり、感度は高いが誤差が大きい。更に励起角をスキャンするためレーザー源の回転装置が必要となり、装置構成が複雑で高価である。
【００１１】
以上、ＳＰＲ、従来型ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）の問題点を列挙すると以下のとおりである。
（１）ＳＰＲ；厳密な温度管理、測定毎の校正が必要、誤差大、装置複雑、高価。
（２）従来型ＥＬＩＳＡ；分析速度が遅い。
（３）ＨＰＣＬ；大型化、分析速度が遅い。
【００１２】
【特許文献１】
特開２００２−１４８２５８号公報（要約）
【特許文献２】
特開２００１−４６２８号公報（要約、特許請求の範囲）
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高速測定可能で、試料液の採取時に各工程機器のコンタミネーションがない蛋白質定量装置及び測定方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、細胞の培養工程、分離工程及び培養生産物の精製工程を含むフローから試料液をオンラインで採取するサンプリング部と、該試料液を希釈及び濾過の少なくとも一方を実施して液組成を調整する前処理部と、調整して得られた液に含まれる蛋白質を抗原抗体反応により定量する計測部と、上記構成による装置の一連の動作を制御する制御部とを含む蛋白質の定量装置及び定量方法に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明による蛋白質自動計測装置は、生体細胞を培養して蛋白質を生産するプラントの細胞培養工程、培養に続く分離工程及び培養生産物の精製工程を含むフローから少なくとも１回試料液をオンラインで採取するサンプリング部と、該試料液を希釈及び濾過の少なくとも一方を実施してマイクロフローセルを流通し得るように液組成を調整する前処理部と、該調整液に含まれる蛋白質と酵素を反応させるマイクロフローセルと、反応によって得られた結果により蛋白質を定量する計測部と、上記装置構成部の一連の動作を自動的に制御する制御部と、定量結果を記録する記録部とから構成される。
【００１６】
本発明は、蛋白質と酵素を抗体抗原反応させ発色させるマイクロフローセルとして、特開２００１−４６２８号公報に記載されたようなマイクロチャネル反応装置を用いることができる。また、図１に示すようなマイクロフローセルを使用することができる。
マイクロフローセルを用いると、液体クロマトグラフィを利用する場合と比べて大幅に反応時間を短縮することができる。マイクロフローセルの反応部の断面積は、０．０４ｍｍ2以下とする。断面積が大きいと、反応時間が長くなり、培養プラントなどのオンラインモニターの信頼性が低くなる。
本発明で使用するマイクロフローセルの概略を図１に示すように、上下に２枚の基板１、２から構成されている。下基板にはマイクロチャンネル３、４が形成され、試料や試薬が管５，６から供給される。所定の反応をした試料は管７、８から光学検出部に供給される。
このマイクロフローセルはデスポーザブルであり、１回の反応毎に処分し、試料が変われば新しいフローセルと交換される。マイクロチャンネルは反応速度の関係から、その断面積を０．０４ｍｍ2以下とする。
【００１７】
従って、試料はきわめて細い流路反応部を通過させなければならないので、反応試料をそのままで供給することができない。そのため、採取した試料を予め希釈するか、濾過して、試料が狭隘な反応路を通過できるようにすることが必要である。本発明においては、希釈と濾過の両方を実施してもよいことは言うまでも無い。
特開２００１−４６２８号公報に記載の分析方法においては、標識抗体として金コロイドを用い、熱レンズ顕微鏡を用いる光熱変換分析を用いているが、コロイドを励起するための光源を用いるため、装置が複雑化、高価となる問題がある。本発明は、酵素と蛋白質を発色反応させ、これを光学系により検出するので、装置構成が極めて単純化され、コストも抑制できる。
本発明において、マイクロフローセル内で酵素の反応基質液と蛋白をほぼ一定の速度で流しながら接触させることにより、発色性の色素に変換する。そして特定波長における吸光度あるいは蛍光発色量によって定量する。これは、ＬＤＨ（ラクトースデヒドロゲナーゼ）などの検出に用いられる。
目的の生産物に対して選択的親和性を有する一次抗体をマイクロフローセルの流路内に予め固定化し、酵素標識免疫吸着分析法の原理を用いて目的物を酵素で標識し、酵素による発色反応によって提供することもできる。この抗体検出は、上記ＬＤＨの検出と平行して実施できるように、ＬＤＨ検出用マイクロフローセルと抗体検出用のマイクロフローセルを配置しても良い。
本発明による計測部は、複数の試薬を微小流路へ送液する手段と、交換可能な微小流路部と、光源及び光源から発した光のうち、特定波長の光のみを透過する光学フィルタと、反応基質を溜める光学セルと、光学セル中の試薬を透過した光の強度を測定する受光素子を含む構成を有する。
また、マイクロフローセルと光学セル後段に、液送切り替え手段を有し、光学セルもしくは廃液タンクへの送液を選択できるようにする。
本発明によれば、各工程からの試料液をオンラインで採取するので、外界雰囲気と試料液が接触することが無く、装置への細菌類の混入が無く、各工程での生体細胞の死滅、もしくは試料液の劣化を防止することができる。また、作業員による試料液の手作業採取ではなく、自動採取を行えば、作業員の負担を大幅に低減することができる。
【００１８】
また、採取した試料液を希釈により、塩濃度、ｐＨ等の液状態が調整されるため、測定部での抗原抗体反応の安定性を向上し、測定誤差を低減することができると共に、濾過を容易にすることが可能である。
【００１９】
更に、試料液の濾過を行うことにより、不純物が測定部に供給されるのを防止できるため、測定精度を向上することができる。更に、抗原抗体反応を用いた測定方法であるため、従来法である高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）のような微細なカラムを通過させる必要がなく、高圧ポンプおよび耐圧仕様の配管が不要にでき、装置の小型化およびコスト低減が可能である。
【００２０】
本発明の他の実施態様によれば、蛋白質自動計測装置は、計測部において縦断面積が０．０４ｍｍ2以下の微小流路内で抗原抗体反応を行うことにより蛋白質を定量することを特徴とする。本発明によれば、縦断面積が０．０４ｍｍ2以下の微小流路内で拡散律速である抗原抗体反応を行うため、拡散時間が低減され、定量時間を大幅に低減することが可能である。
【００２１】
従来の測定方法では深さ２ｍｍ程度の反応場で分析に３時間要していたが、反応場を１／１０である０．２ｍｍ角以下に微小化することにより測定所要時間を約１／１００にでき、目標の５分以下に短縮できるため、培養状態監視、高品質な製品管理が可能である。
【００２２】
本発明の更に他の蛋白質自動計測装置よれば、蛋白質の検出手段として蛍光光度測定法、発色吸光度測定法、燐光光度測定法の何れか一つを用いる。本発明によれば、検出手段として発色吸光度測定法を用いるので、装置の小型化が可能である。これは、光源、光学フィルタおよび受光素子といった小型簡易機器の構成で光学測定が行えるためである。
【００２３】
本発明の実施形態を図面により以下詳細に説明する。図２は本蛋白質自動計測装置のシステム図である。図２に示す通り、この装置は以下の装置構成を含んでいる。
（１）生体細胞を培養して蛋白質を生産するプラントの細胞培養工程２１１と分離工程１２、或いは培養生産物の精製工程１３の内、少なくとも一つの処理工程又はそれぞれの工程前後の配管や貯槽などから試料液を自動採取するオンラインサンプリング部１４、１４′、１４″。
【００２４】
従って試料は少なくとも上記３つの工程を含むフローから採取される。試料は更に他の工程又はその前後から採取しても良いことは言うまでも無い。
（２）該試料液を希釈或いは濾過の少なくとも一方を実施してマイクロフローセルを流通し得るように液組成を調整する前処理部１５、１５′、１５″。
（３）該調整液に含まれる蛋白質を、マイクロフローセルを用いて抗原抗体反応を利用して発光させ定量する計測部１６、１６′、１６″。発光信号は光学系を用いて簡単に検出できる。
（４）上記構成による装置の一連の動作を自動的に制御する制御部１７、１７′、１７″。
（５）定量結果を記録する記録部１８、１８′、１８″。
【００２５】
図３、図４は、マイクロフローセルを含む測定系を詳細に説明する図である。図３と図４で同じ符号は同じ要素を示し、図２と同じ符号も同じ要素を示す。
【００２６】
図３、図４において、計測部１６はサンプリング部１４で採取された試料はマイクロフローセルに送られ、これに必要な試薬がポンプにより供給される。試料中の蛋白質はマイクロフローセルのマイクロチャンネルに充填されたポリマービーズに固定された酵素と反応し発色する。そして試料はビーズとともに光学セルに光学的に結合され、検出される。検出の終わったビーズ及び試料は廃液タンクに送られる。
図４には、マイクロフローセルに送られた試料液の内、蛋白質を含む液体をマイクロフローセル後段のローターリーバルブ等の送液切替装置で廃液タンクに直接送液する場合の装置構成を示す。蛋白質を含む液体を光学セルを経由せずに送液できるため、光学セルへの蛋白質の付着を防止できるため、測定結果の誤差を低減することが可能である。
【００２７】
図５は培養槽から培養液を採取し、ＥＬＩＳＡ法により蛋白質を定量する場合の機器構成の一例である。図５を用いて、培養工程から培養液を採取してマイクロフローセルを利用したＥＬＩＳＡ法により蛋白質を定量し、結果を記録するまでの動作を説明する。
【００２８】
尚、本定量装置の測定対象となる蛋白質は、生体細胞が増殖して培養液中に分泌する生産蛋白質のみでなく、生体細胞が死滅して細胞内から培養液中に流出したＬＤＨ等の酵素蛋白質も含まれる。
【００２９】
まず、外界と培養液が接触しないように培養槽１１に接続されたサンプリング管１９から、ポンプ３０を用いて培養液をオンラインで採取し、これを前処理部１５に送液する。オンラインで自動採取を行うため、従来の手作業採取と異なり、外界からの細菌の混入がない。従って、試料液の劣化を防止できると共に、作業員の負担が低減できる。送液時の脈動を低減することにより定量結果の誤差を抑制する観点から、ポンプはシリンジポンプが好ましいが、ピエゾポンプでも構わない。
【００３０】
前処理部１５に送液された培養液は、まず粗フィルタ１１０で粗く細胞組織等の不純物を除去した後に、希釈混合セル１１１に送液する。同時に希釈液タンク２４からポンプ２５を用いて希釈混合セル１１１に希釈液を指定量供給する。希釈混合セル１１１に供給された二液を混合機１１２により均一混合した後、ポンプ２７を用いて精密フィルタ１１４に送液し、測定用に調整された試料液を計測部１６に送液する。
【００３１】
粗フィルタ１１０で予め細胞組織等の不純物を濾過しているため、希釈混合セル１１１における試薬の希釈が容易に行える。また、希釈液にｐＨ緩衝液を用いることにより、試料液のｐＨを安定させることができるので、後の計測部１６での抗原抗体反応を安定化させて、測定誤差を低減することができる。
【００３２】
混合機１１２は、試料液と非接触で短時間に液を均一混合させる観点から、ピエゾ素子を用いた超音波振動装置、もしくはモーターを用いた振動混合機を用いることが望ましいが、磁性攪拌子を用いた混合機でも構わない。また、精密フィルタ１１４により後段の計測部１６の微小流路で閉塞の恐れのある不純物を除去するため、微小流路内での試薬流れを安定化することができ、反応の安定化による測定誤差の低減が可能である。
【００３３】
計測部１６へは前処理部１５で調整された試料液の他に、ＥＬＩＳＡ法による測定に必要な試薬が、試薬タンク２６、２８からポンプ２７、２９を用いて送液される。まず、断面積１ｍｍ2以下の微小流路に予め測定対象である蛋白質（抗原）に対する一次抗体を固相化したマイクロフローセル（反応槽）１１６に、調整された試料液を流し、一次抗体に結合させる。順次、二次抗体液、発色酵素液を送液しそれらを結合させた後、基質液を流す。
【００３４】
基質液は発色酵素との接触により計測部１６内部で発色し、後段の光学セル２０に送られる。
【００３５】
光学ランプ１１８で発生した光の内、発色した基質に吸収される波長の光を光学フィルタ１１９で選択して、光学セル２０を透過させる。透過光の発色吸光度を受光素子２２で測定した後、基質液は廃液タンク２３に送液される。
【００３６】
尚、基質液以外の試薬には蛋白質が含まれるため、これを光学セル２０に送った場合、セル表面への蛋白吸着により測定誤差を生じる恐れがある。このため、基質液以外は送液切り替え装置１１７で廃液タンクに直接選択送液する。
【００３７】
送液選択装置１１７は低デッドボリュームのロータリーバルブ単独でも構わないし、反応槽１１６の内部に分岐形状の微小流路を持たすことにより反応槽１１６の内部に送液選択機能を持たせても構わない。低デッドボリュームのロータリーバルブを用いた場合は、試薬間のコンタミネーションが防止できるため測定精度を向上させることが可能である。また、分岐型の微小流路を用いた場合、接液面への蛋白の吸着によるロータリーバルブの劣化を防止することが可能である。
【００３８】
反応槽１１６の一例としては、特開２００１−４６２８に記載されているマイクロリアクタが挙げられる。従来の測定方法では深さ２ｍｍ程度の反応場で分析に３時間要していたが、反応場を１／１０である０．０２ｍｍ角以下に微小化することにより測定所要時間を約１／１００に短縮され、５分以下に短縮できるため、培養状態監視、高品質な製品管理が可能である。
【００３９】
測定が終了した試料液は廃液溜め２３に送られ分析が終了する。また反応槽の温度は温度センサ３３により測定されヒーターもしくはペルチェ素子３４により温度管理が行われる。更に希釈タンク２４、試薬タンク２６、２８の液体は温度により劣化しやすいため２〜１０℃で保存できるように３３と冷却装置３１により温度管理が行われる。
【００４０】
ポンプによる試料液、試薬の送液、希釈セルの混合装置の作動、送液選択装置の動作、反応槽の温度調節、試薬保管庫の温度調節、測定結果の出力、光学系の制御は全て制御装置により行われる。光学測定結果は記録計８へ出力される。
【００４１】
上記実施例によれば、試料液をオンラインで採取するので、外界雰囲気と試料液が接触することが無く、装置への細菌類の混入が無い。そのため、培養工程での生体細胞の死滅、もしくは分離・精製工程での試料液の劣化を防止することができる。また、自動採取を行うため、作業員の負担を大幅に低減することができる。
【００４２】
また、採取した試料液を前処理部で塩濃度、ｐＨ等の液状態が調整されるため、抗原抗体反応の安定性を向上し、測定誤差を低減することができる。また、抗原抗体反応を用いた測定方法であるため、従来法である高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）のような微細なカラムを通過させる必要がない。
【００４３】
その結果、高圧ポンプおよび耐圧仕様の配管が不要にでき、装置の小型化およびコスト低減が可能である。
【００４４】
更に、縦断面積が１ｍｍ２以下の微小流路内で拡散律速である抗原抗体反応を行うため、拡散時間が従来の１／９に低減され、定量時間を２０分以下に短縮することが可能である。またこれにより、培養状態監視、高品質な製品管理が可能である。
【００４５】
また、蛋白質の検出手段として蛍光光度測定法、発色吸光度測定法、燐光光度測定法の何れかを用いるので、光源、光学フィルタおよび受光素子といった小型簡易機器の組合せで光学測定が行える。そのため装置の小型化が可能である。
【００４６】
上記実施例に拠れば、試料液をオンラインで採取するので、外界雰囲気と試料液との接触を防止できる。このため、装置への細菌類の混入が防げるため、培養工程での生体細胞の死滅、もしくは分離・精製工程での試料液の劣化を防止することができる。
【００４７】
自動採取を行うため、作業員の負担を大幅に低減することができる。採取した試料液を前処理部で塩濃度、ｐＨ等の液状態が調整されるため、抗原抗体反応の安定性を向上し、測定誤差を低減することができる。
【００４８】
抗原抗体反応を用いた測定方法であるため、従来法であるＨＰＬＣのような微細なカラムを通過させる必要がないため、高圧ポンプおよび耐圧仕様の配管が不要にでき、装置の小型化およびコスト低減が可能である。
【００４９】
更に、縦断面積が０．０４ｍｍ2以下の微小流路内で拡散律速である抗原抗体反応を行うため、拡散時間が従来の１／１００に低減され、定量時間を５分以下に短縮することが可能である。またこれにより、培養状態監視、高品質な製品管理が可能である。
【００５０】
また、蛋白質の検出手段として蛍光光度測定法、発色吸光度測定法、燐光光度測定法の何れかを用いるので、光源、光学フィルタおよび受光素子といった小型簡易機器の組合せで光学測定が行えるため装置の小型化が可能である。
【００５１】
試料液をオンラインで採取するので、外界雰囲気と試料液が接触することが無く、装置への細菌類の混入が無いため、培養工程での生体細胞の死滅、もしくは分離・精製工程での試料液の劣化を防止することができる。
【００５２】
表１にＤＮＡポリメラーゼα抗体（ＩｇＧ）を分泌生産するマウス−マウスハイブリドーマＳＴＫ−１を１Ｌの培養槽で培養し、本発明および従来ＥＬＩＳＡ法で培養液中の抗体濃度を測定した際の分析所要時間を示す。
【００５３】
本発明の測定方法においては、予めマイクロ流路内にニワトリ抗マウスＩｇＧ固定し、ここにＩｇＧを含む試料液を５０μＬ／分で流した後に、牛血清アルブミン液で洗浄した。次にビオチン標識したウマ抗マウスＩｇＧを流し、再び牛血清アルブミン液を流した後、アビジン標識したアルカリフォスファターゼを流した。
【００５４】
ここに牛血清アルブミン液を流し洗浄を行った後に、ｐ−ニトロフェニルリン酸を流し、４０５ｎｍでの発色吸光度を測定した。また、従来のＥＬＩＳＡ法においても同様に、予め底面にニワトリ抗マウスＩｇＧを吸着させたウェルプレートに、マウスＩｇＧを含む培養液を注入しプレートを洗浄した後、牛血清アルブミン液でプレートを洗浄し、ここにビオチン標識したウマ抗マウスＩｇＧを流した。次に牛血清アルブミン液を流した後、アビジン標識したアルカリフォスファターゼを流し、ここに牛血清アルブミン液を流し洗浄を行った後に、ｐ−ニトロフェニルリン酸を流し、４０５ｎｍでの発色吸光度を測定した。
【００５５】
その結果、従来ＥＬＩＳＡ法では分析に数時間要するのに対して、本発明の分析方法では約５分で測定が行え、更に試料液を１／１０以下に低減することが可能であった。図６に両者の測定結果の比較を示す通り、本発明の測定方法は従来のＥＬＩＳＡ法とほぼ同じ測定値が得られることが分かった。
【００５６】
【表１】
【００５７】
【発明の効果】
本発明によれば、簡単な装置構成で、蛋白質の定量が短時間で実施でき、また試料のコンタミネーションが防止でき、信頼性の高い分析ができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による蛋白質自動計測装置におけるマイクロフローセルの該楽を示す斜視図。
【図２】本発明による蛋白質自動計測装置のシステムの一実施例のブロック図。
【図３】本発明のシステムにおいて用いられる測定部の具体的構成を説明するブロック図。
【図４】本発明のシステムにおいて用いられるＬＤＨ測定と抗体測定を切り替える手段を説明するブロック図。
【図５】本発明のシステムにおいて用いられる蛍光光度測定法又は燐光光度測定法による蛋白質定量法を説明するブロック図。
【図６】本発明と従来ＥＬＩＳＡ法による分析結果の比較を示すグラフ。
【符号の説明】
１１、１１１…培養槽、１２…分離工程、１３…精製工程、１４…サンプリング部、１５…前処理部、１６…計測部、１７…制御部、１８…記録部、１９…サンプリング管、２０…光学セル、２２…受光素子、２３…廃液タンク、２４…希釈液タンク、２５、２７，２９，３０…ポンプ、２６…試薬タンク、３１…冷却装置、３２、３３…温度センサ、３４…ペルチェ素子、３５…反応槽用光学セル、１１０…粗フィルタ、１１１…希釈混合セル、１１２…混合機、１１４…精密フィルタ、１１５、１１７…送液選択装置、１１６…反応槽、１１８…光学ランプ、１１９…光学フィルタ。
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養プラントなどにおける蛋白質定量方法及びその装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗体等の高分子蛋白質医薬品は培養槽内で生体細胞を培養して生産される。この後、培養液から生産物である医薬品を分離・精製し出荷される。これら医薬品は品質および安全性を保証する必要があるため、生体細胞の培養工程のみでなく、それ以降の分離工程、精製工程においても実際に医薬品が正常処理されているか確認することが要求される。特に近年、ＧＭＰ（医薬品の優良製造規範）が施行されたため品質保証のニーズが高まっている。
【０００３】
従来、これら高分子医薬品は作業員が各処理工程から培養液もしくは試料液を手作業で採取し、マイクロウェルプレートを用いたＥＬＩＳＡ（酵素標識免疫吸着分析）法により定量されていた。この分析作業は「免疫学イラストレイテッド（多田富雄監訳、南江堂発行、２０００年１月）」に記載される通り、処理プロセスが多い。
【０００４】
また、培養工程以降の複数の製造工程から一定時間毎に採取される多数の試料液に対して手作業で定量する必要があるため、測定作業者の負担は非常に大きかった。また、培養槽から手作業により採取を行うため、採取時に外界の細菌、ウイルスが培養槽に混入し、培養細胞が死滅する危険性があった。
【０００５】
更に、この方式では深さ数ｍｍ程度の比較的大きな反応場で、拡散律速である抗原抗体反応を行うため、試料を採取してから分析結果を得るまでの測定所要時間が３時間以上を要し、培養状態の監視や製品の品質管理を行うには十分なものではなかった。培養状態の監視、高品質な製品管理を行うためには測定所要時間を約２０分以下に低減する必要がある。
【０００６】
高速測定が可能であり、かつ作業者の負担を軽減する方法としては、「高速液体クロマトグラフィハンドブック、改訂２版（日本分析化学会関東支部編、丸善発行）」に記載されているような高速液体クロマトグラフを用いた自動定量方法が考えられる。
【０００７】
この方法はカラムへの蛋白の吸着・脱離を利用して分離・定量するものであるが、試料液を微細な吸着カラムに送液する必要があるため、高圧ポンプが必要となる。また配管類に耐圧部品を使用する必要があるので、装置が大型化する問題があった。
【０００８】
特開２００１−４６２８号公報には、ガラス基板にマイクロチャンネル反応部とマイクロチャンネル流入部を形成した免疫分析マイクロチップが開示されている。このマイクロチャンネル反応部には固体粒子が充填され、この固体粒子上で抗原抗体反応を行わせ、光熱変換分析により分析する。
【０００９】
高速測定できる方法としては、特開２００２−１４８２５８号公報に記載されているようなＳＰＲセンサを用いた測定方法がある。この方法は、金属薄膜表面に物質が付着する事により表面プラズモンの励起角がシフトする事を利用して付着量を測定するものである。
【００１０】
しかし、励起角は温度依存性が非常に強いため、ペルチェ素子等を用いた±０．１℃以下の厳密な温度管理が必要となる問題があり、温度管理が出来ない場合はセンサを2つ用意してリファレンス測定しなければならない。また、不純物の影響を受けやすいため測定毎にセンサを校正する必要あり、感度は高いが誤差が大きい。更に励起角をスキャンするためレーザー源の回転装置が必要となり、装置構成が複雑で高価である。
【００１１】
以上、ＳＰＲ、従来型ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）の問題点を列挙すると以下のとおりである。
（１）ＳＰＲ；厳密な温度管理、測定毎の校正が必要、誤差大、装置複雑、高価。
（２）従来型ＥＬＩＳＡ；分析速度が遅い。
（３）ＨＰＣＬ；大型化、分析速度が遅い。
【００１２】
【特許文献１】
特開２００２−１４８２５８号公報（要約）
【特許文献２】
特開２００１−４６２８号公報（要約、特許請求の範囲）
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高速測定可能で、試料液の採取時に各工程機器のコンタミネーションがない蛋白質定量装置及び測定方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、細胞の培養工程、分離工程及び培養生産物の精製工程を含むフローから試料液をオンラインで採取するサンプリング部と、該試料液を希釈及び濾過の少なくとも一方を実施して液組成を調整する前処理部と、調整して得られた液に含まれる蛋白質を抗原抗体反応により定量する計測部と、上記構成による装置の一連の動作を制御する制御部とを含む蛋白質の定量装置及び定量方法に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明による蛋白質自動計測装置は、生体細胞を培養して蛋白質を生産するプラントの細胞培養工程、培養に続く分離工程及び培養生産物の精製工程を含むフローから少なくとも１回試料液をオンラインで採取するサンプリング部と、該試料液を希釈及び濾過の少なくとも一方を実施してマイクロフローセルを流通し得るように液組成を調整する前処理部と、該調整液に含まれる蛋白質と酵素を反応させるマイクロフローセルと、反応によって得られた結果により蛋白質を定量する計測部と、上記装置構成部の一連の動作を自動的に制御する制御部と、定量結果を記録する記録部とから構成される。
【００１６】
本発明は、蛋白質と酵素を抗体抗原反応させ発色させるマイクロフローセルとして、特開２００１−４６２８号公報に記載されたようなマイクロチャネル反応装置を用いることができる。また、図１に示すようなマイクロフローセルを使用することができる。
マイクロフローセルを用いると、液体クロマトグラフィを利用する場合と比べて大幅に反応時間を短縮することができる。マイクロフローセルの反応部の断面積は、０．０４ｍｍ2以下とする。断面積が大きいと、反応時間が長くなり、培養プラントなどのオンラインモニターの信頼性が低くなる。
本発明で使用するマイクロフローセルの概略を図１に示すように、上下に２枚の基板１、２から構成されている。下基板にはマイクロチャンネル３、４が形成され、試料や試薬が管５，６から供給される。所定の反応をした試料は管７、８から光学検出部に供給される。
このマイクロフローセルはデスポーザブルであり、１回の反応毎に処分し、試料が変われば新しいフローセルと交換される。マイクロチャンネルは反応速度の関係から、その断面積を０．０４ｍｍ2以下とする。
【００１７】
従って、試料はきわめて細い流路反応部を通過させなければならないので、反応試料をそのままで供給することができない。そのため、採取した試料を予め希釈するか、濾過して、試料が狭隘な反応路を通過できるようにすることが必要である。本発明においては、希釈と濾過の両方を実施してもよいことは言うまでも無い。
特開２００１−４６２８号公報に記載の分析方法においては、標識抗体として金コロイドを用い、熱レンズ顕微鏡を用いる光熱変換分析を用いているが、コロイドを励起するための光源を用いるため、装置が複雑化、高価となる問題がある。本発明は、酵素と蛋白質を発色反応させ、これを光学系により検出するので、装置構成が極めて単純化され、コストも抑制できる。
本発明において、マイクロフローセル内で酵素の反応基質液と蛋白をほぼ一定の速度で流しながら接触させることにより、発色性の色素に変換する。そして特定波長における吸光度あるいは蛍光発色量によって定量する。これは、ＬＤＨ（ラクトースデヒドロゲナーゼ）などの検出に用いられる。
目的の生産物に対して選択的親和性を有する一次抗体をマイクロフローセルの流路内に予め固定化し、酵素標識免疫吸着分析法の原理を用いて目的物を酵素で標識し、酵素による発色反応によって提供することもできる。この抗体検出は、上記ＬＤＨの検出と平行して実施できるように、ＬＤＨ検出用マイクロフローセルと抗体検出用のマイクロフローセルを配置しても良い。
本発明による計測部は、複数の試薬を微小流路へ送液する手段と、交換可能な微小流路部と、光源及び光源から発した光のうち、特定波長の光のみを透過する光学フィルタと、反応基質を溜める光学セルと、光学セル中の試薬を透過した光の強度を測定する受光素子を含む構成を有する。
また、マイクロフローセルと光学セル後段に、液送切り替え手段を有し、光学セルもしくは廃液タンクへの送液を選択できるようにする。
本発明によれば、各工程からの試料液をオンラインで採取するので、外界雰囲気と試料液が接触することが無く、装置への細菌類の混入が無く、各工程での生体細胞の死滅、もしくは試料液の劣化を防止することができる。また、作業員による試料液の手作業採取ではなく、自動採取を行えば、作業員の負担を大幅に低減することができる。
【００１８】
また、採取した試料液を希釈により、塩濃度、ｐＨ等の液状態が調整されるため、測定部での抗原抗体反応の安定性を向上し、測定誤差を低減することができると共に、濾過を容易にすることが可能である。
【００１９】
更に、試料液の濾過を行うことにより、不純物が測定部に供給されるのを防止できるため、測定精度を向上することができる。更に、抗原抗体反応を用いた測定方法であるため、従来法である高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）のような微細なカラムを通過させる必要がなく、高圧ポンプおよび耐圧仕様の配管が不要にでき、装置の小型化およびコスト低減が可能である。
【００２０】
本発明の他の実施態様によれば、蛋白質自動計測装置は、計測部において縦断面積が０．０４ｍｍ2以下の微小流路内で抗原抗体反応を行うことにより蛋白質を定量することを特徴とする。本発明によれば、縦断面積が０．０４ｍｍ2以下の微小流路内で拡散律速である抗原抗体反応を行うため、拡散時間が低減され、定量時間を大幅に低減することが可能である。
【００２１】
従来の測定方法では深さ２ｍｍ程度の反応場で分析に３時間要していたが、反応場を１／１０である０．２ｍｍ角以下に微小化することにより測定所要時間を約１／１００にでき、目標の５分以下に短縮できるため、培養状態監視、高品質な製品管理が可能である。
【００２２】
本発明の更に他の蛋白質自動計測装置よれば、蛋白質の検出手段として蛍光光度測定法、発色吸光度測定法、燐光光度測定法の何れか一つを用いる。本発明によれば、検出手段として発色吸光度測定法を用いるので、装置の小型化が可能である。これは、光源、光学フィルタおよび受光素子といった小型簡易機器の構成で光学測定が行えるためである。
【００２３】
本発明の実施形態を図面により以下詳細に説明する。図２は本蛋白質自動計測装置のシステム図である。図２に示す通り、この装置は以下の装置構成を含んでいる。
（１）生体細胞を培養して蛋白質を生産するプラントの細胞培養工程２１１と分離工程１２、或いは培養生産物の精製工程１３の内、少なくとも一つの処理工程又はそれぞれの工程前後の配管や貯槽などから試料液を自動採取するオンラインサンプリング部１４、１４′、１４″。
【００２４】
従って試料は少なくとも上記３つの工程を含むフローから採取される。試料は更に他の工程又はその前後から採取しても良いことは言うまでも無い。
（２）該試料液を希釈或いは濾過の少なくとも一方を実施してマイクロフローセルを流通し得るように液組成を調整する前処理部１５、１５′、１５″。
（３）該調整液に含まれる蛋白質を、マイクロフローセルを用いて抗原抗体反応を利用して発光させ定量する計測部１６、１６′、１６″。発光信号は光学系を用いて簡単に検出できる。
（４）上記構成による装置の一連の動作を自動的に制御する制御部１７、１７′、１７″。
（５）定量結果を記録する記録部１８、１８′、１８″。
【００２５】
図３、図４は、マイクロフローセルを含む測定系を詳細に説明する図である。図３と図４で同じ符号は同じ要素を示し、図２と同じ符号も同じ要素を示す。
【００２６】
図３、図４において、計測部１６はサンプリング部１４で採取された試料はマイクロフローセルに送られ、これに必要な試薬がポンプにより供給される。試料中の蛋白質はマイクロフローセルのマイクロチャンネルに充填されたポリマービーズに固定された酵素と反応し発色する。そして試料はビーズとともに光学セルに光学的に結合され、検出される。検出の終わったビーズ及び試料は廃液タンクに送られる。
図４には、マイクロフローセルに送られた試料液の内、蛋白質を含む液体をマイクロフローセル後段のローターリーバルブ等の送液切替装置で廃液タンクに直接送液する場合の装置構成を示す。蛋白質を含む液体を光学セルを経由せずに送液できるため、光学セルへの蛋白質の付着を防止できるため、測定結果の誤差を低減することが可能である。
【００２７】
図５は培養槽から培養液を採取し、ＥＬＩＳＡ法により蛋白質を定量する場合の機器構成の一例である。図５を用いて、培養工程から培養液を採取してマイクロフローセルを利用したＥＬＩＳＡ法により蛋白質を定量し、結果を記録するまでの動作を説明する。
【００２８】
尚、本定量装置の測定対象となる蛋白質は、生体細胞が増殖して培養液中に分泌する生産蛋白質のみでなく、生体細胞が死滅して細胞内から培養液中に流出したＬＤＨ等の酵素蛋白質も含まれる。
【００２９】
まず、外界と培養液が接触しないように培養槽１１に接続されたサンプリング管１９から、ポンプ３０を用いて培養液をオンラインで採取し、これを前処理部１５に送液する。オンラインで自動採取を行うため、従来の手作業採取と異なり、外界からの細菌の混入がない。従って、試料液の劣化を防止できると共に、作業員の負担が低減できる。送液時の脈動を低減することにより定量結果の誤差を抑制する観点から、ポンプはシリンジポンプが好ましいが、ピエゾポンプでも構わない。
【００３０】
前処理部１５に送液された培養液は、まず粗フィルタ１１０で粗く細胞組織等の不純物を除去した後に、希釈混合セル１１１に送液する。同時に希釈液タンク２４からポンプ２５を用いて希釈混合セル１１１に希釈液を指定量供給する。希釈混合セル１１１に供給された二液を混合機１１２により均一混合した後、ポンプ２７を用いて精密フィルタ１１４に送液し、測定用に調整された試料液を計測部１６に送液する。
【００３１】
粗フィルタ１１０で予め細胞組織等の不純物を濾過しているため、希釈混合セル１１１における試薬の希釈が容易に行える。また、希釈液にｐＨ緩衝液を用いることにより、試料液のｐＨを安定させることができるので、後の計測部１６での抗原抗体反応を安定化させて、測定誤差を低減することができる。
【００３２】
混合機１１２は、試料液と非接触で短時間に液を均一混合させる観点から、ピエゾ素子を用いた超音波振動装置、もしくはモーターを用いた振動混合機を用いることが望ましいが、磁性攪拌子を用いた混合機でも構わない。また、精密フィルタ１１４により後段の計測部１６の微小流路で閉塞の恐れのある不純物を除去するため、微小流路内での試薬流れを安定化することができ、反応の安定化による測定誤差の低減が可能である。
【００３３】
計測部１６へは前処理部１５で調整された試料液の他に、ＥＬＩＳＡ法による測定に必要な試薬が、試薬タンク２６、２８からポンプ２７、２９を用いて送液される。まず、断面積１ｍｍ2以下の微小流路に予め測定対象である蛋白質（抗原）に対する一次抗体を固相化したマイクロフローセル（反応槽）１１６に、調整された試料液を流し、一次抗体に結合させる。順次、二次抗体液、発色酵素液を送液しそれらを結合させた後、基質液を流す。
【００３４】
基質液は発色酵素との接触により計測部１６内部で発色し、後段の光学セル２０に送られる。
【００３５】
光学ランプ１１８で発生した光の内、発色した基質に吸収される波長の光を光学フィルタ１１９で選択して、光学セル２０を透過させる。透過光の発色吸光度を受光素子２２で測定した後、基質液は廃液タンク２３に送液される。
【００３６】
尚、基質液以外の試薬には蛋白質が含まれるため、これを光学セル２０に送った場合、セル表面への蛋白吸着により測定誤差を生じる恐れがある。このため、基質液以外は送液切り替え装置１１７で廃液タンクに直接選択送液する。
【００３７】
送液選択装置１１７は低デッドボリュームのロータリーバルブ単独でも構わないし、反応槽１１６の内部に分岐形状の微小流路を持たすことにより反応槽１１６の内部に送液選択機能を持たせても構わない。低デッドボリュームのロータリーバルブを用いた場合は、試薬間のコンタミネーションが防止できるため測定精度を向上させることが可能である。また、分岐型の微小流路を用いた場合、接液面への蛋白の吸着によるロータリーバルブの劣化を防止することが可能である。
【００３８】
反応槽１１６の一例としては、特開２００１−４６２８に記載されているマイクロリアクタが挙げられる。従来の測定方法では深さ２ｍｍ程度の反応場で分析に３時間要していたが、反応場を１／１０である０．０２ｍｍ角以下に微小化することにより測定所要時間を約１／１００に短縮され、５分以下に短縮できるため、培養状態監視、高品質な製品管理が可能である。
【００３９】
測定が終了した試料液は廃液溜め２３に送られ分析が終了する。また反応槽の温度は温度センサ３３により測定されヒーターもしくはペルチェ素子３４により温度管理が行われる。更に希釈タンク２４、試薬タンク２６、２８の液体は温度により劣化しやすいため２〜１０℃で保存できるように３３と冷却装置３１により温度管理が行われる。
【００４０】
ポンプによる試料液、試薬の送液、希釈セルの混合装置の作動、送液選択装置の動作、反応槽の温度調節、試薬保管庫の温度調節、測定結果の出力、光学系の制御は全て制御装置により行われる。光学測定結果は記録計８へ出力される。
【００４１】
上記実施例によれば、試料液をオンラインで採取するので、外界雰囲気と試料液が接触することが無く、装置への細菌類の混入が無い。そのため、培養工程での生体細胞の死滅、もしくは分離・精製工程での試料液の劣化を防止することができる。また、自動採取を行うため、作業員の負担を大幅に低減することができる。
【００４２】
また、採取した試料液を前処理部で塩濃度、ｐＨ等の液状態が調整されるため、抗原抗体反応の安定性を向上し、測定誤差を低減することができる。また、抗原抗体反応を用いた測定方法であるため、従来法である高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）のような微細なカラムを通過させる必要がない。
【００４３】
その結果、高圧ポンプおよび耐圧仕様の配管が不要にでき、装置の小型化およびコスト低減が可能である。
【００４４】
更に、縦断面積が１ｍｍ２以下の微小流路内で拡散律速である抗原抗体反応を行うため、拡散時間が従来の１／９に低減され、定量時間を２０分以下に短縮することが可能である。またこれにより、培養状態監視、高品質な製品管理が可能である。
【００４５】
また、蛋白質の検出手段として蛍光光度測定法、発色吸光度測定法、燐光光度測定法の何れかを用いるので、光源、光学フィルタおよび受光素子といった小型簡易機器の組合せで光学測定が行える。そのため装置の小型化が可能である。
【００４６】
上記実施例に拠れば、試料液をオンラインで採取するので、外界雰囲気と試料液との接触を防止できる。このため、装置への細菌類の混入が防げるため、培養工程での生体細胞の死滅、もしくは分離・精製工程での試料液の劣化を防止することができる。
【００４７】
自動採取を行うため、作業員の負担を大幅に低減することができる。採取した試料液を前処理部で塩濃度、ｐＨ等の液状態が調整されるため、抗原抗体反応の安定性を向上し、測定誤差を低減することができる。
【００４８】
抗原抗体反応を用いた測定方法であるため、従来法であるＨＰＬＣのような微細なカラムを通過させる必要がないため、高圧ポンプおよび耐圧仕様の配管が不要にでき、装置の小型化およびコスト低減が可能である。
【００４９】
更に、縦断面積が０．０４ｍｍ2以下の微小流路内で拡散律速である抗原抗体反応を行うため、拡散時間が従来の１／１００に低減され、定量時間を５分以下に短縮することが可能である。またこれにより、培養状態監視、高品質な製品管理が可能である。
【００５０】
また、蛋白質の検出手段として蛍光光度測定法、発色吸光度測定法、燐光光度測定法の何れかを用いるので、光源、光学フィルタおよび受光素子といった小型簡易機器の組合せで光学測定が行えるため装置の小型化が可能である。
【００５１】
試料液をオンラインで採取するので、外界雰囲気と試料液が接触することが無く、装置への細菌類の混入が無いため、培養工程での生体細胞の死滅、もしくは分離・精製工程での試料液の劣化を防止することができる。
【００５２】
表１にＤＮＡポリメラーゼα抗体（ＩｇＧ）を分泌生産するマウス−マウスハイブリドーマＳＴＫ−１を１Ｌの培養槽で培養し、本発明および従来ＥＬＩＳＡ法で培養液中の抗体濃度を測定した際の分析所要時間を示す。
【００５３】
本発明の測定方法においては、予めマイクロ流路内にニワトリ抗マウスＩｇＧ固定し、ここにＩｇＧを含む試料液を５０μＬ／分で流した後に、牛血清アルブミン液で洗浄した。次にビオチン標識したウマ抗マウスＩｇＧを流し、再び牛血清アルブミン液を流した後、アビジン標識したアルカリフォスファターゼを流した。
【００５４】
ここに牛血清アルブミン液を流し洗浄を行った後に、ｐ−ニトロフェニルリン酸を流し、４０５ｎｍでの発色吸光度を測定した。また、従来のＥＬＩＳＡ法においても同様に、予め底面にニワトリ抗マウスＩｇＧを吸着させたウェルプレートに、マウスＩｇＧを含む培養液を注入しプレートを洗浄した後、牛血清アルブミン液でプレートを洗浄し、ここにビオチン標識したウマ抗マウスＩｇＧを流した。次に牛血清アルブミン液を流した後、アビジン標識したアルカリフォスファターゼを流し、ここに牛血清アルブミン液を流し洗浄を行った後に、ｐ−ニトロフェニルリン酸を流し、４０５ｎｍでの発色吸光度を測定した。
【００５５】
その結果、従来ＥＬＩＳＡ法では分析に数時間要するのに対して、本発明の分析方法では約５分で測定が行え、更に試料液を１／１０以下に低減することが可能であった。図６に両者の測定結果の比較を示す通り、本発明の測定方法は従来のＥＬＩＳＡ法とほぼ同じ測定値が得られることが分かった。
【００５６】
【表１】
【発明の効果】
本発明によれば、簡単な装置構成で、蛋白質の定量が短時間で実施でき、また試料のコンタミネーションが防止でき、信頼性の高い分析ができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による蛋白質自動計測装置におけるマイクロフローセルの該楽を示す斜視図。
【図２】本発明による蛋白質自動計測装置のシステムの一実施例のブロック図。
【図３】本発明のシステムにおいて用いられる測定部の具体的構成を説明するブロック図。
【図４】本発明のシステムにおいて用いられるＬＤＨ測定と抗体測定を切り替える手段を説明するブロック図。
【図５】本発明のシステムにおいて用いられる蛍光光度測定法又は燐光光度測定法による蛋白質定量法を説明するブロック図。
【図６】本発明と従来ＥＬＩＳＡ法による分析結果の比較を示すグラフ。
【符号の説明】
１１、１１１…培養槽、１２…分離工程、１３…精製工程、１４…サンプリング部、１５…前処理部、１６…計測部、１７…制御部、１８…記録部、１９…サンプリング管、２０…光学セル、２２…受光素子、２３…廃液タンク、２４…希釈液タンク、２５、２７，２９，３０…ポンプ、２６…試薬タンク、３１…冷却装置、３２、３３…温度センサ、３４…ペルチェ素子、３５…反応槽用光学セル、１１０…粗フィルタ、１１１…希釈混合セル、１１２…混合機、１１４…精密フィルタ、１１５、１１７…送液選択装置、１１６…反応槽、１１８…光学ランプ、１１９…光学フィルタ。
Claims (4)
- 細胞の培養工程、培養に続く分離工程及び培養生産物の精製工程を含むフローから試料液を１回以上オンラインでサンプリングし、該試料液を希釈或いは濾過の少なくとも一方を実施して試料液が、反応部の断面積が０．０４ｍｍ ２ 以下であって、目的の生産物に対して選択的親和性を有する一次抗体を前記マイクロフローセルの流路内に予め固定化したマイクロフローセルに流通し得るように、試料液組成を調整し、調整して得られた試料液に含まれる蛋白質をマイクロフローセルにおいて酵素反応によって発色反応させ、蛋白質を定量分析することを特徴とする細胞培養による蛋白質生産プラントの蛋白質計測方法。
- 請求項１記載の蛋白質計測方法において、前記マイクロフローセルはデイスポーザブルであることを特徴とする蛋白質生産プラントの蛋白質計測方法。
- 酵素標識免疫吸着分析法を用いて目的物を酵素で標識し、酵素による発色反応によって分析することを特徴とする請求項１記載の蛋白質生産プラントの蛋白質計測方法。
- 生体細胞を培養して蛋白質を生産するプラントにおいて、細胞の培養工程、培養に続く分離工程及び培養生産物の精製工程を含むフローから少なくとも１回試料液をオンラインで採取するサンプリング部と、該試料液を希釈及び濾過の少なくとも一方を実施して試料液が、反応部の断面積が０．０４ｍｍ ２ 以下であって、目的の生産物に対して選択的親和性を有する一次抗体を前記マイクロフローセルの流路内に予め固定化したマイクロフローセルを流通し得るように、試料液組成を調整する前処理部と、調整して得られた試料液に含まれる蛋白質を酵素反応によって発色反応させるマイクロフローセルと、反応結果を利用して蛋白質を定量分析する計測部と、上記構成による装置の一連の動作を制御する制御部と、定量結果を記録する記録部とを有することを特徴とする細胞培養による蛋白質生産プラントの蛋白質計測装置。
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