JP3796340B2

JP3796340B2 - Serine protease inhibitor

Info

Publication number: JP3796340B2
Application number: JP33510897A
Authority: JP
Inventors: 大毅京谷; 邦彦枡田; 由利岡野; 仁正木
Original assignee: Noevir Co Ltd
Current assignee: Noevir Co Ltd
Priority date: 1997-11-18
Filing date: 1997-11-18
Publication date: 2006-07-12
Anticipated expiration: 2017-11-18
Also published as: JPH11147834A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、セージ(Salvia officinalis L.)及びクワ(Morus)属から選択される１種又は２種以上の植物の抽出物を有効成分とするセリンプロテアーゼ阻害剤に関し、更に詳しくは、膵炎治療剤，急性動脈炎，肺気腫，動脈硬化，関節リュウマチ，癌の転移・浸潤等の治療剤として、また、皮膚のはり・弾力を回復維持することで皮膚の老化を防止し、若々しい肌の状態を維持する効果が期待されるセリンプロテアーゼ阻害剤、及びセリンプロテアーゼの一種であるエラスターゼ，トリプシン，キモトリプシン，プラスミン阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内には、トリプシン，キモトリプシン，トロンビン，プラスミン，エラスターゼ等種々のセリンプロテアーゼが存在し、それらの酵素が何らかの要因により異常に活性化されると、炎症，疼痛，アレルギー，血液異常，組織破壊などの疾患を引き起こすと考えられている。例えば、急性膵炎或いは慢性膵炎の急性病変期には、種々の要因により活性化した膵蛋白分解酵素による膵臓組織の破壊と、活性化した酵素の血中への逸脱による全身の組織、臓器障害など重篤な症状が発現することが知られている。その原因として膵セリンプロテアーゼ、特にキーエンザイムとしてトリプシンの関与が重視されており、近年上記の状態を改善する治療薬として幾つかの合成抗トリプシン剤が開発上市されている。また、紫外線曝露や加齢、種々の炎症刺激などにより、エラスチン破壊酵素であるエラスターゼが過剰発現することによって、エラスチンが変性・破壊されることが、皮膚の弾力性低下につながると考えられており、エラスターゼの働きを抑て、皮膚に弾力やハリを与えるエラスチンの変性・破壊を防止することが皮膚の老化防止に重要である。更に、好中球エラスターゼ阻害剤は、急性動脈炎，肺気腫，動脈硬化，関節リュウマチ，癌の転移・浸潤などの治療薬としての使用が期待されている。
【０００３】
かかるセリンプロテアーゼ阻害剤としては、数多く知られているが、その大部分は活性中心のセリンの水酸基と不可逆的に結合して失活させる不可逆的阻害剤であり、酵素を再生させることが出来ないため副作用が懸念される。一方可逆的な阻害剤としては基質類似のアルデヒド，ケトン，ボロニックアシッド等が知られている。
【０００４】
しかしながら、これまでのセリンプロテアーゼ阻害剤の多くは、可逆的なものであっても、その体内動態，副作用などの問題が解決されていなかったり、作用効果が不十分であったり、安定性が悪かったりして、有効な効果を得るにはかなりの量を含有させなければならないものも存在していた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明においては、連用しても副作用などの問題がなく、高い安全性を有するセリンプロテアーゼ阻害剤を提供することを目的とした。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は広く種々の天然物についてセリンプロテアーゼ阻害作用を調べた結果、セージ(Salvia officinalis L.)及びクワ属(Morus)植物の抽出物が、優れたセリンプロテアーゼ阻害作用を有し、しかも内服，外用にかかわらず、副作用の問題がなく、安全性が高いことを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
セージ(Salvia officinalis L.)は、シソ科(Labiatae)アキギリ属(Salvia)の植物の一種で、高さ３０〜７０ｃｍ，全草に白い軟毛が密生する常緑多年草であり、ヨーロッパでは、古くから香草及び民間薬として利用されてきた。このセージ(Salvia officinalis L.)の抽出物の生理作用に関しては、抗菌作用（特開平７−２６７８７３号公報，特開平８−１１９８７２号公報等）、抗酸化作用（特開平３−９９８４号公報）、皮膚過酸化脂質生成抑制作用（特開昭６１−２４５２２号公報）、抗炎症作用（特開平１−８３０２２号公報，特開昭６０−１５６６１８号公報等）、ヒアルロニダーゼ阻害作用（特開平１−１２８９３３号公報）、微生物由来のプロテアーゼ阻害作用（特開平１−１２８９３４号公報）等が開示されている。しかしながら、セージ抽出物が、セリンプロテアーゼ、特にエラスターゼ，トリプシン，キモトリプシン及びプラスミンに対し、高い阻害活性を示すことはこれまで知られていなかった。
【０００８】
クワ属(Morus)属は、クワ科(Moraceae)植物の一種で、果実を食用にすること、また葉を蚕の飼料にするために数種が広く栽培されている。また、クワ属植物の根皮を桑白皮、葉を桑葉、果実を桑たいと呼び、それぞれ生薬として利用されてきた。例えば、桑白皮は、消炎性利尿剤，緩下剤として利用されてきており、その抽出物に対しては、チロシナーゼ阻害作用（特開昭５０−１３５２３６号公報他），微生物由来のプロテアーゼ阻害作用（特開平６−２５０００号公報），抗菌作用（特開平８−１５１３２５号公報他）などが開示されている。桑葉はペントサン，ガラクタン，グルコース，カロチン，タンニンなどを含み、中国で駆風薬として、日本では民間で桑茶として利用されており、桑葉抽出物の抗酸化作用（特開昭６０−４２４８５号公報），活性酸素消去作用（特開平８−１４３４６６号公報）等が開示されている。さらに、桑たい中には、有機酸，粘液質，色素，糖分などを含有し、利尿，鎮咳に効果があるといわれ、生食したり、醸酒用にも利用される。しかしながら、クワ属植物が、セリンプロテアーゼ、特にエラスターゼ，トリプシン，キモトリプシン及びプラスミンに対し、高い阻害活性を示すことはこれまで知られていなかった。
【０００９】
【発明の実施の形態】
【００１０】
本発明においてセージ(Salvia officinalis L.)の抽出物を得る際、抽出に供する部位は特に限定されないが、葉，花及び全草を生のまま若しくは乾燥させて用いることができる。
【００１１】
本発明において用いられるクワ(Morus)属植物としては、クワ（ヤマグワ，ノグワ）(Morus bombycis Koidz. , Morus japonica L.H.Bailey non Sieb. , Morus alba L.var.stylosa Bur.)、マグワ（カラヤマグワ，トウグワ）(Morus alba L. , Morus atropurpure Roxb.)、ロソウ（ログワ，マルバグワ，モチグワ）(Morus multicaulis Perr. , Morus latifolia(Bur.)Poir. , Morus alba L.var.latifolia Bur. , Morus alba L.var.multicaulis Loud.)、オガサワラグワ(Morus boninensis Koidz.)、イチベイ(Morus argutidens Koidz.)、シマグワ(Morus australis Poir. , Morus acidosa Griff)、ハマグワ(Morus bombycis Koidz. var.maritima Koidz.)、ハチジョウグワ(Morus kagayamae Koidz.)、モウコグワ(Morus mongolica(Bur.)Schneid , Morus alba L.var.mongolica Bur.)、クロミグワ(Morus nigra L.)、アカミグワ(Morus rubra L.)、ノグワ（ケグワ）(Morus tiliaefolia Makino)等が例示されるが、特に限定されない。これらのクワ属植物の抽出物を得る際に抽出に供する部位は特に限定されないが、根皮，樹皮，葉，実，花から選択される１種又は２種以上の部位の抽出物を得るのが好ましく、さらには、葉からの抽出物が、セリンプロテアーゼ活性の点から最も好ましい。
【００１２】
本発明において用いられるセージ及びクワ属植物の抽出物を得る際の抽出溶媒としては、精製水、エタノール，メタノール，イソプロパノール，イソブタノール，n-ヘキサノール，メチルアミルアルコール，2-エチルブタノール，n-オクチルアルコールなどのアルコール類、グリセリン，エチレングリコール，エチレングリコールモノメチルエーテル，エチレングリコールモノエチルエーテル，プロピレングリコール，プロピレングリコールモノメチルエーテル，プロピレングリコールモノエチルエーテル，トリエチレングリコール，1,3-ブチレングリコール，ヘキシレングリコール等の多価アルコール又はその誘導体、アセトン，メチルエチルケトン，メチルイソブチルケトン，メチル-n-プロピルケトンなどのケトン類、酢酸エチル，酢酸イソプロピルなどのエステル類、エチルエーテル，イソプロピルエーテル，n-ブチルエーテル等のエーテル類などの極性溶媒から選択される１種又は２種以上の混合溶媒が好適に使用でき、また、リン酸緩衝生理食塩水等の無機塩類を添加した溶媒をも用いることができるが、特に限定はされない。本発明の目的には、セリンプロテアーゼ阻害作用の点から、極性溶媒が好ましく、さらには、メタノール，エタノール，1,3-ブチレングリコール，プロピレングリコール，精製水から選択される１種又は２種以上の混合溶媒、特にエタノール水溶液を溶媒とすることが好ましい。
【００１３】
抽出方法としては、室温，冷却又は加温した状態で浸漬して抽出する方法、水蒸気蒸留等の蒸留法を用いて抽出する方法、生の植物から圧搾して抽出物を得る圧搾法等が例示され、これらの方法を単独で、又は２種以上を組み合わせて抽出を行う。
【００１４】
抽出の際の植物と溶媒との比率は特に限定されるものではないが、植物１に対して溶媒０．５〜１０００重量倍、特に抽出操作、効率の点で０．５〜１００重量倍が好ましい。また、抽出温度は、常圧下で室温から溶剤の沸点以下の範囲とするのが便利であり、抽出時間は抽出温度などによって異なるが、２時間〜２週間の範囲とするのが好ましい。
【００１５】
また、このようにして得られたセージ及びクワ属植物の抽出物は、抽出物をそのまま用いることもできるが、セリンプロテアーゼ阻害作用を失わない範囲内で脱臭，脱色，濃縮等の精製操作を加えたり、さらにはカラムクロマトグラフィー等を用いて分画物として用いてもよい。これらの抽出物や精製物，分画物は、これらから溶媒を除去することによって乾固物とすることもでき、さらにアルコールなどの溶媒に可溶化した形態、或いは乳剤の形態で提供することができる。
【００１６】
本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤は、当分野で公知の化合物と混合し、非経口投与，経口投与又は外部投与に適した、医薬品，医薬部外品，化粧品，食品の形で使用することができる。食品においては、油脂製品や乳化製品、清涼飲料等に添加することができる。医薬品では経口剤，外用剤，注射剤，吸入剤，点鼻・点眼剤等に添加することができ、これらの使用方法に応じて、錠剤，液剤，注射剤，軟膏，クリーム，ローション，エアゾール剤，座剤等の所望の剤型にすることができる。また、必要に応じて賦形剤，基剤，乳化剤，安定剤，溶解助剤，矯味剤，保存剤，芳香剤，着色剤，コーティング剤などを適宜配合することができる。医薬部外品・化粧品としては、化粧水，乳液，クリーム等に添加することができ、必要に応じて油分，保湿剤，紫外線吸収剤，水溶性高分子，酸化防止剤，界面活性剤，金属イオン封鎖剤，抗菌防腐剤等が配合できる。
【００１７】
医薬品として利用する場合の植物抽出物の投与量は、使用する植物の種類，抽出溶媒，精製の程度や、患者の年齢，症状等により大きく変動するが、一般には、経口投与の場合、乾燥重量として５〜５００mg/日の範囲である。食品や化粧品に配合する場合は、その効果や添加した際の香り、色調の点から考え、０．００１〜５重量％の濃度範囲とすることが望ましい。
【００１８】
【実施例】
さらに本発明の特徴について、実施例により詳細に説明する。
【００１９】
実施例１〜実施例６
表１に示した植物の各部５００ｇを、５０容量％エタノール水溶液５０００ｍｌに浸漬し、室温で一週間静置することにより抽出した。その後、植物体を濾別除去し、溶媒を減圧留去した後、得られた固形分を５０容量％エタノール水溶液にて再溶解し５０ｍｌとし、実施例１〜６を得た。
【００２０】
【表１】

【００２１】
実施例のセリンプロテアーゼ阻害作用を、好中球エラスターゼ，トリプシン，α-キモトリプシン，プラスミンを用いて検討した。結果を表２にまとめて示す
。
【００２２】
好中球エラスターゼ活性阻害
実施例１〜実施例６を用いて、好中球エラスターゼ活性阻害率を測定した。好中球エラスターゼ活性は、サクシニル（Ｏ−メチル）−アラニル−アラニル−プロリル−バリル−４−メチル−クマリル−７−アミド（９μＭ濃度，ペプチド化学研究所社製）を基質として、３７℃にて１時間ヒト好中球由来のエラスターゼ（１μg/ml，Ｓｉｇｍａ社製）と反応させた後、分解生成物である7-アミノ-4-メチルクマリンの生成量を、励起波長３５５nm，蛍光波長４６０nmで蛍光強度を測定することにより評価した。実施例をそれぞれ０．１mg/ml添加した場合、及び実施例未添加の場合について酵素活性を測定し、下記の式（１）を用いて好中球エラスターゼ活性阻害率を算出した。
【００２３】
【数１】

【００２４】
トリプシン活性阻害
トリプシン活性は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．３mlに、ブタ膵臓由来トリプシン（４０００〜５０００USPunit/mg，和光純薬社製）溶液（４０μg/ml）０．０３mlを添加して３０℃で５分間インキュベートを行い、基質としてＢＡＰＡ（N-α-ベンゾイル-DL-アルギニン-p-ニトロアニリド塩酸塩）０．０２mlを加えて更に３０℃で３０分間インキュベートした後、２０％酢酸溶液を０．３ml添加して反応を停止し、４０５nmの吸光度を測定することにより評価した。実施例をそれぞれ０．１mg/ml添加した場合、及び実施例未添加の場合について酵素活性を測定し、式（２）を用いてトリプシン活性阻害率を算出した。
【００２５】
【数２】

【００２６】
α-キモトリプシン活性阻害
α-キモトリプシン活性は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．４mlに、α-キモトリプシンタイプ７溶液（０．６５μg/ml０．１Ｍリン酸緩衝液，Ｓｉｇｍａ社製）０．０５mlを加え、３７℃で５分間インキュベートを行い、基質としてサクシニル−アラニル−アラニル−プロリル−フェニルアラニン−p-ニトロアニリド塩酸塩溶液（３．０ｍＭ５０％ＤＭＳＯ溶液）０．０２mlを加えて、更に３７℃で３０分間インキュベートした後、２０％酢酸溶液を０．３ml添加して反応を停止し、４０５nmの吸光度を測定することにより評価した。実施例をそれぞれ０．１mg/ml添加した場合、及び実施例未添加の場合について酵素活性を測定し、式（２）を用いてα-キモトリプシン活性阻害率を算出した。
【００２７】
プラスミン活性阻害
プラスミン活性は、直径９cmのシャーレにプラスミノーゲン除去フィブリノーゲンタイプ２の０．６％水溶液４mlを入れ、ｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸緩衝液４mlを加えて攪拌し、トロンビン（１０unit/ml）０．１mlを滴下し、ゆっくりと混和し３０分間静置し、フィブリンゲルを調製した。プラスミン溶液（１０unit/ml）をシャーレのゲル上に添加し、３７℃で２時間インキュベートし、フィブリンゲルの溶解した面積を測定した。実施例をそれぞれ０．１mg/ml添加した場合、及び実施例未添加の場合について酵素活性を測定し、式（３）を用いてプラスミン活性阻害率を算出した。
【００２８】
【数３】

【００２９】
【表２】

【００３０】
表２に示した結果より、本発明の実施例１〜６は、好中球エラスターゼ，トリプシン，α-キモトリプシン，プラスミンに対して、危険率１％で有意な活性阻害作用を有することが示された。
【００３１】
続いて、本発明の各実施例について熱及び光に対する安定性を評価した。各実施例を１００℃で１０分間熱処理した場合、及び３カ月間露光保存した場合のそれぞれについて、０．１ｍｇ／ｍｌ添加時の好中球エラスターゼ活性阻害率を測定し、未処理の場合の好中球エラスターゼ活性阻害率と比較して表３に示した。表３より明らかなように、いずれの実施例も熱及び光に対し非常に良好な安定性を示し、１００℃で１０分間の熱処理及び３カ月間の露光保存によっても、好中球エラスターゼ活性阻害作用の低下はほとんど見られなかった。
【００３２】
【表３】

【００３３】
また、本発明の各実施例について、培養ヒト線維芽細胞に対する細胞毒性を評価した。ヒト由来線維芽細胞を、１ウェル当たり２．０×１０⁴個となるように９６穴マイクロプレートに播種し、２４時間後に、実施例のそれぞれを１．０ｍｇ／ｍｌ含有する１．０容量％牛胎仔血清添加ダルベッコ修正基礎栄養培地培地にて３７℃で２４時間さらに培養して、生細胞数を計測して細胞生存率を求め、５０％致死濃度（ＬＤ₅₀）を算出した。その結果、表３に示すように、いずれの実施例においてもＬＤ₅₀は１００．０ｍｇ／ｍｌ以上であり、試験した濃度では細胞毒性は認められなかった。
【００３４】
【発明の効果】
以上詳述したように、セージ(Salvia officinalis L.)及びクワ属(Morus)植物の抽出物を含有する本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤は、エラスターゼ，トリプシン，キモトリプシン，プラスミン等のセリンプロテアーゼ阻害に対し優れた作用を示し、本発明にかかるセリンプロテアーゼ阻害剤は、膵炎治療剤，急性動脈炎，肺気腫，動脈硬化，関節リュウマチ，癌の転移・浸潤等の治療剤として、また、皮膚のはり・弾力を回復維持することで皮膚の老化を防止し、若々しい肌の状態を維持する効果が期待される。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a serine protease inhibitor containing, as an active ingredient, an extract of one or more plants selected from the genus Sage ( Salvia officinalis L.) and mulberry ( Morus ), and more specifically, a therapeutic agent for pancreatitis , As a therapeutic agent for acute arteritis, emphysema, arteriosclerosis, rheumatoid arthritis, metastasis / invasion of cancer, etc., and by restoring and maintaining skin agglomeration / elasticity to prevent skin aging, youthful skin condition The present invention relates to a serine protease inhibitor that is expected to maintain an effect, and an elastase, trypsin, chymotrypsin, and plasmin inhibitor that are a kind of serine protease.
[0002]
[Prior art]
There are various serine proteases such as trypsin, chymotrypsin, thrombin, plasmin, and elastase in the living body. If these enzymes are activated abnormally for some reason, inflammation, pain, allergies, blood abnormalities, tissue destruction, etc. It is thought to cause diseases. For example, in the acute lesion stage of acute pancreatitis or chronic pancreatitis, pancreatic tissue destruction by pancreatic proteolytic enzyme activated by various factors, systemic tissue and organ damage due to deviation of activated enzyme into blood, etc. Serious symptoms are known to develop. As a cause thereof, the involvement of trypsin as a pancreatic serine protease, particularly as a key enzyme, is emphasized. In recent years, several synthetic antitrypsin agents have been developed and marketed as therapeutic agents for improving the above-mentioned conditions. In addition, it is thought that elastin degeneration and destruction by overexpression of elastin, an elastin-degrading enzyme due to ultraviolet exposure, aging, various inflammatory stimuli, etc., leads to a decrease in skin elasticity. In addition, it is important to prevent the aging of the skin to suppress the action of elastase and prevent the degeneration and destruction of elastin which gives the skin elasticity and elasticity. Further, neutrophil elastase inhibitors are expected to be used as therapeutic agents for acute arteritis, emphysema, arteriosclerosis, rheumatoid arthritis, metastasis and invasion of cancer.
[0003]
Many such serine protease inhibitors are known, but most of them are irreversible inhibitors that irreversibly bind to and deactivate the serine hydroxyl group at the active center and cannot regenerate the enzyme. Therefore, there are concerns about side effects. On the other hand, substrate-like aldehydes, ketones, boronic acids and the like are known as reversible inhibitors.
[0004]
However, many of the serine protease inhibitors so far have been reversible, but their problems such as pharmacokinetics and side effects have not been solved, their effects are insufficient, and their stability is poor. In some cases, a significant amount must be contained to obtain an effective effect.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an object of the present invention is to provide a serine protease inhibitor having high safety without causing problems such as side effects even when used continuously.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of examining the serine protease inhibitory action of a wide variety of natural products, the present inventors have found that extracts of sage ( Salvia officinalis L.) and mulberry ( Morus ) plants have an excellent serine protease inhibitory action. It has been found that there is no problem of side effects regardless of internal use or external use, and the safety is high, and the present invention has been completed.
[0007]
Sage ( Salvia officinalis L.) is a kind of plant belonging to the genus Labiatae ( Salvia ), 30-70cm in height, and is an evergreen perennial plant with dense white soft hairs on the whole plant. And has been used as a folk medicine. Regarding the physiological action of the extract of this sage ( Salvia officinalis L.), antibacterial action (JP-A-7-267873, JP-A-8-119872, etc.), antioxidant action (JP-A-3-9984) Skin lipid peroxide production inhibitory effect (Japanese Patent Laid-Open No. 61-24522), anti-inflammatory effect (Japanese Patent Laid-Open No. 1-83022, Japanese Patent Laid-Open No. 60-156618, etc.), Hyaluronidase inhibitory action (Japanese Patent Laid-Open No. No. 128933), microorganism-derived protease inhibitory action (Japanese Patent Laid-Open No. 1-128934), and the like. However, it has not been known so far that sage extract exhibits high inhibitory activity against serine proteases, particularly elastase, trypsin, chymotrypsin and plasmin.
[0008]
The genus Morus is a kind of Moraceae plant, and several kinds are widely cultivated to make the fruits edible and to make the leaves into straw feed. In addition, the root bark of the genus Mulberry is called mulberry white bark, the leaves are called mulberry leaves, and the fruits are mulberry. For example, mulberry bark has been used as an anti-inflammatory diuretic and laxative, and its extract has a tyrosinase inhibitory action (Japanese Patent Laid-Open No. 50-135236 et al.), A microorganism-derived protease inhibitory action ( JP-A-6-25000), antibacterial action (JP-A-8-151325, etc.) and the like are disclosed. Mulberry leaves contain pentosan, galactan, glucose, carotene, tannin and the like, and are used as a wind-up drug in China and as a mulberry tea in the private sector in Japan. The antioxidant activity of mulberry leaves extract (Japanese Patent Laid-Open No. 60-42485) No. 1), active oxygen scavenging action (JP-A-8-143466), and the like. In addition, mulberry contains organic acids, mucus, pigments, sugars, etc., and is said to be effective for diuresis and coughing. It is used for raw eating and brewing. However, it has not been known so far that mulberry plants exhibit high inhibitory activity against serine proteases, particularly elastase, trypsin, chymotrypsin and plasmin.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
[0010]
In the present invention, when obtaining an extract of sage ( Salvia officinalis L.), the site for extraction is not particularly limited, but leaves, flowers and whole plants can be used raw or dried.
[0011]
The mulberry (Morus) genus plants used in the present invention, mulberry (Yamaguwa, Noguwa) (Morus bombycis Koidz., Morus japonica LHBailey non Sieb., Morus alba L.var. Stylosa Bur.), Morus alba (Karayamaguwa, white mulberry) (Morus alba L., Morus atropurpure Roxb .), Rosou (Roguwa, Marubaguwa, Mochiguwa) (Morus multicaulis Perr., Morus latifolia (Bur.) Poir., Morus alba L.var. latifolia Bur., Morus alba L.var . multicaulis Loud.), Ogasawara Harrow (Morus boninensis Koidz.), Ichibei (Morus argutidens Koidz.), Shimaguwa (Morus australis Poir., Morus acidosa Griff), Hamaguwa (Morus bombycis Koidz. var. maritima Koidz.), Hachijouguwa ( Morus kagayamae Koidz.), Moukoguwa (Morus mongolica (Bur.) Schneid , Morus alba L.var. mongolica Bur.), Kuromiguwa (Morus nigra L.), Akamiguwa (Morus rubra L.), Noguwa (Keguwa) (Morus tiliaefolia Makino) etc. No. There are no particular limitations on the site used for extraction when obtaining these mulberry plant extracts, but an extract of one or more types selected from root bark, bark, leaves, fruits and flowers can be obtained. Furthermore, an extract from leaves is most preferable from the viewpoint of serine protease activity.
[0012]
As an extraction solvent for obtaining extracts of sage and mulberry plants used in the present invention, purified water, ethanol, methanol, isopropanol, isobutanol, n-hexanol, methyl amyl alcohol, 2-ethylbutanol, n-octyl are used. Alcohols such as alcohol, glycerin, ethylene glycol, ethylene glycol monomethyl ether, ethylene glycol monoethyl ether, propylene glycol, propylene glycol monomethyl ether, propylene glycol monoethyl ether, triethylene glycol, 1,3-butylene glycol, hexylene glycol Polyhydric alcohols or derivatives thereof, ketones such as acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, methyl-n-propyl ketone, ethyl acetate, iso One or two or more mixed solvents selected from polar solvents such as esters such as propyl, ethers such as ethyl ether, isopropyl ether and n-butyl ether can be suitably used, and phosphate buffered saline Although the solvent which added inorganic salts, such as, can also be used, it does not specifically limit. For the purpose of the present invention, a polar solvent is preferable from the viewpoint of serine protease inhibitory action, and further, one or more kinds selected from methanol, ethanol, 1,3-butylene glycol, propylene glycol and purified water are used. It is preferable to use a mixed solvent, particularly an aqueous ethanol solution.
[0013]
Examples of the extraction method include a method of extraction by immersion in a cooled or heated state at room temperature, a method of extraction using a distillation method such as steam distillation, a pressing method of squeezing from a raw plant to obtain an extract, etc. These methods are used alone or in combination of two or more.
[0014]
The ratio of the plant and the solvent at the time of extraction is not particularly limited, but is 0.5 to 1000 times by weight of the solvent with respect to the plant 1, particularly 0.5 to 100 times by weight in terms of extraction operation and efficiency. preferable. The extraction temperature is conveniently in the range from room temperature to the boiling point of the solvent under normal pressure, and the extraction time is preferably in the range of 2 hours to 2 weeks, although it varies depending on the extraction temperature.
[0015]
In addition, the extract of sage and mulberry plants obtained in this way can be used as they are, but purification operations such as deodorization, decolorization and concentration are added within a range not losing the serine protease inhibitory action. Alternatively, it may be used as a fraction using column chromatography or the like. These extracts, purified products, and fractions can be dried by removing the solvent from them, and can be provided in a form solubilized in a solvent such as alcohol, or in the form of an emulsion. it can.
[0016]
The serine protease inhibitor of the present invention can be used in the form of pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics and foods suitable for parenteral administration, oral administration or external administration by mixing with compounds known in the art. . In food, it can be added to oil and fat products, emulsified products, soft drinks and the like. In pharmaceutical products, it can be added to oral preparations, external preparations, injections, inhalants, nasal drops, eye drops, etc., and tablets, solutions, injections, ointments, creams, lotions, aerosols depending on how they are used. , And a desired dosage form such as a suppository. Moreover, an excipient | filler, a base, an emulsifier, a stabilizer, a solubilizing agent, a corrigent, a preservative, a fragrance | flavor, a coloring agent, a coating agent etc. can be suitably mix | blended as needed. For quasi-drugs and cosmetics, it can be added to lotions, emulsions, creams, etc., if necessary, oil, moisturizer, UV absorber, water-soluble polymer, antioxidant, surfactant, metal Ion sequestering agents, antibacterial preservatives, etc. can be blended.
[0017]
The dosage of the plant extract when used as a medicine varies greatly depending on the type of plant used, the extraction solvent, the degree of purification, the age and symptoms of the patient, etc. As a range of 5 to 500 mg / day. When blended in foods and cosmetics, it is desirable that the concentration range be 0.001 to 5% by weight in view of the effects, fragrance and color tone when added.
[0018]
【Example】
Further, the features of the present invention will be described in detail with reference to examples.
[0019]
Examples 1 to 6
500 g of each part of the plant shown in Table 1 was immersed in 5000 ml of 50% by volume ethanol aqueous solution and extracted by allowing to stand at room temperature for one week. Then, after removing the plant body by filtration and distilling off the solvent under reduced pressure, the obtained solid content was redissolved in a 50% by volume ethanol aqueous solution to 50 ml, and Examples 1 to 6 were obtained.
[0020]
[Table 1]

[0021]
The serine protease inhibitory action of the examples was examined using neutrophil elastase, trypsin, α-chymotrypsin, and plasmin. The results are summarized in Table 2.
[0022]
Inhibition of Neutrophil Elastase Activity Using Examples 1 to 6, the inhibition rate of neutrophil elastase activity was measured. Neutrophil elastase activity was determined at 37 ° C. using succinyl (O-methyl) -alanyl-alanyl-prolyl-valyl-4-methyl-coumalyl-7-amide (9 μM concentration, manufactured by Peptide Chemical Laboratories) as a substrate. After reacting with elastase derived from human neutrophils (1 μg / ml, manufactured by Sigma) for 1 hour, the amount of decomposition product 7-amino-4-methylcoumarin was determined at an excitation wavelength of 355 nm and a fluorescence wavelength of 460 nm. Evaluation was made by measuring the fluorescence intensity. The enzyme activity was measured when 0.1 mg / ml of each example was added and when no example was added, and the inhibition rate of neutrophil elastase activity was calculated using the following formula (1).
[0023]
[Expression 1]

[0024]
Trypsin activity inhibition The trypsin activity was determined by using 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0) in 0.3 ml and porcine pancreatic trypsin (4000 to 5000 USPunit / mg, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) solution (40 μg / ml) in 0.03 ml. And then incubating at 30 ° C. for 5 minutes, adding 0.02 ml of BAPA (N-α-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide hydrochloride) as a substrate and further incubating at 30 ° C. for 30 minutes. The reaction was stopped by adding 0.3 ml of 20% acetic acid solution, and evaluation was made by measuring the absorbance at 405 nm. The enzyme activity was measured when 0.1 mg / ml of each example was added and when no example was added, and the trypsin activity inhibition rate was calculated using equation (2).
[0025]
[Expression 2]

[0026]
Inhibition of α-chymotrypsin activity α-chymotrypsin activity was determined by adding α-chymotrypsin type 7 solution (0.65 μg / ml 0.1 M phosphate buffer, Sigma) to 0.4 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0). ) Add 0.05 ml, incubate at 37 ° C. for 5 minutes, add 0.02 ml of succinyl-alanyl-alanyl-prolyl-phenylalanine-p-nitroanilide hydrochloride solution (3.0 mM 50% DMSO solution) as substrate After further incubation at 37 ° C. for 30 minutes, the reaction was stopped by adding 0.3 ml of a 20% acetic acid solution, and evaluation was performed by measuring the absorbance at 405 nm. The enzyme activity was measured when 0.1 mg / ml of each example was added and when no example was added, and α-chymotrypsin activity inhibition rate was calculated using equation (2).
[0027]
Plasmin activity inhibition Plasmin activity was measured by adding 4 ml of a 0.6% aqueous solution of plasminogen-removed fibrinogen type 2 to a petri dish having a diameter of 9 cm, adding 4 ml of 0.1 M phosphate buffer having a pH of 7.4, and thrombin (10 units). 0.1 ml of / ml) was added dropwise, mixed slowly and allowed to stand for 30 minutes to prepare a fibrin gel. A plasmin solution (10 units / ml) was added onto a petri dish gel and incubated at 37 ° C. for 2 hours, and the dissolved area of the fibrin gel was measured. Enzyme activity was measured when 0.1 mg / ml of each example was added and when no example was added, and the inhibition rate of plasmin activity was calculated using equation (3).
[0028]
[Equation 3]

[0029]
[Table 2]

[0030]
The results shown in Table 2 show that Examples 1 to 6 of the present invention have a significant activity inhibitory effect on neutrophil elastase, trypsin, α-chymotrypsin, and plasmin at a risk rate of 1%. It was.
[0031]
Subsequently, the stability to heat and light was evaluated for each example of the present invention. The neutrophil elastase inhibition rate at the time of addition of 0.1 mg / ml was measured for each case where each example was heat-treated at 100 ° C. for 10 minutes and after exposure storage for 3 months. The results are shown in Table 3 in comparison with the inhibition rate of neutrophil elastase activity. As is apparent from Table 3, all examples showed very good stability against heat and light, and neutrophil elastase activity was inhibited by heat treatment at 100 ° C. for 10 minutes and exposure storage for 3 months. Almost no decrease in action was seen.
[0032]
[Table 3]

[0033]
In addition, each example of the present invention was evaluated for cytotoxicity against cultured human fibroblasts. Human-derived fibroblasts were seeded in a 96-well microplate at 2.0 × 10 ⁴ per well, and 24 hours later, 1.0% by volume containing 1.0 mg / ml of each of the examples. The cells were further cultured at 37 ° C. for 24 hours in Dulbecco's modified basal nutrient medium supplemented with fetal calf serum, the number of viable cells was counted to determine the cell viability, and the 50% lethal concentration (LD ₅₀ ) was calculated. As a result, as shown in Table 3, LD ₅₀ was 100.0 mg / ml or higher in any of the Examples, and no cytotoxicity was observed at the tested concentrations.
[0034]
【The invention's effect】
As described above in detail, the serine protease inhibitor of the present invention containing extracts of sage ( Salvia officinalis L.) and mulberry ( Morus ) plants is effective for inhibiting serine proteases such as elastase, trypsin, chymotrypsin, and plasmin. The serine protease inhibitor according to the present invention, which exhibits excellent action, is used as a therapeutic agent for pancreatitis, acute arteritis, emphysema, arteriosclerosis, rheumatoid arthritis, cancer metastasis / invasion, etc. It is expected to prevent skin aging and maintain a youthful skin condition.

Claims

A serine protease inhibitor comprising, as an active ingredient, an extract of one or more plants selected from the genus Morus .

An elastase inhibitor comprising as an active ingredient an extract of one or more plants selected from plants of the genus Morus .

A trypsin inhibitor comprising as an active ingredient an extract of one or more plants selected from plants belonging to the genus Morus .

A chymotrypsin inhibitor comprising, as an active ingredient, an extract of one or more kinds of plants selected from plants belonging to the genus Morus .

A plasmin inhibitor comprising, as an active ingredient, an extract of one or more plants selected from plants of the genus Morus .