KR102470781B1 - Cosmetic Composition for Reducing Skin Wrinkle - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피멘타 라세모사(Pimenta racemosa)의 추출물을 유효성분으로 하는 콜라겐 생합성촉진용 피부 외용제 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 콜라겐 합성을 촉진함으로써, 피부 주름을 더욱 완화할 수 있고, 피부를 보다 견고하며 탄력 있게 유지해주는 효과를 얻을 수 있다.The present invention is Pimenta racemosa ( Pimenta racemosa ) as an active ingredient, and relates to a composition for external application for skin and a cosmetic composition for promoting collagen biosynthesis, wherein the composition can further alleviate skin wrinkles by promoting collagen synthesis, and keeps the skin more firm and elastic. effect can be obtained.
Description
본 발명은 피멘타 라세모사(Pimenta racemosa)의 추출물을 포함하는 콜라겐 생성 촉진용 피부 외용제 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.The present invention is Pimenta racemosa ( Pimenta racemosa ) It relates to a composition for external application for skin and a cosmetic composition for promoting collagen production containing an extract.
피부는 체내의 근육들과 기관을 보호하는 다수의 상피조직으로 이루어진 외피 체계에서 가장 큰 조직으로, 외부 환경으로부터 신체 내부를 보호하여 체내의 항상성을 유지시키는데 중요한 역할을 한다. 그 결과 피부는 외부에서 주어지는 물리적, 화학적 자극, 스트레스, 영양 결핍 등에 의해 피부의 정상기능이 저하되고 탄력 저하, 주름 생성 등의 피부 노화 현상이 촉진된다.Skin is the largest tissue in the integumentary system consisting of a plurality of epithelial tissues that protect muscles and organs in the body, and plays an important role in maintaining homeostasis in the body by protecting the inside of the body from the external environment. As a result, the normal function of the skin is deteriorated due to external physical and chemical stimuli, stress, nutritional deficiency, etc., and skin aging phenomena such as loss of elasticity and wrinkle formation are promoted.
피부의 노화는 내인적 노화(innate age)와 외인적 노화(extrinsic age)로 구분할 수 있다. 상기 내인적 노화는 연령이 증가함에 따라 발생하는 노화로, 신체의 생리적인 기능이 저하되어 나타나는 노화이다. 또한, 상기 외인적 노화는 외부 자외선, 활성산소, 스트레스 등에 의해 발생하는 노화 현상을 말한다. 이러한 내인적 및 외인적 노화 요인에 의해 피부의 노화가 진행되고, 그 결과 피부 표면에 주름이 생성되어 피부결이 거칠어지고 탄력이 감소한다.Skin aging can be divided into intrinsic age and extrinsic age. The endogenous aging is aging that occurs as age increases, and is aging that occurs when physiological functions of the body are lowered. In addition, the extrinsic aging refers to an aging phenomenon caused by external ultraviolet rays, active oxygen, stress, and the like. Aging of the skin progresses due to these intrinsic and extrinsic aging factors, and as a result, wrinkles are generated on the skin surface, resulting in rough skin texture and reduced elasticity.
주름이 생성되는 기작에 따르면, 진피 내의 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin) 등은 분해 및 생성이 계속해서 이루어지는데, 이때 분해작용 후 생성작용으로 인한 보충이 원활하지 않으면 피부가 탄력을 잃고 주름이 생성된다.According to the mechanism by which wrinkles are formed, collagen, elastin, etc. in the dermis are continuously decomposed and produced. is created
지금까지 연구보고된 대표적인 주름완화 및 피부 노화 예방 물질로는 레티노익산(retinoic acid), 레티놀(retinol), 아스코르브산(ascorbic acid), α-히드록시산(α-hydroxy acid) 등이 있다.Representative wrinkle reduction and skin aging prevention substances that have been studied and reported so far include retinoic acid, retinol, ascorbic acid, α-hydroxy acid, and the like.
레티노익산은 지질과산화(lipid per-oxidation) 및 오르니틴 디카복실라아제 반응(ornithine decarboxylase response)을 억제한다. 그러나 자외선에 의해 민감한 반응을 보이며 자극이 높아 피부가 붉어지는 부작용이 보고되어 사용이 제한되고 있으며, 또한, 6개월 이상 계속 사용해야만 효과가 나타나는 문제점이 있다.Retinoic acid inhibits lipid per-oxidation and ornithine decarboxylase response. However, it shows a sensitive reaction to ultraviolet rays and has a side effect of reddening of the skin due to high irritation, and its use is limited, and there is a problem in that the effect appears only when continuously used for 6 months or more.
레티놀은 레티노익산에 비해 주름개선 효과가 약하지만 상대적으로 안전성이 높아 널리 사용되고 있다. 그러나 레티놀을 고농도로 사용하면 피부자극이 발생하며, 자외선에 노출 시 피부 색소 침착을 일으키며, 공기 중의 산소, 열 및 빛 등에 의해 쉽게 산화되므로 안정성에 문제가 있다.Retinol has a weak anti-wrinkle effect compared to retinoic acid, but is relatively safe and widely used. However, when retinol is used in high concentration, it causes skin irritation, causes skin pigmentation when exposed to ultraviolet rays, and is easily oxidized by oxygen in the air, heat, and light, so there is a problem in stability.
아스코르브산은 공기, 수분, 고온 등 외부 환경에 의해 쉽게 산화되어 그에 따라 활성이 많이 감소하므로 주름개선 정도가 낮아지고, 제형의 변색 및 변취를 유발하는 문제점이 있다. Ascorbic acid is easily oxidized by external environments such as air, moisture, and high temperature, and thus its activity is greatly reduced, so the degree of wrinkle improvement is lowered and discoloration and odor of the formulation are caused.
또한, α-히드록시산도 항주름제로 공시되어 있으나, 가려움, 홍반, 자외선에 민감성 반응 등 피부자극 부작용이 수반되어 제품의 안전성 측면에 문제점이 있다.In addition, α-hydroxy acid is also disclosed as an anti-wrinkle agent, but it is accompanied by skin irritation side effects such as itching, erythema, and sensitivity to ultraviolet rays, and there is a problem in terms of safety of the product.
이외에도, 주름 방지를 위해 자외선 차단제, 보습제, 항산화제 등을 함유한 화장품들이 널리 사용되고 있으나 이 제품들의 실질적인 주름 개선 효과는 미미한 편이다.In addition, cosmetics containing sunscreens, moisturizers, antioxidants, etc. are widely used to prevent wrinkles, but the actual wrinkle improvement effect of these products is insignificant.
한편, 정유(essential oil)는 존재하는 수목의 열매, 잎, 꽃, 줄기, 나무껍질과 뿌리 등에서 추출하며, 추출한 식물의 이름을 따서 명명한다. 식물에서 추출되는 정유는 단일 화학성분이 아닌 휘발성분이 강한 monoerpene 계와 phenolics 계 화합물의 혼합물로 추출 식물 종의 유전적 특성과 재배지역의 환경 및 채취시기에 따라 정유성분의 조성에 차이가 나타난다. 이러한 정유는 식물의 생장과 분화에 직접적인 영향을 미치지는 않으나 다양한 기능을 나타내는 물질이며, 의약, 향료, 생활용품 등에 광범위하게 이용되고 있다.On the other hand, essential oil is extracted from the fruit, leaf, flower, stem, bark and root of an existing tree, and is named after the extracted plant. Essential oil extracted from plants is not a single chemical component, but a mixture of monoerpene and phenolics compounds with strong volatile content. The composition of essential oil components differs depending on the genetic characteristics of the extracted plant species, the environment of the cultivation area, and the time of collection. These essential oils do not directly affect the growth and differentiation of plants, but are substances that exhibit various functions, and are widely used in medicine, perfume, and household goods.
일 예로 대한민국 특허공개 제2014-0062958호는 세신 추출물로부터 추출되는 정유(essential oil) 분획물을 포함하는 체지방 또는 셀룰라이트 감소 및 예방효과를 갖는 아로마 오일 조성물 및 화장료 조성물 우울증의 예방 및 개선 용 화장료 조성물을 개시하고 있다. For example, Korean Patent Publication No. 2014-0062958 discloses an aroma oil composition and a cosmetic composition having an effect of reducing and preventing body fat or cellulite containing an essential oil fraction extracted from a seshin extract, and a cosmetic composition for preventing and improving depression. are starting
본 발명자들은 피멘타 라세모사(Pimenta racemosa)의 추출물이 콜라겐 생성을 촉진하여 실질적으로 피부에 적용되는 경우 피부 주름 개선 효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors Pimenta racemosa ( Pimenta The present invention was completed by confirming that the extract of racemosa ) promotes collagen production and exhibits a skin wrinkle improvement effect when applied to the skin.
따라서, 본 발명은 피멘타 라세모사(Pimenta racemosa)의 추출물을 유효성분으로 포함하는 콜라겐 합성 촉진용 피부 외용제 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.Therefore, the present invention is Pimenta racemosa ( Pimenta racemosa ) as an active ingredient, and to provide a composition for external application for skin for promoting collagen synthesis.
또한, 본 발명은 피멘타 라세모사(Pimenta racemosa)의 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다In addition, the present invention is Pimenta racemosa ( Pimenta racemosa ) as an active ingredient to provide a cosmetic composition for improving wrinkles containing an extract as an active ingredient
상기한 과제를 달성하기 위해, 본 발명은In order to achieve the above object, the present invention
피멘타 라세모사(Pimenta racemosa)의 추출물을 유효성분으로 함유하는 콜라겐 생합성 촉진용 피부 외용제 조성물을 제공한다.Pimenta racemosa ( Pimenta racemosa ) It provides a composition for external application for skin for promoting collagen biosynthesis containing an extract as an active ingredient.
또한 본 발명은Also, the present invention
피멘타 라세모사(Pimenta racemosa)의 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다. Pimenta racemosa ( Pimenta racemosa ) It provides a cosmetic composition for improving wrinkles containing an extract as an active ingredient.
본 발명에 따른 외용제 조성물 및 화장료 조성물은 피부 진피 층의 섬유아세포에 작용하여 콜라겐 생성을 촉진하므로, 피부 주름, 피부 탄력 저하, 또는 노화를 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다. Since the composition for external use and the cosmetic composition according to the present invention promote collagen production by acting on fibroblasts in the dermal layer of the skin, they can be usefully used to prevent or improve skin wrinkles, decrease in skin elasticity, or aging.
도 1은 실험예 1에서 인간 피부섬유아세포에 대한 베이유(bay oil)의 세포독성결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 실험예 2에서 진피 섬유아세포 내 콜라겐에 대한 베이유(bay oil)의 생성 증가활성을 나타낸 그래프이다.1 is a graph showing the cytotoxicity results of bay oil on human dermal fibroblasts in Experimental Example 1.
2 is a graph showing the production increasing activity of bay oil for collagen in dermal fibroblasts in Experimental Example 2;
본 발명의 조성물은 유효성분으로 피멘타 라세모사(Pimenta racemosa) 추출물을 함유한다. The composition of the present invention as an active ingredient Pimenta racemosa ( Pimenta racemosa ) extract.
본 발명에 있어서, 상기 피멘타 라세모사(Pimenta racemosa) 추출물은 다양한 기관 또는 부분으로부터 추출하여 얻은 것으로, 피멘타 라세모사(Pimenta racemosa)의 잎, 꽃, 줄기, 가지, 뿌리, 전초 및 열매 중 선택된 어느 하나 이상에 용매를 가하여 추출한 것을 특징으로 한다. 바람직하기로 잎을 사용한다. In the present invention, the Pimenta racemosa (Pimenta racemosa) The extract is obtained by extracting from various organs or parts, Pimenta racemosa (Pimenta racemosa) It is characterized by extracting by adding a solvent to any one or more selected from leaves, flowers, stems, branches, roots, outposts, and fruits. Leaves are preferably used.
본 발명에서 원료로 사용하는 피멘타 라세모사(Pimenta racemosa) 추출물은 피멘타 라세모사(Pimenta racemosa)로부터 침출, 전출하여 얻은 침출액, 또는 그 침출액을 다시 일부 또는 전부 농축하여 얻은 농축물, 또는 다시 그 농축물을 건조시켜 제조한 추출 엑기스 및 추출액 중에 함유되고 있는 주 효과를 발휘하는 화학물질 그 자체를 포함한다. Pimenta racemosa used as a raw material in the present invention racemosa ) Extract is Pimenta racemosa ( Pimenta racemosa ), a leachate obtained by leaching or transfer, or a concentrate obtained by partially or entirely concentrating the leachate, or an extract prepared by drying the concentrate again, and a chemical substance containing the main effect contained in the extract contains itself
본 발명의 추출물은, 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 용매를 사용하여, 통상적으로 이용되는 증류추출, 냉침, 환류 냉각추출, 열수추출, 실온추출, 가온추출, 초음파추출, 초임계추출 등의 방법으로 제조될 수 있다.The extract of the present invention is prepared according to a conventional method known in the art, that is, using a conventional solvent, distillation extraction, cooling, reflux cooling extraction, hot water extraction, room temperature extraction, warming extraction, ultrasonic extraction , supercritical extraction, and the like.
구체적으로는 정제수, 탄소수 1 내지 6의 알코올, 글리세린, 탄소수 2 내지 6의 알킬렌글리콜, 탄소수 1 내지 6의 알칸, 탄소수 1 내지 6의 할로겐화 탄화수소, 탄소수 2 내지 6의 알킬 알카노에이트 및 그의 혼합물로부터 선택된 추출용매를 사용할 수 있다. 좀 더 구체적으로 예시하면 정제수, 메탄올, 에탄올, 1,2-프로판디올, 글리세린, 에틸렌글리콜, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 헥산, 에틸아세테이트 및 그의 혼합물로부터 선택된 추출용매를 사용할 수 있다. 이때 추출용매의 사용량은 원료 중량의 5 내지 30 배 부피량이며, 보다 바람직하게는 5 내지 20 배이다.Specifically, purified water, alcohol having 1 to 6 carbon atoms, glycerin, alkylene glycol having 2 to 6 carbon atoms, alkanes having 1 to 6 carbon atoms, halogenated hydrocarbons having 1 to 6 carbon atoms, alkyl alkanoates having 2 to 6 carbon atoms, and mixtures thereof Extraction solvents selected from may be used. More specifically, an extraction solvent selected from purified water, methanol, ethanol, 1,2-propanediol, glycerin, ethylene glycol, butylene glycol, propylene glycol, dichloromethane, dichloroethane, hexane, ethyl acetate, and mixtures thereof may be used. can At this time, the amount of the extraction solvent is 5 to 30 times the volume of the raw material weight, more preferably 5 to 20 times.
추출온도는 당업자가 추출 방법에 적절한 다양한 온도 범위를 채택할 수 있으며, 예를 들어, 20 ℃ 내지 100 ℃ 등에서 수행될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 또한, 추출시간은 추출방법에 따라 상이하며, 당업자가 적절한 추출 시간을 채택할 수 있으며, 이에 국한되지 않으나, 약 1 시간 내지 수일의 범위에서 단회 또는 복수회로 수행될 수 있다. 상기 1차 추출용매로 추출을 수행하여 얻어진 추출물은 통상의 방법에 따라 여과하여 불순물을 제거한 액상 형태로 얻거나, 얻어진 액상 형태의 추출물을 통상의 방법에 따라 감압농축 및/또는 건조하여 분말 형태로 얻을 수 있다.The extraction temperature may be selected by those skilled in the art in various temperature ranges suitable for the extraction method, and may be performed at, for example, 20 °C to 100 °C, but is not limited thereto. In addition, the extraction time differs depending on the extraction method, and a person skilled in the art may select an appropriate extraction time, but is not limited thereto, and may be performed single or multiple times in the range of about 1 hour to several days. The extract obtained by performing the extraction with the primary extraction solvent is obtained in liquid form from which impurities are removed by filtering according to a conventional method, or the obtained liquid extract is concentrated under reduced pressure and / or dried according to a conventional method to obtain a powder form. You can get it.
본 발명은 일 구현예에 따르면, 상기 추출물은 피멘타 라세모사(Pimenta racemosa) 잎의 증기 증류에 의해 얻은 베이유(bay oil)이다. According to one embodiment of the present invention, the extract is a bay oil obtained by steam distillation of Pimenta racemosa leaves.
또한, 본 발명에 따른 추출물을 조성 성분으로 사용함에 있어서는 동결 건조된 분말 형태로는 물론이고, 물 또는 통상의 유기용매에 분산 또는 용해된 액체 형태로도 사용될 수 있다.In addition, when using the extract according to the present invention as a composition component, it can be used not only in the form of a lyophilized powder, but also in the form of a liquid dispersed or dissolved in water or a common organic solvent.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 상기 추출물 성분 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분을 함유할 수 있다.In addition, the composition according to the present invention may contain, in addition to the above extract components, other components capable of giving a synergistic effect to the main effect, preferably within a range that does not impair the main effect intended by the present invention.
본 발명에 따른 실험예 2를 통해 베이유(bay oil)의 콜라겐 합성 효과를 알아보기 위해 실험한 결과, 24시간 처리시 104% 이상, 48시간 처리시 140% 이상 콜라겐 합성량이 증가하였다.As a result of experiments to determine the collagen synthesis effect of bay oil through Experimental Example 2 according to the present invention, the amount of collagen synthesis increased by 104% or more when treated for 24 hours and 140% or more when treated for 48 hours.
이러한 결과를 통해 본 발명에서 제시하는 피멘타 라세모사(Pimenta racemosa)의 추출물은 피부 외용제 조성물 및 화장료 조성물로 적용이 가능하고, 이를 피부에 적용시 콜라겐 합성을 촉진함으로써, 피부 주름을 더욱 완화할 수 있고, 피부를 보다 견고하며 탄력 있게 유지해주는 효과를 얻을 수 있다.Through these results, the extract of Pimenta racemosa presented in the present invention can be applied as an external composition for skin and a cosmetic composition, and when applied to the skin, by promoting collagen synthesis, skin wrinkles can be further alleviated. It has the effect of keeping the skin firmer and more elastic.
피멘타 라세모사(Pimenta racemosa)의 추출물은 전체 외용제 조성물 중량 대비 0.0001 내지 30.0 중량% 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.001 내지 30.0 중량%를 포함할 수 있다. 만약, 상기 화합물의 함량이 제안 범위 미만일 경우 뚜렷한 효과를 기대할 수 없고, 반대로 제안 범위를 초과하는 경우 함량의 증가에 비해 효과의 증가가 미미하며 약간의 세포 독성을 야기할 수 있다.Pimenta racemosa ( Pimenta racemosa ) may be included in an amount of 0.0001 to 30.0% by weight, preferably 0.001 to 30.0% by weight, based on the total weight of the composition for external application. If the content of the compound is less than the suggested range, a clear effect cannot be expected, and conversely, if the content exceeds the suggested range, the increase in effect is insignificant compared to the increase in the content and may cause slight cytotoxicity.
상기 외용제 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들어 바디 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제의 제형을 갖는 외용제 조성물일 수 있다. 이때 각 제형의 외용제 조성물에 있어서, 상기한 피멘타 라세모사(Pimenta racemosa)의 추출물 이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용목적 등에따라 당업자가 적의 선정하여 배합할 수 있다.The composition for external application is not particularly limited in its formulation, and may be, for example, a composition for external application having a formulation of body lotion, ointment, gel, cream, patch, or spray. At this time, in the composition for external use of each dosage form, other components other than the extract of Pimenta racemosa described above may be appropriately selected and blended by a person skilled in the art according to the formulation or purpose of use of other external preparations.
특히, 본 발명에 따른 피멘타 라세모사(Pimenta racemosa)의 추출물은 콜라겐 합성 촉진 효과를 통해 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물로서 적용이 가능하다.In particular, Pimenta racemosa according to the present invention ( Pimenta racemosa ) can be applied as a cosmetic composition containing it as an active ingredient through the collagen synthesis promoting effect.
피멘타 라세모사(Pimenta racemosa)의 추출물은 전체 화장료 조성물 중량 대비 0.0001 내지 30.0 중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.001 내지 30.0 중량%를 포함할 수 있다. 만약, 상기 화합물의 함량이 제안 범위 미만일 경우 뚜렷한 효과를 기대할 수 없고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하는 경우 포함량의 증가에 비해 효과의 증가가 미치지 못하며 약간의 세포 독성을 나타낼 수 있다.Pimenta racemosa ( Pimenta The extract of racemosa ) may be included in an amount of 0.0001 to 30.0% by weight, preferably 0.001 to 30.0% by weight, based on the weight of the total cosmetic composition. If the content of the compound is less than the suggested range, a clear effect cannot be expected, and on the contrary, if it exceeds the above range, the increase in the effect is not achieved compared to the increase in the amount contained and may exhibit slight cytotoxicity.
상기 화장료 조성물은 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들어 화장수, 유액, 크림, 폼, 에센스, 세럼, 유연수, 유액, 파운데이션, 메이크업 베이스, 비누, 선 스크린크림 및 선 오일 등의 제형으로 제조할 수 있다.The cosmetic composition is not particularly limited in its dosage form, and for example, lotion, lotion, cream, foam, essence, serum, softening water, lotion, foundation, makeup base, soap, sunscreen cream and sun oil, etc. It can be made into a formulation.
또한, 각 제형의 조성들은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 포함하여 제조된다.In addition, the composition of each formulation may contain various bases and additives necessary and appropriate for formulation of the formulation, and within the range that does not reduce the effect, nonionic surfactants, silicone polymers, extender pigments, fragrances, preservatives, Bactericides, oxidative stabilizers, organic solvents, ionic or nonionic thickeners, softeners, antioxidants, free radical destroyers, opacifying agents, stabilizers, emollients, silicones, α-hydroxy acids, antifoaming agents, humectants, Vitamins, insect repellents, fragrances, preservatives, surfactants, anti-inflammatory agents, Substance P antagonists, fillers, polymers, propellants, basifying or acidifying agents, or colorants.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, a preferred embodiment is presented to aid understanding of the present invention. However, the following examples are only provided to more easily understand the present invention, and the content of the present invention is not limited by the examples.
실험예Experimental example 1: One: 베이유의bayou's 세포 독성 확인 Confirmation of cytotoxicity
1. 인간 피부 섬유 아세포의 배양1. Culture of human dermal fibroblasts
인간 피부 섬유 아세포(Human dermal fibroblast)는 Gibco사(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)로부터 구입하였다. 세포들은 DMEM 배지(Gibco사) 중에서 37℃에서 배양하였다. 배지는 부착된 세포들이 80% 합류(confluence) 때까지 유지하고 80 % 합류시기에 계대 배양을 수행하였다. 합류 때까지 배지는 2일 마다 교체하였다. 상기 계대 배양은 배양액을 제거한 플라스크를 인산완충식염수(phosphate buffer saline, PBS)로 세척하고 0.25 % 트립신-EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)로 세포를 떨어뜨린 후 세포 부유액을 원심분리한 후, 세포 수를 측정하고, 배양액에서 다시 3 배로 계대 배양하였다. Human dermal fibroblasts were purchased from Gibco (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Cells were cultured at 37°C in DMEM medium (Gibco). The medium was maintained until the attached cells reached 80% confluence and subculture was performed at 80% confluence. Medium was changed every 2 days until confluence. In the subculture, the flask from which the culture medium was removed was washed with phosphate buffer saline (PBS), the cells were dropped with 0.25% trypsin-EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), and the cell suspension was centrifuged. After that, the number of cells was measured and subcultured three times again in the culture medium.
2. 세포 독성 측정2. Cytotoxicity measurement
96 웰 플레이트에 10% 혈청이 첨가된 DMEM 배지(Gibco사)를 각각 넣고, 인간 피부 섬유아세포 5 X 102를 접종하여, 5% CO2 및 37℃ 조건에서 배양하여 세포를 배양 접시에 부착시킨 다음, 24시간 동안 혈청을 제거한 배양액에서 배양한 후, 음성대조군(DMSO처리)과 베이유 처리군으로 나누었다. 베이유를 DMSO에 농도별로 용해시켜 10㎕을 처리하였다(처리농도 0.00001 wt%~0.08 wt%). DMEM medium (Gibco) supplemented with 10% serum was added to a 96-well plate, inoculated with 5 X 10 2 human skin fibroblasts, and cultured under 5% CO 2 and 37 ° C conditions to attach the cells to the culture dish. Next, after culturing in the culture medium from which the serum was removed for 24 hours, it was divided into a negative control group (DMSO treatment) and a bayou treatment group. Bayou was dissolved in DMSO by concentration and treated with 10 μl (treatment concentration 0.00001 wt% to 0.08 wt%).
상기 처리 후, 5% CO2 및 37℃ 조건에서 24 시간 동안 배양하였다. 이후 MTT 시약을 넣고 4시간 후 배지를 제거하고 DMSO 200 ㎕를 가하여 포마잔 결정체 (formazan crystal)를 용해 시킨 후 마이크로평판 판독기 (microplate reader)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.After the treatment, the cells were cultured for 24 hours at 5% CO 2 and 37°C. Thereafter, the MTT reagent was added, and after 4 hours, the medium was removed, and 200 μl of DMSO was added to dissolve the formazan crystal, and the absorbance was measured at 570 nm using a microplate reader. The results are shown in Figure 1.
도 1의 결과로부터, 대조군을 기준으로 하였을 때, 베이유를 처리한 조건에서 최종 농도 0.005 wt% 이하에서 세포 독성이 없으며, 매우 낮은 농도에서 약 10% 가량 세포증식이 증가함을 알 수 있었다. From the results of FIG. 1, it was found that, based on the control group, there was no cytotoxicity at a final concentration of 0.005 wt% or less in the condition treated with bayou, and cell proliferation increased by about 10% at a very low concentration.
실험예Experimental example 2: 진피 섬유아세포 내 콜라겐 합성량 증가 효과 2: Effect of increasing the amount of collagen synthesis in dermal fibroblasts
베이유(bay oil)가 진피 섬유아세포 내 콜라겐 합성량에 미치는 영향을 확인하기 위하여 콜라겐 측정 실험을 진행하였다. 진피 섬유아세포주를 10% 우태혈청과 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에 첨가하여 37℃, 5% CO2,조건에서 배양하였다. 1일 배양 후에 베이유 0.0005 wt% 적용 배지로 바꾼 후 24시간, 48시간 각각 배양하였다. 웰을 PBS로 3회 세척하고 항체-POD 공액 용액(conjugate solution)을 웰에 100㎕ 넣고 37℃에서 1시간 방치하였다. 웰을 PBS로 3회 세척하고 기질용액(TMB)을 웰에 100㎕ 넣고 25℃에서 30분 방치하였다. 1N H2SO4를 웰에 100㎕ 넣고 콜라겐의 양을 ELISA 판독기(Bio-Tek instrument)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 DMSO를 처리한 대조군과의 상대적인 흡광도 차이에 따라 콜라겐 생성 증가활성을 계산하여 결과를 도출하고, 그 결과는 도 2에 나타내었다. In order to confirm the effect of bay oil on the amount of collagen synthesis in dermal fibroblasts, a collagen measurement experiment was conducted. The dermal fibroblast cell line was added to DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 U/ml penicillin, and 100 μg/ml streptomycin, and cultured at 37°C, 5% CO 2 , conditions. After culturing for 1 day, the culture medium was changed to 0.0005 wt% of bayou, followed by culturing for 24 hours and 48 hours, respectively. The wells were washed three times with PBS, and 100 μl of the antibody-POD conjugate solution was put into the wells and left at 37° C. for 1 hour. The wells were washed three times with PBS, and 100 μl of a substrate solution (TMB) was added to the wells and allowed to stand at 25° C. for 30 minutes. 100 μl of 1N H 2 SO 4 was added to the well, and absorbance at 450 nm was measured for the amount of collagen using an ELISA reader (Bio-Tek instrument). At this time, the result was derived by calculating the collagen production increasing activity according to the relative absorbance difference from the control group treated with DMSO, and the results are shown in FIG. 2.
도 2를 참조하면, 콜라겐 합성량 정도를 측정하였을 때, 베이유 24시간 처리 했을 때 약 104 % 콜라겐 합성량을 보여 그 증가 정도가 미약한 반면, 48시간 처리했을 때 콜라겐 합성량은 약 140% 증가하였다. 이는 베이유를 지속적으로 사용할 경우에 콜라겐 합성 효과가 증대됨을 나타낸다. Referring to Figure 2, when the amount of collagen synthesis was measured, when treated with bayou for 24 hours, the amount of collagen synthesis was shown to be about 104%, and the increase was insignificant, whereas, when treated for 48 hours, the amount of collagen synthesis was about 140% increased. This indicates that the effect of collagen synthesis is increased when the bayou is continuously used.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제형예를 제시한다. 그러나 하기의 제형예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 제형예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, preferred formulation examples are presented to aid understanding of the present invention. However, the following formulation examples are only provided to more easily understand the present invention, and the content of the present invention is not limited by the formulation examples.
제형예formulation example 1: 유연화장수 ( 1: Softening lotion ( 스킨skin ))
하기의 표 1과 같이 베이유(bay oil)를 함유하는 유연화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.As shown in Table 1 below, softening lotion containing bay oil was prepared according to a conventional method.
제형예formulation example 2: 영양화장수 (로션) 2: Nourishing lotion (lotion)
하기의 표 2와 같이 베이유(bay oil)를 함유하는 영양화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.As shown in Table 2 below, nutrient lotion containing bay oil was prepared according to a conventional method.
제형예formulation example 3 : 마사지 크림 3 : Massage Cream
하기의 표 3과 같이 베이유(bay oil)를 함유하는 마사지 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.As shown in Table 3 below, a massage cream containing bay oil was prepared according to a conventional method.
제형예formulation example 4 : 에센스 4 : Essence
하기의 표 4와 같이 베이유(bay oil)를 함유하는 에센스를 통상의 방법에 따라 제조하였다.As shown in Table 4 below, an essence containing bay oil was prepared according to a conventional method.
제형예formulation example 5: 연고 5: ointment
하기 표 5와 같이 베이유(bay oil)를 함유하는 연고를 통상의 방법에 따라 제조하였다.As shown in Table 5 below, an ointment containing bay oil was prepared according to a conventional method.
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