JP3790737B2 - 相補分子間の結合検出方法およびその方法に利用されるせん断応力測定センサー - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、相補分子間の結合検出方法およびその方法に利用されるせん断応力測定センサーに係り、特にバイオチップにおいてプローブとターゲットとの結合を検出する方法およびセンサーに関する。
【0002】
【従来の技術】
バイオチップとは、分析しようとするDNA、蛋白質などのプローブを基板上に高密度で付着させたチップであって、試料内のターゲットである遺伝子の発現パターンや欠陥、蛋白質の分布や反応パターンなどを分析しうる。バイオチップは、プローブの付着形態によって、固体基板上に付着させたマイクロアレイチップと、微細チャンネル上に付着させたラブ・オン・チップ(lab−on−a−chip)とに分けられる。また、プローブの種類によって、DNAチップまたは蛋白質チップなどに分けられる。このようなバイオチップでは、試料内にプローブと結合可能なターゲットが存在するか否かを判断するために、基板上に固定されたプローブとターゲットとの結合を検出できるシステムが必要である。
【0003】
プローブとターゲットとの結合を検出する方法としては、遺伝子分析用のDNAチップで試料DNAに蛍光物質をラベル付けし、チップ上のプローブと反応させた後、共焦点顕微鏡やCCDカメラを使用してチップ表面に残った蛍光物質を検出する方法がある(例えば、特許文献1参照。)。しかし、このような光学的な検出方法は、システムの小型化が難しく、直接デジタル化された出力が得られないために、電気信号をデジタル化する変換装置が必要になる。
【0004】
また、他の方法としては、DNAの混成化(hybridization)を酸化/還元が容易な金属化合物を用いて電気化学的に検出する方法がある(例えば、特許文献2、3参照。)。この方法は、DNAが混成化された時、酸化/還元が容易な金属を含む他の化合物が共に錯体を構成することに着目し、これを電気化学的に検出するものである(例えば、非特許文献1〜4参照。)。しかし、この電気化学的な方法も別途のラベル付けが必要である。
【0005】
その他、以下のような、蛍光物質や他のいかなるラベルも使用せずにプローブとターゲットとの結合を検出する方法についての研究が活発に進行しつつある。そのうちの1つには、水晶ミクロバランス(Crystal Microbalance)を用いて結合前後の質量差を測定する方法(例えば、非特許文献5参照。)、その他には、マトリックス補助レーザー吸着イオン化(MALDI)質量分光測定法を用いて分析する方法(例えば、非特許文献6、特許文献4参照。)があり、さらに、その他には、DNAプローブとターゲットとの結合前後における分子間の結合力を微細組立された機械的センサータイプのカンチレバーを用いて1塩基差まで測定する方法もある(例えば、非特許文献7、8参照。)。しかし、この場合には、カンチレバービームの屈折を非常に精密に測定しなければならないため、レーザーなどの別途の高価な装備が必要になる。
【0006】
したがって、従来、別途のラベル付けが不要で、検出結果を電気的信号として直接得ることができ、レーザーのような別途の高価な装備が不要な、敏感で効率的なプローブの新たな結合検出方法の開発が求められている。
【0007】
【特許文献1】
米国特許第6,141,096号明細書
【特許文献2】
米国特許第6,096,273号明細書
【特許文献3】
米国特許第6,090,933号明細書
【特許文献4】
米国特許第6,043,031号明細書
【非特許文献1】
Anal.Chem,Vol.70,pp.4670−4677,1998
【非特許文献2】
J.Am.Chem.Soc,Vol.119,pp.9861−9870,1997
【非特許文献3】
Analytica Chimica Acta,Vol.286,pp.219−224,1994
【非特許文献4】
Bioconjugate Chem,Vol.8,pp.906−913,1997
【非特許文献5】
Anal.Chem,Vol.70,pp.1288−1296,1998
【非特許文献6】
Anal.Chem,Vol.69,pp.4540−4546,1997
【非特許文献7】
Science,Vol.288,pp.316−318,2000
【非特許文献8】
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98,1560,2001
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、蛍光物質のような別途のラベル付けが不要で、検出結果を電気的信号として得られる新たなプローブとターゲットの結合検出方法を提供することである。
【0009】
また、本発明の他の目的は、プローブとターゲットの結合検出方法に利用できる新たなせん断応力測定センサーを提供することである。
【0010】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的を達成するために本発明は、(a) センサー基板の表面にプローブを付着させる段階と、(b) 前記センサー基板の表面と平行に対向する試料基板にターゲットを含む試料を投入する段階と、(c) 前記センサー基板と前記試料基板との間隔をプローブとターゲットとの結合体の大きさに合わせて調節する段階と、(d) 前記センサー基板に付着しているプローブを前記試料に含まれるターゲットと反応させる段階と、(e) 前記反応前後における前記センサー基板の表面のせん断応力の変化を測定する段階と、を含み、前記せん断応力の変化は、振動運動の相変化と力変化とを測定することによって得ることを特徴とする相補分子間の結合検出方法。
【0011】
本発明の方法において、せん断応力の測定は、公知のいかなるせん断応力測定方法も使用できるが、本発明の方法では、振動運動の相変化と力変化を測定する方法を使用している。
【0012】
本発明の方法において、せん断応力を測定する方法は、既によく知られている(J.Van Alsten,and S.Granick,Rev.Sci.Inst,62,463,1991)。この方法を要約すれば、信号入力部をサイン曲線で振動させ、信号出力部で振動運動の相変化と力変化とを測定する。これらの変化はセンサー表面に固定されている物質の粘度や構造などにより大きく影響を受ける。物質が弾性固体である場合、せん断応力はフックの法則によってひずみに比例し、液体である場合、せん断応力はニュートンの法則によってせん断率に比例する。しかし、粘弾性液体である場合には2つの法則が併せて適用される。弾性せん断係数はせん断応力の弾性成分であって、変形と同相の成分である。一方、粘性せん断係数はせん断応力の粘性成分であって、せん断率、すなわちフィルムの変形率に比例する成分である。
【0013】
局所粘度は表面における距離の関数で表されるため粘度を決めにくい。しかし、フローに抵抗を与えるという意味での有効粘度は前記せん断応力の粘性成分から分かるので、粘性応力/有効せん断率と定義して使用する。ここで、有効せん断率とは、最大せん断振幅/フィルム厚さである。
【0014】
本発明の方法において、センサー基板と試料基板との間隔は予想されるプローブとターゲットとの結合体(プローブターゲット複合体)の大きさに合わせて調節できるが、望ましくは間隔を狭めながらプローブが付着されたセンサー基板の反発力の変化を測定することによって決定されたプローブターゲット複合体の大きさに調節する。
【0015】
本発明の方法において、プローブまたはターゲットは選択的に結合可能ないかなるプローブも使用できるが、望ましくはDNAオリゴマー、c−DNAのような核酸、抗原、抗体のような蛋白質、補助因子、オリゴ糖類及び細胞などを含む。
【0016】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、請求項1に係る相補分子間の結合検出方法に使用されるせん断応力センサであって、(a)振動を発生する信号入力部と、(b)前記信号入力部からの振動を遅延する信号出力部と、(c)前記信号入力部と前記信号出力部とを接続するセンサー基板と、(d)前記センサー基板の表面と平行に対向する試料基板と、(e)前記センサー基板と前記試料基板との間隔を調節する間隔調節部と、(f)前記信号入力部と前記信号出力部との間の振動運動の相変化と力変化とを測定する信号検出部とを含むせん断応力測定センサーを提供する。
【0017】
本発明のセンサーにおいて、振動(信号)を入力/出力する信号入力部/信号出力部は周期的な振動で動かし、振動の程度を測定可能なメカニズムであれば、いかなるメカニズムも使用できる。振動運動は、圧電効果(電圧)、静電誘導(容量)、電磁誘導(電流)または熱膨張現象(体積)により誘発されることが望ましい。
【0018】
本発明のせん断応力測定センサーにおいては、信号入力部、信号出力部及びこれらを接続するセンサー基板が1つの単位となって多数配列されているセンサーの形態を有することが望ましい。このようなセンサーは多数のプローブを高密度で固定させるバイオチップに効率よく使用されうる。
【0019】
本発明のせん断応力測定センサーにおいて、前記センサー基板の表面とそれと平行に対向する試料基板との間隔を調節する間隔調節部は、センサー基板と試料基板との間隔を調節できるものであればいかなる機械的装置でも使用できるが、静電容量を用いてセンサー基板と試料基板との間隔を測定することが望ましい。この間隔調節部は前記基板両面間の間隔によってせん断応力が変わるため、プローブターゲット複合体の大きさに合わせてせん断応力を測定することが最も重要である。
【0020】
本発明のセンサーにおいて、信号検出部は信号入力部と信号出力部との間における振動運動の相変化と力変化とを測定できるものであれば、いかなる装置も利用できるが、望ましくは、弾性せん断係数及び粘性せん断係数を測定する装置、さらに望ましくはロックイン増幅器を使用する。
【0021】
【発明の実施の形態】
以下、添付した図面に基づき、本発明を詳細に説明する。
【0022】
図1は、本発明の望ましい一実施形態の説明に供する図であって、圧電タイプの振動板を用いてせん断応力を測定するセンサーの模式図を示すものである。せん断応力測定センサー1は次のように構成される。支持基板2には振動板3,3’対峙して取り付けられ、その振動板3,3’の端部には支持基板2に対してその面が平行になるように、センサー基板4が取り付けられる。センサー基板4は、図に示すように、支持基板2に複数取り付けられる。センサー基板4を支える一方の振動板3は信号入力部として使用され、他方の振動板3’は信号出力部として使用される。前記振動板3、3’(例えば圧電バイモルフ)は圧電効果により振動し、その振動運動の相変化と力変化とが信号検出部5により検出される。センサー基板4の表面にはターゲットに選択的に結合するDNAまたはプロテインなどのプローブが付着される。センサー基板4と試料基板6とは、両基板の表面が平行になるよう対向して配置されており、機械的装置(図示せず)により支持基板2または試料基板6を垂直方向に進退移動させてセンサー基板4と試料基板6との間隔を調節でき、この間隔は電気容量測定装置7を用いて測定することができる。
【0023】
図2は、本発明に係るせん断応力測定センサーに相異なるプローブを付着する方法を示す模式図(図2A)と、分析しようとする試料との混成化反応を示す模式図(図2B)である。まず、振動板が取り付けられたせん断応力測定センサー1を、相異なる種類のプローブ8を入れたマルチウェル容器9に浸しプローブを付着させる。次に、ターゲットを入れた単一ウェル容器10にセンサー1を浸して混成化反応を起こさせる。なお、試料基板6は前記単一ウェル容器10の底部に位置する。次に、洗浄段階を経た後、バッファ溶液が入れられている容器内でせん断応力測定を行う。
【0024】
図3は、図1のセンサーを複数配列したことを示す模式図である。ここで、対向して見える1対の棒は信号入力部、信号出力部及びこれらを接続する基板より構成された1つのセンサー素子を示す。
【0025】
図4は、本発明の望ましい一実施形態の説明に供する図であって、静電タイプの振動板を用いてせん断応力を測定するセンサーの模式図である。ここで、せん断応力測定センサー11は2つの振動板13,13’、それぞれの振動板に隣接した固定面12,12’と、前記振動板の両末端部分を連結するセンサー基板14を含む。この振動板13,13’の内、一方の振動板13は信号入力部として使用され、他方の振動板13’は信号出力部として使用される。図4では、せん断応力測定センサー11の振動板13,13’は、図1に示したような圧電タイプではなく静電力によって振動するものであり、この振動は、横に固定されている面12,12’との静電容量差を測定することによって信号検出部(図示せず)で検出する。
【0026】
【実施例】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は単に本発明の理解を容易にするために例示するものであり、本発明の範囲はこれらの実施例により制限されるものではない。
【0027】
[実施例1]
チオール変形したDNAオリゴマープローブの固定
本実験は、せん断応力差によって混成化反応前後の変化が測定できるか否かをテストするために、せん断力測定ができるように改変した表面力装置(surface forces apparatus;SFA)を使用した(Granick,S.Science 1991,253,1374参照)。一般のSFA実験方法にしたがい、白雲母を段差のない平滑なシート状に形成し(以下、雲母シートと称する)、その片面に660ÅのAgをスパッタリングしてAg面を形成し、その雲母シートを曲率半径Rが2cm以下のレンズに接着剤で接着した。
【0028】
雲母シートのAg面にDNAを固定するためチオール変形したDNAを使用した。2つの雲母シート表面間の距離は既知の方法にしたがい多重ビーム干渉測定方法を用いて測定した(Journal of Colloid and Interface Science,1973,44,2,259,1973,J.Phys.Chem.B.2000,104,7652参照)。一般のSFA実験では、Agスパッタリングされた上下の雲母シート表面を、Ag層表面を外側に向けて雲母表面間にある液体に対して実験する。本実験では組み合わせられたDNAプローブフィルムを使用するために、一方はAg層、他方は雲母表面が相互に対向するように配置した。
【0029】
Ag層表面と雲母表面との間隔が300Åになると、強いファンデルワールス力によりフラット接触でジャンプしたが、これは雲母及びAg層の表面が非常に清潔であることを意味する。Ag層と雲母の接触点の複数箇所を測定すると、構造的妨害の波長は2〜4Å内外で一定した。Ag層表面の粗さは、15〜20Årms内外と推定されたが、両面の相対的な間隔は比較的正確に測れた。厚さ算出時に必要なDNA溶液の屈折率は1.46と仮定した(Jordan,C.E.;Frutos,A.G.;Thiel,A.T.;Corn,R.M.Anal.Chem.1997,69,4939参照)。
【0030】
プローブには、ハンターシンドローム病の原因と考えられる、Iduronate−2−sulphate(IDS)エキソン遺伝子の一部の下記配列番号1のオリゴヌクレオチドを用いた。
【0031】
配列番号:1
(SH−C6−5’−GTT CTT CTC ATC ATC−3’)
【0032】
該オリゴマーをResearch Genetics(Huntsville,AL)で購買し、5’末端をアルカンチオールスペーサにて変形させた。分子量はM=4651g/molであった。チオール変性したss−DNA 1mM溶液(1MN aH2PO4、pH4.0)にAg層表面を接触させ、3時間吸着させた後、バッファ溶液及び脱イオン水で順次洗浄してN2ガスで乾燥した。物理的に吸着したDNAを除去し、ss−DNAプローブのを表面から延びた構造にするために1mMメルカプトヘキサノール、(HS−(CH2)6OH)に10分間接触させ、次いで脱イオン水で洗浄しN2ガスで乾燥した。
【0033】
[実施例2]
プローブと相補的な序列の混成化
混成化反応実験を行うために、プローブに相補的な下記配列番号2(3’−CAA GAA GAG TAG TAG−5’)を有する1.5mMss−DNA溶液(TE−1M NaCl buffer(10mM Tris−HCl,1mM EDTA,1M NaCl pH7.6)と38℃で2時間反応させ、次いで、38℃ TE−1M NaClバッファと脱イオン水で順次に洗浄してN2ガスで乾燥させた。
【0034】
配列番号:2
(3’−CAA GAA GAG TAG TAG−5’)
【0035】
[実施例3]
反発力の測定
反発力の測定は、図1に示したセンサーの原理を使用した改変された表面力装置(Modified Surface Forces Apparatus,S.Granick,Science,253,1374,1991,J.Peachey,J.VanAlsten,and S.Granick,Rev.Sci.Inst,62,463,1991参照)を使用して測定した。Ag層表面にチオール変性したオリゴマーを吸着させた後、混成化反応前後のDNA薄膜の反発力を測定した。
【0036】
ss−DNAプローブの固定または混成化反応後の表面間にNaCl 1M溶液を1滴落として実験を行った。この際、下面は純粋雲母となり、上面はAg層表面チオール変性されたDNAを固定させた面となるか、あるいはこの面にターゲットで混成化された表面となった。
【0037】
対照実験において、DNAは水中で負電荷を帯びる非処理の雲母には吸着しなかった。したがって、チオール変性されたDNAオリゴマーは、オリゴマーの末端部分が付着し末端拘束された(end−tethered)形状を有し、反対側の雲母表面には非特異的な吸着は少ない。
【0038】
両面間の間隔が1mm以上離れている時、マイクロピペットを用いてNaCl1M 溶液を1滴落とし、下の雲母表面が固定されているスプリングに一定の力を加えて両面の間隔を徐々に狭めつつ、両面の間隔を、多重ビーム干渉測定方法を用いて測定した。与えられた力とストリング定数によって移動する距離と実際移動した距離とを比較して、図5の上図のような力距離曲線を求めた。
【0039】
図5は、図1に示したセンサーの原理を使用した改変された表面力装置(S.Granick,Science,253,1374,1991,J.Peachey,J.VanAlsten,and S.Granick,Rev.Sci.Inst,62,463,1991参照)を用いて測定したデータを示すグラフである。ここで、Ag層表面にチオール変性したローブを組み合わせ単層方法で吸着させて相補的な塩基対と混成化反応前後のDNA薄膜の反発力(上図)及びせん断応力(下図)を求めた。四角形(■):1.0M NaCl溶液中のss−DNA;三角形(△):過量のメルカプトヘキサノール添加後の1.0MNaCl溶液中のss−DNA;円形(●):混成化反応後の1.0M NaCl溶液中のds−DNA。上図には曲率半径Rで標準化した反発力(F/R)をY軸、両面間の間隔をX軸で示し、下図にはせん断応力、すなわち弾性せん断係数G’を左側Y軸とし、有効接触面積で標準化していない弾性せん断力定数g’を右側Y軸とし、両面間の間隔をX軸とし、半対数スケールで示した。図5にはせん断応力G’:垂直圧力PNの比率を示した。なお、せん断応力は1.3Hzで測定し、有効接触面積はラングバイン近似式(Aeff〜2πRD)を用いて計算した。
【0040】
参考に、実験に使用したss−DNA 15merの長さは77Å、ds−DNAの長さは63Åと予測される。図5の上図に四角形記号で示したように、メルカプトヘキサノールで処理する前のチオール末端を有するss−DNAプローブが1.0M NaCl溶液中に含まれる場合、反発力は約43±2Åから始まり、26±2Åではそれ以上圧縮されない硬壁厚さが測定できた。
【0041】
ss−プローブを吸着させた表面に、メルカプトヘキサノールで処理した場合(三角形)には、DNAプローブがより延びた構造となり、反発力が始まる膜厚がss−DNAプローブのみ存在する場合よりも厚い約80±2Åから始まってそれ以上圧縮されない硬壁厚さは、28±2Åであった。
【0042】
混成化反応以後には反発力が約72±2Åから始まって41±2Åまでは単調に増加し、41±2Åで突然30±2Åにジャンプした。これは比較的硬いds−DNAが過重な垂直圧力に耐えられず、チルト角を変えたものと考えられる。したがって、ds−DNAの大きさは41±2Åないし30±2Å、望ましくは約31±2Åである。
【0043】
以上の結果から分かるように、DNAプローブが固定された表面に他の表面を近づけつつ反発力を測定すれば、その力の差だけでも混成化反応の発生有無が分かる。すなわち、反発力だけを正確に測定しても単一及び二重筋の厚さや力の差が確認できる。しかし、反発力は正確に測定しにくく、単一と二重筋との差がせん断応力に比べて小さいという短所がある。
【0044】
[実施例4]
せん断応力の測定
次に、せん断応力を用いてDNA混成化反応を検出する例を説明する。図1の模式図に示すせん断応力測定装置を用いて、DNAのせん断応力の変化を測定してDNAの混成化反応の有無を検出する。実験時、せん断振幅は2Åより小さくして、できるだけシステムを妨害しない線形様式で実験した。
【0045】
信号入力部として機能する振動板3を種々の周波数でサイン曲線型励起を行い、信号出力部として機能する反対側の振動板3’の運動を検出し、弾性及び粘性応答を区別して試料の弾性力または粘性力を測定し、その中の弾性力を図5の下図に示した。混成化反応後の弾性力が粘性力より顕著に大きいことが分かる。これは混成化されたDNAの強度がss−DNAよりはるかに大きいためと考えられる。
【0046】
また、図5の挿入図から分かるように、せん断応力をG’として垂直圧力PNで標準化を行えば、せん断応力がはるかに大きいことが分かる。したがって、反発力よりせん断応力は混成化反応検出において感度が高いことが分かる。
【0047】
図5の実験は、せん断振幅とせん断周波数とを一定にしてギャップ厚さを薄くしつつ実験した結果であって、図6は両面間の間隔を図5の実験結果から得た二分子大きさレベルの31±2Åに固定させておき、ss−DNA,ds−DNAフィルムに種々の周波数のせん断を与え、弾性せん断係数(上図)と粘性せん断係数(下図)を比較したデータである。ここで、データ記号は図5と同一である。左側Y軸の有効弾性せん断係数G’(上図)と有効粘性せん断係数G”(下図)とはラングバイン近似式を使用して標準化した力であり、右側Y軸は有効接触面積で標準化していない弾性(上図)及び粘性(下図)せん断力定数g’,g”であり、X軸はラジアンせん断周波数である。図示したように混成化反応以後の試料の弾性及び粘性係数が混成化反応前のss−DNAよりオーダーが大きいことが分かり、これを用いてDNAの混成化反応の有無を検出できる。
【0048】
図7は、センサー基板4と試料基板6との間隔が31±2Åである時、ss−DNA,ds−DNAフィルムのせん断振幅を広めた際、測定した弾性せん断係数(黒抜き記号)と粘性せん断係数(白抜き記号)を示すグラフである。データ記号は四角形(■,□):1.0M NaCl溶液中のss−DNA;三角形(▲,△):過量のメルカプトヘキサノール添加後の1.0M NaCl溶液中のss−DNA;円形(●,○):混成化反応後の1.0M NaCl溶液中のds−DNAであり、標準化方法は図6と同一である。せん断振幅を広めると、ある限界せん断振幅で係数が減少する。しかし、せん断振幅が10nm程度となって試料が非線形条件にあってもss−DNAプローブと混成化反応以後のせん断係数の差は10倍以上であった。
【0049】
以上では配列が完全一致したターゲット試料を使用して実験したが、単一塩基突然変異などの突然変異性のある試料を使用してもss−プローブと大差ないと予想される。
【0050】
【発明の効果】
前述したように、本発明の検出方法によればDNAまたはプロテインなどの生物質を分析する時、センサー表面のプローブがターゲットと結合する前後のセンサー表面の振動運動の相変化と力変化とを測定することによって得られるせん断応力差を測定することによって、既存の蛍光物質を用いた検出方法と違って別途のラベル付けが不要で、電気的信号にて検出でき、かつカンチレバーの屈折程度を測定する方法に比べてさらに敏感でレーザーのような高価の装備が不要になる。
【図面の簡単な説明】
【図1】圧電タイプの振動板を用いてせん断応力を測定するせん断応力測定センサーの模式図である。
【図2】Aは、本発明に係るせん断応力測定センサーに相異なるプローブを付着する方法を、Bは、分析しようとする試料との混成化反応を示す模式図である。
【図3】図1のセンサーを複数配列したことを示す模式図である。
【図4】静電タイプの振動板を用いてせん断応力を測定するセンサーの模式図である。
【図5】せん断力測定ができるように改変した表面力装置を使用してDNAの混成化反応前後のDNA薄膜フィルムの反発力(上図)及びせん断応力(下図)を測定したデータを示すグラフである。
【図6】センサー基板と試料基板との間隔が31±2Åである時、ss−DNA,ds−DNAフィルムの種々の周波数で測定した弾性せん断係数(上図)と粘性せん断係数(下図)とを示すグラフである。
【図7】センサー基板と試料基板との間隔が31±2Åである時、ss−DNA,ds−DNAフィルムのせん断振幅を広めた際、測定した弾性せん断係数(黒抜き記号)と粘性せん断係数(白抜き記号)とを示すグラフである。
【符号の説明】
1…せん断応力測定センサー
2…支持基板
3,3’…振動板
4…センサー基板
5…信号検出部
6…試料基板
7…電気容量測定装置
8…相異なる種類のプローブ
9…プローブを入れたマルチウェル容器,
10…ターゲットを入れた単一ウェル容器
11…せん断応力測定センサー
13,13’…振動板
14…センサー基板
【配列表】
Claims (7)
- (a) センサー基板の表面にプローブを付着させる段階と、
(b) 前記センサー基板の表面と平行に対向する試料基板にターゲットを含む試料を投入する段階と、
(c) 前記センサー基板と前記試料基板との間隔をプローブとターゲットとの結合体の大きさに合わせて調節する段階と、
(d) 前記センサー基板に付着しているプローブを前記試料に含まれるターゲットと反応させる段階と、
(e) 前記反応前後における前記センサー基板の表面のせん断応力の変化を測定する段階と、を含み、
前記せん断応力の変化は、振動運動の相変化と力変化とを測定することによって得ることを特徴とする相補分子間の結合検出方法。 - 前記センサー基板と前記試料基板との間隔は、当該間隔を狭めたときの前記センサー基板と前記試料基板との間の反発力の変化を測定することによって決定され、前記結合体の大きさに合わせて調節されることを特徴とする請求項1に記載の相補分子間の結合検出方法。
- 前記プローブは、核酸、蛋白質、補助因子、オリゴ糖類または細胞であることを特徴とする請求項1に記載の相補分子間の結合検出方法。
- 請求項1に係る相補分子間の結合検出方法に使用されるせん断応力センサであって、
(a)振動を発生する信号入力部と、
(b) 前記信号入力部からの振動を遅延する信号出力部と、
(c) 前記信号入力部と前記信号出力部とを接続するセンサー基板と、
(d) 前記センサー基板の表面と平行に対向する試料基板と、
(e) 前記センサー基板と前記試料基板との間隔を調節する間隔調節部と、
(f) 前記信号入力部と前記信号出力部との間の振動運動の相変化と力変化とを測定する信号検出部とを含むことを特徴とするせん断応力測定センサー。 - 前記信号入力部と前記信号出力部との間の振動運動は、圧電効果(電圧)、静電誘導(容量)、電磁誘導(電流)または熱膨張現象(体積)により誘発されることを特徴とする請求項4に記載のせん断応力測定センサー。
- 前記信号入力部、前記信号出力部及びこれらを接続するセンサー基板は、これらを一単位として複数単位配列されていることを特徴とする請求項4に記載のせん断応力測定センサー。
- 前記間隔調節部は、前記センサー基板と前記試料基板との間の静電容量を測定する静電容量測定装置を含むことを特徴とする請求項4に記載のせん断応力測定センサー。
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WO2005038459A2 (en) * | 2003-08-06 | 2005-04-28 | Bridger Technologies, Inc. | Bridged element for detection of a target substance |
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US7517695B2 (en) * | 2004-01-20 | 2009-04-14 | The Curators Of The University Of Missouri | Local flow and shear stress sensor based on molecular rotors |
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DE102004022263A1 (de) * | 2004-05-06 | 2005-12-15 | Clondiag Chip Technologies Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen |
US7497133B2 (en) * | 2004-05-24 | 2009-03-03 | Drexel University | All electric piezoelectric finger sensor (PEFS) for soft material stiffness measurement |
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JP2006133164A (ja) * | 2004-11-09 | 2006-05-25 | Fyuuensu:Kk | カルモデュリンの構造変化を検出する方法、カルモデュリンの構造変化に影響を与える活性を有する物質を探索する方法 |
KR100667314B1 (ko) * | 2005-01-06 | 2007-01-12 | 삼성전자주식회사 | 초음파를 이용한 바이오결합 검출 장치 및 그 방법 |
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JP4705504B2 (ja) * | 2006-04-05 | 2011-06-22 | アイダエンジニアリング株式会社 | マイクロ流体チップ |
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US20080012578A1 (en) * | 2006-07-14 | 2008-01-17 | Cascade Microtech, Inc. | System for detecting molecular structure and events |
KR101490531B1 (ko) * | 2006-07-17 | 2015-02-05 | 유니버셜 바이오센서스 피티와이 엘티디. | 자성 입자 이동성의 전기화학적 검출 |
KR100741160B1 (ko) * | 2006-10-11 | 2007-07-20 | 충북대학교 산학협력단 | 단백질 나노어레이 상에서 단백질-단백질 상호작용의고성능 분석법 |
KR100798361B1 (ko) * | 2007-02-01 | 2008-01-28 | 포항공과대학교 산학협력단 | 감지기둥을 갖는 미세질량 측정 센서 |
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KR100937825B1 (ko) * | 2007-12-14 | 2010-01-20 | 전북대학교산학협력단 | 연료 검사장치 |
US8181531B2 (en) | 2008-06-27 | 2012-05-22 | Edwin Carlen | Accessible stress-based electrostatic monitoring of chemical reactions and binding |
US9011670B2 (en) | 2008-08-14 | 2015-04-21 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Three-dimensional metal ion sensor arrays on printed circuit boards |
US8319503B2 (en) | 2008-11-24 | 2012-11-27 | Cascade Microtech, Inc. | Test apparatus for measuring a characteristic of a device under test |
EP2547998A1 (en) * | 2010-03-16 | 2013-01-23 | Abbott GmbH & Co. KG | Method and device for determining mechanical stress load and interface effects on particles dispersed in a fluid |
WO2012068392A2 (en) * | 2010-11-17 | 2012-05-24 | California Institute Of Technology | Low cost, portable sensor for molecular assays |
CN105490507A (zh) * | 2016-01-13 | 2016-04-13 | 蔡权 | 一种带有高重复性湿度检测装置的电源操作门板 |
CN105675560B (zh) * | 2016-01-18 | 2018-06-01 | 中国科学院化学研究所 | 一种获取剪切场下单个聚合物分子荧光发射光谱信息的方法 |
CN106092380A (zh) * | 2016-06-13 | 2016-11-09 | 常州大学 | 一种测量基因片段作用力的微简支梁装置 |
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US5372930A (en) * | 1992-09-16 | 1994-12-13 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Sensor for ultra-low concentration molecular recognition |
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