JP3623602B2

JP3623602B2 - 試料観察方法及びその装置

Info

Publication number: JP3623602B2
Application number: JP18068896A
Authority: JP
Inventors: 俊郎樋口; 謙一工藤; 秀夫横田; 祥愼福田; 光典小久保
Original assignee: Kanagawa Academy of Science and Technology; Japan Science and Technology Agency; Toshiba Machine Co Ltd; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Kanagawa Academy of Science and Technology; Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency; Shibaura Machine Co Ltd
Priority date: 1996-07-10
Filing date: 1996-07-10
Publication date: 2005-02-23
Anticipated expiration: 2016-07-10
Also published as: JPH1026586A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医療分野における病理検査，製薬分野における毒性検査，食品分野における食品検査，農業分野における農作物検査や植物構造解析，生物分野における生体試料検査等に有用な試料観察方法及びその装置に関し、特に試料切断面を撮像して得た画像データに基づいて試料観察を行う試料観察方法及びその装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、この種の試料観察には、観察対象となる試料を切断し、白色光を照射しながら試料切断面をＣＣＤカメラにより撮像して画像データを記憶し、該画像データを観察可能なデータに処理してから、試料切断面や試料構造をモニターに表示する通常観察法が一般に採用されている。
【０００３】
また、観察対象となる試料を蛍光染料で予め染色し、該蛍光染料が励起される特定波長光を試料切断面に照射することで、試料内部の微細物質や器官や病原体や癌等を観察する蛍光観察法も知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記従来の観察方法では、何れも１つの試料切断面に対して１つの画像データを得ているだけなので、試料切断面毎に得られた画像データを如何様に処理しても、試料切断面や試料構造を今以上詳細に観察することができない。
【０００５】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、試料切断面や試料構造をより詳細に観察できる試料観察方法と、この方法実施に好適な試料観察装置を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明に係る試料観察方法は、請求項１に記載のように、試料を切断し、該試料切断面を照明しながら撮像手段により撮像して画像データを記憶し、該画像データに基づいて試料観察を行う試料観察方法において、第１光源からの光を対物レンズを通じて試料切断面に直接的に照射する直接照明手段と、第２光源からの光を対物レンズ周囲の間接照明器を通じて試料切断面に間接的に照射する間接照明手段とを備え、試料切断面からの光のうち撮像手段に導かれる波長光を選択する光波長選択手段を用いて試料切断面からの光を対物レンズを通じて撮像手段に導き、光波長選択手段による光波長の選択を繰り返しながら必要な試料切断面各々に対して光波長選択数に応じた複数の画像データを記憶する、ことをその特徴とする。
【０００９】
一方、本発明に係る試料観察装置は、請求項６に記載のように、試料を切断する切断手段と、照明された試料切断面を撮像する撮像手段と、撮像手段で得られた画像データを記憶する記憶手段と、画像データを観察可能なデータに処理するデータ処理手段とを備えた試料観察装置において、第１光源からの光を対物レンズを通じて試料切断面に直接的に照射する直接照明手段と、第２光源からの光を対物レンズ周囲の間接照明器を通じて試料切断面に間接的に照射する間接照明手段と、試料切断面からの光を対物レンズを通じて撮像手段に導く光路途中に設けられ、試料切断面からの光のうち撮像手段に導かれる波長光を選択する光波長選択手段と、光波長選択手段による光波長の選択を繰り返しながら必要な試料切断面各々に対して光波長選択数に応じた複数の画像データを記憶する撮像制御手段とを具備した、ことをその特徴とする。
【００１２】
【発明の実施の形態】
図１には本発明を適用した試料観察装置の概略構成を示してある。図中の１は第１の光源、２は第１の光波長選択器、３は第２の光源、４は第２の光波長選択器、５は二次元ＣＣＤを内蔵したカメラ、６は第３の光波長選択器、７はハーフミラー（このハーフミラーは光の透過波長を制限可能なダイクロイックミラーでもよい）、８は対物レンズ、９は間接照明器、１０は試料載置テーブル、Ｓは試料、１１は撮像制御部、１２は光波長選択制御部、１３は主制御部、１４はモニターである。
【００１３】
第１の光波長選択器２は、光通過孔を有する本体２ａと、該本体２ａに一部を挿入した状態で回転自在に軸支された円盤状のフィルタ支持板２ｂと、フィルタ支持板２ｂを回転駆動するエンコーダ付きのサーボモータ２ｃとから構成されている。フィルタ支持板２ｂには、図２（ａ）に示すように、円形のフィルタ支持孔２ｂ１が周方向に４５度間隔で計８個形成されており、これら支持孔２ｂ１には、試料Ｓの染色に用いられる４種類の蛍光染料を個別に励起できる波長光（λＦ１〜λＦ４）を透過可能な４種類の光学フィルタＦ１〜Ｆ４が、周方向に２組並ぶように装着されている。
【００１４】
第２の光波長選択器４は、第１の光波長選択器２と同様に、光通過孔を有する本体４ａと、該本体４ａに一部を挿入した状態で回転自在に軸支された円盤状のフィルタ支持板４ｂと、フィルタ支持板４ｂを回転駆動するエンコーダ付きのサーボモータ４ｃとから構成されている。フィルタ支持板４ｂには、図２（ａ）に示すように、円形のフィルタ支持孔４ｂ１が周方向に４５度間隔で計８個形成されており、これら支持孔２ｂ１には、第１の光波長選択器２と同じ光学フィルタＦ１〜Ｆ４が、周方向に２組並ぶように装着されている。
【００１５】
第３の光波長選択器６は、第１の光波長選択器２と同様に、光通過孔を有する本体６ａと、該本体６ａに一部を挿入した状態で回転自在に軸支された円盤状のフィルタ支持板６ｂと、フィルタ支持板６ｂを回転駆動するエンコーダ付きのサーボモータ６ｃとから構成されている。フィルタ支持板６ｂには、図２（ｂ）に示すように、円形のフィルタ支持孔６ｂ１が周方向に４５度間隔で計８個形成されており、これら支持孔６ｂ１には、第１，第２の光波長選択器２，４とは異なる光学フィルタｆ１〜ｆ４、つまり、試料Ｓの染色に用いられる４種類の蛍光染料を励起したときに発せられる光の波長（λｆ１〜λｆ４）を透過可能な４種類の光学フィルタｆ１〜ｆ４が、周方向に２組並ぶように装着されている。
【００１６】
これら第１，第２，第３の光波長選択器２，４，６では、サーボモータ２ｃ，４ｃ，６ｃによりフィルタ支持板２ｂ，４ｂ，６ｂを４５度角で回転させることによって、光学フィルタＦ１〜Ｆ４またはｆ１〜ｆ４の１つを本体２ａの光通過孔に一致させることができる。
【００１７】
第１の光源１は直接照明用のもので、白色光を出射する水銀灯等の電球を内部に備えており、内面光沢管や光ファイバ等の光伝搬路を通じて白色光を第１の光波長選択器２に入射する。第１の光波長選択器２を通過した光は同様の光伝搬路を通じてハーフミラー７に入射される。
【００１８】
第２の光源３は間接照明用のもので、白色光を出射する水銀灯等の電球を内部に備えており、内面光沢管や光ファイバ等の光伝搬路を通じて白色光を第２の光波長選択器４に入射する。第２の光波長選択器４を通過した光は同様の光伝搬路を通じて、対物レンズ８の下端部周囲に配置された間接照明器９に入射される。この間接照明器９は光透過材料からリング状に形成され、光入射によって全体を同色に発光し、試料Ｓの切断面を対物レンズ８の周囲から間接的に照明する。
【００１９】
撮像制御部１１は、メモリ及びＣＰＵ等を備えており、主制御部１３からの撮像信号を受けてカメラ５による撮像を実施しカメラ５で得られた画像データをメモリに記憶すると共に、記憶された画像データに対し領域分割，輪郭変形処理，特徴抽出，合成等のデータ処理を施す。
【００２０】
光波長選択制御部１２は、サーボモータ用の駆動回路等を備えており、主制御部１３からの波長切替信号を受けて各光波長選択器２，４，６によるフィルタ切り替えを実施する。
【００２１】
主制御部１３は、メモリ及びＣＰＵ等を備えており、観察制御のプログラムに従って撮像制御部１１及び光波長選択制御部１２に制御信号を送出し、切断面撮像とフィルタ切り替えを実施する共に、必要な処理データを撮像制御部１１から取り込んで試料Ｓの切断面画像や３次元画像をモニター１４に表示する。
【００２２】
試料Ｓは、医療分野，製薬分野，食品分野，農業分野，生物分野等から適宜選択されたもので、異なる波長の光（光学フィルタＦ１〜Ｆ４を透過した波長光λＦ１〜λＦ４）それぞれで励起される４種類の蛍光染料によって予め染色されている。試料Ｓとして柔らかいもの、例えば生物，植物，食品等を用いる場合には、綺麗な切断面を得るためにこれら試料は加熱，酸素遮断，時間経過等の手法によって染色後に固形化処理される。
【００２３】
以下に、上述の試料観察装置で実現される試料観察方法について図３及び図４を参照して説明する。
【００２４】
まず、観察対象となる試料Ｓを、回転式切断刃やスライド式切断刃等を用いて図３に示す面Ｓａで切断し、その切断面Ｓａが対物レンズ８に向き合うようにテーブル１０に載置する。
【００２５】
次に、光波長選択制御部１２によって各光波長選択器２，４，６のフィルタ支持板２ｂ，４ｂ，６ｂを同時に回転させて、第１，第２の光波長選択器２，４では、４種類の蛍光染料の１つを励起する波長光λＦ１を透過可能な光学フィルタＦ１を本体２ａ，４ａの光通過孔に一致させ、一方、第３の光波長選択器６では波長光λＦ１を切断面Ｓａに照射したときに励起された波長光λｆ１を透過可能な光学フィルタｆ１を本体６ａの光通過孔に一致させると共に、撮像制御部１１によってカメラ５による撮像を実施する。
【００２６】
これにより、第１の光源１から出射された白色光のうちλＦ１の波長光のみが第１の光波長選択器２の光学フィルタＦ１を透過して、該波長光λＦ１がハーフミラー７及び対物レンズ８を通じて試料Ｓの切断面Ｓａに照射されると共に、第２の光源３から出射された白色光のうちλＦ１の波長光のみが第２の光波長選択器４の光学フィルタＦ１を通過し、該波長光λＦ１が間接照明器９を通じて試料Ｓの切断面Ｓａに間接的に照射され、試料Ｓの切断面Ｓａは波長光λＦ１で励起可能な蛍光染料で染色された部分のみを蛍光発色する。
【００２７】
切断面Ｓａからの反射光、つまり、切断面Ｓａに照射された波長光λＦ１とこの波長光λＦ１で励起された波長光λｆ１は、対物レンズ８及びハーフミラー７を通じて第３の光波長選択器６の光学フィルタｆ１に導かれ、反射光のうちλｆ１の波長光のみが光学フィルタｆ１を透過してカメラ５に導かれる。
【００２８】
つまり、ここでは波長光λＦ１を切断面Ｓａに照射し、該波長光λＦ１で励起された光（波長光λｆ１）をカメラ５に導いて切断面Ｓａを撮像し、この切断面Ｓａの画像（図４（ａ）の左端の画像）をメモリに記憶する。
【００２９】
次に、光波長選択制御部１２によって各光波長選択器２，４，６のフィルタ支持板２ｂ，４ｂ，６ｂを同時に回転させて、第１，第２の光波長選択器２，４では、上記とは別の蛍光染料を励起する波長光λＦ２を透過可能な光学フィルタＦ２を本体２ａ，４ａの光通過孔に一致させ、一方、第３の光波長選択器６では波長光λＦ２を切断面Ｓａに照射したときに励起された波長光λｆ２を透過可能な光学フィルタｆ２を本体６ａの光通過孔に一致させると共に、撮像制御部１１によってカメラ５による撮像を実施する。
【００３０】
つまり、ここでは波長光λＦ２を切断面Ｓａに照射し、該波長光λＦ２で励起された光（波長光λｆ２）をカメラ５に導いて切断面Ｓａを撮像し、この切断面Ｓａの画像（図４（ａ）の左から２番目の画像）をメモリに記憶する。
【００３１】
次に、光波長選択制御部１２によって各光波長選択器２，４，６のフィルタ支持板２ｂ，４ｂ，６ｂを同時に回転させて、第１，第２の光波長選択器２，４では、上記とは別の蛍光染料を励起する波長光λＦ３を透過可能な光学フィルタＦ３を本体２ａ，４ａの光通過孔に一致させ、一方、第３の光波長選択器６では波長光λＦ３を切断面Ｓａに照射したときに励起された波長光λｆ３を透過可能な光学フィルタｆ３を本体６ａの光通過孔に一致させると共に、撮像制御部１１によってカメラ５による撮像を実施する。
【００３２】
つまり、ここでは波長光λＦ３を切断面Ｓａに照射し、該波長光λＦ３で励起された光（波長光λｆ３）をカメラ５に導いて切断面Ｓａを撮像し、この切断面Ｓａの画像（図４（ａ）の右から２番目の画像）をメモリに記憶する。
【００３３】
次に、光波長選択制御部１２によって各光波長選択器２，４，６のフィルタ支持板２ｂ，４ｂ，６ｂを同時に回転させて、第１，第２の光波長選択器２，４では、上記とは別の蛍光染料を励起する波長光λＦ４を透過可能な光学フィルタＦ４を本体２ａ，４ａの光通過孔に一致させ、一方、第３の光波長選択器６では、波長光λＦ４を切断面Ｓａに照射したときに励起された波長光λｆ４を透過可能な光学フィルタｆ４を本体６ａの光通過孔に一致させると共に、撮像制御部１１によってカメラ５による撮像を実施する。
【００３４】
つまり、ここでは波長光λＦ４を切断面Ｓａに照射し、該波長光λＦ４で励起された光（波長光λｆ４）をカメラ５に導いて切断面Ｓａを撮像し、この切断面Ｓａの画像（図４（ａ）の右から２番目の画像）をメモリに記憶する。
【００３５】
これ以後も、上記と同様に、試料Ｓを図３に示す面Ｓｂ，Ｓｃ，Ｓｄで順次切断し、各切断面Ｓｂ，Ｓｃ，Ｓｄに対し４種類の波長光λＦ１〜λＦ４を照射しながら、各波長光λＦ１〜λＦ４で励起された光（波長光λｆ１〜λｆ４）をカメラ５に導いて切断面Ｓｂ，Ｓｃ，Ｓｄを撮像し、図４（ｂ）（ｃ）（ｄ）に示す切断面Ｓｂ，Ｓｃ，Ｓｄの画像をメモリに記憶する。
【００３６】
切断面Ｓａ〜Ｓｄ毎に得られた４つの画像データは、撮像制御部１１により領域分割，輪郭変形処理，特徴抽出，合成等のデータ処理を施される。これら処理データは必要に応じて主制御部１３に取り込まれ、各切断面画像や３次元画像等がモニター１４に表示される。
【００３７】
このように、上述の試料観察方法及びその装置によれば、各切断面Ｓａ〜Ｓｄ毎に得た４つの画像データを利用して切断面観察をより詳細に行えると共に、これら画像データから試料の３次元立体構造を高精度で構築してその構造観察を詳細且つ正確に実施できる。
【００３８】
また、各切断面Ｓａ〜Ｓｄ毎に蛍光発色状態が異なる４つの画像データを得ているので、蛍光観察による切断面観察と構造観察を高感度で実施でき、試料内部の微細物質や器官や病原体や癌等を観察する場合に極めて有用である。
【００３９】
さらに、試料切断面を直接光と間接光によって照明して撮像を行うので、照明陰やムラを原因としたノイズを排除して観察に適した画像データを取り込むことができる。
【００４０】
尚、図１乃至図４に示した実施形態では、各光波長選択器としてフィルタ支持板を回転させることで光学フィルタの切り替えを行うものを例示したが、図５または図６に示す光波長選択器を代わりに使用することもできる。
【００４１】
図５に示した光波長選択器２１は、本体２１ａと、光分岐器２１ｂと、光合流器２１ｃと、４種類の光学フィルタＦ１〜Ｆ４（ｆ１〜ｆ４）と、各光学フィルタＦ１〜Ｆ４（ｆ１〜ｆ４）の光入射面に設けられた開閉自在なシャッター２１ｄと、計８個のミラー２１ｅとから構成されている。シャッター２１ｄは図示省略の動力源、例えばモータやソレノイド等による開閉を可能としており、２分割またはスライドによる開閉によって光学フィルタＦ１〜Ｆ４（ｆ１〜ｆ４）への光入射を選択的に制御する。
【００４２】
この光波長選択器２１では、光源から光分岐器２１ｂの端部に入射された光を該光分岐器２１ｂで４方向に分岐して、各分岐光をミラー２１ｅを介して各シャッター２１ｄに導くことができ、使用する光学フィルタに合わせてシャッター２１ｄを選択的に開放しておけば、所定の光学フィルタのみに光を入射して、該光学フィルタを透過した特定波長の光をミラー２１ｅを介して光合流器２１ｃに導いてその端部から出射することができる。
【００４３】
図６に示した光波長選択器２２は、本体２２ａと、ポリゴンミラー２２ｂと、計９個のミラーと、４種類の光学フィルタＦ１〜Ｆ４（ｆ１〜ｆ４）と、光合流器２２ｄとから構成されている。ポリゴンミラー２２ｂは図示省略の動力源、例えばモータ等による角度変位を可能としており、自らの角度変位によって光学フィルタＦ１〜Ｆ４（ｆ１〜ｆ４）への光入射を選択的に制御する。
【００４４】
この光波長選択器２２では、光源からポリゴンミラー２２ｂに入射された光を該ポリゴンミラー２２ｂで反射し、該反射光をミラー２２ｃを介して光学フィルタＦ１〜Ｆ４のうちの１つに導くことができ、使用する光学フィルタに合わせてポリゴンミラー２２ｂの反射角度を変化させておけば、所定の光学フィルタのみに光を入射して、該光学フィルタを透過した特定波長の光をミラー２２ｃを介して光合流器２２ｄに導いてその端部から出射することができる。また、ポリゴンミラー２２ｂの反射光を直接光合流器２２ｄに導くことで、波長非選択の白色光をその端部から出射することもできる。
【００４５】
図１に示した各光波長選択器２，４，６でも、光学フィルタが装着されない箇所をフィルタ支持板に残しておけば、波長非選択の白色光を試料切断面に照射することができる。また、図５に示した光波長選択器２１でも、光学フィルタがない場所に設けたシャッターに分岐光の１つを導けるようにしておけば、波長非選択の白色光を試料切断面に照射することができる。
【００４６】
このように、光源から出射された白色光を直接試料切断面に照射できる機能を光波長選択器に付加しておけば、白色光を試料切断面に照射したときの画像を各切断面毎に得ることが可能であり、蛍光観察と白色光による通常観察とを可能として切断面観察をより一層詳細に行えると共に、白色光による画像を蛍光発色の画像とを合成して３次元立体構造を構築することにより試料構造の観察をより詳細且つ正確に実施できる。
【００４７】
また、図１乃至図４に示した実施形態では、試料観察装置とは異なる位置で別途切断した試料をテーブルに載置するようにしたものを例示したが、図７に示す切断装置を図１の装置に組み合わせて使用すれば、単一の装置にて試料の切断と切断面の撮像を連続して行うことができる。
【００４８】
同図に示した切断装置３１は、ベースフレーム３２と、切断刃３３を備えた切断刃取付円盤３４と、切断刃取付円盤回転用のモータ３５と、試料Ｓが載置されるテーブル３６と、テーブル３６を上下動可能に支持する一対のガイドロッド３７と、テーブル昇降用のモータ３８と、モータ回転を直線動力に変換してテーブル３６に伝達するボールネジ３９とから構成されている。切断刃取付円盤３６は大小２つの環状リングの間に切断刃３３を備えており、自らの回転によって試料Ｓを切断刃３３によって切断することができる。
【００４９】
この切断装置３１では、モータ３８を作動させてテーブル３６を上昇させ、試料Ｓの上端を切断刃３３よりも所定量突出させた状態で、モータ３５を作動させて切断刃取付円盤３４を１回転させることで、試料Ｓの突出分を切断刃３３により切断して切断面を切断刃取付円盤３６のリング間から露出させることができる。つまり、テーブル３６が図１に示した試料観察装置の対物レンズ４の真下に位置するように同装置を配置すれば、観察対象となる試料Ｓを必要量送り込んで切断し、その切断面をカメラ５により撮像することができる。
【００５０】
さらに、図１乃至図４に示した実施形態では、試料切断面に照射される光の波長を第１，第２の光波長選択器２，４で選択し、カメラ５に入射される光の波長を第３の光波長選択器６で選択するようにしたものを例示したが、第１，第２の光波長選択器２，４を排除した装置構成、つまり、白色光を試料切断面に照射しカメラ５に入射される光の波長を第３の光波長選択器６で選択しながら撮像を行うようにしても図４と近似の画像を各切断面毎に得ることが可能である。また、第３の光波長選択器６を排除した装置構成、つまり、試料切断面に照射される光の波長を第１，第２の光波長選択器２，４で選択しながら試料切断面からの反射光をカメラ５に入射して撮像を行うようにしても図４と近似の画像を各切断面毎に得ることが可能である。特に後者の場合では、ハーフミラーとしてダイクロイックミラーを用いれば、該ダイクロイックミラーによってカメラ５に入射される光の波長を選択波長に合わせて制限することもできる。
【００５１】
さらにまた、図１乃至図４に示した実施形態では、第１の光源１からの光と第２の光源３からの光を用いて試料切断面を照明するようにしたものを例示したが、第１の光源１を除外した装置構成、つまり、第２の光源３からの光で試料切断面を間接的に照明するだけでも所期の画像をカメラ５に取り込むことができる。この場合の間接照明は図１に示したリング状の照明器に限らず、複数個の平板状照明器で試料切断面を斜め上方から照明するものであってもよい。
【００５２】
さらにまた、図１乃至図４に示した実施形態では、試料の切断と該切断面の撮像を順次繰り返すようにしたものを例示したが、切断面撮像は必ずしも試料切断の度に実施する必要はなく、全ての切断面のうち必要な切断面のみに対して撮像を実施してその画像データを記憶するようにしてもよい。
【００５３】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明に係る試料観察方法及びその装置によれば、各切断面毎に得た複数の画像データを利用して切断面観察をより詳細に行えると共に、これら画像データから試料の３次元立体構造を高精度で構築してその構造観察を詳細且つ正確に実施できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を適用した試料観察装置の概略構成を示す図
【図２】フィルタ支持板の上面図
【図３】試料の斜視図
【図４】切断面毎の画像を示す図
【図５】光波長選択器の他の構造例を示す図
【図６】光波長選択器の他の構造例を示す図
【図７】切断装置の概略構成を示す図
【符号の説明】
１…カメラ、２…第１の光波長選択器、２ｂ…フィルタ支持板、Ｆ１〜Ｆ４…光学フィルタ、３…ハーフミラー、４…対物レンズ、５…第１の光源、６…第２の光波長選択器、６ｂ…フィルタ支持板、７…第２の光源、８…第３の光波長選択器、８ｂ…フィルタ支持板、９…間接照明器、１０…テーブル、Ｓ…試料、１１…撮像制御部、１２…光波長選択制御部、１３…主制御部、１４…モニター、Ｓａ，Ｓｂ，Ｓｃ，Ｓｄ…試料切断面。

Claims

試料を切断し、該試料切断面を照明しながら撮像手段により撮像して画像データを記憶し、該画像データに基づいて試料観察を行う試料観察方法において、
第１光源からの光を対物レンズを通じて試料切断面に直接的に照射する直接照明手段と、第２光源からの光を対物レンズ周囲の間接照明器を通じて試料切断面に間接的に照射する間接照明手段と、試料切断面からの光を対物レンズを通じて撮像手段に導く光路途中に設けられ、試料切断面からの光のうち撮像手段に導かれる波長光を選択する光波長選択手段とを備え、
光波長選択手段による光波長の選択を繰り返しながら必要な試料切断面各々に対して光波長選択数に応じた複数の画像データを記憶する、
ことを特徴とする試料観察方法。
直接照明手段は、試料切断面に直接的に照射される波長光を選択する光波長選択手段を備え、この光波長選択手段は、第１光源からの光のうち特定の波長光のみを選択的にフィルタリングして試料切断面に導く機能の他に光源からの光をそのまま試料切断面に導く機能を有する、
ことを特徴とする請求項１に記載の試料観察方法。
間接照明手段は、試料切断面に間接的に照射される波長光を選択する光波長選択手段を備え、この光波長選択手段は、第２光源からの光のうち特定の波長光のみを選択的にフィルタリングして試料切断面に導く機能と光源からの光をそのまま試料切断面に導く機能とを有する、
ことを特徴とする請求項１または２に記載の試料観察方法。
光波長選択手段には、
複数種類の光学フィルタが周方向に並ぶように支持するフィルタ支持板と、該フィルタ支持板を回転させることで使用する光学フィルタの切り替えを行う動力源とを備えた光波長選択器と、
複数種類の光学フィルタと、各光学フィルタへの光入射を行うミラー群と、各光学フィルタの一面に設けられた開閉可能なシャッターと、各シャッターを選択的に開放することで使用する光学フィルタの切り替えを行う動力源とを備えた光波長選択器と、
複数種類の光学フィルタと、各光学フィルタへの光入射を選択的に行う可変ミラーと、可変ミラーの反射角度を変化させることで使用する光学フィルタの切り替えを行う動力源とを備えた光波長選択器の、何れか１つを使用する、
ことを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の試料観察方法。
試料を切断する切断手段と、照明された試料切断面を撮像する撮像手段と、撮像手段で得られた画像データを記憶する記憶手段と、画像データを観察可能なデータに処理するデータ処理手段とを備えた試料観察装置において、
第１光源からの光を対物レンズを通じて試料切断面に直接的に照射する直接照明手段と、
第２光源からの光を対物レンズ周囲の間接照明器を通じて試料切断面に間接的に照射する間接照明手段と、
試料切断面からの光を対物レンズを通じて撮像手段に導く光路途中に設けられ、試料切断面からの光のうち撮像手段に導かれる波長光を選択する光波長選択手段と、
光波長選択手段による光波長の選択を繰り返しながら必要な試料切断面各々に対して光波長選択数に応じた複数の画像データを記憶する撮像制御手段とを具備した、
ことを特徴とする試料観察装置。
直接照明手段は、試料切断面に直接的に照射される波長光を選択する光波長選択手段を備え、この光波長選択手段は、第１光源からの光のうち特定の波長光のみを選択的にフィルタリングして試料切断面に導く機能の他に光源からの光をそのまま試料切断面に導く機能を有する、
ことを特徴とする請求項５に記載の試料観察装置。
間接照明手段は、試料切断面に間接的に照射される波長光を選択する光波長選択手段を備え、この光波長選択手段は、第２光源からの光のうち特定の波長光のみを選択的にフィルタリングして試料切断面に導く機能と光源からの光をそのまま試料切断面に導く機能とを有する、
ことを特徴とする請求項５または６に記載の試料観察装置。
光波長選択手段には、
複数種類の光学フィルタが周方向に並ぶように支持するフィルタ支持板と、該フィルタ支持板を回転させることで使用する光学フィルタの切り替えを行う動力源とを備えた光波長選択器と、
複数種類の光学フィルタと、各光学フィルタへの光入射を行うミラー群と、各光学フィルタの一面に設けられた開閉可能なシャッターと、各シャッターを選択的に開放することで使用する光学フィルタの切り替えを行う動力源とを備えた光波長選択器と、
複数種類の光学フィルタと、各光学フィルタへの光入射を選択的に行う可変ミラーと、可変ミラーの反射角度を変化させることで使用する光学フィルタの切り替えを行う動力源とを備えた光波長選択器の、何れか１つが使用されている、
ことを特徴とする請求項５〜７の何れか１項に記載の試料観察装置。