JP3600540B2 - Ａｄａｍｔｓポリペプチド、それをコードする核酸、及びその使用 - Google Patents

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は、ＡＤＡＭＴＳとして知られるタンパク質のファミリーのメンバーに関する。
【０００２】
本発明の背景
ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、メタロプロテアーゼのＡＤＡＭ（Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ ）の特徴を示し、そしてさらにスロンボスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）ドメイン（ＴＳ）を含む。プロトタイプのＡＤＡＭＴＳは、マウスにおいて同定され、心臓及び腎臓内で発現され、そして炎症誘発性の刺激によりアップレギュレートされることが判明している（Ｋ．Ｋｕｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｍｏｔｉｆｓ ａｓ ａ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ， ２７２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５５６ （Ｊａｎｕａｒｙ １９９７））。これまで、９つのメンバーがＨＵＧＯデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｕｓｅｒｓ／ｈｅｓｔｅｒ／ａｄａｍｔｓ．）により認められている。このファミリーのメンバーは、軟骨に重要な機械特性を提供し、そして関節炎の進行の間に失われる高分子量のプロテオグリカンであるアグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）を分解する能力をもつ。
【０００３】
アグレカナーゼ（Ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ）活性は、いくつかのＡＤＡＭＴＳタンパク質について証明されている（例えば、Ｍ．Ｄ．Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ， Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−１； ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＡＭＴＳ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ２８４ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６６４ （Ｊｕｎｅ １９９９）； Ｉ．Ａｂｂａｓｚａｄｅ， Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＡＭＴＳ １１ ａｎ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＡＤＡＭＴＳ ｆａｍｉｌｙ， ２７４ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３４４３ （Ａｕｇｕｓｔ １９９９） を参照のこと）。アグレカナーゼ活性に加えて、ＡＤＡＭＴＳ−４は、中枢神経系内で主に発現されることが分かっている他のプロテログリカンであるブレビカン（ｂｒｅｖｉｃａｎ）を開裂することが示された（Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｂｉｎｄｉｎｇ （ＢＥＨＡＢ）／Ｂｒｅｖｉｃａｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ ａ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｍｏｔｉｆｓ （ＡＤＡＭＴＳ） ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ， ２７５ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２６９５ （Ｊｕｌｙ ２０００））。この活性は、神経膠腫の浸潤性において役割を演じていると推定された。ＡＤＡＭＴＳ−４の他の活性は、ベータ−アミロイドにより処理されたラットの星状細胞においてその発現が誘導されるものとして提案されており、これは、アルツハイマー病における役割を示唆する（Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， ＡＤＡＭＴＳ−４ ｉｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ ｔｒｅａｔｅｄ ｒａｔ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ， ２８９ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １７７ （２０００））。他のＡＤＡＭＴＳタンパク質は抗血管形成（例えば、Ｖａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．， ＭＥＴＨ−１， Ａ ｈｕｍａｎ ｏｒｔｈｏｌｏｇ ｏｆ ＡＤＡＭＴＳ−１， ａｎｄ ＭＥＴＨ−２ ａｒｅ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ａｎｇｉｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ２７４ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３３４９ （Ａｕｇｕｓｔ １９９９）を参照のこと）及び／又はプロコラーゲン・プロセッシング活性（Ａ．Ｃｏｌｉｇｅ ｅｔ ａｌ．， ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ Ｎ−ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ： ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｚｉｎｃ−ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍａｔｒｉｘ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ， ９４ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ （Ｍａｒｃｈ １９９７））を示すと報告されている。特に泌尿生殖系に関する、受精能及び臓器発達におけるＡＤＡＭＴＳ−１の他の役割は、マウスにおける遺伝子欠損と関係付けられた（Ｓｈｉｎｄｏ ｅｔ ａｌ．， ＡＤＡＭＴＳ−１： ａ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ−ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ， ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ， ａｎｄ ｏｒｇａｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ， １０５ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １３４５ （Ｍａｙ ２０００））。
【０００４】
ＡＤＡＭＴＳタンパク質及びＡＤＡＭＴＳタンパク質のアゴニスト及びアンタゴニストは重要な治療用途をもち、これらは、関節炎（変形性関節炎及びリウマチ様関節炎）、炎症性腸疾患、クローン病、気腫、急性呼吸困難症候群、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、臓器移植毒性及び拒絶、悪液質、アレルギー、癌（例えば、固形腫瘍癌であって、結腸、乳房、肺、前立腺、脳を含むもの、並びに白血病及びリンパ腫を含む造血性悪性腫瘍）、組織潰瘍形成、再狭窄、歯周病、表皮水疱性、骨粗しょう症、人工関節インプラントのゆるみ、アテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化斑裂開を含む）、大動脈瘤（腹部大動脈及び脳大動脈瘤を含む）、うっ血性心不全、心筋梗塞、発作、脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、神経変性疾患（急性及び慢性）、自己免疫疾患、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、片頭痛、うつ病、末梢ニューロパシー、痛み、脳アミロイド血管障害、向知性又は認識性亢進、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、眼血管形成、角膜損傷、黄斑変性症、異常外傷治癒、熱傷、糖尿病ショック、不妊症、並びにメタロプロテイナーゼ活性を特徴とし及び／又は哺乳動物のアダマリシン（ａｄａｍａｌｙｓｉｎ）活性を特徴とする他の疾患の治療を含む。
ＷＯ００５３７７４は、本発明のＡＤＡＭＴＳタンパク質に関する配列をもつＡＤＡＭＴＳタンパク質について記載している。
【０００５】
本発明の要約
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１と名付けた新規ＡＤＡＭＴＳタンパク質に、そして関連ポリヌクレオチド及びポリペプチドに関する。本発明は、上記タンパク質及びポリペプチドの製造に、及び関連アッセイにも関する。本発明は、さらに、上記タンパク質の基質の同定方法に、上記タンパク質の阻害剤又は活性化剤の同定方法に、そして診断、バイオ療法、及び遺伝子治療方法における本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの使用に関する。
【０００６】
特に、本発明は、以下の：
（ａ）配列番号２のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチド、あるいはそのメタロプロテイナーゼ又はジスインテグリン・ドメイン、プロドメイン、又はスロンボスポンジン（ＴＳＰ）ドメインをコードするヌクレオチド配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１のポリヌクレオチド分子にストリンジェント条件下でハイブリダイズする少なくとも１５の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列；及び
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列の相補物；
から成る群から選ばれるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子に関する。このような単離ヌクレオチド分子は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡを含むことができる。
【０００７】
１の態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１に対し少なくとも８０％同一であり、そして他の態様においては、配列番号１のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチド・コーディング配列、あるいはそのメタロプロテイナーゼ又はジスインテグリン・ドメイン、プロドメイン、又はスロンボスポンジン（ＴＳＰ）ドメインをコードする配列を含む。
【０００８】
さらなる態様においては、本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子によりコードされるポリペプチドに関する。例えば、本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドは、配列番号２に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、又はそのメタロプロテイナーゼ又はジスインテグリン・ドメイン、プロドメイン、又はスロンボスポンジン（ＴＳＰ）ドメイン、又はＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の少なくとも約１０の連続アミノ酸をもつアミノ酸配列を含むことができる。好ましい態様においては、上記ポリペプチドは、配列番号２、あるいはそのメタロプロテイナーゼ又はジスインテグリン・ドメイン、プロドメイン、又はスロンボスポンジン（ＴＳＰ）ドメインを含む。
【０００９】
他の局面においては、本発明は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む発現系であって、その発現系がコンパチブルな宿主細胞内に存在するとき、配列番号２のポリペプチドと、あるいはそのメタロプロテイナーゼ又はジスインテグリン・ドメイン、プロドメイン、又はスロンボスポンジン（ＴＳＰ）ドメイン少なくとも８０％の同一性を有するアミノ配列を含むＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドを産生することができる、前記発現系に関する。本発明の上記局面の１の態様においては、その発現系は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドを産生することができる。
【００１０】
他の局面においては、本発明は、本発明の発現系を含む宿主細胞に関する。
他の局面においては、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドの製法であって、上記ポリペプチドの製造のために十分な条件下、本発明の宿主細胞を培養し、そして細胞培養物から上記ポリペプチドを回収する、ことを含む前記製法に関する。
【００１１】
他の局面においては、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドを産生する細胞の作成方法であって、適当な培養条件下、上記宿主細胞が、上記ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドを産生するように、本発明の発現系で宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトすることを含む、前記方法に関する。
他の局面においては、本発明は、本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドに免疫特異的な抗体に関する。本発明は、本発明のポリペプチドのアンタゴニスト、アゴニスト、及び基質にも関する。
【００１２】
さらなる局面においては、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１のアゴニスト又はアンタゴニストの治療的有効量を患者に投与することを含む、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の活性又は発現を変更する必要のある患者を治療する方法に関する。
他の局面においては、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の活性又は発現を変更させるために、本発明のポリヌクレオチドを患者に投与することを含む、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の活性又は発現を変更する必要のある患者を治療する方法に関する。本発明は、そのリガンド、基質、又はレセプターについてＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１と競合するポリペプチドの治療的有効量を患者に投与することを含む、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の活性又は発現を変換する必要のある患者を治療する方法にも関する。
【００１３】
本発明は、患者におけるＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の発現又は活性に関して患者における疾患を診断し又は疾患に対する感受性を診断するための方法であって、上記患者のゲノム内の、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１をコードするヌクレオチド配列内での突然変異の存在又は不存在を決定することを含む前記方法にも関する。あるいは、本発明は、患者におけるＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の発現又は活性に関して患者における疾患を診断し又は疾患に対する感受性を診断するための方法であって、その患者から得られたサンプル中のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の存在又は量を分析することを含む前記方法に関する。
【００１４】
他の局面においては、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１にアンタゴナイズする化合物を同定するための方法であって：
（ａ）候補化合物を、本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドを発現する細胞と、あるいは上記ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドを発現する細胞からの細胞膜、又は上記ポリペプチドを発現する細胞により馴された培地、又は上記ポリペプチドの精製された組成物と、接触させ；そして
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１活性を測定する、
を含む前記方法に関する。
【００１５】
他の態様においては、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１にアゴナイズ結合する化合物を同定するための方法であって：
（ａ）候補化合物を、本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドを発現する細胞と、あるいは上記ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドを発現する細胞からの細胞膜、又は上記ポリペプチドを発現する細胞により馴された培地、又は上記ポリペプチドの精製された組成物と、接触させ；そして
（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１活性の刺激を測定する、
を含む前記方法に関する。
【００１６】
さらなる態様においては、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１に結合する化合物を同定するための方法であって：
（ａ）候補化合物を、本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドを発現する細胞と、あるいは上記ポリペプチドを発現する細胞からの細胞膜、又は上記ポリペプチドを発現する細胞により馴された培地、又は上記ポリペプチドの精製された組成物と、接触させ；そして
（ｂ）上記ポリペプチドへの上記候補化合物の結合を測定する、
を含む前記方法に関する。
【００１７】
本発明は、核酸材料を含有する生物学的サンプル中のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１をコードするポリヌクレオチドを検出する方法であって：
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１に特異的な本発明の単離ポリヌクレオチドを、上記生物学的サンプルの上記核酸材料にハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成し；そして
（ｂ）上記ハイブリダイゼーション複合体を検出する、ここで上記ハイブリダイゼーション複合体の存在は上記生物学的サンプル中のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１をコードするポリヌクレオチドの存在に相関する、
を含む前記方法にも関する。
【００１８】
さらなる態様においては、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１のための基質を同定する方法であって、酵素的に活性な本発明のポリペプチドを含むポリペプチドを、候補基質に接触させ、そして生成物への基質の変換又は上記基質への上記ポリペプチドの結合のいずれかを測定することを含む前記方法に関する。
本発明は、医薬として許容される担体とともに、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１のアゴニスト又はアンタゴニストの治療的有効量を投与することを含む、関節炎（変形性関節炎及びリウマチ様関節炎）、炎症性腸疾患、クローン病、気腫、急性呼吸困難症候群、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、臓器移植毒性及び拒絶、悪液質、アレルギー、癌（例えば、固形腫瘍癌であって、結腸、乳房、肺、前立腺、脳を含むもの、並びに白血病及びリンパ腫を含む造血性悪性腫瘍）、組織潰瘍形成、再狭窄、歯周病、表皮水疱性、骨粗しょう症、人工関節インプラントのゆるみ、アテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化斑裂開を含む）、大動脈瘤（腹部大動脈及び脳大動脈瘤を含む）、うっ血性心不全、心筋梗塞、発作、脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、神経変性疾患（急性及び慢性）、自己免疫疾患、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、片頭痛、うつ病、末梢ニューロパシー、痛み、脳アミロイド血管障害、向知性又は認識性亢進、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、眼血管形成、角膜損傷、黄斑変性症、異常外傷治癒、熱傷、不妊症又は糖尿病ショックの治療のための方法にも関する。
【００１９】
本発明は、医薬として許容される担体とともに、本発明のポリペプチドを投与することを含む、関節炎（変形性関節炎及びリウマチ様関節炎）、炎症性腸疾患、クローン病、気腫、急性呼吸困難症候群、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、臓器移植毒性及び拒絶、悪液質、アレルギー、癌（例えば、固形腫瘍癌であって、結腸、乳房、肺、前立腺、脳を含むもの、並びに白血病及びリンパ腫を含む造血性悪性腫瘍）、組織潰瘍形成、再狭窄、歯周病、表皮水疱性、骨粗しょう症、人工関節インプラントのゆるみ、アテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化斑裂開を含む）、大動脈瘤（腹部大動脈及び脳大動脈瘤を含む）、うっ血性心不全、心筋梗塞、発作、脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、神経変性疾患（急性及び慢性）、自己免疫疾患、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、片頭痛、うつ病、末梢ニューロパシー、痛み、脳アミロイド血管障害、向知性又は認識性亢進、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、眼血管形成、角膜損傷、黄斑変性症、異常外傷治癒、熱傷、不妊症又は糖尿病ショックの治療のための方法にも関する。
【００２０】
本発明は、医薬として許容される担体とともに、本発明のポリヌクレオチドを投与することを含む、関節炎（変形性関節炎及びリウマチ様関節炎）、炎症性腸疾患、クローン病、気腫、急性呼吸困難症候群、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、臓器移植毒性及び拒絶、悪液質、アレルギー、癌（例えば、固形腫瘍癌であって、結腸、乳房、肺、前立腺、脳を含むもの、並びに白血病及びリンパ腫を含む造血性悪性腫瘍）、組織潰瘍形成、再狭窄、歯周病、表皮水疱性、骨粗しょう症、人工関節インプラントのゆるみ、アテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化斑裂開を含む）、大動脈瘤（腹部大動脈及び脳大動脈瘤を含む）、うっ血性心不全、心筋梗塞、発作、脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、神経変性疾患（急性及び慢性）、自己免疫疾患、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、片頭痛、うつ病、末梢ニューロパシー、痛み、脳アミロイド血管障害、向知性又は認識性亢進、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、眼血管形成、角膜損傷、黄斑変性症、異常外傷治癒、熱傷、不妊症又は糖尿病ショックの治療のための方法にも関する。
【００２１】
本発明はさらに、医薬として許容される担体とともに、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１のアゴニスト又はアンタゴニストの治療的有効量を含む、関節炎（変形性関節炎及びリウマチ様関節炎）、炎症性腸疾患、クローン病、気腫、急性呼吸困難症候群、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、臓器移植毒性及び拒絶、悪液質、アレルギー、癌（例えば、固形腫瘍癌であって、結腸、乳房、肺、前立腺、脳を含むもの、並びに白血病及びリンパ腫を含む造血性悪性腫瘍）、組織潰瘍形成、再狭窄、歯周病、表皮水疱性、骨粗しょう症、人工関節インプラントのゆるみ、アテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化斑裂開を含む）、大動脈瘤（腹部大動脈及び脳大動脈瘤を含む）、うっ血性心不全、心筋梗塞、発作、脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、神経変性疾患（急性及び慢性）、自己免疫疾患、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、片頭痛、うつ病、末梢ニューロパシー、痛み、脳アミロイド血管障害、向知性又は認識性亢進、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、眼血管形成、角膜損傷、黄斑変性症、異常外傷治癒、熱傷、不妊症又は糖尿病ショックの治療のための医薬組成物に関する。
【００２２】
本発明は、医薬として許容される担体とともに、本発明のポリペプチドを含む、関節炎（変形性関節炎及びリウマチ様関節炎）、炎症性腸疾患、クローン病、気腫、急性呼吸困難症候群、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、臓器移植毒性及び拒絶、悪液質、アレルギー、癌（例えば、固形腫瘍癌であって、結腸、乳房、肺、前立腺、脳を含むもの、並びに白血病及びリンパ腫を含む造血性悪性腫瘍）、組織潰瘍形成、再狭窄、歯周病、表皮水疱性、骨粗しょう症、人工関節インプラントのゆるみ、アテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化斑裂開を含む）、大動脈瘤（腹部大動脈及び脳大動脈瘤を含む）、うっ血性心不全、心筋梗塞、発作、脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、神経変性疾患（急性及び慢性）、自己免疫疾患、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、片頭痛、うつ病、末梢ニューロパシー、痛み、脳アミロイド血管障害、向知性又は認識性亢進、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、眼血管形成、角膜損傷、黄斑変性症、異常外傷治癒、熱傷、不妊症又は糖尿病ショックの治療のための医薬組成物にも関する。
【００２３】
本発明は、医薬として許容される担体とともに、本発明のポリヌクレオチドを含む、関節炎（変形性関節炎及びリウマチ様関節炎）、炎症性腸疾患、クローン病、気腫、急性呼吸困難症候群、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、臓器移植毒性及び拒絶、悪液質、アレルギー、癌（例えば、固形腫瘍癌であって、結腸、乳房、肺、前立腺、脳を含むもの、並びに白血病及びリンパ腫を含む造血性悪性腫瘍）、組織潰瘍形成、再狭窄、歯周病、表皮水疱性、骨粗しょう症、人工関節インプラントのゆるみ、アテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化斑裂開を含む）、大動脈瘤（腹部大動脈及び脳大動脈瘤を含む）、うっ血性心不全、心筋梗塞、発作、脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、神経変性疾患（急性及び慢性）、自己免疫疾患、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、片頭痛、うつ病、末梢ニューロパシー、痛み、脳アミロイド血管障害、向知性又は認識性亢進、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、眼血管形成、角膜損傷、黄斑変性症、異常外傷治癒、熱傷、不妊症又は糖尿病ショックの治療のための医薬組成物にも関する。
【００２４】
本発明の詳細な説明
我々は、変形性関節炎の軟骨から調製したｃＤＮＡライブラリー中でＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの比較的高いレベルを、そしてヒト肺及び脳由来のｃＤＮＡライブラリー中での低いレベルを発見した。変形性関節炎の軟骨中でのＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の発現、及び炎症誘発剤によるその調節は、関節炎疾患の病因におけるその役割に一致する。
本明細書中に使用する用語の理解を容易にするために、以下の定義を提供する。
本明細書中に使用するとき”抗体”とは、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、キメラ、単鎖、及びヒト化抗体、並びにＦａｂ断片であって、Ｆａｂ又は他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含むものを含む。
【００２５】
”ポリヌクレオチド”は、一般に、非修飾ＲＮＡ又はＤＮＡあるいは修飾ＲＮＡ又はＤＮＡであることができる、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドのいずれかをいう。”ポリヌクレオチド”は、非限定的に、１本鎖及び２本鎖ＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖ＲＮＡ、及び１本鎖及び２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖又は、より典型的には、２本鎖又は１本鎖及び２本鎖領域の混合物であることができるＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。さらに、”ポリヌクレオチド”とは、ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの両者を含む３本鎖領域をいう。用語”ポリヌクレオチド”は、１以上の修飾塩基を含むＤＮＡとＲＮＡ、及び安定性又は他の理由のために修飾された骨格をもつＤＮＡ又はＲＮＡをも含む。”修飾された”塩基は、例えば、トリチル化塩基及び普通でない塩基、例えばイノシンを含む。さまざまな修飾がＤＮＡとＲＮＡに行われている；従って、”ポリヌクレオチド”は、典型的には天然に存在するポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞に特徴的なＤＮＡとＲＮＡの化学的形態を包含する。”ポリヌクレオチド”は、しばしばオリゴヌクレオチドといわれる、比較的短いポリヌクレオチドをも包含する。
【００２６】
”ポリペプチド”とは、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合、すなわち、ペプチド・アイソスターにより互いに連結される２以上のアミノ酸を含むペプチド又はタンパク質のいずれかをいう。”ポリペプチド”とは、一般にペプチド、オリゴペプチド又はオリゴマーといわれる短鎖と、一般にタンパク質といわれる長鎖の両者をいう。”ポリペプチド”は２０の遺伝子コードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。”ポリペプチド”は、天然プロセス、例えば翻訳後プロセッシング、又は本分野において周知の化学的技術のいずれかにより、修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾は、基礎的なテキスト、及びより詳細なモノグラフ、並びに学術論文中によく記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノ又はカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのどこでも生じうる。同じタイプの修飾は、与えられたポリペプチド内のいくつかの部位において同程度又は変更された程度において存在することができるということが理解されるであろう。また、与えられたポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含むことができる。ポリペプチドは、ユビキネーション（ｕｂｉｑｕｉｎａｔｉｏｎ）の結果として分枝することができ、そして分枝の有無に拘らず、環状であることができる。環状、分枝及び分枝環状ポリペプチドは、翻訳後天然プロセスから生じることができ、又は合成方法によりなされることができる。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシレーション、グリコシレーション、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシレーション、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移−ＲＮＡ仲介付加、例えば、アルギニレーション、及びユビキチネーションを含む。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｍ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｆ．Ｗｏｏｄ， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ： ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ， ｐｇｓ．１−１２ ｉｎ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３； Ｓ．Ｓｅｉｆｔｅｒ ａｎｄ Ｓ．Ｅｎｇｌａｒｄ， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ， １８２ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６２６ （１９９０）； Ｓ．Ｉ．Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｓｔｈｅｓｉｓ， ｐｏｓｔｔｒａｎｓｔａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ， ａｎｄ ａｇｉｎｇ， ６６３ Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ４８ （１９９２） 。
【００２７】
本明細書中に使用するとき、”変異体”は、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドとはそれぞれ相違するが、本質的特性を保持する、ポリヌクレオチド又はポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、他の参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が相違する。上記変異体のヌクレオチド配列における変化は、上記参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更してもしなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下に討議するように、上記参照配列によりコードされるポリペプチドにおける、アミノ酸置換、付加、欠失、融合、及び切断をもたらすことができる。ポリペプチドの典型的な変異体は、他の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が相違する。一般に、上記参照ポリペプチドの配列と上記変異体の配列が全体として酷似し、そして多くの領域において、同一であるように、相違は制限される。変異体と参照ポリペプチドは、いずれかの組合せにおける、１以上の置換、付加、及び／又は欠失によりアミノ酸配列が相違しうる。置換され又は挿入されたアミノ酸配列の残基は、その遺伝子コードによりコードされるものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、天然のもの、例えば、対立遺伝子変異体であることができ、又はそれは、天然に生じることが知られていない変異体であることができる。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの非天然変異体は、突然変異誘発技術又は直接合成により作られることができる。
【００２８】
”同一性”は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、最高のオーダーのマッチが得られるように、上記配列が整列される。”同一性”自体は、本分野に認知された意味をもち、そして公表された技術を用いて計算されることができる。例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｄ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ， ｐａｒｔ １， Ａ．Ｍ．Ｇｒｉｆｆｉｎ， ａｎｄ Ｈ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇ．ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７； 及びＳｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｉｍｅｒ， Ｍ．Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｊ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， ｅｄｓ．， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１を参照のこと。２つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の間の同一性を計測するための多数の方法が存在するけれども、用語”同一性”は当業者に周知である。同一性及び類似性を決定する方法は、コンピュータ・プログラムにおいてコードされる。２つの配列の間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータ・プログラム方法は、非限定的に、ＧＣＳプログラム・パッケージ；Ｊ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， ｅｔ ａｌ．， Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｓｅｔ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＶＡＸ， １２ （１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８７ （Ｊａｎｕａｒｙ １９８４）； ＢＬＡＳＴＰ； ＢＬＡＳＴＮ； ＦＡＳＴＡ； Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ， ２１５ （３） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４０３ （Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９０）を含む。同一性を決定する上記方法の中で、好ましい方法はＢＬＡＳＴＰである。
【００２９】
説明として、Ｆｉｇ．１の参照ヌクレオチド配列に少なくとも、例えば、９５％の”同一性”を有するヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドにより、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、そのポリヌクレオチド配列がＦｉｇ．１の参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当り５までの点変異を含んでもよいということを除き、同一であるということが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドを得るために、参照配列内のヌクレオチドの５％までが、欠失され又は他のヌクレオチドで置換されることができ、又は参照配列内の全ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドがその参照配列内に挿入されることができる。上記参照配列の上記突然変異は、上記参照ヌクレオチド配列の５′又は３′末端位で、又は上記末端位の間のどこかで生じ、上記参照配列内のヌクレオチド間に個々にか又は上記参照配列内の１以上の連続群内に散在されることができる。
【００３０】
同様に、Ｆｉｇ．２の参照アミノ酸配列に、少なくとも、例えば、９５％の”同一性”を有するアミノ酸配列をもつポリペプチドにより、上記ポリペプチドのアミノ酸配列は、そのポリペプチド配列がＦｉｇ．２の参照アミノ酸の各１００アミノ酸当り５までのアミノ酸変更を含んでもよいということを除き、同一であるということが意図される。換言すれば、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をもつポリペプチドを得るために、参照配列内のアミノ酸残基の５％までが、欠失され又は他のアミノ酸で置換されることができ、又は参照配列内の全アミノ酸残基の５％までの多数のアミノ酸がその参照配列内に挿入されることができる。上記参照配列の上記変更は、上記参照アミノ酸配列のアミノ又はカルボキシル末端部分で、又は上記末端部分の間のどこかで生じ、上記参照配列内の残基間に個々にか又は上記参照配列内の１以上の連続群内に散在されることができる。
【００３１】
ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチド
１の局面においては、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドに関する。ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドは、Ｆｉｇ．２のポリペプチド、並びにＦｉｇ．２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及びＦｉｇ．２の配列に少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００３２】
ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドは、プロセスされていない又は部分的にプロセスされた前駆体、あるいは”成熟”タンパク質の形態であることができ、これは、次に融合タンパク質の如き大きなタンパク質の一部であることができる。その成熟形は通常アミノ酸１０４から又はその付近から始まり、そしてそのカルボキシル末端に続く。分泌又はリーダー配列、プロ配列、精製又は同定を助ける配列、例えば、多数のヒスチジン残基、又は組換え製造の間の安定性のための追加の配列を含む、追加のアミノ酸配列を含むことが、しばしば有利である。
【００３３】
ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドの断片も本発明に包含される。断片は、上述のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドのアミノ酸配列の部分とその全体が同一であるが全体とは同一でないところのアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドと同様に、断片は”独立”したものであり、又はそれらが一部又は領域を、最も好ましくは単一の連続領域として、形成するところのより大きなポリペプチド内に含まれることができる。
【００３４】
好ましい断片は、例えば、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドのアミノ酸配列をもつ切断ポリペプチドを含む。但し、アミノ末端を含む連続シリーズの残基又はカルボキシル末端を含む連続シリーズの残基の欠失、あるいは２つの連続シリーズの残基の欠失であってその中の１がアミノ末端をそして他がカルボキシル末端を含むものである。構造又は機能的特性を特徴とする断片、例えば、アルファ−ヘリックス及びアルファ−ヘリックス形成領域、ベータ−シート及びベータ−シート形成領域、ターン及びターン形成領域、コイル及びコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域、基質結合領域、並びに高抗原性係数領域も好ましい。生物学的に活性な断片も好ましい。生物学的に活性な断片は、類似の活性又は改良された活性、又は減少された不所望の活性を有するものを含む、１以上のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１活性を仲介するものである。最も好ましいのは、Ｆｉｇ．３に示すドメインの１以上を含む断片である。特に好ましい態様においては、上記断片は、そのメタロプロテイナーゼ・ドメイン、そのジスインテグリン・ドメイン又はそのスロンボスポンジン・ドメインを含む。他の態様においては、上記ポリペプチドは、その亜鉛結合性モチーフの延長を包含する、配列番号２のアミノ酸４３４〜４６２を含む。
【００３５】
このような断片は、便利には、それ自体で、又は融合タンパク質の一部として使用される。例えば、本発明のタンパク質又はポリペプチドを含む融合タンパク質を発現するであろう発現ベクターが構築されることができる。このような融合タンパク質は、例えば、上記タンパク質に対する抗血清を産生するために、上記タンパク質の生化学的特性を研究するために、異なる免疫学的又は機能的特性を示すタンパク質を操作するために、同定又は精製を助けるために、組換え発現タンパク質の安定性を改良するために、又は治療剤として、使用されることができる。可能性のある融合タンパク質発現ベクターは、非限定的に、β−ガラクトシダーゼ及びｔｒｐＥ融合物、マルトース結合性タンパク質融合物（ｐＭａｌシリーズ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合物（ｐＧＥＸシリーズ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）、ポリヒスチジン融合物（ｐＥＴシリーズ；Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ）、及びチオレドキシン融合物（ｐＴｒｘＦｕｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）をコードする配列を取り込んだベクターを含む。１例としては、ジスインテグリン・ドメイン又はＴＳＰドメイン、あるいはその変異体又は断片を含むポリペプチドが、天然のジスインテグリン・ドメイン又はＴＳＰドメインとのインビボ又はインビトロにおける相互作用を競合阻害するために、単独で又は融合タンパク質の部分として、投与されることができる。上記の及び他の融合タンパク質をコードする発現ベクターの構築方法は本分野において周知である。
【００３６】
上記の定義された配列及び断片の変異体も本発明の部分を形成する。好ましい変異体は、保存的アミノ酸置換すなわち、ある残基を同様の特徴を有する他のものにより置換するものによる上記指示物から変化したものである。典型的な保存的置換は、Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ、及びＩｌｅ間；Ｓｅｒ及びＴｈｒ間；酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕ間；Ａｓｎ及びＧｌｎ間；塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇ間；そして芳香族残基Ｐｈｅ及びＴｙｒ間にある。特に好ましいのは、数個、５〜１０、１〜５、又は１〜２のアミノ酸が、いずれかの組合せにおいて、置換、欠失、又は付加されているような変異体である。
【００３７】
本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドは、いずれかの好適なやり方で調製されることができる。上記ポリペプチドは、単離天然ポリペプチド、組換え製造ポリペプチド、合成製造ポリペプチド、及び上記方法の組合せにより製造されたポリペプチドを含む。上記方法は、本分野においてよく理解されている。
本発明の他の態様は、単離されたＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドである。単離ポリペプチドは、その天然環境から実質的に取り出されたものである。単離されたＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドは、例えば、その天然源から得られ、組換え技術を用いて製造され、又は化学的に合成されることができる。単離ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドは全長ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチド、そのプロドメインのフリン解裂によりプロセスされる予想成熟形態（ＦＬＳＹ…から始まる予想成熟形態、アミノ酸２９２）、あるいはアミノ酸が欠失、挿入、逆位、置換及び／又は誘導体化（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化、及び／又はグリコシルホスファチジル・イノシトールの付加）されているところのＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドの如き、上記ポリペプチドのいずれかの同族体であることができる。ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドの同族体は、その同族体をコードする核酸配列が、本明細書中に開示する天然ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチド・アミノ酸配列をコードする核酸配列にストリンジェント条件下ハイブリダイズすることができるように、天然ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチド・アミノ酸配列に十分に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。本明細書中に使用するとき、”ストリンジェント・ハイブリダイズ条件”とは、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、１％ＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中６５℃におけるフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中６５℃での洗浄をいう（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．， ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ａｔ ｐ．２．１０．３ を参照のこと）。ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドの同族体は、その同族体が天然ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドの少なくとも１のエピトープに対して免疫応答を顕出する能力を有するように十分に、交差反応性であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをも含む。好ましくは、上記同族体は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の１以上の生物学的活性を保持する。
【００３８】
本発明のタンパク質同族体の最小長は、対応の天然タンパク質をコードする核酸分子の相補的配列と安定したハイブリッドを形成することができる核酸分子によりコードされることができるために十分なものである。それ故、上記タンパク質同族体をコードする核酸分子のサイズは、核酸組成、上記核酸分子と相補的配列の間のパーセント・ホモロジー、並びにハイブリダイゼーション条件自体（例えば、温度、塩濃度、及びホルムアミド濃度）に依存する。上記核酸の最小サイズは、典型的には、その核酸分子がＧＣリッチである場合、長さ少なくとも約１２〜約１５ヌクレオチドであり、そしてそれらがＡＴリッチである場合、少なくとも約１５〜約１７塩基である。本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質同族体をコードするために使用される核酸分子の最小サイズは、長さ約２０〜約２５ヌクレオチドである。上記核酸分子は遺伝子の一部、遺伝子の全体、又は多数の遺伝子、又はその部分を含むことができる点で、上記核酸分子の最大サイズには、実施上の制約以外の、制限はない。１の態様においては、本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質同族体の最小サイズは、長さ１０から、より好ましくは１２、さらにより好ましくは２５アミノ酸である。他の態様においては、本発明のポリペプチドは、約１０を超える、又は２５、好ましくは７５を超える、より好ましくは１００を超えるアミノ酸であって、配列番号２のアミノ酸配列に同一であるものを有するアミノ酸配列を含む。好ましいタンパク質又はポリペプチドのサイズは、全長、多価タンパク質（すなわち、各々がある機能を有するところの２以上のドメインを有する融点タンパク質）、又は上記タンパク質の機能的部分が望まれるかどうかに依存する。機能的部分は、本明細書中に記載されるドメイン、上記ドメインに関する本分野における知識及び上記ドメインのための知られたアッセイ、又はその機能活性に基づいて得られうる。有用なタンパク質断片又は他のポリペプチドは、配列番号２のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質との抗原性交差反応性に基づいてスクリーニングされることもできる。
【００３９】
本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質同族体は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質をコードする天然遺伝子の対立遺伝子変異体を含む。”天然”遺伝子は、自然に最もしばしば存在するものである。ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質同族体は、非限定的に、例えば、ランダム又は標的化突然変異誘発を行うための古典的又は組換えＤＮＡ技術を用いて、あるタンパク質をコードする遺伝子を直接修飾することを含む、本分野に知られた技術を用いて製造されることができる。
【００４０】
他の態様においては、本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドは、本明細書中に開示するＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドの部分であって、（Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定され、そして本分野において標準的な方法を用いて求められた）約２５ｋＤの分子量をもつ部分を含む。
【００４１】
本発明は、翻訳後修飾を経験したＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質を包含する。このような修飾は、例えば、グリコシル化（例えば、Ｎ−結合及び／又はＯ結合オリゴ糖の付加を含む）又は翻訳後のコンフォメーション変化又は翻訳後欠失を含むことができる。
他のＡＤＡＭＴＳファミリー・メンバーに比較してＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１のメタロプロテアーゼ・ドメインにおける２９〜３６％の同一性に基づき、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１は、１以上のタンパク質分解活性（例えば、コラゲナーゼ、アグレカナーゼ（ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ）、プロコラーゲン・プロテアーゼ）、並びにスロンボスポンジン・ドメインの存在を要求してもしなくてもよい抗−血管形成活性を有することができる。Ｆｉｇ．３及び４を参照のこと。ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の上記の可能性のある活性は、当業者に知られた技術を用いてテストされることができる。例えば、Ｐ．Ｄ．Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｍｒ ７２，０００ ｔｙｐｅ ＩＶ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ， ５０ （１９） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１８４ （Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９０）； Ｆ．Ｖａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．， ＭＥＴＨ−１ ａ ｈｕｍａｎ ｏｒｔｈｏｌｏｇ ｏｆ ＡＤＡＭＴＳ−１， ａｎｄ ＭＥＴＨ−２ ａｒｅ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ａｎｇｉｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ２７４ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３３４９ （Ａｕｇ． １９９９）； Ｅ．Ｃ．Ａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ， ２７４ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６５９４ （Ｍａｒ． １９９９）； Ａ．Ｃｏｌｌｉｇｅ ｅｔ ａｌ．， ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ Ｎ−ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ： Ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｚｉｎｃ−ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍａｔｒｉｘ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ９４ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （ＵＳＡ） ２３７４ （Ｍａｒｃｈ １９９７）を参照のこと。
【００４２】
ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリヌクレオチド
本発明の他の局面は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリヌクレオチドに関する。ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリヌクレオチドは、上記ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチド及び断片をコードする単離されたポリヌクレオチド、並びにそれに密に関連するポリヌクレオチドを含む。より特に、本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリヌクレオチドは、Ｆｉｇ．２のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドをコードするＦｉｇ．１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及びＦｉｇ．１の特定の配列を有するポリヌクレオチドを含む。ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリヌクレオチドは、さらに、Ｆｉｇ．２のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及びＦｉｇ．１のポリヌクレオチド配列に少なくとも８０％同一であるポリヌクレオチドを含む。これに関しては、少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、そして少なくとも９５％をもつものが特に好ましい。さらに、少なくとも９７％をもつものが高く好ましく、そして少なくとも９８〜９９％をもつものが最も高く好ましく、少なくとも９９％をもつものが最も好ましい。
【００４３】
１の態様においては、本発明の核酸分子は、配列番号１の配列に関して、１〜５０の間、より好ましくは１〜２５の間、そして最も好ましくは１〜５の間のヌクレオチドが挿入、欠失、又は置換されているヌクレオチド配列をもつ。
本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリヌクレオチドは、増幅又はＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１のためのプローブ又はマーカーとしての使用のために用いうる条件下でハイブリダイズするために十分な、Ｆｉｇ．１中に含まれるヌクレオチド配列に対する同一性を有するヌクレオチド配列をも包含する。このような配列は、典型的には、５０％ ＧＣ含量の標的をもつ長さ１５〜２５のヌクレオチドであり、そして当業者に周知のＰＣＲ増幅又はオリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション方法において有用である（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， （１９９６）， ＩＳＢＮ １−８８２２４７４−５７−１を参照のこと）。
【００４４】
１の態様においては、単離核酸分子は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１に特異的な、すなわち、配列番号１のためのプローブとして特異的に作用する、配列番号１の断片を含む。この断片は、長さ、少なくとも、例えば１５，２５，３５，４５又は７５ヌクレオチドであることができる。
本発明の他の態様は、ストリンジェント条件下、本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドの中の１以上をコードするＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチド遺伝子（図１）と、ハイブリダイズすることができる単離核酸分子である。
【００４５】
本発明の単離核酸分子は、ＤＮＡ，ＲＮＡ、あるいはＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかの誘導体を含むことができる。
本発明の単離核酸分子は、全体の（すなわち、完全な）遺伝子としてか又は上記遺伝子との安定したハイブリッドを形成することができるその部分として、その天然源から得られうる。本明細書中に使用するとき、句、ある存在物の”少なくとも一部”とは、その存在物の機能的局面をもつために少なくとも十分な存在物の量をいう。例えば、本明細書中に使用するとき、核酸配列の少なくとも一部は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、特定の所望の遺伝子（例えば、ＡＤＡＭＴＳ遺伝子）との安定なハイブリッドを形成することができる一定量の核酸である。本発明の単離核酸分子は、組換え技術（例えば、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）増幅、クローニング）又は化学合成を用いても製造されうる。単離ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質核酸分子は、非限定的に天然対立遺伝子変異体、及び本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質をコードし又はＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質をコードする天然核酸分子単離物とストリンジェント条件下安定したハイブリッドを形成するその核酸分子の能力を実質的に妨害しないようなやり方でヌクレオチドが挿入、欠失、置換、及び／又は逆位されているところの修飾核酸分子を含む、天然核酸分子及びその同族体を含む。
【００４６】
本発明は、上記ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドをも提供する。
ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の発現
１の態様においては、本発明の単離ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質は、上記タンパク質を製造するために有効な条件下で上記タンパク質を発現することができる組換え細胞を培養し、そして上記タンパク質を回収することにより製造される。好ましい細胞は、バクテリア（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母（例えば、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ））、昆虫（例えば、ＳＦ９）又は哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ，Ｃｏｓ７、及びＨＥＫ２９３）を含む。この組換え細胞は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質を発現することができ、そして本発明の１以上の核酸分子で宿主細胞を形質転換させることにより製造される。このような組換え細胞は本発明の一部である。好適な形質転換技術は、非限定的に、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、及びプロトプラスト融合を含む。本発明の組換え細胞は、単細胞のまま残存してもよいし又は組織臓器又は多細胞臓器に成長してもよい。慣用技術に従って細胞を形質転換させるために使用される本発明の核酸分子は染色体外に残ってもよいし又は発現されるそれらの能力が保持されるようなやり方で形質転換された（すなわち、組換え体）細胞の染色体内の１以上の部位に組み込まれることができる。
【００４７】
細胞を形質転換させるために好適な宿主細胞は、少なくとも１の本発明の核酸分子で形質転換された後に、本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質を製造することができるいずれかの細胞を含む。宿主細胞は、形質転換された細胞であるか又は少なくとも１の本発明の核酸分子で既に形質転換されている細胞のいずれかであることができる。好適な宿主細胞は、バクテリア、真菌（酵母を含む）、昆虫、動物、及び植物の細胞を含む。
【００４８】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞内に届けることができるベクター内に挿入された上記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターをも包含する。このようなベクターは、通常、異種核酸配列、例えば、本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質の核酸分子に隣接して天然には存在しない核酸配列を含む。上記ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか、そして原核又は真核のいずれかであることができ、そして典型的には、ウイルス又はプラスミドである。組換えベクターは、本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリヌクレオチドのクローニング、配列決定、及び／又は他の操作又は発現において使用されることができる。
【００４９】
本発明の１の態様においては、組換え細胞は、１以上の転写制御配列を含有する発現ベクターに作用可能な状態で連結された１以上の本発明のポリヌクレオチド分子を各々含む、１以上の組換え分子で宿主細胞を形質転換させることにより製造される。句”作用可能な状態で連結された”とは、宿主細胞内に形質転換されるときにその分子が発現されることができるようなやり方で発現ベクター内に挿入された核酸分子をいう。本明細書中に使用するとき、句”発現ベクター”とは、宿主細胞を形質転換させ、そして特定の核酸分子の発現をもたらすことができるＤＮＡ又はＲＮＡベクターをいう。
【００５０】
好ましくは、上記発現ベクターは、上記宿主細胞内で複製することもできる。発現ベクターは、原核又は真核のいずれかであることができ、そして典型的にはウイルス又はプラスミドである。本発明の発現ベクターは、バクテリア、真菌（ｆｕｎｇａｌ）、昆虫、動物、及び／又は植物細胞内で直接的遺伝子発現をもたらすベクターを含む。本発明の核酸分子は、調節配列、例えば、プロモーター、オペレーター、レプレッサー、エンハンサー、終止配列、複製起点、及び他の調節配列であってその組換え細胞と適合性であり、かつ、核酸分子の発現を制御するものを含む発現ベクターに作用可能な状態で連結されることができる。本発明において使用されることができる転写制御配列は、転写の開始、伸長、及び終結を制御することができるものを含む。特に重要な転写制御配列は、転写開始を制御するもの、例えば、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、及びレプレッサー配列である。好適な転写制御配列は、本発明の組換え細胞の中の１内で機能するものを含む。さまざまなこのような転写制御配列が当業者に知られている。好ましい転写制御配列は、バクテリア、酵母、及び哺乳動物細胞内で機能するものを、例えば、非限定的に、ｔａｃ，ｌａｃ，ｔｒｐ，ｔｒｃ，ｏｘｙ−ｐｒｏ，ｏｍｐ／ｌｐｐ，ｒｍＢ、バクテリオファージ・ラムダ（λ）（例えば、λ_Ｐ とλＰ_Ｒ 及びこれらプロモーターを含む融合物）、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファージＳＰＯ１、メタロチオネイン、アルファ接合因子、バキュロウイルス、ワクシニア・ウイルス、ヘルペス・ウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、シミアン・ウイルス４０、レトロウイルス作用、レトロウイルス・ロング・ターミナル・リピート、ラウス（Ｒｏｕｓ）サルコーマ・ウイルス、熱ショック、リン酸及び硝酸転写制御配列、並びに原核又は真核細胞内での遺伝子発現を制御することができる他の配列を、含む。追加の好適な転写制御配列は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びにリンフォカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロン又はインターロイキンにより誘導されうるプロモーター）を含む。本発明の実施において有用な転写制御は配列は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質をコードするＤＮＡに会合する天然配列を含む。
【００５１】
発現ベクター内への挿入のために好ましい核酸分子は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質の少なくとも１部をコードする核酸分子、又はその同族体を含む。本発明の発現ベクターは、例えば、先に討議したような、融合タンパク質としての本発明の核酸分子の発現を許容する融合配列を含むこともできる。本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１核酸分子内に融合配列を含ませることは、上記核酸分子によりコードされるタンパク質の製造、保存、又は使用の間の安定性を高めることができる。さらに、融合セグメントは、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質の検出及び精製を単純化して、アフィニティー・クロマトグラフィーによる精製を可能にする（例えば、Ｆｉｇ．６を参照のこと）。融合セグメントは、望ましい機能（例えば、高められた安定性及び／又は容易な精製）を与えるいずれかのサイズを有することができる。１以上の融合セグメントを使用することは本発明の範囲内にある。融合セグメントは、本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質又はポリペプチドのアミノ及び／又はカルボキシ末端に連結されることができる。融合セグメントとＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質の間の結合は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質の簡単な回収を可能にするように、開裂を受け易いように構築されることができる。融合タンパク質は、好ましくは、本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドのカルボキシル及び／又はアミノ末端に付着された融合セグメントをコードするアミノ酸配列で形質転換された組換え細胞を培養することにより製造される。
【００５２】
本発明は、本発明の核酸分子による形質転換から生じた組換え細胞を含む。好ましい組換え細胞は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸分子、又はその同族体により形質転換される。本発明の核酸配列のコピー数の増幅は、その細胞のゲノム内の上記核酸配列のコピー数を増加させることにより又は形質転換により上記核酸配列の追加のコピーを導入することにより達成されることができる。コピー数の増加は、より多量の酵素が作られ、基質から生成物への高められた変換を導くようなやり方で行われる。形質転換は、酵素合成を高めるために細胞内に核酸が形質転換されるようないずれかの方法を用いて達成されることができる。形質転換前に、所望により、上記核酸配列は、より高い比活性をもつ酵素をコードするように操作されることができる。
【００５３】
本発明に従って、本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質を製造するために有効な条件下で組換え細胞を培養することにより上記タンパク質を製造し、そして上記タンパク質を回収するために、組換えタンパク質が使用される。有効な条件は、非限定的に、タンパク質製造を許容する適当な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ、及び酸素条件を含む。好適な培地は、典型的には水性であり、そして同化性炭水化物、窒素及びリン酸源、並びに適当な塩、ミネラル、金属その他の栄養素、例えばビタミン類を含む。上記培地は複合栄養素を含み、又は最小であることができる。
【００５４】
本発明の細胞は、非限定的に、バッチ、フェッド−バッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）、細胞リサイクル、及び連続発酵槽を含む、慣用の発酵バイオリアクター内で培養されることができる。培養は、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイター・ディッシュ、及びペトリ・プレート内で行われることもできる。培養は、組換え細胞のために適当な温度、ｐＨ、及び酸素含量において行われる。このような培養は当業者の専門的技術内にある。
【００５５】
製造のために使用されるベクター及び宿主系に依存して、得られたＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質は、組換え細胞内に残ることも又はその発酵培地中に分泌されることもできる。本発明に従って”タンパク質を回収する”ことは、上記タンパク質を含有する発酵培地又は細胞を単に集めることを含むことができ、そして分離又は精製の追加のステップを含む必要はない。本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質は、例えば、非限定的に、アフィニティー・クロマトグラフィー（Ｆｉｇ．６）、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング及び示差的可溶化を含む、さまざまな標準的タンパク質精製技術を用いて精製されることができる。
【００５６】
さらに、本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質は、トランスジェニック動物、又は上記動物から回収された液体、例えば乳から回収されたＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質を発現する細胞からＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質を単離することにより製造されることができる。本発明の単離タンパク質又はポリペプチドは、以下さらに討議するように、治療用組成物を配合するために使用されることができる。
【００５７】
ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１に対する抗体
本発明は、本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質又はポリペプチドに選択的に結合することができる抗体をも含む。抗−ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１抗体のポリクローナル集団は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１抗血清中に含まれることができる。免疫ブロット・アッセイ、免疫沈降アッセイ、酵素イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光抗体アッセイ、及び免疫電子顕微鏡を含む当業者に知られたさまざまな方法を用いて、結合は計測されることができる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ， １９８９ を参照のこと。
【００５８】
本発明の抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体のいずれかであることができ、そして本分野において標準的な技術を用いて調製されることができる。本発明の抗体は、抗体を得るために使用される上記タンパク質のエピトープの中の少なくとも１に選択的に結合することができる１本鎖抗体を含む、機能的等価物、例えば、抗体断片及び遺伝子操作された抗体を含む。好ましくは、抗体は、少なくとも一部、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１核酸分子によりコードされるタンパク質に応答して、産生される。
【００５９】
ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１基質の同定
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１基質を同定するための方法をも包含する。上記方法は、候補基質を酵素的に活性な本発明のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドを含むポリペプチドと接触させ、そして基質から生成物への変換が、又は上記候補基質へのポリペプチドの結合が測定されるようなものを含む。本発明は、候補化合物と本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの間の相互作用を計算するコンピュータ・ソフトウェアを用いて行われる論理的（ｒａｔｉｏｎａｌ）ドラッグ・デザインをも包含する。
【００６０】
基質は、候補タンパク質又は合成基質アプローチにより同定されることができる。例えば、候補タンパク質は、アガロース・ゲル・マトリックス内に投げられ（ｃａｓｔ）ることができ、そして上記タンパク質を消化するＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質の能力が電気泳動法（ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）を用いて決定される。Ｐ．Ｄ．Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｍｒ ７２，０００ ｔｙｐｅ ＩＶ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ， ５０ （１９） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１８４ （Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９０）を参照のこと。あるいは、ファージ・ディスプレイ又は蛍光計測ペプチド・ライブラリーが上記タンパク質の基質を同定するためにスクリーニングされることができる。Ｄ．Ｒ． Ｏ’Ｂｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｏｆ ＨＳＶ−１ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ， ２３６ （２） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３８ （Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９７） を参照のこと。
【００６１】
ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１のアゴニスト／アンタゴニスト
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１のアゴニスト及び／又はアンタゴニストを決定するためのアッセイも含む。アグレカナーゼ、コラゲナーゼ、プロコラーゲン・プロテアーゼ及び／又は血管形成の活性を測定するためのアッセイが、好ましくは７００ダルトン未満の低分子量化合物である、アゴニスト又はアンタゴニストを同定するために使用されることができる。上記化合物は、ヒドロキサム酸成分又は場合により置換された複素環式核、あるいはアリール又は複素アリール・スルホンアミド成分を含むことができ、これらの化合物は、内因性又は組換えのＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の活性を阻害又は刺激する。Ｅ．Ｃ．Ａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ． Ａ ｓｏｌｕｂｌｅ， ｃａｒｔｉｌａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｇｇｒｅｃａｎ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ２７４ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６５９４ （Ｍａｒｃｈ １９９９）； Ｍ．Ｄ．Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， 前掲；Ａ．Ｃｏｌｉｇｅ ｅｔ ａｌ．， 前掲；Ｋ．Ｋｕｎｏ ｅｔ ａｌ．， 前掲。ＥＬＩＳＡ又は蛍光基質アッセイは、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１タンパク質の、アゴニスト又はアンタゴニストを決定するために、又は、その比タンパク質分解活性を測定するために、行われることができる。
【００６２】
診断的アッセイ
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の発現及び／又は活性に関する病気を診断し又はその病気に対する感受性を診断するための方法をも含む。このような病気は、患者のゲノムにおける上記ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列における突然変異の存在又は不存在を決定することにより同定されることができる。あるいは、患者から得られたサンプル中のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドの存在又は量は、病気又は病気に対する感受性の指標として、測定されることができる。このような診断は、以下を含む病気に関して行われることができる：関節炎（変形性関節炎及びリウマチ様関節炎）、炎症性腸疾患、クローン病、気腫、急性呼吸困難症候群、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、臓器移植毒性及び拒絶、悪液質、アレルギー、癌（例えば、固形腫瘍癌であって、結腸、乳房、肺、前立腺、脳を含むもの、並びに白血病及びリンパ腫を含む造血性悪性腫瘍）、組織潰瘍形成、再狭窄、歯周病、表皮水疱性、骨粗しょう症、人工関節インプラントのゆるみ、アテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化斑裂開を含む）、大動脈瘤（腹部大動脈及び脳大動脈瘤を含む）、うっ血性心不全、心筋梗塞、発作、脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、神経変性疾患（急性及び慢性）、自己免疫疾患、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、片頭痛、うつ病、末梢ニューロパシー、痛み、脳アミロイド血管障害、向知性又は認識性亢進、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、眼血管形成、角膜損傷、黄斑変性症、異常外傷治癒、熱傷、糖尿病ショック、不妊症、並びにメタロプロテイナーゼ活性を特徴とし及び／又は哺乳動物のアダマリシン（ａｄａｍａｌｙｓｉｎ）活性を特徴とする他の疾患。
【００６３】
治療用組成物及びＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の使用
本発明の１の態様においては、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１、又は本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの、抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、基質及び／又は変異体は、関節炎（変形性関節炎及びリウマチ様関節炎）、炎症性腸疾患、クローン病、気腫、急性呼吸困難症候群、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、臓器移植毒性及び拒絶、悪液質、アレルギー、癌（例えば、固形腫瘍癌であって、結腸、乳房、肺、前立腺、脳を含むもの、並びに白血病及びリンパ腫を含む造血性悪性腫瘍）、組織潰瘍形成、再狭窄、歯周病、表皮水疱性、骨粗しょう症、人工関節インプラントのゆるみ、アテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化斑裂開を含む）、大動脈瘤（腹部大動脈及び脳大動脈瘤を含む）、うっ血性心不全、心筋梗塞、発作、脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、神経変性疾患（急性及び慢性）、自己免疫疾患、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、片頭痛、うつ病、末梢ニューロパシー、痛み、脳アミロイド血管障害、向知性又は認識性亢進、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、眼血管形成、角膜損傷、黄斑変性症、異常外傷治癒、熱傷、糖尿病ショック、不妊症、並びにメタロプロテイナーゼ活性を特徴とし及び／又は哺乳動物のアダマリシン（ａｄａｍａｌｙｓｉｎ）活性を特徴とする他の疾患の治療のための治療用組成物中に使用される。
【００６４】
１の態様においては、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、インビボ又はエクスビボ遺伝子治療の一部として、遺伝子治療の適用において細胞を形質転換させるために使用されることができる。ポリヌクレオチドは、アンチセンス療法において、そしてリボザイムの構築において使用されることもできる。上記方法におけるポリヌクレオチドの使用は、当業者に知られている。
【００６５】
ヒトを含む哺乳動物への投与のためには、経口、非経口（例えば、静脈内、筋中又は皮下）、バッカル、肛門、及び局所を含むさまざまな慣用経路が使用されうる。
経口投与のためには、さまざまな賦形剤、例えば微晶性セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸２カルシウム、及びグリシンを含有する錠剤が、さまざまな崩壊剤、例えば、デンプン（及び好ましくは、コーン、ポテト、又はタピオカ・デンプン）、アルギン酸、及び特定の複雑なシリケートとともに、そしてポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチン及びアカシアの如き顆粒バインダーとともに、使用されることができる。類似のタイプの固体組成物も、ゼラチン・カプセル内の増量剤として使用される；この点で好ましい材料は、ラクトース又は乳糖並びに高分子量ポリエチレン・グリコールをも含む。水性懸濁液及び／又はエリキシルが経口投与のために望ましいとき、上記活性成分は、各種甘味料又は芳香剤、着色料又は染料、及び所望により、乳化及び／又は懸濁剤と、水、エタノール、プロピレン・グリコール、グリセリン及びその各種組合せの如き希釈剤とともに、併合されることができる。動物の場合には、それらは、有利には、５〜５０００ｐｐｍ 、好ましくは、２５〜５００ｐｐｍ の濃度で、動物飼料又は飲料水中に含有される。
【００６６】
非経口投与（筋中、腹膜内、皮下、及び静脈内使用）のためには、上記活性成分の滅菌注射溶液が通常調製される。
ゴマ油又はピーナッツ油又は水性プロピレン・グリコール中の上記治療用化合物の溶液が使用される。上記水性溶液は、必要により、好ましくは８より高いｐＨに好適に調整され、かつ、緩衝化され、そして上記液体希釈剤はまず等張性にされなければならない。上記水性溶液は、静脈内注射目的に好適である。上記油状溶液は、関節内、筋中、及び皮下注射目的のために好適である。無菌条件下での上記全溶液の調製は、当業者に周知の標準的な医薬技術により容易に達成される。動物の場合、化合物は、単一投与又は３回までの分割投与において与えられた、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、有利には０．２〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の投与レベルにおいて筋中又は皮下投与されることができる。
【００６７】
活性化合物は、直腸組成物、例えば、坐剤又は保持浣腸中に、例えば、慣用の坐剤ベース、例えば、ココア・バター又は他のグリセリドを含んで、配合されることもできる。
鼻腔内投与又は吸入による投与のためには、活性化合物は、便利には、患者により圧迫され又はポンピングされるポンプ・スプレー容器からの溶液又は懸濁液の形態で、又は好適な駆出剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、２酸化炭素又は他の好適な気体の使用により、加圧容器又は噴霧器からのエアロゾル・スプレーの提供として、デリバリーされる。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量された量をデリバリーするためのバルブを提供することにより測定することができる。加圧された容器又は噴霧器は、上記活性化合物の溶液又は懸濁液を含有することができる。吸入器又はガス注入器内での使用のための（例えば、ゼラチンから作られた）カプセル及びカートリッジは、本発明の化合物と好適な粉末ベース、例えばラクトース又はデンプンの粉末ミックスを含有して、配合されることができる。
【００６８】
本発明の治療用組成物は、本明細書中に記載するような医学的失調をもついずれかの患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与されることができる。有効なやり方で本発明の治療用化合物を投与するために用いられる許容されるプロトコールは、個々の投与量サイズ、投与数、投与の頻度及び投与モードに従って変化する。適当なプロトコールの決定は、過度の実験を伴わずに当業者により達成される。有効投与量は、本明細書中に記載する医学的失調に関して患者を治療することができる投与量をいう。有効投与量は、例えば、使用される治療用組成物、治療されている医学的失調並びに受容動物のサイズ及びタイプに依存して変化する。
【００６９】
投与量及び治療期間は、治療されている病的症状に依存する。治療期間は、１日、１週間以上であることができ、そして患者の寿命にわたって続くことができる。
ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の同定
新規ＡＤＡＭＴＳ遺伝子ファミリー・メンバーの同定のために、公に入手可能なタンパク質配列の非凡長セットをアセンブルした（受託番号：Ｄ６７０７６，ＡＪ００３１２５，ＡＢ００２３６４，ＡＢ０１４５８８）。低ストリンジェンシーＢＬＡＳＴサーチのシリーズを、次に、７エリーとして上記タンパク質配列の各々を使用してＬｉｆｅ Ｓｅｑ Ｇｏｌｄ（商標）データベース（Ｉｎｃｙｔｅ）に対して行い、そしてＲｅｃＡ−仲介ホモロジー捕獲を対応ｃＤＮＡクローンを単離するために使用した。上記捕獲配列にハイブリダイズするコロニーを単離し、そして最大のクローン（Ｓ３−２．６ｋｂ）を配列決定した。上記配列は、シグナル・ペプチド、プロドメイン、フリン開裂部位、及び部分メタロプロテイナーゼ・ドメインをコードしていた。しかしながら、Ｚｉｎｃ結合性モチーフ、ジスインテグリン、及びスロンボスポンジン・モチーフは存在しなかった。次に、ＡＤＡＭＴＳファミリー・メンバーをクローン化するための試みが、クローンの同定を導いた（ＩＩＡ）。このクローンの配列決定は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓに対して重複した配列同一性をもつ５５のアミノ酸を表し、そして残りのメタロプロテイナーゼ・ドメインをコードしていた。従って、２つの独立したＥＳＴのクローニングの追跡により、上記複数の配列は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１といわれる１つの新規ＡＤＡＭＴＳにまとまった（Ｆｉｇ．１のヌクレオチド１〜１３８５〔配列番号１〕。公表された非注釈配列（Ｇｅｎ Ｂａｎｋアクセス番号ＡＢ０３７７３３）が、我々の複合体ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１クローンと重なることが分かり、そしてＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１のための全長配列〔配列番号１〕の同定を完成させた。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１のための全長配列をクローン化し、そして一連の重複断片として配列決定した。ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の完全ポリペプチド配列をＦｉｇ．２〔配列番号２〕に示す。配列番号１のヌクレオチド１５４４〜４４８０を含む断片を、変形性関節炎軟骨ＲＮＡから以下のプライマー・セットを用いて増幅した：
配列番号１のヌクレオチド１５４４〜２５１６（センス ５’ＧＧＴＧＧＡＡＴＣＣＡＴＣＡＴＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧ３’〔配列番号３〕；アンチセンス ５’ＧＡＡＧＣＴＧＡＴＡＧＴＡＧＧＣＴＧＴＧＴＴＣＣＣ３’〔配列番号４〕）
配列番号１のヌクレオチド２１７１−４４８０（センス ５’ＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＡＧＴＴＧＧＡ３’〔配列番号５〕；アンチセンス ５’ＣＴＧＡＣＡＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＣＧＣＣＧＣＴＧＧ３’〔配列番号６〕
また、配列番号１のヌクレオチド３５９６〜５４７０を含む３’末端を、以下のプライマー・セットを用いてＡ５４９（ヒト肺セルライン）ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりクローン化した：
（センス ５’ＴＣＡＧＡＧＴＧＣＴＴＧＧＴＣＡＣＣＴＧＴ３’〔配列番号７〕；アンチセンス５’ＣＣＣＧＣＴＴＴＧＣＡＴＡＣＡＡＧＧＡＡ３’〔配列番号８〕）。上記重複断片を作製するために行ったＲＴ−ＰＣＲは、製造者の指示に従って、エロンガーゼ（Ｅｌｏｎｇａｓｅ）ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）の添加をもって、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ−Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＣＢＯ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を使用した。簡単に言えば、１μｌのＥｌｏｎｇａｓｅポリメラーゼを添加して、２００ｎＭのセンス及びアンチセンス遺伝子特異的プライマーを含む各反応において、１μｇの全ＲＮＡを使用した。熱サイクリング・パラメーターは：３０分間５０℃、２分間９４℃で１サイクル、その後９４℃１５秒、５５℃３０秒、及び７２℃６分間の３５サイクルであった。
変形性関節炎（ＯＡ）軟骨由来軟骨細胞内でのＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の発現及び炎症誘発性サイトカインによる誘導
ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１に対するプライマーはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより合成された（センス・プライマー ５’−ＧＡＧＡＧＣＣＴＣＡＡＣＡＧＧＡＧＧＣ−３’〔配列番号９〕及びアンチセンス・プライマー ５’−ＧＣＡＣＴＧＡＧＴＧＧＡＡＡＡＣＣＣＡＴＴＣＣ−３’〔配列番号１０〕）。
軟骨細胞を、変形性関節炎に罹った２患者の軟骨から単離し、そして組織培養基中で培養した。軟骨細胞を模擬処理（Ｆｉｇ．５中、レーン１＝患者１、レーン３＝患者２）し、又はレチノイン酸で処理（Ｆｉｇ．５中、レーン２、患者１）し、又はＩＬ−１で処理（Ｆｉｇ．５中、レーン４、患者２）した。ＲＮＡを標準的な方法で単離し、そして５μｇの各サンプルを、（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素及び製造者により推奨される条件を用いて）オリゴαＴプライミングを使用した第１ストランドｃＤＮＡ合成反応において使用した。４％のｃＤＮＡ反応生成物を、製造者により推奨される条件を用いてＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＬＩ１）及び１５０ｎｇの上記プライマーを使用したＰＣＲ反応において鋳型として使用した。ＰＣＲサイクリング条件９５℃６０秒、その後９４℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃４５秒の３０サイクル。反応生成物（１０μｌ）をアガロース・ゲル電気泳動（４％Ｎｕｓｉｅｖｅ，ＦＭＣ）により分画し、そして臭化エチジウム染色ゲルをＵＶにより可視化した。ＰＣＲ対照（Ｆｉｇ．５中、水、レーン５）及びＤＮＡ分子量マーカー（図示せず、ＨａｅＩＩＩ ，ＬＴ１で消化されたＰｈｉＸファージＤＮＡ）を含めた。矢印により示され、かつ、予想サイズに対応する（〜４００ヌクレオチド）生成物は、両患者において観察され、そして炎症誘発性の剤による処理によりアップレギュレートされた。
切断されたＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１融合タンパク質の発現及び精製
そのプロ、メタロプロテアーゼ、ジスインテグリン及び第１スロンボスポンジン・ドメインを含んでいたＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の切断バージョン（配列番号２のアミノ酸１９〜６９８）を、（ヒト・キチナーゼ様タンパク質からの）異種アミノ末端分泌シグナル及びカルボキシ末端６ヒスチジン・タグとの融合タンパク質として、バキュロウイルス発現ベクター（ｐＦａｓｔＢａｃ誘導体、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓ ｂｕｒｇ， ＭＤ）内にクローン化し、そしてニッケル・アフィニティー・クロマトグラフィーにより精製し、そしてヒスチジン・タグ・エピトープ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）に対して生じた抗体を用いてウェスタン・ブロットにより検出した。Ｆｉｇ．６。発現された生成物のサイズ（４５ｋＤ）は、上記プロドメインのフリン開裂による上記タンパク質の適当な成熟に一致した。
特に、約１００ｍｌの馴らされた昆虫細胞培地を、２０ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳに対して透析し、そしてバッチ・アフィニティー・クロマトグラフィーにより４℃一夜、精製した。この樹脂を、２０ｍＭイミダゾールを含有するホスフェート・バッファーで洗浄し、そして５０ｍＭ，１００ｍＭ、そして最終的に２５０ｍＭのイミダゾールを含有するホスフェート・バッファーでステップ−ワイズに溶出した。サンプルを、２分間煮沸により変性された５％Ｂ−メルカプトエタノールを含有するサンプル・バッファー（Ｎｏｖｅｘ， Ｃａｒｌｓｈａｄ， ＣＡ）で２倍に希釈した。２０μｌの各サンプルを４〜２０％グラジエントのＳＤＳ−ＰＡＧＥミニ−ゲル上で分離し、そしてＮｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（Ｎｏｖｅｘ， Ｃａｒｌｓｂａｄ）に移した。
ＢＬＡＳＴＰ２．０．９分析は、Ｆｉｇ．４中のアラインメントに示すように、多数のＡＤＡＭＴＳファミリー・メンバーに対する高いホモロジーを示した。
これまでの本発明の説明を、説明及び記述の目的のために提示してきた。さらに、上記説明は、本発明を、本明細書中に開示する形態に限定することを意図されない。従って、上記教示、及び関連分野における技術又は知識に相応する変更及び修正は、本発明の範囲内にある。添付クレームは、従来技術により許される程度で他の態様を含むと解釈されるべきであると意図される。
【００７０】
配列表
配列番号１は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１のヌクレオチド配列である。
配列番号２は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の演繹アミノ酸配列である。
配列番号３〜１０は、実施例中に記載するプライマーのヌクレオチド配列である。
【００７１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ｆｉｇ．１はＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の全長ポリヌクレオチド配列〔配列番号１〕を示す。
【図２】Ｆｉｇ．１のつづきである。
【図３】Ｆｉｇ．２は、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１の実質的に完全なポリペプチド配列〔配列番号２〕を示す。
【図４】Ｆｉｇ．３（Ａ）と（Ｂ）は、ＡＤＡＭＴＳファミリーのタンパク質のドメイン、上記ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチド内の上記ドメインに対応する配列、及び核酸シグナチャー配列を示す。
【図５】Ｆｉｇ．３（Ｂ）のつづき。
【図６】Ｆｉｇ．３（Ｂ）のつづき。
【図７】Ｆｉｇ．３（Ｂ）のつづき。
【図８】Ｆｉｇ．３（Ｂ）のつづき。
【図９】Ｆｉｇ．３（Ｂ）のつづき。
【図１０】Ｆｉｇ．３（Ｂ）のつづき。
【図１１】Ｆｉｇ．３（Ｂ）のつづき。
【図１２】Ｆｉｇ．３（Ｂ）のつづき。
【図１３】Ｆｉｇ．３（Ｂ）のつづき。
【図１４】Ｆｉｇ．３（Ｂ）のつづき。
【図１５】Ｆｉｇ．３（Ｂ）のつづき。
【図１６】Ｆｉｇ．４は、他のＡＤＡＭＴＳタンパク質の配列にアラインメントされたメタロプロテアーゼ・ドメインのＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチド配列のホモロジーを示す。
【図１７】Ｆｉｇ．５は、変形性関節炎軟骨から調製された軟骨細胞における炎症誘発処理によるＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１発現及び調節の半定量的ＰＣＲ分析の結果を示す。
【図１８】Ｆｉｇ．６は、昆虫細胞内で発現された精製組換えＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１（アミノ酸１９〜６９８）のウェスタン・ブロット分析を示す。

Claims (12)

1. 以下の：
   （ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列；
   （ｂ）配列番号１に記載のポリヌクレオチド分子にストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、タンパク質分解活性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；及び
   （ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）に記載のヌクレオチド配列の相補物；
   から成る群から選ばれるヌクレオチド配列から成る単離ポリヌクレオチド分子。
2. 配列番号２のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子。
3. 請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド分子によりコードされたポリペプチド。
4. 請求項２に記載の単離ポリヌクレオチド分子によりコードされたポリペプチド。
5. ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む発現系であって、当該発現系がコンパチブルな宿主細胞内に存在するとき、請求項３又は４に記載のポリペプチドを産生することができる、前記発現系。
6. 請求項５に記載の発現系を含む宿主細胞。
7. ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドの製法であって、当該ポリペプチドの製造のために十分な条件下で、請求項６に記載の宿主細胞を培養し、そして細胞培養物から当該ポリペプチドを回収する、ことを含む前記製法。
8. ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドに免疫特異的な抗体を含む剤であって、ここで当該ポリペプチドが請求項３又は４に記載のポリペプチドである、前記剤。
9. 患者のゲノム内の、請求項３又は４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列内での突然変異の存在又は不存在を決定し又は上記患者から得られたサンプル中のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１発現の存在又は量を分析することを含むインビトロ・アッセイ法。
10. ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１にアンタゴナイズし、アゴナイズし、又はそれに結合する化合物を同定するための方法であって：
    （ａ）候補化合物を、請求項３又は４に記載のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドを発現する細胞と、あるいは上記ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１ポリペプチドを発現する細胞からの細胞膜、又は上記ポリペプチドを発現する細胞により馴された培地、又は上記ポリペプチドの精製された組成物と、接触させ；そして
    （ｂ）ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１活性の阻害又は刺激、又は上記ポリペプチドへの上記候補化合物の結合を測定する、
    を含む前記方法。
11. 核酸材料を含有する生物学的サンプル中のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１をコードするポリヌクレオチドを検出する方法であって：
    （ａ）ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１に特異的な請求項１又は２に記載の単離ポリヌクレオチドを、上記生物学的サンプルの上記核酸材料にハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成し；そして
    （ｂ）上記ハイブリダイゼーション複合体を検出する、ここで上記ハイブリダイゼーション複合体の存在は上記生物学的サンプル中のＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１をコードするポリヌクレオチドの存在に相関する、
    を含む前記方法。
12. 請求項３又は４に記載の酵素として活性なポリペプチドを含むポリペプチドを、候補基質と接触させ、そして生成物への基質の変換又は上記基質への上記ポリペプチドの結合のいずれかを測定する、ことを含む、ＡＤＡＭＴＳ−Ｓ１のための基質を同定する方法。

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