JP3564065B2 - アロフェロン−免疫調節ペプチド - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は天然物を起源とする免疫調節物質に関する。具体的には、本発明は免疫不全状態、感染症及び腫瘍性疾患の治療において有用な無脊椎動物起源のペプチド及びそのようなペプチドを含む医薬用製剤に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来技術として免疫系の効力を刺激することができる昆虫を含む動物及び植物組織の物質を含有する天然物起源の様々な医薬用製剤が知られている。
CD4−陽性T細胞又は骨髄細胞から抗−HIV活性を有する細胞タンパクを得る方法が米国特許第5,480,782号に開示されている。
抗菌活性と抗ウイルス活性を示す銀杏葉抽出物を含む処方がドイツ特許公開第43 34 600 A1号に開示されている。
活性成分として動物の組織、血清又は細胞から抽出された主要組織適合遺伝子複合系抗原を含む、生体の免疫反応を刺激するための医薬用組成物がWO 96/04005号に開示されている。組織、細胞又は血清はヤギ、子牛又はブタの肝臓及び牛の赤血球から選択される。
抗癌化学療法の副作用を防ぎつつ癌を治療し、かつヒトの免疫機能を増進させるためのニゲラ・サティバ(Nigella sativa)植物の抽出物を含む医薬用組成物が米国特許第5,482,711号に開示されている。
【0003】
イガイの一種であるミチルス・エデュリス(Mytilus edulis)から単離され、様々なウイルス、細菌及び原生動物に対して有効な抗生物質組成として使用されるポリペプチド分画がWO 81/03124号に開示されている。
蜜蜂由来の抗菌ペプチド並びにその単離、製造及び適用の方法が欧州特許公開第0 299 828 A1号に開示されている。
甲虫の一種であるテネブリオ・モリトール(Tenebrio molitor)及びレプチノタルサ・デセムリニアタ(Leptinotarsa decemlineata)から単離された抗菌ペプチドがWO 90/14098号に開示されている。
鱗翅目昆虫の一種であるヒアロフォラ・グロベリ(Hyalophora gloveri)から単離された抗菌タンパクが欧州特許公開0 856 519 A2号に開示されている。
レンチウイルス経膜タンパクのアルギニン含有性断片と構造的に類似な抗微生物ペプチドが米国特許第5,714,577号に開示されている。
【0004】
ブタの白血球から単離された抗ウイルス及び抗微生物ペプチドが米国特許第5,804,558号に開示されている。
主要組織適合遺伝子複合系クラスII抗原に特異的に結合し、それにより自己免疫疾患の発生可能性を減少させる免疫調節ペプチドが米国特許第5,827,516号に開示されている。
特定抗体の生産及び抗体依存性T−リンパ球の抗腫瘍活性の刺激剤としての、多様な軟体動物及び、昆虫の一種であるカリフォラ・エリスロセファラ(Calliphora erythrocephala)を含む節足動物から単離されたヘモシアニン及びアリルフォリンの用途が欧州特許公開第0 320 528 A1号に開示されている。
【0005】
免疫不全状態、感染症及び腫瘍性疾患の治療に適した薬の最近の体制は上述した製剤及びこれに類似の天然医薬用製剤により強化されている。しかしながら、現在までに利用可能な薬剤は現存の免疫調節医学における要求の全体に対応しているわけではない。
【0006】
【発明が解決すべき課題】
従って、免疫調節活性を有し、特に免疫不全状態、感染症及び腫瘍性疾患の治療に有用な医薬用製剤を提供することが本発明の目的である。
【0007】
【課題を解決するための手段】
今回驚くべきことに、望ましい免疫調節活性を示す特定のペプチドが発見された。
従って、本発明は最大30個のアミノ酸残基から成り免疫調節活性を示すペプチドであって、下記の一般構造式(1);
X1−His−Gly−X2−His−Gly−Val−X3 (1)
(式中、X1は存在しないか又は少なくとも1個のアミノ酸残基を示し、
X2はペプチド結合又は少なくとも1個のアミノ酸残基を示し、
X3は存在しないか又は少なくとも1個のアミノ酸残基を示す)
で表されるペプチド又はその医薬上許容しうる塩若しくはエーテルに関する。
【0008】
本発明は昆虫、すなわちハエの一種であるカリフォラ・ビシナ R.−D. (Calliphora vicina R.−D.; Diptera, Calliphoridae)の細菌感染させた幼虫の血液から単離されたペプチドの代表的な要素であり、ここで”アロフェロン”と命名された新しい種類の免疫調節ペプチドを提供するものである。
【0009】
本発明のアロフェロンは動物(マウス)及びヒトのナチュラルキラー細胞の細胞傷害性抗癌活性を刺激することが見出されている。アロフェロンの免疫調節活性に関する実験データから、前記アロフェロンがかなり低い濃度でヒト及びマウスのリンパ球の細胞傷害性抗癌活性を刺激することができるということが示されている。最少有効濃度は約0.0005 ng/mlと測定されている。最適濃度は0.05−0.5ng/mlであることが見出された。先天免疫の奏効体メカニズムとしての天然細胞傷害性の重要な役割(Trinchieri G., Advances in Immunology, 1989, vol. 47,187−375; Brittenden J., Heys S.D., Ross J. and Eremin O., 1996, vol. 77, 1126−1243)を考えると、アロフェロンは免疫調節方式で作用する抗ウイルス、抗微生物及び抗癌薬剤として有用と考えられる。
【0010】
さらに、細胞傷害性リンパ球の抗癌活性刺激に関して、アロフェロンは実験動物において強くて持続的なインターフェロン合成を誘導することが見出された。インターフェロンはウイルス感染及び何らかの他の外部刺激に反応して生体内で生成される重要な抗ウイルス性(アルファ及びベータ・インターフェロン)及び免疫調節性(ガンマ・インターフェロン)サイトカインの一群である。血中インターフェロン濃度の上昇は広い範囲のウイルス性、腫瘍性及び自己免疫性障害を治療又は緩和させるのに役立つ。組換え又は天然インターフェロンの注射はC型肝炎(Bekkering et al., J. Hepathology, 1998, 28, 6, p.960−964), ヘルペス(Cardamakis et al., Gynecol. Obstet. Invest., 1998, 46, 1, p.54−57), 多発性骨髄腫(Zee et al., J. Clin. Oncol., 1998, 16, 8, p.2834−2839), ホジキン病(Aviles et al., Leuk. Lymphoma, 1998, 30, 5−6, p.651−656), 骨髄性白血病(Gilbert H.S., Cancer, 1998, 83, 6, p.1205−13), 多発性硬化症(Durelli et al., Mult. Scler, 1995, 1, suppl.1, p.32−37), アトピー性皮膚炎(Schneider et al., Ann. Allergy Asthma Immunol., 1998, 80, 3, p.263−268), 真菌感染症(Kullberg, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1997, 16, p.51−55)などの免疫療法に使用されて好結果が得られている。さらに、外生インターフェロン、すなわちフェニルピリミヂノンアナログであるブロピリミンのような内生インターフェロン合成誘導物質を使用しても同様の治療結果が得られると考えられている(Akaza et al., Eur. Urol., 1998, 34, p.107−110)。
【0011】
実験データから、アロフェロンはインターフェロン合成を効果的に誘導して、インターフェロンと類似な様式で、ある種の免疫反応(ナチュラルキラー活性)を刺激することが示されている。そのため、アロフェロンはインターフェロン及びインターフェロン誘導物質と比べてインターフェロン感受性のウイルス疾患及び癌疾患の治療を含む同様の治療的用途を有するがこれらに限定されないと考えられる。このような仮説はウイルスに感染させたマウスの実験から直接確認できる。ヒトインフルエンザウイルスA及びBの致死量を肺に感染させたマウスではアロフェロン投与が生存率を顕著に増大させることが示されている。
【0012】
アロフェロンの化学的構造は、医学的に重要な他の物質だけでなくインターフェロン、他の公知のサイトカイン及びインターフェロン誘導物質に対しても類似性を持たない。アロフェロンの化学的構造及び生物学的活性の様式は、欧州特許公開第0 320 528 A1号に開示されているカリフォラ(Calliphora)から単離されて免疫活性及び抗腫瘍活性が示されたアリルフォリン(arylphorin)とも全く異なっている。アロフェロンは、好ましくは1200 Daに近い分子量を有し、これまでに記述されていない独特なペプチド群に属するものである。カリフォラからのアリルフォリンは約500,000 Daの分子量を有し(Naumann U. and Scheller K. Biochem. Biophys. Res. Communications, 1991, 177, p.963−971)、欧州特許公開第0 320 528 A1号に開示されているように抗体依存性T−リンパ球の抗腫瘍活性の特異的ワクチン化及び特異的刺激の過程におけるアジュバントとしての使用が提唱されている。これまでのところナチュラルキラー細胞活性及びインターフェロン合成に対するアリルフォリンの効果の可能性に関するデータは得られていない。
【0013】
アロフェロンは以下のような一般式により表される独特なアミノ酸配列を有する線形ペプチドである:
X1−His−Gly−X2−His−Gly−Val−X3
(式中、X1は存在しないか又は少なくとも1個のアミノ酸残基を示し、
X2はペプチド結合又は少なくとも1個のアミノ酸残基を示し、
X3は存在しないか又は少なくとも1個のアミノ酸残基を示す)。
本発明のアロフェロンは最大30個、好ましくは最大20個、最も好ましくは5〜13個のアミノ酸残基を有する。
本発明のアロフェロンの例を表1に要約する。
【0014】
【表1】
アロフェロン1及び2は哺乳動物ナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性を刺激することができるサイトカイン様物質を目的を持ってスクリーニングする過程で、昆虫、すなわちカリフォラ・ビシナ(Calliphora vicina)の細菌に感染させた血液から単離された天然ペプチドである。アロフェロン3及び4は、天然の原型分子に可能な生物学的に活性な修飾を決定するために化学的に合成されたアロフェロン1のトランケイト形態である。
【0015】
リンパ球の細胞傷害活性に対するアロフェロン1〜4の効果の比較研究で、全てのアロフェロンが生物活性を有する分子であることが証明された。実施例5を参照のこと。これによりアロフェロン構造における(機能的に重要な)保存的部分と変更可能な部分の区別が可能となる。アロフェロン5〜20はアロフェロンの基本構造の可変断片の好ましい変更を示すために表した例である。
【0016】
データーベースの探索からはアロフェロン構造と密接な類似性を持つ天然物起源のペプチド又は生物活性を有する合成ペプチドは明らかにされなかった。従って、アロフェロンは新しい生物活性ペプチド群に属すると考えられる。それにもかかわらず、アロフェロンはある程度まではある種の機能的に重要なタンパク断片と構造的な類似性を有する。例えば、アロフェロン1はインフルエンザウイルスBヘマグルチニン前駆体の377−387断片と63%の同一性を有する。ヘマグルチニンは宿主の細胞膜との統合をつかさどるウイルス外被の重要な膜親和性タンパクとして知られている。
【0017】
アロフェロン1は本発明の開発過程において原型分子として使用された。アロフェロン1は13個のアミノ酸から成る1265 Daの分子量を有する線形ペプチドである。表1を参照のこと。アロフェロン2〜4と比較すると、NK細胞の細胞傷害性の刺激体としての有効性及び他の活性において必要なアロフェロン構造の機能的に重要な要素を決定することができ、このペプチドの生物学的活性を変化させない構造的変更が予測できる。
【0018】
アロフェロン1をアロフェロン2〜4の構造と比較すると、全てのペプチドがNK細胞の細胞傷害試験で同様の活性を示したことから、Ser−Gly−His−Gly−Gln−His−Gly−Val断片が存在すれば生物学的活性を維持するのに充分であることが示されている。従って、この断片又は断片の一部がアロフェロン配列において核となる保存的構造を表している。アロフェロン1の分子の1〜3位は除去するか、又は1個以上の他のアミノ酸に代替することができる。
【0019】
さらに、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの類似断片と比較してみると、アロフェロン1配列においてセリン(Ser)とグリシン(Gly)のアミノ酸が占めている4位及び5位は好ましくは脂肪族、芳香族又は複素環式アミノ酸の群から選択される他のアミノ酸に置き換えることができることが分かる。例えば、セリンはスレオニン(Thr)で置き換えることができ、グリシンはセリンで置き換えることができる。
【0020】
このように、得られているデータからアロフェロン1配列の初めの5個のアミノ酸は存在しないか又は少なくとも1個のアミノ酸を含んでいてもよい可変断片であることが分かる。従って、この断片をアロフェロンの構造式(1)においてX1と記す。望ましくは、X1は存在しないか、His−Gly−Val−Ser−Gly−、Gly−Val−Ser−Gly−、Val−Ser−Gly−、Ser−Gly−、Pro−Ser−Leu−Thr−Gly−、Phe−Ile−Val−Ser−Ala−、Thr−、Leu−Ala−Ser−Leu−、Cys−Val−Val−Thr−Gly−、Ile−Ser−Gly−、Cys−Gly−、Ile−Val−Ala−Arg−Ile−、Phe−Gly−、His−Gly−Asp−Ser−Gly−、Ser−Gly−及びTyr−Ala−Met−Ser−Gly−から成る群から選択される。
【0021】
同様に、アロフェロン1の14〜15位は除去するか、又は1個以上のアミノ酸による配列で置き換えることができる。従って、この断片はアロフェロン構造式(1)においてX3と記す。望ましくは、X3は存在しないか、−His−Gly、−His、 −Tyr−Asp、−Phe−Val、−Pro、−Gln−His−Gly、−Leu−Ala、−Asp、−Pro−Leu、−Met 及び−Phe−Ileから成る群から選択される。
【0022】
さらに、アロフェロン及びそれと類似なヘマグルチニン断片を比較すると、アロフェロン分子中ではグルタミンである9位も変更可能であり、グルタミンを例えばアラニンのような他のアミノ酸に置き換えることができることがわかる。そこで、アロフェロン構造式(1)の9位はX2と記されるが、これはGlyとHisを連結するペプチド結合であるか又は少なくとも1個以上のアミノ酸、好ましくは0〜3個のアミノ酸、さらに好ましくは0〜2個のアミノ酸、最も好ましくは1個のアミノ酸、特に−Gln−でもよい。
【0023】
望ましくは、X2はペプチド結合であるか、−Gln−、−Phe−、−Asp−、−Ser−、−Asn−、 −Ala−、−Gln−Asn−、−Ala−Val− 及び−Ser−Asp−Glyから成る群から選択される。
【0024】
アロフェロンの生物学的活性を有意に変化させることなく、キャリアタンパクのようなより大きい分子中にアロフェロン配列を挿入することも可能である。そこで、本発明はまた、上記一般式(1)を有するアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパクのような化合物に関するものであるが、このペプチド又はタンパクは自然界に存在するものではなく、特にインフルエンザウイルスBの前駆体ではない。
【0025】
下記実施例に要約される免疫学的、薬学的及び毒性学的複合試験から、アロフェロンの有用な性質の範囲が示されている。得られたデータからアロフェロンが新規のサイトカイン様ペプチドであることが示されている。アロフェロンの作用様式にはインターフェロン合成の誘導の他に、細胞傷害性リンパ球による細胞の非自己又は非正常自己認識及び溶解を刺激することが含まれる。従って、アロフェロンはインターフェロン生成不全及びナチュラルキラー細胞の活性不全を矯正し、当該不全によるウイルス性、腫瘍性及びその他の疾患を治療するための免疫調節医薬品として有用である。アロフェロンは事実上毒性がなく、先進的前臨床研究から示されているように、催奇形性、胎児毒性又は突然変異原性を有していない。
アロフェロン1の実験的に立証された性質を表2に要約する。
【0026】
【表2】
【0027】
一般に、薬学的活性スペクトルはナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性及び抗ウイルス剤耐性に対する影響に関するインターフェロン−アルファの公知の性質と一致する。このような観点から、アロフェロンはインターフェロン−アルファの機能的アナログとして特徴づけることができる。アロフェロンの作用様式は、in vitroでのNK細胞の細胞傷害活性に対する刺激に関しては、非常に低い濃度、すなわち約1ピコグラム/ml(10−9 g/ml)で観察される。このような観点から、アロフェロンはインターフェロンやインターロイキンなどの内生サイトカイン類と同等又はより優れた活性を有している。
【0028】
さらに、アロフェロンは単独で又はインターロイキン12と協同でインターフェロン−ガンマを含む内性インターフェロンの合成を誘導することができる。従って、アロフェロンはインターフェロン誘導物質群に属すると言える。
アロフェロンのin vivo活性の前臨床研究から、アロフェロンはヒトインフルエンザウイルスに感染したマウスモデルを用いた試験で強力な抗ウイルス活性を有することが示された。このモデルでは、ヒトインフルエンザウイルス懸濁液を野生型のオスに鼻腔内投与して感染させ、アロフェロン1を感染一日前及び感染後1、2、4、6及び8日目に腹腔内投与した。アロフェロンはマウスの肺損傷及び死亡を効果的に防止した。これにより、アロフェロンはウイルス感染を治療又は予防するための医薬用製剤の製造に有用であると言える。
in vivo及びin vitroの研究過程でアロフェロン1の急性及び慢性毒性はどちらも見られなかった。
【0029】
本発明の医薬用製剤が賦形剤又は担体のような通常の添加物も含んでいてよいことは言うまでもない。本製剤は鼻腔内;経口又は直腸内のような腸内;及び腹腔内、筋肉内、静脈内又は経皮のような非経口の経路により患者に投与することができる。本製剤は鼻腔内滴下溶液、スプレー剤、リポソーム剤、カプセル剤、錠剤及び座薬のような投与形態で投与できる。非経口用としては、医薬上の活性を有する成分を好ましくは注射可能な溶液の形態にする。
【0030】
このように、アロフェロンはインターフェロン系及びナチュラル細胞が媒介する細胞傷害を含む先天免疫の改善が治療上の重要性を持ちうる多様な感染性又は腫瘍性疾患の治療又は予防に有用である。アロフェロン適用が有望な状態の例としては、インフルエンザウイルス及び他の呼吸器系ウイルスによる感染症、ウイルス性肝炎、AIDS並びにAIDS関連の2次感染症及び腫瘍状態、急性及び慢性の白血病並びにインターフェロン治療の有効性が証明されているその他の癌、インターフェロン治療に感受性を有する全身性真菌感染症などが挙げられる。
【0031】
生物学的活性のある種の類似性(NK細胞の細胞傷害活性の刺激、間接的抗ウイルス活性)にもかかわらず、アロフェロンは構造及び作用様式の点ではインターフェロンとは非常に異なっている。すなわち、インターフェロンは17000〜80000ダルトンの範囲の分子量を有する糖タンパクである。その組織及び種の特異性だけでなくアミノ酸鎖のグリコシル化はインターフェロンの機能的活性に必須の条件である。アロフェロンは好ましくは1265 Daの分子量を有する好ましくはグリコシル化されていないオリゴペプチドであり、その分子量はインターフェロンの分子量の13分の1ないし60分の1と小さい。アロフェロンのアミノ酸配列はインターフェロンの配列のいずれの断片とも類似性がない。また、機能的側面においてもアロフェロンとインターフェロンの間には本質的な違いがある。すなわち、 アロフェロンは内生的インターフェロンの生成を誘導してインターフェロンにより媒介される防御反応連鎖を促進する。外生インターフェロンの使用は、マイナスのフィードバックメカニズムにより内生インターフェロンの合成をむしろ抑制すると考えられる。
【0032】
本発明のペプチドは天然原料から単離するか又は公知の方法により合成することができる。本発明のペプチドはまた組換えDNA技術により製造することもできる。このように本発明は、例えば本発明のいずれかのペプチドを含むペプチド配列をコードするcDNAのようなDNA配列を含む適当なベクターで予め形質転換した宿主細胞を培養すること−但し、この場合、当該DNA配列はプロモーター調節下に置かれ、当該ペプチド配列のDNA配列が正しく発現されるように宿主細胞の機構により認識される終止信号が当該DNA配列の後ろに続く−及び細胞培養物中の発現産物から探索されたペプチドを回収することを含む。望ましい宿主細胞は、ラクトバシラス(Lactobacillus)株、大腸菌、アグロバクテリウム(Agrobacterium)又はバシラス(Bacillus)株に属する。或いは、本ペプチドは周知の化学的合成法により容易に製造することもできる。
【0033】
以下の実施例により、本発明をさらに説明する。
【0034】
【実施例】
実施例1
昆虫の血液からのアロフェロンの単離、構造決定及び化学的合成
アロフェロンは最初、免疫化された(細菌に感染させた)昆虫、すなわちハエの一種であるカリフォラ・ビシナ(Calliphora vicina)の血液中に発見された。先に記述されている実験室条件下で維持されたカリフォラ・ビシナの幼虫に摂食後(Chernysh S.I., Simonenko N.P., Numata H. Appl. Entomol. Zool., 1995, Vol.30, No.3, p.498−499)、加熱殺生した大腸菌(Escherichia coli)及びマイクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)細胞の懸濁液に浸した針で小皮を刺すことによって細菌に感染させた。傷付いた敗血症状態の幼虫の血リンパを採取し、遠心分離してSep−Pak C18クロマトグラフィーカラム(Waters Co.)にのせた。このカラムを0.05%トリフルオロ酢酸で洗浄した。その後、標的となる物質を0.05%トリフルオロ酢酸で酸性化させた50%アセトニトリルで溶出させた。溶出した組成物を凍結乾燥して、活性素因の段階的クロマトグラフィー精製に使用した。精製工程中に、細胞傷害性細胞としてマウス脾臓リンパ球を用い、標的としてH3ウリジンでラベルしたK562癌細胞を用いて、各分画の生物学的活性をモニターした。
【0035】
精製工程の結果、強力な免疫調節活性を示しアロフェロン1及び2と命名された2個の近種のオリゴペプチドが最初の組成物から単離され化学的な特性分析がなされた。これらのペプチドのアミノ酸配列はモデル473Aシーケンサー(AppliedBiosystems)で自動エドマン分解法を用いて決定された。アロフェロン1及び2の構造は下記のように決定された:
【0036】
上記ペプチドをさらにブルカー(Bremen)BIFLEXマトリックス補助レーザー脱着タイムオブフライト質量分析計により分析し、分子量が1265 Da(アロフェロン1)及び1126 Da(アロフェロン2)と実験的に決定された。アミノ酸配列データから推定されたアロフェロン1及び2の分子量と質量分析計により決定された分子量は良好に一致しており、このことはアロフェロン1及び2が翻訳後修飾を経ていない線形ペプチドであることを立証している。
【0037】
アロフェロン1を生物学的研究及び前臨床研究のための原形分子として選択した。後の実験に十分な量のアロフェロン1を得るために、固相ペプチド合成技術によりに化学的にアロフェロン1を合成した(Neimark J. and J.−P. Brian, Peptide Research, 1993, vol.6, p.219)。ペプチド精製プロトコールは二つの主要な工程を含む。第一の工程はC18吸着剤(Waters)を付着させたSep−Pak Vacカラムを用い、0.05%トリフルオロ酢酸で酸性化させた40%アセトニトリルでカラム溶出して行った。最終的に、Aquapore ODS Prep 10 C18 (100 x 10 mm, Brownlee)が装着されたBeckman Gold Systemクロマトグラフを使用して、0.05%トリフルオロ酢酸及び酸性化させたアセトニトリルの線形濃度勾配(2.5 ml/minの流速、40分間で0−20% アセトニトリル;検出波長は225 nm)により均質性が得られるまでペプチドを精製した。ペプチドの純度はMALDI−TOF質量分析計により確認した。アミノ酸配列の正確さはマイクロシーケンンシングによって確認した。
アロフェロン1について記載したものと同等の方法により、アロフェロン1のトランケイテッド形態であるアロフェロン3及び4が合成、精製及び検査された。
【0038】
実施例2
マウス脾臓リンパ球の細胞傷害に対するアロフェロン1の効果
マウス脾臓リンパ球の細胞傷害活性に対するアロフェロンの効果を分析するために、標準的な細胞傷害アッセイを用いた(Hashimoto J. and Sudo E., Gann, 1971, vol.62, 139−145; Filatova N.A., Malygin A.M., Goryunova L.B., Fel V.Ya. and Khavinson V.K., Tsitologia, 1990, vol.32, No.6, 652−658)。H3−ウリジンでラベルしたK562ヒト白血病細胞を細胞傷害性リンパ球による攻撃の標的として用いた。新鮮な脾臓リンパ球と標的細胞を合わせて上記調製物の存在又は非存在下で18時間間インキュベートした。その後、死亡した及び正常な標的細胞の比率並びにそれに対応する細胞傷害指数を対照群及び実験群において測定した。
【0039】
合成アロフェロン1の刺激活性についての典型的な結果を表3に示す。
培地にアロフェロンを投与すると広い濃度範囲(0.05−50 ng/ml)で、標的である腫瘍細胞に対するナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性の統計的に有意な増幅が誘導された。500 ng/mlの濃度では刺激効果を示さなかった。しかしながら、この場合でも細胞傷害が対照レベル以下には抑制されることはなかった。従って、最小有効濃度の1000倍過剰でもNK細胞の細胞傷害活性に対して有害ではなかった。
このようにアロフェロンは、NK細胞の活性化をつかさどるインターロイキン2又はインターフェロン−アルファのような特異的サイトカインに特徴的な非常に低い濃度でマウス脾臓リンパ球の細胞傷害活性を刺激する。同時に、アロフェロンは有効濃度の10000倍過剰でも免疫抑制作用を示さなかった。
【0040】
【表3】
【0041】
実施例3
ヒト末梢血液リンパ球の細胞傷害活性に対するアロフェロン1の効果
細胞傷害指数の測定を実施例2に記述したように行った。ヒト末梢血液リンパ球をドナーの新鮮な血液から分離し、ヒストパック1077溶液(Sigma)を用いた遠心分離により赤血球を除去した。遠心分離後、リンパ球をリン酸緩衝液に再懸濁し、遠心分離後、RNaseを加えたRPMI 1640培地に再懸濁した。このリンパ球を2×105細胞/mlの濃度に希釈し、直ちに細胞傷害の分析に使用した。NK細胞の細胞傷害の天然刺激剤であるインターフェロン−アルファ2b(Intron, Shering−Plough)を陽性対照として用いた。
【0042】
上記調製物を培地に加えた場合0.0005 ng/mlの濃度からK562癌細胞に対するPBLの細胞傷害が有意に増加したが、刺激活性は約0.05 ng/mlの濃度でプラトーに達した(表4)。5 ng/mlの濃度で投与されたインターフェロン−アルファ2bは0.05−0.5 ng/mlの最適濃度範囲で投与されたアロフェロンと比較すると効果が低かった。
これらの実験データは腫瘍細胞を溶解に導く末梢血液リンパ球のin vitro細胞傷害活性に対するアロフェロンの強力な刺激効果を証明している。
【0043】
【表4】
【0044】
実施例4
健康なドナー集団におけるリンパ球の細胞傷害活性に対する刺激に関するアロフェロン1及びインターフェロン−アルファ 2b の有効性の変動の比較研究
アロフェロン及びインターフェロン−アルファ2bの刺激に対するリンパ球の反応の多様性及び相互関係を評価するために、17人の健康なドナーから無作為にサンプリングしてPBLの細胞傷害活性をモニターした。細胞傷害活性は実施例2及び3に記述したように評価した。この研究では二種類の標的細胞:すなわち、赤骨髄性白血病細胞に由来するK562細胞株及び固形結腸直腸腫瘍に由来するA431細胞株を同時に使用した。この試験でリンパ球と標的細胞の比率(E/T比)は20:1であった。
【0045】
得られたデータを表5に要約する。表中の各数値は6回の細胞傷害測定の結果を含むものである。このデータは対照群においてリンパ球の細胞傷害活性の大きなばらつきを示し、特に異なる起源の標的細胞を認識して排除する能力における違いを示している。上記調製物の投与に対する反応も異なる。それにも関わらず、アロフェロンとインターフェロン投与に対する反応では明確な相互関係が大部分のドナーで見られた:ほとんどのケースでインターフェロンに陽性に反応するドナーはアロフェロンにも陽性に反応し、逆も同様である。
【0046】
表5のデータに基づいて計算された2種の調製物の有効性を総合化した数値を表6に示す。ほとんどのドナーがインターフェロン(17人のドナー中10人)及びアロフェロン(同じく10人)に反応し、K562又はA431標的に対する細胞傷害活性が統計的に立証される増加を示した。アロフェロン及びインターフェロン投与に対する反応性は良好な相互関係にあった:すなわち、9人のドナーが両方の調製物に同程度に反応し、各1人のドナーがそれぞれインターフェロン又はアロフェロンに選択的に反応した。
【0047】
このように、健康なドナーの反応性の分析からこのモデルではアロフェロン及びインターフェロン−アルファ2bは同様の有効性を持つことが示される。さらに、全ての個体においてではないにしても大部分の個体において、2種の調製物は細胞傷害性リンパ球の活性を刺激するものとして互換性があるように見える。
【0048】
【表5】
【表6】
【0049】
【表7】
【0050】
実施例5
癌患者からの無作為サンプリングによるリンパ球の細胞傷害活性に対する刺激に関するアロフェロン1及びインターフェロン−アルファ 2b の有効性の変動の比較研究
18人の種々の悪性腫瘍の患者から取った血液サンプルを実施例3の健康なドナーの場合と同様のプロトコールで試験した。結果を表7に示す。アロフェロン処置対する陽性反応が、多様な患者群、特に慢性及び急性白血病患者(9例中5例)で見られた。非ホジキンリンパ腫の患者(6例中2例)及び肺癌患者1例でも陽性反応が検出された。
【0051】
インターフェロン又はアロフェロンに陽性反応をみせる個体の比率は健康なドナーに比べると癌患者で若干減少したがそれでも有意であった(全体数に対してそれぞれ56%及び50%)。インターフェロン及びアロフェロンに対する反応性の相互関係も健康なドナーに比べると弱かったが証明されている。所定の試験によると、アロフェロンは癌患者の一部において注射用インターフェロンを代替するに適当なように見える。しかしながら、アロフェロンの活性がインターフェロンの活性によく似ているだけではなく内生インターフェロンの産生を刺激するということを考えると、天然の細胞傷害の直接的な活性化及び内生インターフェロン合成の誘導を通じて免疫反応を二重に刺激することが予想されるために、アロフェロンは注射用インターフェロンの代替製剤としてよりいっそう期待される。
【0052】
【表8】
【表9】
【表10】
【0053】
【表11】
【0054】
実施例6
ヒト末梢血液リンパ球の細胞傷害活性に対するアロフェロン1構造アナログの影響
アロフェロン1アナログであるアロフェロン3及び4の活性を実施例2及び3に述べたプロトコールに従って調べた。健康なドナーの血液から単離した単核分画及びA431細胞株の標的細胞を合わせて、上記調製物、すなわちアロフェロン1、アロフェロン3,アロフェロン4又はインターフェロン−アルファ2b(陽性対照)のうちの1つの存在下でインキュベートした。全ての例において上記調製物の濃度は5 ng/mlとした。無処置対照群を上回る細胞傷害指数を有効性の基準として使用した。
表9のデータはアロフェロン1及びインターフェロン−アルファ2bと比較してアロフェロン3及び4に同様の有効性があることを証明している。
このように、アロフェロン1の構造的アナログであるアロフェロン3及び4の有効性の比較分析から、アロフェロン1のアミノ酸配列の1−4位及び/又は14−15位がその特異的薬理活性においては不要であり、従って、活性の損失なしに変更又は置換することができるアロフェロン1構造の可変部分であることが示されている。
【0055】
【表12】
【0056】
実施例7
ヒトインフルエンザウイルス A が感染したマウスに及ぼすアロフェロンの in vivo 抗ウイルス活性
アロフェロンの抗ウイルス活性をヒトインフルエンザウイルスAを致死量感染させたマウスモデルを使用して調べた。対マウス病原性ウイルス株A/Aichi/2/68(セロタイプ H3N2)の懸濁液を20〜22 g体重の野生型オスに LD50の10倍に相当する用量で鼻腔内に投与した。0.5 mlの0.9% NaClに溶解したアロフェロン1をウイルス接種の一日前、並びに接種後1、2、4、6及び8日目に腹腔内注射した。この調製物はマウス一匹当たり25及び2.5μg(0.5及び0.05μg/kg)の2種類の用量で試験した。対照マウスには同一容量の溶媒を注射した。感染後十日間のマウスの死亡率をモニターした。
表10のデータは25μgのアロフェロンで処置した群で感染後の死亡率が有意に減少したことを示している。2.5μgの用量では有効でなかった。
【0057】
【表13】
【0058】
アロフェロンの抗ウイルス活性をレマンタジンと比較した実験で同様の結果が得られた。表11を参照のこと。レマンタジン(アマンタジン誘導体)はインフルエンザウイルスAに対して特異的に有効な最も強力な抗ウイルス剤の一つである(Ershov F.I., Antiviral preparations, Medicina, Moscow, 1998, 187pp)。アロフェロンをウイルス接種の1日前、次いで接種の1時間前、さらに感染後1及び2日後に25μgの用量で皮下注射した。レマンタジンは1000μgの用量でウイルス接種の1日前、次いで接種の1時間前、さらに感染後1、2及び3日後に経口投与した。
【0059】
アロフェロン及びレマンタジンは両方ともインフルエンザウイルスによって引き起こされる致命的な肺損傷からほとんどの感染動物を有効に保護した。レマンタジンのほうがインフルエンザウイルスA感染の場合においてはわずかにより効果的であるように見えるが、アロフェロンに比べるとレマンタジンは著しく多い投与量(約40倍)で使用しなければならない。さらに、インフルエンザウイルスのA株及びB株に同等に効果的なアロフェロンとは異なり、レマンタジンはインフルエンザウイルスB及び他のウイルス感染の場合には効果がないことが知られている。
【0060】
【表14】
【0061】
実施例8
ヒトインフルエンザウイルス Bが感染したマウスにおけるアロフェロンのin vivo抗ウイルス活性
アロフェロンの抗ウイルスB有効性を実施例6に記述したプロトコールに従って試験した。対マウス病原性 Lee 1/40ヒトインフルエンザウイルス B 株をLD50の3及び30倍当量の用量で動物に鼻腔内接種した。多様なインフルエンザウイルス株に有効な抗ウイルス剤であるリバビリン(Ribavirin)、すなわち1−ベータ−D−リボフラノシル−1,2,4−トリアゾール−3−カルボキサミド(Liao H.J. and StollarV. Antiviral Res., 1993, 22, 285; Ershov F.I. Antiviral preparations, Medicina, Moscow, 1998, 187 pp)を陽性対照として使用した。
【0062】
結果を表12に示す。ウイルス投与量に関わらず、両方の対照群で感染により高い致死率の重篤な肺炎が引き起こされた。リバビリンは低い方のウイルス用量(LD50の3倍) を接種したマウスでは有効に保護したが、高い方の用量(LD50の30倍)に対しては有効でなかった。この時、アロフェロンは両方の場合において同等に有効であった。従って、アロフェロンは公知の抗ウイルス剤であるリバビリンに比較して、より優れた抗ウイルス効果を有することが証明された。さらに、アロフェロンはリバビリンの治療用量の約1/10程度の用量で有効であった。
【0063】
【表15】
【0064】
実施例9
マウスにおけるインターフェロン合成に対するアロフェロンの in vivo 効果
アロフェロンの抗ウイルス活性に可能な作用様式を調べるために、マウスにおけるインターフェロン合成に対する上記調製物のin vivo効果を研究した。アロフェロン処理及び対照(無処理)動物の血清中のインターフェロン濃度を単層L−929細胞をモデルに用いて測定した。水疱性口内炎ウイルス(Indiana 株)を試験ウイルスとして50%細胞変性用量の100倍超過用量で使用した。インターフェロン活性の1ユニットは、試験ウイルスの細胞傷害に対して50%のL−929細胞を保護するマウス血清希釈倍数の反比例値で表す。シクロフェロンを陽性対照として用いた。シクロフェロンはアクリダノン化合物群に属するインターフェロン誘導物質である(Ershov F.I. Antiviral preparations, Medicina, Moscow, 1998, 187 pp)。アロフェロン又はシクロフェロンはそれぞれ25μg及び500μgの用量で腹腔内投与された。
2シリーズの実験結果を表13に要約する。各シリーズで実験群は4匹の動物から成っていた。各動物から血液サンプルを採取して個々の血清を合わせ、インターフェロン測定に使用した。アロフェロンは統計的に有意にインターフェロン濃度増加を刺激し、処置の24時間後に最大効果に達した。
【0065】
【表16】
【0066】
マウスにおけるインターフェロン合成に対するアロフェロンのin vivo効果に関する他の例を表14に示す。アロフェロンを皮下注射したことと個々の血液サンプルを別々に分析したことを除いて、上記実験と同じ方法で行った。アロフェロン及びシクロフェロンは両方とも短期間観察、すなわち処置後6時間目においてインターフェロン生成を刺激した。24時間の間にアロフェロン及びシクロフェロンの両方の処置動物でインターフェロン力価は対照レベルに戻った。
このように、上記データからアロフェロンが公知のインターフェロン誘導物質であるシクロフェロンと同様のレベルでin vivoインターフェロン誘導活性を有することが確認された。刺激効果の長さは、おそらく動物の生理的状態及び投与方法に依存して、6時間から24時間又はそれ以上の範囲に及びうる。シクロフェロンのような伝統的なインターフェロン誘導性化学物質と比較して、アロフェロンは非常に低い投与量(約1/20)で有効であるという長所を持つ。
【0067】
【表17】
【0068】
実施例 10
アロフェロンの毒性評価
アロフェロンの毒性をin vitro及びin vivoモデルを用いて試験した。表15を参照。動物及び微生物モデルでの急性若しくは慢性毒性、アレルゲン活性、胎児毒性又は生殖機能に対する有害な効果、又はヒトのin vitroモデルでの細胞傷害はこれまでのところ記録されていない。従って、アロフェロンは毒性が非常に低いか又は実質的に毒性がない物質と結論される。
【0069】
【表18】
【表19】
Claims (9)
- 免疫調節活性を示すペプチドであって、下記の一般構造式(1);
Y-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-X3 (1)
(式中、Yは、0〜3個のアミノ酸残基を示し、及びX3は0〜2個のアミノ酸残基を示す)で表されることを特徴とするペプチド、又はその医薬上許容しうる塩。 - 請求項1に記載のペプチド又は該ペプチドの医薬上活性のある塩を含む医薬用組成物。
- 請求項1に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるDNA。
- 請求項1に記載のペプチドをコードするDNA断片を含み、形質転換後に前記ペプチドを発現するベクターであって、宿主細胞内で請求項1に記載のペプチドを発現するのに適したベクター。
- 請求項4に記載のベクターにより形質転換されていることを特徴とする宿主細胞。
- 細菌細胞であることを特徴とする請求項5に記載の宿主細胞。
- 活性成分として請求項1に記載のペプチド又は該ペプチドの医薬上活性のある塩を含む抗癌剤。
- 活性成分として請求項1に記載のペプチド又は該ペプチドの医薬上活性のある塩を含む抗ウィルス剤。
- 活性成分として請求項1に記載のペプチド又は該ペプチドの医薬上活性のある塩を含む、インターフェロン誘導活性を示す免疫調節剤。
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