JP2001348399A - アロフェロン−免疫調節ペプチド - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】免疫調節活性を有し、特に免疫不全状態、感染
症及び腫瘍性疾患の治療に有用な医薬用製剤の提供。 【解決手段】 最大３０個のアミノ酸残基から成り免疫
調節活性を示すペプチドであって、下記の一般構造式
（１）で表されるペプチド、又はその医薬上許容しうる
塩若しくはエーテル。 X1-His-Gly-X2-His-Gly-Val-X3 （１） （上記式中、X1は存在しないか又は少なくとも1個のア
ミノ酸残基を示し、X2はペプチド結合又は少なくとも1
個のアミノ酸残基を示し、X3は存在しないか又は少なく
とも1個のアミノ酸残基を示す）
症及び腫瘍性疾患の治療に有用な医薬用製剤の提供。 【解決手段】 最大３０個のアミノ酸残基から成り免疫
調節活性を示すペプチドであって、下記の一般構造式
（１）で表されるペプチド、又はその医薬上許容しうる
塩若しくはエーテル。 X1-His-Gly-X2-His-Gly-Val-X3 （１） （上記式中、X1は存在しないか又は少なくとも1個のア
ミノ酸残基を示し、X2はペプチド結合又は少なくとも1
個のアミノ酸残基を示し、X3は存在しないか又は少なく
とも1個のアミノ酸残基を示す）
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は天然物を起源とする
免疫調節物質に関する。具体的には、本発明は免疫不全
状態、感染症及び腫瘍性疾患の治療において有用な無脊
椎動物起源のペプチド及びそのようなペプチドを含む医
薬用製剤に関する。
免疫調節物質に関する。具体的には、本発明は免疫不全
状態、感染症及び腫瘍性疾患の治療において有用な無脊
椎動物起源のペプチド及びそのようなペプチドを含む医
薬用製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来技術として免疫系の効力を刺激する
ことができる昆虫を含む動物及び植物組織の物質を含有
する天然物起源の様々な医薬用製剤が知られている。CD
4-陽性T細胞又は骨髄細胞から抗−HIV活性を有する細胞
タンパクを得る方法が米国特許第5,480,782号に開示さ
れている。抗菌活性と抗ウイルス活性を示す銀杏葉抽出
物を含む処方がドイツ特許公開第43 34 600 A1号に開示
されている。活性成分として動物の組織、血清又は細胞
から抽出された主要組織適合遺伝子複合系抗原を含む、
生体の免疫反応を刺激するための医薬用組成物がWO 96/
04005号に開示されている。組織、細胞又は血清はヤ
ギ、子牛又はブタの肝臓及び牛の赤血球から選択され
る。抗癌化学療法の副作用を防ぎつつ癌を治療し、かつ
ヒトの免疫機能を増進させるためのニゲラ・サティバ(N
igella sativa)植物の抽出物を含む医薬用組成物が米国
特許第5,482,711号に開示されている。
ことができる昆虫を含む動物及び植物組織の物質を含有
する天然物起源の様々な医薬用製剤が知られている。CD
4-陽性T細胞又は骨髄細胞から抗−HIV活性を有する細胞
タンパクを得る方法が米国特許第5,480,782号に開示さ
れている。抗菌活性と抗ウイルス活性を示す銀杏葉抽出
物を含む処方がドイツ特許公開第43 34 600 A1号に開示
されている。活性成分として動物の組織、血清又は細胞
から抽出された主要組織適合遺伝子複合系抗原を含む、
生体の免疫反応を刺激するための医薬用組成物がWO 96/
04005号に開示されている。組織、細胞又は血清はヤ
ギ、子牛又はブタの肝臓及び牛の赤血球から選択され
る。抗癌化学療法の副作用を防ぎつつ癌を治療し、かつ
ヒトの免疫機能を増進させるためのニゲラ・サティバ(N
igella sativa)植物の抽出物を含む医薬用組成物が米国
特許第5,482,711号に開示されている。
【０００３】イガイの一種であるミチルス・エデュリス
（Mytilus edulis）から単離され、様々なウイルス、
細菌及び原生動物に対して有効な抗生物質組成として使
用されるポリペプチド分画がWO 81/03124号に開示され
ている。蜜蜂由来の抗菌ペプチド並びにその単離、製造
及び適用の方法が欧州特許公開第0 299 828 A1号に開示
されている。甲虫の一種であるテネブリオ・モリトール
(Tenebrio molitor)及びレプチノタルサ・デセムリニア
タ(Leptinotarsa decemlineata)から単離された抗菌ペ
プチドがWO 90/14098号に開示されている。鱗翅目昆虫
の一種であるヒアロフォラ・グロベリ(Hyalophora glov
eri)から単離された抗菌タンパクが欧州特許公開0 856
519 A2号に開示されている。レンチウイルス経膜タンパ
クのアルギニン含有性断片と構造的に類似な抗微生物ペ
プチドが米国特許第5,714,577号に開示されている。
（Mytilus edulis）から単離され、様々なウイルス、
細菌及び原生動物に対して有効な抗生物質組成として使
用されるポリペプチド分画がWO 81/03124号に開示され
ている。蜜蜂由来の抗菌ペプチド並びにその単離、製造
及び適用の方法が欧州特許公開第0 299 828 A1号に開示
されている。甲虫の一種であるテネブリオ・モリトール
(Tenebrio molitor)及びレプチノタルサ・デセムリニア
タ(Leptinotarsa decemlineata)から単離された抗菌ペ
プチドがWO 90/14098号に開示されている。鱗翅目昆虫
の一種であるヒアロフォラ・グロベリ(Hyalophora glov
eri)から単離された抗菌タンパクが欧州特許公開0 856
519 A2号に開示されている。レンチウイルス経膜タンパ
クのアルギニン含有性断片と構造的に類似な抗微生物ペ
プチドが米国特許第5,714,577号に開示されている。
【０００４】ブタの白血球から単離された抗ウイルス及
び抗微生物ペプチドが米国特許第5,804,558号に開示さ
れている。主要組織適合遺伝子複合系クラスII抗原に特
異的に結合し、それにより自己免疫疾患の発生可能性を
減少させる免疫調節ペプチドが米国特許第5,827,516号
に開示されている。特定抗体の生産及び抗体依存性T-リ
ンパ球の抗腫瘍活性の刺激剤としての、多様な軟体動物
及び、昆虫の一種であるカリフォラ・エリスロセファラ
(Calliphora erythrocephala)を含む節足動物から単離
されたヘモシアニン及びアリルフォリンの用途が欧州特
許公開第0 320 528 A1号に開示されている。
び抗微生物ペプチドが米国特許第5,804,558号に開示さ
れている。主要組織適合遺伝子複合系クラスII抗原に特
異的に結合し、それにより自己免疫疾患の発生可能性を
減少させる免疫調節ペプチドが米国特許第5,827,516号
に開示されている。特定抗体の生産及び抗体依存性T-リ
ンパ球の抗腫瘍活性の刺激剤としての、多様な軟体動物
及び、昆虫の一種であるカリフォラ・エリスロセファラ
(Calliphora erythrocephala)を含む節足動物から単離
されたヘモシアニン及びアリルフォリンの用途が欧州特
許公開第0 320 528 A1号に開示されている。
【０００５】免疫不全状態、感染症及び腫瘍性疾患の治
療に適した薬の最近の体制は上述した製剤及びこれに類
似の天然医薬用製剤により強化されている。しかしなが
ら、現在までに利用可能な薬剤は現存の免疫調節医学に
おける要求の全体に対応しているわけではない。
療に適した薬の最近の体制は上述した製剤及びこれに類
似の天然医薬用製剤により強化されている。しかしなが
ら、現在までに利用可能な薬剤は現存の免疫調節医学に
おける要求の全体に対応しているわけではない。
【０００６】
【発明が解決すべき課題】従って、免疫調節活性を有
し、特に免疫不全状態、感染症及び腫瘍性疾患の治療に
有用な医薬用製剤を提供することが本発明の目的であ
る。
し、特に免疫不全状態、感染症及び腫瘍性疾患の治療に
有用な医薬用製剤を提供することが本発明の目的であ
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】今回驚くべきことに、望
ましい免疫調節活性を示す特定のペプチドが発見され
た。従って、本発明は最大３０個のアミノ酸残基から成
り免疫調節活性を示すペプチドであって、下記の一般構
造式（１）； X1-His-Gly-X2-His-Gly-Val-X3 （１） （式中、X1は存在しないか又は少なくとも1個のアミノ
酸残基を示し、X2はペプチド結合又は少なくとも1個の
アミノ酸残基を示し、X3は存在しないか又は少なくとも
1個のアミノ酸残基を示す）で表されるペプチド又はそ
の医薬上許容しうる塩若しくはエーテルに関する。
ましい免疫調節活性を示す特定のペプチドが発見され
た。従って、本発明は最大３０個のアミノ酸残基から成
り免疫調節活性を示すペプチドであって、下記の一般構
造式（１）； X1-His-Gly-X2-His-Gly-Val-X3 （１） （式中、X1は存在しないか又は少なくとも1個のアミノ
酸残基を示し、X2はペプチド結合又は少なくとも1個の
アミノ酸残基を示し、X3は存在しないか又は少なくとも
1個のアミノ酸残基を示す）で表されるペプチド又はそ
の医薬上許容しうる塩若しくはエーテルに関する。
【０００８】本発明は昆虫、すなわちハエの一種である
カリフォラ・ビシナ R.-D. (Calliphora vicina R.-D.;
Diptera, Calliphoridae)の細菌感染させた幼虫の血液
から単離されたペプチドの代表的な要素であり、ここ
で"アロフェロン"と命名された新しい種類の免疫調節ペ
プチドを提供するものである。
カリフォラ・ビシナ R.-D. (Calliphora vicina R.-D.;
Diptera, Calliphoridae)の細菌感染させた幼虫の血液
から単離されたペプチドの代表的な要素であり、ここ
で"アロフェロン"と命名された新しい種類の免疫調節ペ
プチドを提供するものである。
【０００９】本発明のアロフェロンは動物（マウス）及
びヒトのナチュラルキラー細胞の細胞傷害性抗癌活性を
刺激することが見出されている。アロフェロンの免疫調
節活性に関する実験データから、前記アロフェロンがか
なり低い濃度でヒト及びマウスのリンパ球の細胞傷害性
抗癌活性を刺激することができるということが示されて
いる。最少有効濃度は約0.0005 ng/mlと測定されてい
る。最適濃度は0.05-0.5ng/mlであることが見出され
た。先天免疫の奏効体メカニズムとしての天然細胞傷害
性の重要な役割(Trinchieri G., Advances in Immunolo
gy, 1989, vol. 47,187-375; Brittenden J., Heys S.
D., Ross J. and Eremin O., 1996, vol. 77, 1126-124
3)を考えると、アロフェロンは免疫調節方式で作用する
抗ウイルス、抗微生物及び抗癌薬剤として有用と考えら
れる。
びヒトのナチュラルキラー細胞の細胞傷害性抗癌活性を
刺激することが見出されている。アロフェロンの免疫調
節活性に関する実験データから、前記アロフェロンがか
なり低い濃度でヒト及びマウスのリンパ球の細胞傷害性
抗癌活性を刺激することができるということが示されて
いる。最少有効濃度は約0.0005 ng/mlと測定されてい
る。最適濃度は0.05-0.5ng/mlであることが見出され
た。先天免疫の奏効体メカニズムとしての天然細胞傷害
性の重要な役割(Trinchieri G., Advances in Immunolo
gy, 1989, vol. 47,187-375; Brittenden J., Heys S.
D., Ross J. and Eremin O., 1996, vol. 77, 1126-124
3)を考えると、アロフェロンは免疫調節方式で作用する
抗ウイルス、抗微生物及び抗癌薬剤として有用と考えら
れる。
【００１０】さらに、細胞傷害性リンパ球の抗癌活性刺
激に関して、アロフェロンは実験動物において強くて持
続的なインターフェロン合成を誘導することが見出され
た。インターフェロンはウイルス感染及び何らかの他の
外部刺激に反応して生体内で生成される重要な抗ウイル
ス性（アルファ及びベータ・インターフェロン）及び免
疫調節性（ガンマ・インターフェロン）サイトカインの
一群である。血中インターフェロン濃度の上昇は広い範
囲のウイルス性、腫瘍性及び自己免疫性障害を治療又は
緩和させるのに役立つ。組換え又は天然インターフェロ
ンの注射はC型肝炎(Bekkering et al., J. Hepatholog
y, 1998, 28, 6, p.960-964), ヘルペス(Cardamakis et
al., Gynecol. Obstet. Invest., 1998, 46, 1, p.54-
57), 多発性骨髄腫(Zee et al., J. Clin. Oncol., 199
8, 16, 8, p.2834-2839), ホジキン病(Aviles et al.,
Leuk. Lymphoma, 1998, 30, 5-6, p.651-656), 骨髄性
白血病(Gilbert H.S., Cancer, 1998, 83, 6, p.1205-1
3), 多発性硬化症(Durelli et al., Mult. Scler, 199
5, 1, suppl.1, p.32-37), アトピー性皮膚炎(Schneide
r et al., Ann. Allergy Asthma Immunol., 1998, 80,
3, p.263-268), 真菌感染症(Kullberg, Eur. J. Clin.
Microbiol. Infect. Dis., 1997, 16, p.51-55)などの
免疫療法に使用されて好結果が得られている。さらに、
外生インターフェロン、すなわちフェニルピリミヂノン
アナログであるブロピリミンのような内生インターフェ
ロン合成誘導物質を使用しても同様の治療結果が得られ
ると考えられている(Akaza et al., Eur. Urol., 1998,
34, p.107-110)。
激に関して、アロフェロンは実験動物において強くて持
続的なインターフェロン合成を誘導することが見出され
た。インターフェロンはウイルス感染及び何らかの他の
外部刺激に反応して生体内で生成される重要な抗ウイル
ス性（アルファ及びベータ・インターフェロン）及び免
疫調節性（ガンマ・インターフェロン）サイトカインの
一群である。血中インターフェロン濃度の上昇は広い範
囲のウイルス性、腫瘍性及び自己免疫性障害を治療又は
緩和させるのに役立つ。組換え又は天然インターフェロ
ンの注射はC型肝炎(Bekkering et al., J. Hepatholog
y, 1998, 28, 6, p.960-964), ヘルペス(Cardamakis et
al., Gynecol. Obstet. Invest., 1998, 46, 1, p.54-
57), 多発性骨髄腫(Zee et al., J. Clin. Oncol., 199
8, 16, 8, p.2834-2839), ホジキン病(Aviles et al.,
Leuk. Lymphoma, 1998, 30, 5-6, p.651-656), 骨髄性
白血病(Gilbert H.S., Cancer, 1998, 83, 6, p.1205-1
3), 多発性硬化症(Durelli et al., Mult. Scler, 199
5, 1, suppl.1, p.32-37), アトピー性皮膚炎(Schneide
r et al., Ann. Allergy Asthma Immunol., 1998, 80,
3, p.263-268), 真菌感染症(Kullberg, Eur. J. Clin.
Microbiol. Infect. Dis., 1997, 16, p.51-55)などの
免疫療法に使用されて好結果が得られている。さらに、
外生インターフェロン、すなわちフェニルピリミヂノン
アナログであるブロピリミンのような内生インターフェ
ロン合成誘導物質を使用しても同様の治療結果が得られ
ると考えられている(Akaza et al., Eur. Urol., 1998,
34, p.107-110)。
【００１１】実験データから、アロフェロンはインター
フェロン合成を効果的に誘導して、インターフェロンと
類似な様式で、ある種の免疫反応（ナチュラルキラー活
性）を刺激することが示されている。そのため、アロフ
ェロンはインターフェロン及びインターフェロン誘導物
質と比べてインターフェロン感受性のウイルス疾患及び
癌疾患の治療を含む同様の治療的用途を有するがこれら
に限定されないと考えられる。このような仮説はウイル
スに感染させたマウスの実験から直接確認できる。ヒト
インフルエンザウイルスA及びBの致死量を肺に感染させ
たマウスではアロフェロン投与が生存率を顕著に増大さ
せることが示されている。
フェロン合成を効果的に誘導して、インターフェロンと
類似な様式で、ある種の免疫反応（ナチュラルキラー活
性）を刺激することが示されている。そのため、アロフ
ェロンはインターフェロン及びインターフェロン誘導物
質と比べてインターフェロン感受性のウイルス疾患及び
癌疾患の治療を含む同様の治療的用途を有するがこれら
に限定されないと考えられる。このような仮説はウイル
スに感染させたマウスの実験から直接確認できる。ヒト
インフルエンザウイルスA及びBの致死量を肺に感染させ
たマウスではアロフェロン投与が生存率を顕著に増大さ
せることが示されている。
【００１２】アロフェロンの化学的構造は、医学的に重
要な他の物質だけでなくインターフェロン、他の公知の
サイトカイン及びインターフェロン誘導物質に対しても
類似性を持たない。アロフェロンの化学的構造及び生物
学的活性の様式は、欧州特許公開第0 320 528 A1号に開
示されているカリフォラ(Calliphora)から単離されて免
疫活性及び抗腫瘍活性が示されたアリルフォリン(arylp
horin)とも全く異なっている。アロフェロンは、好まし
くは1200 Daに近い分子量を有し、これまでに記述され
ていない独特なペプチド群に属するものである。カリフ
ォラからのアリルフォリンは約500,000 Daの分子量を有
し(Naumann U. and Scheller K. Biochem. Biophys. Re
s. Communications, 1991, 177, p.963-971)、欧州特許
公開第0320 528 A1号に開示されているように抗体依存
性T−リンパ球の抗腫瘍活性の特異的ワクチン化及び特
異的刺激の過程におけるアジュバントとしての使用が提
唱されている。これまでのところナチュラルキラー細胞
活性及びインターフェロン合成に対するアリルフォリン
の効果の可能性に関するデータは得られていない。
要な他の物質だけでなくインターフェロン、他の公知の
サイトカイン及びインターフェロン誘導物質に対しても
類似性を持たない。アロフェロンの化学的構造及び生物
学的活性の様式は、欧州特許公開第0 320 528 A1号に開
示されているカリフォラ(Calliphora)から単離されて免
疫活性及び抗腫瘍活性が示されたアリルフォリン(arylp
horin)とも全く異なっている。アロフェロンは、好まし
くは1200 Daに近い分子量を有し、これまでに記述され
ていない独特なペプチド群に属するものである。カリフ
ォラからのアリルフォリンは約500,000 Daの分子量を有
し(Naumann U. and Scheller K. Biochem. Biophys. Re
s. Communications, 1991, 177, p.963-971)、欧州特許
公開第0320 528 A1号に開示されているように抗体依存
性T−リンパ球の抗腫瘍活性の特異的ワクチン化及び特
異的刺激の過程におけるアジュバントとしての使用が提
唱されている。これまでのところナチュラルキラー細胞
活性及びインターフェロン合成に対するアリルフォリン
の効果の可能性に関するデータは得られていない。
【００１３】アロフェロンは以下のような一般式により
表される独特なアミノ酸配列を有する線形ペプチドであ
る： X1-His-Gly-X2-His-Gly-Val-X3 （式中、X1は存在しないか又は少なくとも1個のアミノ
酸残基を示し、X2はペプチド結合又は少なくとも1個の
アミノ酸残基を示し、X3は存在しないか又は少なくとも
1個のアミノ酸残基を示す）。本発明のアロフェロンは
最大30個、好ましくは最大20個、最も好ましくは5〜13
個のアミノ酸残基を有する。本発明のアロフェロンの例
を表1に要約する。
表される独特なアミノ酸配列を有する線形ペプチドであ
る： X1-His-Gly-X2-His-Gly-Val-X3 （式中、X1は存在しないか又は少なくとも1個のアミノ
酸残基を示し、X2はペプチド結合又は少なくとも1個の
アミノ酸残基を示し、X3は存在しないか又は少なくとも
1個のアミノ酸残基を示す）。本発明のアロフェロンは
最大30個、好ましくは最大20個、最も好ましくは5〜13
個のアミノ酸残基を有する。本発明のアロフェロンの例
を表1に要約する。
【００１４】
【表１】 アロフェロン１及び２は哺乳動物ナチュラルキラー細胞
の細胞傷害活性を刺激することができるサイトカイン様
物質を目的を持ってスクリーニングする過程で、昆虫、
すなわちカリフォラ・ビシナ(Calliphora vicina)の細
菌に感染させた血液から単離された天然ペプチドであ
る。アロフェロン３及び４は、天然の原型分子に可能な
生物学的に活性な修飾を決定するために化学的に合成さ
れたアロフェロン１のトランケイト形態である。
の細胞傷害活性を刺激することができるサイトカイン様
物質を目的を持ってスクリーニングする過程で、昆虫、
すなわちカリフォラ・ビシナ(Calliphora vicina)の細
菌に感染させた血液から単離された天然ペプチドであ
る。アロフェロン３及び４は、天然の原型分子に可能な
生物学的に活性な修飾を決定するために化学的に合成さ
れたアロフェロン１のトランケイト形態である。
【００１５】リンパ球の細胞傷害活性に対するアロフェ
ロン１〜４の効果の比較研究で、全てのアロフェロンが
生物活性を有する分子であることが証明された。実施例
５を参照のこと。これによりアロフェロン構造における
（機能的に重要な）保存的部分と変更可能な部分の区別
が可能となる。アロフェロン5〜20はアロフェロンの基
本構造の可変断片の好ましい変更を示すために表した例
である。
ロン１〜４の効果の比較研究で、全てのアロフェロンが
生物活性を有する分子であることが証明された。実施例
５を参照のこと。これによりアロフェロン構造における
（機能的に重要な）保存的部分と変更可能な部分の区別
が可能となる。アロフェロン5〜20はアロフェロンの基
本構造の可変断片の好ましい変更を示すために表した例
である。
【００１６】データーベースの探索からはアロフェロン
構造と密接な類似性を持つ天然物起源のペプチド又は生
物活性を有する合成ペプチドは明らかにされなかった。
従って、アロフェロンは新しい生物活性ペプチド群に属
すると考えられる。それにもかかわらず、アロフェロン
はある程度まではある種の機能的に重要なタンパク断片
と構造的な類似性を有する。例えば、アロフェロン１は
インフルエンザウイルスBヘマグルチニン前駆体の377−
387断片と63%の同一性を有する。ヘマグルチニンは宿主
の細胞膜との統合をつかさどるウイルス外被の重要な膜
親和性タンパクとして知られている。
構造と密接な類似性を持つ天然物起源のペプチド又は生
物活性を有する合成ペプチドは明らかにされなかった。
従って、アロフェロンは新しい生物活性ペプチド群に属
すると考えられる。それにもかかわらず、アロフェロン
はある程度まではある種の機能的に重要なタンパク断片
と構造的な類似性を有する。例えば、アロフェロン１は
インフルエンザウイルスBヘマグルチニン前駆体の377−
387断片と63%の同一性を有する。ヘマグルチニンは宿主
の細胞膜との統合をつかさどるウイルス外被の重要な膜
親和性タンパクとして知られている。
【００１７】アロフェロン１は本発明の開発過程におい
て原型分子として使用された。アロフェロン１は13個の
アミノ酸から成る1265 Daの分子量を有する線形ペプチ
ドである。表１を参照のこと。アロフェロン２〜４と比
較すると、NK細胞の細胞傷害性の刺激体としての有効性
及び他の活性において必要なアロフェロン構造の機能的
に重要な要素を決定することができ、このペプチドの生
物学的活性を変化させない構造的変更が予測できる。
て原型分子として使用された。アロフェロン１は13個の
アミノ酸から成る1265 Daの分子量を有する線形ペプチ
ドである。表１を参照のこと。アロフェロン２〜４と比
較すると、NK細胞の細胞傷害性の刺激体としての有効性
及び他の活性において必要なアロフェロン構造の機能的
に重要な要素を決定することができ、このペプチドの生
物学的活性を変化させない構造的変更が予測できる。
【００１８】アロフェロン１をアロフェロン２〜４の構
造と比較すると、全てのペプチドがNK細胞の細胞傷害試
験で同様の活性を示したことから、Ser-Gly-His-Gly-Gl
n-His-Gly-Val断片が存在すれば生物学的活性を維持す
るのに充分であることが示されている。従って、この断
片又は断片の一部がアロフェロン配列において核となる
保存的構造を表している。アロフェロン１の分子の1〜3
位は除去するか、又は1個以上の他のアミノ酸に代替す
ることができる。
造と比較すると、全てのペプチドがNK細胞の細胞傷害試
験で同様の活性を示したことから、Ser-Gly-His-Gly-Gl
n-His-Gly-Val断片が存在すれば生物学的活性を維持す
るのに充分であることが示されている。従って、この断
片又は断片の一部がアロフェロン配列において核となる
保存的構造を表している。アロフェロン１の分子の1〜3
位は除去するか、又は1個以上の他のアミノ酸に代替す
ることができる。
【００１９】さらに、インフルエンザウイルスのヘマグ
ルチニンの類似断片と比較してみると、アロフェロン１
配列においてセリン(Ser)とグリシン(Gly)のアミノ酸が
占めている4位及び5位は好ましくは脂肪族、芳香族又は
複素環式アミノ酸の群から選択される他のアミノ酸に置
き換えることができることが分かる。例えば、セリンは
スレオニン(Thr)で置き換えることができ、グリシンは
セリンで置き換えることができる。
ルチニンの類似断片と比較してみると、アロフェロン１
配列においてセリン(Ser)とグリシン(Gly)のアミノ酸が
占めている4位及び5位は好ましくは脂肪族、芳香族又は
複素環式アミノ酸の群から選択される他のアミノ酸に置
き換えることができることが分かる。例えば、セリンは
スレオニン(Thr)で置き換えることができ、グリシンは
セリンで置き換えることができる。
【００２０】このように、得られているデータからアロ
フェロン１配列の初めの５個のアミノ酸は存在しないか
又は少なくとも1個のアミノ酸を含んでいてもよい可変
断片であることが分かる。従って、この断片をアロフェ
ロンの構造式（１）においてX1と記す。望ましくは、X1
は存在しないか、His-Gly-Val-Ser-Gly-、Gly-Val-Ser-
Gly-、Val-Ser-Gly-、Ser-Gly-、Pro-Ser-Leu-Thr-Gly
-、Phe-Ile-Val-Ser-Ala-、Thr-、Leu-Ala-Ser-Leu-、C
ys-Val-Val-Thr-Gly-、Ile-Ser-Gly-、Cys-Gly-、Ile-V
al-Ala-Arg-Ile-、Phe-Gly-、His-Gly-Asp-Ser-Gly-、S
er-Gly-及びTyr-Ala-Met-Ser-Gly-から成る群から選択
される。
フェロン１配列の初めの５個のアミノ酸は存在しないか
又は少なくとも1個のアミノ酸を含んでいてもよい可変
断片であることが分かる。従って、この断片をアロフェ
ロンの構造式（１）においてX1と記す。望ましくは、X1
は存在しないか、His-Gly-Val-Ser-Gly-、Gly-Val-Ser-
Gly-、Val-Ser-Gly-、Ser-Gly-、Pro-Ser-Leu-Thr-Gly
-、Phe-Ile-Val-Ser-Ala-、Thr-、Leu-Ala-Ser-Leu-、C
ys-Val-Val-Thr-Gly-、Ile-Ser-Gly-、Cys-Gly-、Ile-V
al-Ala-Arg-Ile-、Phe-Gly-、His-Gly-Asp-Ser-Gly-、S
er-Gly-及びTyr-Ala-Met-Ser-Gly-から成る群から選択
される。
【００２１】同様に、アロフェロン１の14〜15位は除去
するか、又は1個以上のアミノ酸による配列で置き換え
ることができる。従って、この断片はアロフェロン構造
式（１）においてX3と記す。望ましくは、X3は存在しな
いか、-His-Gly、-His、 -Tyr-Asp、-Phe-Val、-Pro、-
Gln-His-Gly、-Leu-Ala、-Asp、-Pro-Leu、-Met 及び-P
he-Ileから成る群から選択される。
するか、又は1個以上のアミノ酸による配列で置き換え
ることができる。従って、この断片はアロフェロン構造
式（１）においてX3と記す。望ましくは、X3は存在しな
いか、-His-Gly、-His、 -Tyr-Asp、-Phe-Val、-Pro、-
Gln-His-Gly、-Leu-Ala、-Asp、-Pro-Leu、-Met 及び-P
he-Ileから成る群から選択される。
【００２２】さらに、アロフェロン及びそれと類似なヘ
マグルチニン断片を比較すると、アロフェロン分子中で
はグルタミンである9位も変更可能であり、グルタミン
を例えばアラニンのような他のアミノ酸に置き換えるこ
とができることがわかる。そこで、アロフェロン構造式
（１）の９位はX2と記されるが、これはGlyとHisを連結
するペプチド結合であるか又は少なくとも1個以上のア
ミノ酸、好ましくは0〜3個のアミノ酸、さらに好ましく
は0〜2個のアミノ酸、最も好ましくは1個のアミノ酸、
特に-Gln-でもよい。
マグルチニン断片を比較すると、アロフェロン分子中で
はグルタミンである9位も変更可能であり、グルタミン
を例えばアラニンのような他のアミノ酸に置き換えるこ
とができることがわかる。そこで、アロフェロン構造式
（１）の９位はX2と記されるが、これはGlyとHisを連結
するペプチド結合であるか又は少なくとも1個以上のア
ミノ酸、好ましくは0〜3個のアミノ酸、さらに好ましく
は0〜2個のアミノ酸、最も好ましくは1個のアミノ酸、
特に-Gln-でもよい。
【００２３】望ましくは、X2はペプチド結合であるか、
-Gln-、-Phe-、-Asp-、-Ser-、-Asn-、 -Ala-、-Gln-As
n-、-Ala-Val- 及び-Ser-Asp-Glyから成る群から選択さ
れる。
-Gln-、-Phe-、-Asp-、-Ser-、-Asn-、 -Ala-、-Gln-As
n-、-Ala-Val- 及び-Ser-Asp-Glyから成る群から選択さ
れる。
【００２４】アロフェロンの生物学的活性を有意に変化
させることなく、キャリアタンパクのようなより大きい
分子中にアロフェロン配列を挿入することも可能であ
る。そこで、本発明はまた、上記一般式（１）を有する
アミノ酸配列を含むペプチド又はタンパクのような化合
物に関するものであるが、このペプチド又はタンパクは
自然界に存在するものではなく、特にインフルエンザウ
イルスBの前駆体ではない。
させることなく、キャリアタンパクのようなより大きい
分子中にアロフェロン配列を挿入することも可能であ
る。そこで、本発明はまた、上記一般式（１）を有する
アミノ酸配列を含むペプチド又はタンパクのような化合
物に関するものであるが、このペプチド又はタンパクは
自然界に存在するものではなく、特にインフルエンザウ
イルスBの前駆体ではない。
【００２５】下記実施例に要約される免疫学的、薬学的
及び毒性学的複合試験から、アロフェロンの有用な性質
の範囲が示されている。得られたデータからアロフェロ
ンが新規のサイトカイン様ペプチドであることが示され
ている。アロフェロンの作用様式にはインターフェロン
合成の誘導の他に、細胞傷害性リンパ球による細胞の非
自己又は非正常自己認識及び溶解を刺激することが含ま
れる。従って、アロフェロンはインターフェロン生成不
全及びナチュラルキラー細胞の活性不全を矯正し、当該
不全によるウイルス性、腫瘍性及びその他の疾患を治療
するための免疫調節医薬品として有用である。アロフェ
ロンは事実上毒性がなく、先進的前臨床研究から示され
ているように、催奇形性、胎児毒性又は突然変異原性を
有していない。アロフェロン１の実験的に立証された性
質を表2に要約する。
及び毒性学的複合試験から、アロフェロンの有用な性質
の範囲が示されている。得られたデータからアロフェロ
ンが新規のサイトカイン様ペプチドであることが示され
ている。アロフェロンの作用様式にはインターフェロン
合成の誘導の他に、細胞傷害性リンパ球による細胞の非
自己又は非正常自己認識及び溶解を刺激することが含ま
れる。従って、アロフェロンはインターフェロン生成不
全及びナチュラルキラー細胞の活性不全を矯正し、当該
不全によるウイルス性、腫瘍性及びその他の疾患を治療
するための免疫調節医薬品として有用である。アロフェ
ロンは事実上毒性がなく、先進的前臨床研究から示され
ているように、催奇形性、胎児毒性又は突然変異原性を
有していない。アロフェロン１の実験的に立証された性
質を表2に要約する。
【００２６】
【表２】
【００２７】一般に、薬学的活性スペクトルはナチュラ
ルキラー細胞の細胞傷害活性及び抗ウイルス剤耐性に対
する影響に関するインターフェロン−アルファの公知の
性質と一致する。このような観点から、アロフェロンは
インターフェロン−アルファの機能的アナログとして特
徴づけることができる。アロフェロンの作用様式は、in
vitroでのNK細胞の細胞傷害活性に対する刺激に関して
は、非常に低い濃度、すなわち約1ピコグラム/ml(10-9
g/ml)で観察される。このような観点から、アロフェロ
ンはインターフェロンやインターロイキンなどの内生サ
イトカイン類と同等又はより優れた活性を有している。
ルキラー細胞の細胞傷害活性及び抗ウイルス剤耐性に対
する影響に関するインターフェロン−アルファの公知の
性質と一致する。このような観点から、アロフェロンは
インターフェロン−アルファの機能的アナログとして特
徴づけることができる。アロフェロンの作用様式は、in
vitroでのNK細胞の細胞傷害活性に対する刺激に関して
は、非常に低い濃度、すなわち約1ピコグラム/ml(10-9
g/ml)で観察される。このような観点から、アロフェロ
ンはインターフェロンやインターロイキンなどの内生サ
イトカイン類と同等又はより優れた活性を有している。
【００２８】さらに、アロフェロンは単独で又はインタ
ーロイキン12と協同でインターフェロン−ガンマを含む
内性インターフェロンの合成を誘導することができる。
従って、アロフェロンはインターフェロン誘導物質群に
属すると言える。アロフェロンのin vivo活性の前臨床
研究から、アロフェロンはヒトインフルエンザウイルス
に感染したマウスモデルを用いた試験で強力な抗ウイル
ス活性を有することが示された。このモデルでは、ヒト
インフルエンザウイルス懸濁液を野生型のオスに鼻腔内
投与して感染させ、アロフェロン１を感染一日前及び感
染後１、２、４、6及び８日目に腹腔内投与した。アロ
フェロンはマウスの肺損傷及び死亡を効果的に防止し
た。これにより、アロフェロンはウイルス感染を治療又
は予防するための医薬用製剤の製造に有用であると言え
る。in vivo及びin vitroの研究過程でアロフェロン１
の急性及び慢性毒性はどちらも見られなかった。
ーロイキン12と協同でインターフェロン−ガンマを含む
内性インターフェロンの合成を誘導することができる。
従って、アロフェロンはインターフェロン誘導物質群に
属すると言える。アロフェロンのin vivo活性の前臨床
研究から、アロフェロンはヒトインフルエンザウイルス
に感染したマウスモデルを用いた試験で強力な抗ウイル
ス活性を有することが示された。このモデルでは、ヒト
インフルエンザウイルス懸濁液を野生型のオスに鼻腔内
投与して感染させ、アロフェロン１を感染一日前及び感
染後１、２、４、6及び８日目に腹腔内投与した。アロ
フェロンはマウスの肺損傷及び死亡を効果的に防止し
た。これにより、アロフェロンはウイルス感染を治療又
は予防するための医薬用製剤の製造に有用であると言え
る。in vivo及びin vitroの研究過程でアロフェロン１
の急性及び慢性毒性はどちらも見られなかった。
【００２９】本発明の医薬用製剤が賦形剤又は担体のよ
うな通常の添加物も含んでいてよいことは言うまでもな
い。本製剤は鼻腔内；経口又は直腸内のような腸内；及
び腹腔内、筋肉内、静脈内又は経皮のような非経口の経
路により患者に投与することができる。本製剤は鼻腔内
滴下溶液、スプレー剤、リポソーム剤、カプセル剤、錠
剤及び座薬のような投与形態で投与できる。非経口用と
しては、医薬上の活性を有する成分を好ましくは注射可
能な溶液の形態にする。
うな通常の添加物も含んでいてよいことは言うまでもな
い。本製剤は鼻腔内；経口又は直腸内のような腸内；及
び腹腔内、筋肉内、静脈内又は経皮のような非経口の経
路により患者に投与することができる。本製剤は鼻腔内
滴下溶液、スプレー剤、リポソーム剤、カプセル剤、錠
剤及び座薬のような投与形態で投与できる。非経口用と
しては、医薬上の活性を有する成分を好ましくは注射可
能な溶液の形態にする。
【００３０】このように、アロフェロンはインターフェ
ロン系及びナチュラル細胞が媒介する細胞傷害を含む先
天免疫の改善が治療上の重要性を持ちうる多様な感染性
又は腫瘍性疾患の治療又は予防に有用である。アロフェ
ロン適用が有望な状態の例としては、インフルエンザウ
イルス及び他の呼吸器系ウイルスによる感染症、ウイル
ス性肝炎、AIDS並びにAIDS関連の2次感染症及び腫瘍状
態、急性及び慢性の白血病並びにインターフェロン治療
の有効性が証明されているその他の癌、インターフェロ
ン治療に感受性を有する全身性真菌感染症などが挙げら
れる。
ロン系及びナチュラル細胞が媒介する細胞傷害を含む先
天免疫の改善が治療上の重要性を持ちうる多様な感染性
又は腫瘍性疾患の治療又は予防に有用である。アロフェ
ロン適用が有望な状態の例としては、インフルエンザウ
イルス及び他の呼吸器系ウイルスによる感染症、ウイル
ス性肝炎、AIDS並びにAIDS関連の2次感染症及び腫瘍状
態、急性及び慢性の白血病並びにインターフェロン治療
の有効性が証明されているその他の癌、インターフェロ
ン治療に感受性を有する全身性真菌感染症などが挙げら
れる。
【００３１】生物学的活性のある種の類似性（NK細胞の
細胞傷害活性の刺激、間接的抗ウイルス活性）にもかか
わらず、アロフェロンは構造及び作用様式の点ではイン
ターフェロンとは非常に異なっている。すなわち、イン
ターフェロンは17000〜80000ダルトンの範囲の分子量を
有する糖タンパクである。その組織及び種の特異性だけ
でなくアミノ酸鎖のグリコシル化はインターフェロンの
機能的活性に必須の条件である。アロフェロンは好まし
くは1265 Daの分子量を有する好ましくはグリコシル化
されていないオリゴペプチドであり、その分子量はイン
ターフェロンの分子量の13分の1ないし60分の1と小さ
い。アロフェロンのアミノ酸配列はインターフェロンの
配列のいずれの断片とも類似性がない。また、機能的側
面においてもアロフェロンとインターフェロンの間には
本質的な違いがある。すなわち、アロフェロンは内生的
インターフェロンの生成を誘導してインターフェロンに
より媒介される防御反応連鎖を促進する。外生インター
フェロンの使用は、マイナスのフィードバックメカニズ
ムにより内生インターフェロンの合成をむしろ抑制する
と考えられる。
細胞傷害活性の刺激、間接的抗ウイルス活性）にもかか
わらず、アロフェロンは構造及び作用様式の点ではイン
ターフェロンとは非常に異なっている。すなわち、イン
ターフェロンは17000〜80000ダルトンの範囲の分子量を
有する糖タンパクである。その組織及び種の特異性だけ
でなくアミノ酸鎖のグリコシル化はインターフェロンの
機能的活性に必須の条件である。アロフェロンは好まし
くは1265 Daの分子量を有する好ましくはグリコシル化
されていないオリゴペプチドであり、その分子量はイン
ターフェロンの分子量の13分の1ないし60分の1と小さ
い。アロフェロンのアミノ酸配列はインターフェロンの
配列のいずれの断片とも類似性がない。また、機能的側
面においてもアロフェロンとインターフェロンの間には
本質的な違いがある。すなわち、アロフェロンは内生的
インターフェロンの生成を誘導してインターフェロンに
より媒介される防御反応連鎖を促進する。外生インター
フェロンの使用は、マイナスのフィードバックメカニズ
ムにより内生インターフェロンの合成をむしろ抑制する
と考えられる。
【００３２】本発明のペプチドは天然原料から単離する
か又は公知の方法により合成することができる。本発明
のペプチドはまた組換えDNA技術により製造することも
できる。このように本発明は、例えば本発明のいずれか
のペプチドを含むペプチド配列をコードするcDNAのよう
なDNA配列を含む適当なベクターで予め形質転換した宿
主細胞を培養すること−但し、この場合、当該DNA配列
はプロモーター調節下に置かれ、当該ペプチド配列のDN
A配列が正しく発現されるように宿主細胞の機構により
認識される終止信号が当該DNA配列の後ろに続く−及び
細胞培養物中の発現産物から探索されたペプチドを回収
することを含む。望ましい宿主細胞は、ラクトバシラス
(Lactobacillus)株、大腸菌、アグロバクテリウム(Agro
bacterium)又はバシラス(Bacillus)株に属する。或い
は、本ペプチドは周知の化学的合成法により容易に製造
することもできる。
か又は公知の方法により合成することができる。本発明
のペプチドはまた組換えDNA技術により製造することも
できる。このように本発明は、例えば本発明のいずれか
のペプチドを含むペプチド配列をコードするcDNAのよう
なDNA配列を含む適当なベクターで予め形質転換した宿
主細胞を培養すること−但し、この場合、当該DNA配列
はプロモーター調節下に置かれ、当該ペプチド配列のDN
A配列が正しく発現されるように宿主細胞の機構により
認識される終止信号が当該DNA配列の後ろに続く−及び
細胞培養物中の発現産物から探索されたペプチドを回収
することを含む。望ましい宿主細胞は、ラクトバシラス
(Lactobacillus)株、大腸菌、アグロバクテリウム(Agro
bacterium)又はバシラス(Bacillus)株に属する。或い
は、本ペプチドは周知の化学的合成法により容易に製造
することもできる。
【００３３】以下の実施例により、本発明をさらに説明
する。
する。
【００３４】
【実施例】実施例１ 昆虫の血液からのアロフェロンの単離、構造決定及び化
学的合成 アロフェロンは最初、免疫化された（細菌に感染させ
た）昆虫、すなわちハエの一種であるカリフォラ・ビシ
ナ(Calliphora vicina)の血液中に発見された。先に記
述されている実験室条件下で維持されたカリフォラ・ビ
シナの幼虫に摂食後(Chernysh S.I., Simonenko N.P.,
Numata H. Appl. Entomol. Zool., 1995, Vol.30, No.
3, p.498-499)、加熱殺生した大腸菌(Escherichia col
i)及びマイクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteu
s)細胞の懸濁液に浸した針で小皮を刺すことによって細
菌に感染させた。傷付いた敗血症状態の幼虫の血リンパ
を採取し、遠心分離してSep-Pak C18クロマトグラフィ
ーカラム(Waters Co.)にのせた。このカラムを0.05%ト
リフルオロ酢酸で洗浄した。その後、標的となる物質を
0.05%トリフルオロ酢酸で酸性化させた50%アセトニトリ
ルで溶出させた。溶出した組成物を凍結乾燥して、活性
素因の段階的クロマトグラフィー精製に使用した。精製
工程中に、細胞傷害性細胞としてマウス脾臓リンパ球を
用い、標的としてH3ウリジンでラベルしたK562癌細胞を
用いて、各分画の生物学的活性をモニターした。
学的合成 アロフェロンは最初、免疫化された（細菌に感染させ
た）昆虫、すなわちハエの一種であるカリフォラ・ビシ
ナ(Calliphora vicina)の血液中に発見された。先に記
述されている実験室条件下で維持されたカリフォラ・ビ
シナの幼虫に摂食後(Chernysh S.I., Simonenko N.P.,
Numata H. Appl. Entomol. Zool., 1995, Vol.30, No.
3, p.498-499)、加熱殺生した大腸菌(Escherichia col
i)及びマイクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteu
s)細胞の懸濁液に浸した針で小皮を刺すことによって細
菌に感染させた。傷付いた敗血症状態の幼虫の血リンパ
を採取し、遠心分離してSep-Pak C18クロマトグラフィ
ーカラム(Waters Co.)にのせた。このカラムを0.05%ト
リフルオロ酢酸で洗浄した。その後、標的となる物質を
0.05%トリフルオロ酢酸で酸性化させた50%アセトニトリ
ルで溶出させた。溶出した組成物を凍結乾燥して、活性
素因の段階的クロマトグラフィー精製に使用した。精製
工程中に、細胞傷害性細胞としてマウス脾臓リンパ球を
用い、標的としてH3ウリジンでラベルしたK562癌細胞を
用いて、各分画の生物学的活性をモニターした。
【００３５】精製工程の結果、強力な免疫調節活性を示
しアロフェロン１及び２と命名された2個の近種のオリ
ゴペプチドが最初の組成物から単離され化学的な特性分
析がなされた。これらのペプチドのアミノ酸配列はモデ
ル473Aシーケンサー(AppliedBiosystems)で自動エドマ
ン分解法を用いて決定された。アロフェロン１及び２の
構造は下記のように決定された： His-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gl
y(アロフェロン１) Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly(ア
ロフェロン２)
しアロフェロン１及び２と命名された2個の近種のオリ
ゴペプチドが最初の組成物から単離され化学的な特性分
析がなされた。これらのペプチドのアミノ酸配列はモデ
ル473Aシーケンサー(AppliedBiosystems)で自動エドマ
ン分解法を用いて決定された。アロフェロン１及び２の
構造は下記のように決定された： His-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gl
y(アロフェロン１) Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly(ア
ロフェロン２)
【００３６】上記ペプチドをさらにブルカー(Bremen)BI
FLEXマトリックス補助レーザー脱着タイムオブフライト
質量分析計により分析し、分子量が1265 Da(アロフェロ
ン１)及び1126 Da(アロフェロン２)と実験的に決定され
た。アミノ酸配列データから推定されたアロフェロン１
及び２の分子量と質量分析計により決定された分子量は
良好に一致しており、このことはアロフェロン１及び２
が翻訳後修飾を経ていない線形ペプチドであることを立
証している。
FLEXマトリックス補助レーザー脱着タイムオブフライト
質量分析計により分析し、分子量が1265 Da(アロフェロ
ン１)及び1126 Da(アロフェロン２)と実験的に決定され
た。アミノ酸配列データから推定されたアロフェロン１
及び２の分子量と質量分析計により決定された分子量は
良好に一致しており、このことはアロフェロン１及び２
が翻訳後修飾を経ていない線形ペプチドであることを立
証している。
【００３７】アロフェロン１を生物学的研究及び前臨床
研究のための原形分子として選択した。後の実験に十分
な量のアロフェロン１を得るために、固相ペプチド合成
技術によりに化学的にアロフェロン１を合成した(Neima
rk J. and J.-P. Brian, Peptide Research, 1993, vo
l.6, p.219)。ペプチド精製プロトコールは二つの主要
な工程を含む。第一の工程はC18吸着剤(Waters)を付着
させたSep-Pak Vacカラムを用い、0.05%トリフルオロ酢
酸で酸性化させた40%アセトニトリルでカラム溶出して
行った。最終的に、Aquapore ODS Prep 10 C18 (100 x
10 mm, Brownlee)が装着されたBeckman Gold Systemク
ロマトグラフを使用して、0.05%トリフルオロ酢酸及び
酸性化させたアセトニトリルの線形濃度勾配(2.5 ml/mi
nの流速、40分間で0-20% アセトニトリル；検出波長は2
25 nm)により均質性が得られるまでペプチドを精製し
た。ペプチドの純度はMALDI-TOF質量分析計により確認
した。アミノ酸配列の正確さはマイクロシーケンンシン
グによって確認した。アロフェロン１について記載した
ものと同等の方法により、アロフェロン１のトランケイ
テッド形態であるアロフェロン３及び４が合成、精製及
び検査された。
研究のための原形分子として選択した。後の実験に十分
な量のアロフェロン１を得るために、固相ペプチド合成
技術によりに化学的にアロフェロン１を合成した(Neima
rk J. and J.-P. Brian, Peptide Research, 1993, vo
l.6, p.219)。ペプチド精製プロトコールは二つの主要
な工程を含む。第一の工程はC18吸着剤(Waters)を付着
させたSep-Pak Vacカラムを用い、0.05%トリフルオロ酢
酸で酸性化させた40%アセトニトリルでカラム溶出して
行った。最終的に、Aquapore ODS Prep 10 C18 (100 x
10 mm, Brownlee)が装着されたBeckman Gold Systemク
ロマトグラフを使用して、0.05%トリフルオロ酢酸及び
酸性化させたアセトニトリルの線形濃度勾配(2.5 ml/mi
nの流速、40分間で0-20% アセトニトリル；検出波長は2
25 nm)により均質性が得られるまでペプチドを精製し
た。ペプチドの純度はMALDI-TOF質量分析計により確認
した。アミノ酸配列の正確さはマイクロシーケンンシン
グによって確認した。アロフェロン１について記載した
ものと同等の方法により、アロフェロン１のトランケイ
テッド形態であるアロフェロン３及び４が合成、精製及
び検査された。
【００３８】実施例２ マウス脾臓リンパ球の細胞傷害に対するアロフェロン１
の効果 マウス脾臓リンパ球の細胞傷害活性に対するアロフェロ
ンの効果を分析するために、標準的な細胞傷害アッセイ
を用いた(Hashimoto J. and Sudo E., Gann, 1971, vo
l.62, 139-145; Filatova N.A., Malygin A.M., Goryun
ova L.B., Fel V.Ya. and Khavinson V.K., Tsitologi
a, 1990, vol.32, No.6, 652-658)。H3-ウリジンでラベ
ルしたK562ヒト白血病細胞を細胞傷害性リンパ球による
攻撃の標的として用いた。新鮮な脾臓リンパ球と標的細
胞を合わせて上記調製物の存在又は非存在下で18時間間
インキュベートした。その後、死亡した及び正常な標的
細胞の比率並びにそれに対応する細胞傷害指数を対照群
及び実験群において測定した。
の効果 マウス脾臓リンパ球の細胞傷害活性に対するアロフェロ
ンの効果を分析するために、標準的な細胞傷害アッセイ
を用いた(Hashimoto J. and Sudo E., Gann, 1971, vo
l.62, 139-145; Filatova N.A., Malygin A.M., Goryun
ova L.B., Fel V.Ya. and Khavinson V.K., Tsitologi
a, 1990, vol.32, No.6, 652-658)。H3-ウリジンでラベ
ルしたK562ヒト白血病細胞を細胞傷害性リンパ球による
攻撃の標的として用いた。新鮮な脾臓リンパ球と標的細
胞を合わせて上記調製物の存在又は非存在下で18時間間
インキュベートした。その後、死亡した及び正常な標的
細胞の比率並びにそれに対応する細胞傷害指数を対照群
及び実験群において測定した。
【００３９】合成アロフェロン１の刺激活性についての
典型的な結果を表３に示す。培地にアロフェロンを投与
すると広い濃度範囲(0.05-50 ng/ml)で、標的である腫
瘍細胞に対するナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性の
統計的に有意な増幅が誘導された。500 ng/mlの濃度で
は刺激効果を示さなかった。しかしながら、この場合で
も細胞傷害が対照レベル以下には抑制されることはなか
った。従って、最小有効濃度の1000倍過剰でもNK細胞の
細胞傷害活性に対して有害ではなかった。このようにア
ロフェロンは、NK細胞の活性化をつかさどるインターロ
イキン2又はインターフェロン−アルファのような特異
的サイトカインに特徴的な非常に低い濃度でマウス脾臓
リンパ球の細胞傷害活性を刺激する。同時に、アロフェ
ロンは有効濃度の10000倍過剰でも免疫抑制作用を示さ
なかった。
典型的な結果を表３に示す。培地にアロフェロンを投与
すると広い濃度範囲(0.05-50 ng/ml)で、標的である腫
瘍細胞に対するナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性の
統計的に有意な増幅が誘導された。500 ng/mlの濃度で
は刺激効果を示さなかった。しかしながら、この場合で
も細胞傷害が対照レベル以下には抑制されることはなか
った。従って、最小有効濃度の1000倍過剰でもNK細胞の
細胞傷害活性に対して有害ではなかった。このようにア
ロフェロンは、NK細胞の活性化をつかさどるインターロ
イキン2又はインターフェロン−アルファのような特異
的サイトカインに特徴的な非常に低い濃度でマウス脾臓
リンパ球の細胞傷害活性を刺激する。同時に、アロフェ
ロンは有効濃度の10000倍過剰でも免疫抑制作用を示さ
なかった。
【００４０】
【表３】
【００４１】実施例３ ヒト末梢血液リンパ球の細胞傷害活性に対するアロフェ
ロン１の効果 細胞傷害指数の測定を実施例２に記述したように行っ
た。ヒト末梢血液リンパ球をドナーの新鮮な血液から分
離し、ヒストパック1077溶液(Sigma)を用いた遠心分離
により赤血球を除去した。遠心分離後、リンパ球をリン
酸緩衝液に再懸濁し、遠心分離後、RNaseを加えたRPMI
1640培地に再懸濁した。このリンパ球を2×105細胞/ml
の濃度に希釈し、直ちに細胞傷害の分析に使用した。NK
細胞の細胞傷害の天然刺激剤であるインターフェロン−
アルファ2b(Intron, Shering-Plough)を陽性対照として
用いた。
ロン１の効果 細胞傷害指数の測定を実施例２に記述したように行っ
た。ヒト末梢血液リンパ球をドナーの新鮮な血液から分
離し、ヒストパック1077溶液(Sigma)を用いた遠心分離
により赤血球を除去した。遠心分離後、リンパ球をリン
酸緩衝液に再懸濁し、遠心分離後、RNaseを加えたRPMI
1640培地に再懸濁した。このリンパ球を2×105細胞/ml
の濃度に希釈し、直ちに細胞傷害の分析に使用した。NK
細胞の細胞傷害の天然刺激剤であるインターフェロン−
アルファ2b(Intron, Shering-Plough)を陽性対照として
用いた。
【００４２】上記調製物を培地に加えた場合0.0005 ng/
mlの濃度からK562癌細胞に対するPBLの細胞傷害が有意
に増加したが、刺激活性は約0.05 ng/mlの濃度でプラト
ーに達した（表４）。5 ng/mlの濃度で投与されたイン
ターフェロン−アルファ2bは0.05-0.5 ng/mlの最適濃度
範囲で投与されたアロフェロンと比較すると効果が低か
った。これらの実験データは腫瘍細胞を溶解に導く末梢
血液リンパ球のin vitro細胞傷害活性に対するアロフェ
ロンの強力な刺激効果を証明している。
mlの濃度からK562癌細胞に対するPBLの細胞傷害が有意
に増加したが、刺激活性は約0.05 ng/mlの濃度でプラト
ーに達した（表４）。5 ng/mlの濃度で投与されたイン
ターフェロン−アルファ2bは0.05-0.5 ng/mlの最適濃度
範囲で投与されたアロフェロンと比較すると効果が低か
った。これらの実験データは腫瘍細胞を溶解に導く末梢
血液リンパ球のin vitro細胞傷害活性に対するアロフェ
ロンの強力な刺激効果を証明している。
【００４３】
【表４】
【００４４】実施例４ 健康なドナー集団におけるリンパ球の細胞傷害活性に対
する刺激に関するアロフェロン１及びインターフェロン
−アルファ2bの有効性の変動の比較研究 アロフェロン及びインターフェロン−アルファ2bの刺激
に対するリンパ球の反応の多様性及び相互関係を評価す
るために、17人の健康なドナーから無作為にサンプリン
グしてPBLの細胞傷害活性をモニターした。細胞傷害活
性は実施例２及び３に記述したように評価した。この研
究では二種類の標的細胞：すなわち、赤骨髄性白血病細
胞に由来するK562細胞株及び固形結腸直腸腫瘍に由来す
るA431細胞株を同時に使用した。この試験でリンパ球と
標的細胞の比率(E/T比)は20:1であった。
する刺激に関するアロフェロン１及びインターフェロン
−アルファ2bの有効性の変動の比較研究 アロフェロン及びインターフェロン−アルファ2bの刺激
に対するリンパ球の反応の多様性及び相互関係を評価す
るために、17人の健康なドナーから無作為にサンプリン
グしてPBLの細胞傷害活性をモニターした。細胞傷害活
性は実施例２及び３に記述したように評価した。この研
究では二種類の標的細胞：すなわち、赤骨髄性白血病細
胞に由来するK562細胞株及び固形結腸直腸腫瘍に由来す
るA431細胞株を同時に使用した。この試験でリンパ球と
標的細胞の比率(E/T比)は20:1であった。
【００４５】得られたデータを表５に要約する。表中の
各数値は６回の細胞傷害測定の結果を含むものである。
このデータは対照群においてリンパ球の細胞傷害活性の
大きなばらつきを示し、特に異なる起源の標的細胞を認
識して排除する能力における違いを示している。上記調
製物の投与に対する反応も異なる。それにも関わらず、
アロフェロンとインターフェロン投与に対する反応では
明確な相互関係が大部分のドナーで見られた：ほとんど
のケースでインターフェロンに陽性に反応するドナーは
アロフェロンにも陽性に反応し、逆も同様である。
各数値は６回の細胞傷害測定の結果を含むものである。
このデータは対照群においてリンパ球の細胞傷害活性の
大きなばらつきを示し、特に異なる起源の標的細胞を認
識して排除する能力における違いを示している。上記調
製物の投与に対する反応も異なる。それにも関わらず、
アロフェロンとインターフェロン投与に対する反応では
明確な相互関係が大部分のドナーで見られた：ほとんど
のケースでインターフェロンに陽性に反応するドナーは
アロフェロンにも陽性に反応し、逆も同様である。
【００４６】表５のデータに基づいて計算された２種の
調製物の有効性を総合化した数値を表６に示す。ほとん
どのドナーがインターフェロン（17人のドナー中10人）
及びアロフェロン（同じく10人）に反応し、K562又はA4
31標的に対する細胞傷害活性が統計的に立証される増加
を示した。アロフェロン及びインターフェロン投与に対
する反応性は良好な相互関係にあった：すなわち、9人
のドナーが両方の調製物に同程度に反応し、各1人のド
ナーがそれぞれインターフェロン又はアロフェロンに選
択的に反応した。
調製物の有効性を総合化した数値を表６に示す。ほとん
どのドナーがインターフェロン（17人のドナー中10人）
及びアロフェロン（同じく10人）に反応し、K562又はA4
31標的に対する細胞傷害活性が統計的に立証される増加
を示した。アロフェロン及びインターフェロン投与に対
する反応性は良好な相互関係にあった：すなわち、9人
のドナーが両方の調製物に同程度に反応し、各1人のド
ナーがそれぞれインターフェロン又はアロフェロンに選
択的に反応した。
【００４７】このように、健康なドナーの反応性の分析
からこのモデルではアロフェロン及びインターフェロン
−アルファ2bは同様の有効性を持つことが示される。さ
らに、全ての個体においてではないにしても大部分の個
体において、2種の調製物は細胞傷害性リンパ球の活性
を刺激するものとして互換性があるように見える。
からこのモデルではアロフェロン及びインターフェロン
−アルファ2bは同様の有効性を持つことが示される。さ
らに、全ての個体においてではないにしても大部分の個
体において、2種の調製物は細胞傷害性リンパ球の活性
を刺激するものとして互換性があるように見える。
【００４８】
【表５】
【表６】
【００４９】
【表７】
【００５０】実施例５ 癌患者からの無作為サンプリングによるリンパ球の細胞
傷害活性に対する刺激に関するアロフェロン１及びイン
ターフェロン−アルファ2bの有効性の変動の比較研究 18人の種々の悪性腫瘍の患者から取った血液サンプルを
実施例３の健康なドナーの場合と同様のプロトコールで
試験した。結果を表７に示す。アロフェロン処置対する
陽性反応が、多様な患者群、特に慢性及び急性白血病患
者(９例中５例)で見られた。非ホジキンリンパ腫の患者
(６例中２例)及び肺癌患者1例でも陽性反応が検出され
た。
傷害活性に対する刺激に関するアロフェロン１及びイン
ターフェロン−アルファ2bの有効性の変動の比較研究 18人の種々の悪性腫瘍の患者から取った血液サンプルを
実施例３の健康なドナーの場合と同様のプロトコールで
試験した。結果を表７に示す。アロフェロン処置対する
陽性反応が、多様な患者群、特に慢性及び急性白血病患
者(９例中５例)で見られた。非ホジキンリンパ腫の患者
(６例中２例)及び肺癌患者1例でも陽性反応が検出され
た。
【００５１】インターフェロン又はアロフェロンに陽性
反応をみせる個体の比率は健康なドナーに比べると癌患
者で若干減少したがそれでも有意であった(全体数に対
してそれぞれ56%及び50%)。インターフェロン及びアロ
フェロンに対する反応性の相互関係も健康なドナーに比
べると弱かったが証明されている。所定の試験による
と、アロフェロンは癌患者の一部において注射用インタ
ーフェロンを代替するに適当なように見える。しかしな
がら、アロフェロンの活性がインターフェロンの活性に
よく似ているだけではなく内生インターフェロンの産生
を刺激するということを考えると、天然の細胞傷害の直
接的な活性化及び内生インターフェロン合成の誘導を通
じて免疫反応を二重に刺激することが予想されるため
に、アロフェロンは注射用インターフェロンの代替製剤
としてよりいっそう期待される。
反応をみせる個体の比率は健康なドナーに比べると癌患
者で若干減少したがそれでも有意であった(全体数に対
してそれぞれ56%及び50%)。インターフェロン及びアロ
フェロンに対する反応性の相互関係も健康なドナーに比
べると弱かったが証明されている。所定の試験による
と、アロフェロンは癌患者の一部において注射用インタ
ーフェロンを代替するに適当なように見える。しかしな
がら、アロフェロンの活性がインターフェロンの活性に
よく似ているだけではなく内生インターフェロンの産生
を刺激するということを考えると、天然の細胞傷害の直
接的な活性化及び内生インターフェロン合成の誘導を通
じて免疫反応を二重に刺激することが予想されるため
に、アロフェロンは注射用インターフェロンの代替製剤
としてよりいっそう期待される。
【００５２】
【表８】
【表９】
【表１０】
【００５３】
【表１１】
【００５４】実施例６ ヒト末梢血液リンパ球の細胞傷害活性に対するアロフェ
ロン１構造アナログの影響 アロフェロン１アナログであるアロフェロン３及び４の
活性を実施例２及び３に述べたプロトコールに従って調
べた。健康なドナーの血液から単離した単核分画及びA4
31細胞株の標的細胞を合わせて、上記調製物、すなわち
アロフェロン１、アロフェロン３，アロフェロン４又は
インターフェロン−アルファ2b(陽性対照)のうちの１つ
の存在下でインキュベートした。全ての例において上記
調製物の濃度は5 ng/mlとした。無処置対照群を上回る
細胞傷害指数を有効性の基準として使用した。表９のデ
ータはアロフェロン１及びインターフェロン−アルファ
2bと比較してアロフェロン３及び４に同様の有効性があ
ることを証明している。このように、アロフェロン１の
構造的アナログであるアロフェロン３及び４の有効性の
比較分析から、アロフェロン１のアミノ酸配列の1-4位
及び/又は14-15位がその特異的薬理活性においては不要
であり、従って、活性の損失なしに変更又は置換するこ
とができるアロフェロン１構造の可変部分であることが
示されている。
ロン１構造アナログの影響 アロフェロン１アナログであるアロフェロン３及び４の
活性を実施例２及び３に述べたプロトコールに従って調
べた。健康なドナーの血液から単離した単核分画及びA4
31細胞株の標的細胞を合わせて、上記調製物、すなわち
アロフェロン１、アロフェロン３，アロフェロン４又は
インターフェロン−アルファ2b(陽性対照)のうちの１つ
の存在下でインキュベートした。全ての例において上記
調製物の濃度は5 ng/mlとした。無処置対照群を上回る
細胞傷害指数を有効性の基準として使用した。表９のデ
ータはアロフェロン１及びインターフェロン−アルファ
2bと比較してアロフェロン３及び４に同様の有効性があ
ることを証明している。このように、アロフェロン１の
構造的アナログであるアロフェロン３及び４の有効性の
比較分析から、アロフェロン１のアミノ酸配列の1-4位
及び/又は14-15位がその特異的薬理活性においては不要
であり、従って、活性の損失なしに変更又は置換するこ
とができるアロフェロン１構造の可変部分であることが
示されている。
【００５５】
【表１２】
【００５６】実施例７ ヒトインフルエンザウイルスAが感染したマウスに及ぼ
すアロフェロンのin vivo抗ウイルス活性 アロフェロンの抗ウイルス活性をヒトインフルエンザウ
イルスAを致死量感染させたマウスモデルを使用して調
べた。対マウス病原性ウイルス株A/Aichi/2/68(セロタ
イプ H3N2)の懸濁液を20〜22 g体重の野生型オスに LD
50の10倍に相当する用量で鼻腔内に投与した。0.5 mlの
0.9% NaClに溶解したアロフェロン１をウイルス接種の
一日前、並びに接種後１、２、４、６及び８日目に腹腔
内注射した。この調製物はマウス一匹当たり25及び2.5
μg(0.5及び0.05μg/kg)の２種類の用量で試験した。対
照マウスには同一容量の溶媒を注射した。感染後十日間
のマウスの死亡率をモニターした。表10のデータは25μ
gのアロフェロンで処置した群で感染後の死亡率が有意
に減少したことを示している。2.5μgの用量では有効で
なかった。
すアロフェロンのin vivo抗ウイルス活性 アロフェロンの抗ウイルス活性をヒトインフルエンザウ
イルスAを致死量感染させたマウスモデルを使用して調
べた。対マウス病原性ウイルス株A/Aichi/2/68(セロタ
イプ H3N2)の懸濁液を20〜22 g体重の野生型オスに LD
50の10倍に相当する用量で鼻腔内に投与した。0.5 mlの
0.9% NaClに溶解したアロフェロン１をウイルス接種の
一日前、並びに接種後１、２、４、６及び８日目に腹腔
内注射した。この調製物はマウス一匹当たり25及び2.5
μg(0.5及び0.05μg/kg)の２種類の用量で試験した。対
照マウスには同一容量の溶媒を注射した。感染後十日間
のマウスの死亡率をモニターした。表10のデータは25μ
gのアロフェロンで処置した群で感染後の死亡率が有意
に減少したことを示している。2.5μgの用量では有効で
なかった。
【００５７】
【表１３】
【００５８】アロフェロンの抗ウイルス活性をレマンタ
ジンと比較した実験で同様の結果が得られた。表11を参
照のこと。レマンタジン（アマンタジン誘導体）はイン
フルエンザウイルスAに対して特異的に有効な最も強力
な抗ウイルス剤の一つである(Ershov F.I., Antiviral
preparations, Medicina, Moscow, 1998, 187pp)。アロ
フェロンをウイルス接種の１日前、次いで接種の１時間
前、さらに感染後１及び２日後に25μgの用量で皮下注
射した。レマンタジンは1000μgの用量でウイルス接種
の１日前、次いで接種の１時間前、さらに感染後１、２
及び３日後に経口投与した。
ジンと比較した実験で同様の結果が得られた。表11を参
照のこと。レマンタジン（アマンタジン誘導体）はイン
フルエンザウイルスAに対して特異的に有効な最も強力
な抗ウイルス剤の一つである(Ershov F.I., Antiviral
preparations, Medicina, Moscow, 1998, 187pp)。アロ
フェロンをウイルス接種の１日前、次いで接種の１時間
前、さらに感染後１及び２日後に25μgの用量で皮下注
射した。レマンタジンは1000μgの用量でウイルス接種
の１日前、次いで接種の１時間前、さらに感染後１、２
及び３日後に経口投与した。
【００５９】アロフェロン及びレマンタジンは両方とも
インフルエンザウイルスによって引き起こされる致命的
な肺損傷からほとんどの感染動物を有効に保護した。レ
マンタジンのほうがインフルエンザウイルスA感染の場
合においてはわずかにより効果的であるように見える
が、アロフェロンに比べるとレマンタジンは著しく多い
投与量(約40倍)で使用しなければならない。さらに、イ
ンフルエンザウイルスのA株及びB株に同等に効果的なア
ロフェロンとは異なり、レマンタジンはインフルエンザ
ウイルスB及び他のウイルス感染の場合には効果がない
ことが知られている。
インフルエンザウイルスによって引き起こされる致命的
な肺損傷からほとんどの感染動物を有効に保護した。レ
マンタジンのほうがインフルエンザウイルスA感染の場
合においてはわずかにより効果的であるように見える
が、アロフェロンに比べるとレマンタジンは著しく多い
投与量(約40倍)で使用しなければならない。さらに、イ
ンフルエンザウイルスのA株及びB株に同等に効果的なア
ロフェロンとは異なり、レマンタジンはインフルエンザ
ウイルスB及び他のウイルス感染の場合には効果がない
ことが知られている。
【００６０】
【表１４】
【００６１】実施例８ ヒトインフルエンザウイルス Bが感染したマウスにおけ
るアロフェロンのin vivo抗ウイルス活性 アロフェロンの抗ウイルスB有効性を実施例６に記述し
たプロトコールに従って試験した。対マウス病原性 Lee
1/40ヒトインフルエンザウイルス B 株をLD50の３及び
30倍当量の用量で動物に鼻腔内接種した。多様なインフ
ルエンザウイルス株に有効な抗ウイルス剤であるリバビ
リン(Ribavirin)、すなわち1-ベータ-D-リボフラノシル
-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド(Liao H.J. and
StollarV. Antiviral Res., 1993, 22, 285; Ershov
F.I. Antiviral preparations, Medicina, Moscow, 199
8, 187 pp)を陽性対照として使用した。
るアロフェロンのin vivo抗ウイルス活性 アロフェロンの抗ウイルスB有効性を実施例６に記述し
たプロトコールに従って試験した。対マウス病原性 Lee
1/40ヒトインフルエンザウイルス B 株をLD50の３及び
30倍当量の用量で動物に鼻腔内接種した。多様なインフ
ルエンザウイルス株に有効な抗ウイルス剤であるリバビ
リン(Ribavirin)、すなわち1-ベータ-D-リボフラノシル
-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド(Liao H.J. and
StollarV. Antiviral Res., 1993, 22, 285; Ershov
F.I. Antiviral preparations, Medicina, Moscow, 199
8, 187 pp)を陽性対照として使用した。
【００６２】結果を表12に示す。ウイルス投与量に関わ
らず、両方の対照群で感染により高い致死率の重篤な肺
炎が引き起こされた。リバビリンは低い方のウイルス用
量(LD50の３倍) を接種したマウスでは有効に保護した
が、高い方の用量(LD50の30倍)に対しては有効でなかっ
た。この時、アロフェロンは両方の場合において同等に
有効であった。従って、アロフェロンは公知の抗ウイル
ス剤であるリバビリンに比較して、より優れた抗ウイル
ス効果を有することが証明された。さらに、アロフェロ
ンはリバビリンの治療用量の約1/10程度の用量で有効で
あった。
らず、両方の対照群で感染により高い致死率の重篤な肺
炎が引き起こされた。リバビリンは低い方のウイルス用
量(LD50の３倍) を接種したマウスでは有効に保護した
が、高い方の用量(LD50の30倍)に対しては有効でなかっ
た。この時、アロフェロンは両方の場合において同等に
有効であった。従って、アロフェロンは公知の抗ウイル
ス剤であるリバビリンに比較して、より優れた抗ウイル
ス効果を有することが証明された。さらに、アロフェロ
ンはリバビリンの治療用量の約1/10程度の用量で有効で
あった。
【００６３】
【表１５】
【００６４】実施例９ マウスにおけるインターフェロン合成に対するアロフェ
ロンのin vivo 効果 アロフェロンの抗ウイルス活性に可能な作用様式を調べ
るために、マウスにおけるインターフェロン合成に対す
る上記調製物のin vivo効果を研究した。アロフェロン
処理及び対照(無処理)動物の血清中のインターフェロン
濃度を単層L-929細胞をモデルに用いて測定した。水疱
性口内炎ウイルス(Indiana 株)を試験ウイルスとして50
%細胞変性用量の100倍超過用量で使用した。インターフ
ェロン活性の1ユニットは、試験ウイルスの細胞傷害に
対して50%のL-929細胞を保護するマウス血清希釈倍数の
反比例値で表す。シクロフェロンを陽性対照として用い
た。シクロフェロンはアクリダノン化合物群に属するイ
ンターフェロン誘導物質である(Ershov F.I. Antiviral
preparations, Medicina, Moscow, 1998, 187 pp)。ア
ロフェロン又はシクロフェロンはそれぞれ25μg及び500
μgの用量で腹腔内投与された。２シリーズの実験結果
を表13に要約する。各シリーズで実験群は４匹の動物か
ら成っていた。各動物から血液サンプルを採取して個々
の血清を合わせ、インターフェロン測定に使用した。ア
ロフェロンは統計的に有意にインターフェロン濃度増加
を刺激し、処置の24時間後に最大効果に達した。
ロンのin vivo 効果 アロフェロンの抗ウイルス活性に可能な作用様式を調べ
るために、マウスにおけるインターフェロン合成に対す
る上記調製物のin vivo効果を研究した。アロフェロン
処理及び対照(無処理)動物の血清中のインターフェロン
濃度を単層L-929細胞をモデルに用いて測定した。水疱
性口内炎ウイルス(Indiana 株)を試験ウイルスとして50
%細胞変性用量の100倍超過用量で使用した。インターフ
ェロン活性の1ユニットは、試験ウイルスの細胞傷害に
対して50%のL-929細胞を保護するマウス血清希釈倍数の
反比例値で表す。シクロフェロンを陽性対照として用い
た。シクロフェロンはアクリダノン化合物群に属するイ
ンターフェロン誘導物質である(Ershov F.I. Antiviral
preparations, Medicina, Moscow, 1998, 187 pp)。ア
ロフェロン又はシクロフェロンはそれぞれ25μg及び500
μgの用量で腹腔内投与された。２シリーズの実験結果
を表13に要約する。各シリーズで実験群は４匹の動物か
ら成っていた。各動物から血液サンプルを採取して個々
の血清を合わせ、インターフェロン測定に使用した。ア
ロフェロンは統計的に有意にインターフェロン濃度増加
を刺激し、処置の24時間後に最大効果に達した。
【００６５】
【表１６】
【００６６】マウスにおけるインターフェロン合成に対
するアロフェロンのin vivo効果に関する他の例を表14
に示す。アロフェロンを皮下注射したことと個々の血液
サンプルを別々に分析したことを除いて、上記実験と同
じ方法で行った。アロフェロン及びシクロフェロンは両
方とも短期間観察、すなわち処置後６時間目においてイ
ンターフェロン生成を刺激した。24時間の間にアロフェ
ロン及びシクロフェロンの両方の処置動物でインターフ
ェロン力価は対照レベルに戻った。このように、上記デ
ータからアロフェロンが公知のインターフェロン誘導物
質であるシクロフェロンと同様のレベルでin vivoイン
ターフェロン誘導活性を有することが確認された。刺激
効果の長さは、おそらく動物の生理的状態及び投与方法
に依存して、６時間から24時間又はそれ以上の範囲に及
びうる。シクロフェロンのような伝統的なインターフェ
ロン誘導性化学物質と比較して、アロフェロンは非常に
低い投与量(約1/20)で有効であるという長所を持つ。
するアロフェロンのin vivo効果に関する他の例を表14
に示す。アロフェロンを皮下注射したことと個々の血液
サンプルを別々に分析したことを除いて、上記実験と同
じ方法で行った。アロフェロン及びシクロフェロンは両
方とも短期間観察、すなわち処置後６時間目においてイ
ンターフェロン生成を刺激した。24時間の間にアロフェ
ロン及びシクロフェロンの両方の処置動物でインターフ
ェロン力価は対照レベルに戻った。このように、上記デ
ータからアロフェロンが公知のインターフェロン誘導物
質であるシクロフェロンと同様のレベルでin vivoイン
ターフェロン誘導活性を有することが確認された。刺激
効果の長さは、おそらく動物の生理的状態及び投与方法
に依存して、６時間から24時間又はそれ以上の範囲に及
びうる。シクロフェロンのような伝統的なインターフェ
ロン誘導性化学物質と比較して、アロフェロンは非常に
低い投与量(約1/20)で有効であるという長所を持つ。
【００６７】
【表１７】
【００６８】実施例10 アロフェロンの毒性評価 アロフェロンの毒性をin vitro及びin vivoモデルを用
いて試験した。表15を参照。動物及び微生物モデルでの
急性若しくは慢性毒性、アレルゲン活性、胎児毒性又は
生殖機能に対する有害な効果、又はヒトのin vitroモデ
ルでの細胞傷害はこれまでのところ記録されていない。
従って、アロフェロンは毒性が非常に低いか又は実質的
に毒性がない物質と結論される。
いて試験した。表15を参照。動物及び微生物モデルでの
急性若しくは慢性毒性、アレルゲン活性、胎児毒性又は
生殖機能に対する有害な効果、又はヒトのin vitroモデ
ルでの細胞傷害はこれまでのところ記録されていない。
従って、アロフェロンは毒性が非常に低いか又は実質的
に毒性がない物質と結論される。
【００６９】
【表１８】
【表１９】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/02 Ａ６１Ｐ 43/00 １１７ 43/00 １１７ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ソーイン キム 大韓民国、ソウル 137−906、セオチョ グ、ジャムウォンドン、ハンガン アパー トメント １−901 (72)発明者 セルゲイ イバノビッチ チェルニッシュ ロシア、セント ピータースブルグ、モス コウスキィ プロスペクト、97−171 (72)発明者 ゲルマン ペトロビッチ ベッカー ドイツ、エッセン Ｄ−45356、ゲルマニ ア ストリート 62 (72)発明者 ナタリア ボリソブナ マカルディアニ ロシア、モスクワ 121609、オセニィ ボ ウレバード、３−253 (72)発明者 ジュルス ホッフマン フランス、ストラスボウルグ 67000、ル エ クロセナー、５ (72)発明者 フィリッペ ブレ フランス、ベンデンヘイム 67550、ルエ デュ コッタゲ、11 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 DA05 DA06 DA07 4B065 AA11X AA15X AA26X AA87Y AB01 CA44 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA16 BA17 BA18 CA49 CA59 DA21 DA27 DA42 MA52 MA55 MA66 ZB022 ZB032 ZB072 ZB262 ZB322 ZB332 4H045 AA10 AA20 AA30 BA13 BA14 BA15 BA16 BA17 BA18 EA28 EA29 FA10 FA71 GA25 HA03
Claims (16)
- 【請求項１】 最大３０個のアミノ酸残基から成り免疫
調節活性を示すペプチドであって、下記の一般構造式
（１）； X1-His-Gly-X2-His-Gly-Val-X3 （１） （式中、X1は存在しないか又は少なくとも1個のアミノ
酸残基を示し、X2はペプチド結合又は少なくとも1個の
アミノ酸残基を示し、X3は存在しないか又は少なくとも
1個のアミノ酸残基を示す）で表されることを特徴とす
るペプチド、又はその医薬上許容しうる塩若しくはエー
テル。 - 【請求項２】 最大２０個、好ましくは５〜１３個のア
ミノ酸残基から成る、請求項１に記載のペプチド。 - 【請求項３】 X2が０〜３個、好ましくは１個のアミノ
酸残基を表す、請求項１〜２のいずれか１項に記載のペ
プチド。 - 【請求項４】 X1が存在しないか、His-Gly-Val-Ser-Gl
y-、Gly-Val-Ser-Gly-、Val-Ser-Gly-、Ser-Gly-、Pro-
Ser-Leu-Thr-Gly-、Phe-Ile-Val-Ser-Ala-、Thr-、Leu-
Ala-Ser-Leu-、Cys-Val-Val-Thr-Gly-、Ile-Ser-Gly-、
Cys-Gly-、Ile-Val-Ala-Arg-Ile-、Phe-Gly-、His-Gly-
Asp-Ser-Gly-、Ser-Gly-及びTyr-Ala-Met-Ser-Gly-から
成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に
記載のペプチド。 - 【請求項５】 X2がペプチド結合、-Gln-、-Phe-、-Asp
-、-Ser-、-Asn-、-Ala-、-Gln-Asn-、-Ala-Val-及び-S
er-Asp-Gly-から成る群から選択される、請求項１〜４
のいずれか１項に記載のペプチド。 - 【請求項６】 X3が存在しないか、-His-Gly、-His、-T
yr-Asp、-Phe-Val、-Pro、-Gln-His-Gly、-Leu-Ala、-A
sp、-Pro-Leu、-Met及び-Phe-Ileから成る群から選択さ
れる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。 - 【請求項７】 His-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-
Gly-Val-His-Gly、Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-G
ly-Val-His-Gly、Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Va
l-His、Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val、Pro-Ser-Le
u-Thr-Gly-His-Gly-Phe-His-Gly-Val-Tyr-Asp、Phe-Ile
-Val-Ser-Ala-His-Gly-Asp-His-Gly-Val、Thr-His-Gly-
Gln-His-Gly-Val、His-Gly-His-Gly-Val-His-Gly、Leu-
Ala-Ser-Leu-His-Gly-Gln-His-Gly-Val、Cys-Val-Val-T
hr-Gly-His-Gly-Ser-His-Gly-Val-Phe-Val、Ile-Ser-Gl
y-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-Pro、Cys-Gly-His-Gly-Asn
-His-Gly-Val-His、Ile-Val-Ala-Arg-Ile-His-Gly-Gln-
Asn-His-Gly-Val、His-Gly-Ser-Asp-Gly-His-Gly-Val-G
ln-His-Gly、Phe-Gly-His-Gly-His-Gly-Val、His-Gly-A
sn-His-Gly-Val-Leu-Ala、His-Gly-Asp-Ser-Gly-His-Gl
y-Gln-His-Gly-Val-Asp、His-Gly-His-Gly-Val-Pro-Le
u、Ser-Gly-His-Gly-Ala-Val-His-Gly-Val-Met及びTyr-
Ala-Met-Ser-Gly-His-Gly-His-Gly-Val-Phe-Ileから成
る群から選択される、請求項１に記載のペプチド。 - 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項に定義され
たアミノ酸配列、又はその医薬上活性のある塩又はエー
テルを含み免疫調節活性を示す化合物であって、自然界
に存在するペプチド又はタンパク質ではない化合物。 - 【請求項９】 請求項１〜７のいずれか１項に記載のペ
プチド若しくは請求項８に記載の化合物又は前記ペプチ
ド若しくは化合物の医薬上活性のある塩若しくはエーテ
ルを含む医薬用組成物。 - 【請求項10】 免疫調節活性を有する医薬用組成物を製
造するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペ
プチド若しくは請求項８に記載の化合物又は前記ペプチ
ド若しくは化合物の医薬上活性のある塩若しくはエーテ
ルの用途。 - 【請求項11】 前記医薬用組成物がインターフェロン誘
導活性、抗ウイルス活性、抗腫瘍活性を示すか又はヒト
若しくは動物のリンパ球の細胞傷害活性を刺激する、請
求項１０に記載の用途。 - 【請求項12】 前記医薬用組成物が免疫不全状態、ウイ
ルス感染若しくは真菌全身感染のような感染症又は腫瘍
性疾患の治療又は予防に有用な、請求項１０に記載の用
途。 - 【請求項13】 請求項１〜７のいずれか１項に記載のペ
プチドをコードするヌクレオチド配列。 - 【請求項14】 請求項１〜７のいずれか１項に記載のペ
プチドをコードするDNA断片を含み、形質転換後に前記
ペプチドを発現するベクターであって、宿主細胞内で請
求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドを発現する
のに適したベクター。 - 【請求項15】 請求項１4に記載のベクターにより形質
転換されていることを特徴とする宿主細胞。 - 【請求項16】 細菌細胞であることを特徴とする請求項
15に記載の宿主細胞。
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