SE519350C2 - Antibakteriellt protein med specifik effekt mot gram-negativa bakterier, farmaceutiskt aktiva fragment därav med samma specifika effekt, samt farmaceutisk komposition innehållande proteinet eller fragment därav - Google Patents

Description

a ø o ø no 519 350 och har föreslagits spela en roll vid regleringen av celladhesion under det cellulära svaret mot bakteriella infektioner [12, 131.

Förutom de antibakteriella proteinema från insekter, finns också ett antal anti- bakteriella proteiner isolerade från däggdjur, t.ex. det baktericida/penneabilitets- höjande proteinet (BPI) [14,15] och defensinerna [l6]. Defensiner från däggdjur skiljer sig strukturellt från defensiner från insekter, trots att de har liknande stor- lek och laddning.

Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfinning tillhandahåller ett nytt antibakteriellt protein, kallat gloverin. Gloverin är ett basiskt (med ett pl av ca. 9) protein med en molekylvikt av cirka 14 kD innehållande ett stort antal glycinrester men ingen cystein. Gloverin uppvisar ingen kraftig sekvenslikhet med andra kända proteiner. Gloverin inhi- berar tillväxten av gram-negativa bakterier, såsom Escherichia coli. Den minimala koncentrationen som krävs för inhibition av bakterietillvâxt år 1-3 uM, vilket är mindre än 5% av koncentrationen av gloverin i hemolymfan hos infekterade puppor. Syntesen av vitala yttermembranproteiner och, följaktligen, permeabilite- ten av ytterrnembranet påverkas, vilket indikerar att aktiviteten hos gloverin år riktad mot yttermembranet hos gram-negativa bakterier.

Företrådesvis isoleras det nya antibakteriella proteinet, gloverin, enligt uppfinning- en från Hyalophora-fjärilar. Alternativt produceras gloverin genom genetisk mani- pulering eller genom kemisk syntes.

Dessutom innefattar uppfinningen farmaceutiska kompositioner innefattande gloverin eller farmaceutiskt aktiva fragment därav och användning av gloverin eller fragment därav som ett läkemedel mot bakteriell infektion. Vidare avser uppfm- ningen en metod för att behandla bakteriell infektion innefattande administrering av gloverin eller fragment därav. n u ø u nu 519 350 3 Detaljerad beskrivning av uppfinningen MATERIAL OCH METODER Isolering av protein. Diapausande puppor av Hyalophora gloveri injicerades med 105 levande Enterobacter cloacae B12. Efter 7 dagar uppsamlades hemolymfan så- som beskrivits tidigare [3]. Gloverin renades från färskt uppsamlade eller fryst hemolymfa genom följande procedur: 50 m1 hemolymfa utspäddes fem gånger med iskallt destillerat vatten och centrifugerades under 10 minuter vid 17000xg, 4°C.

Mâttad arnmoniumsulfat (SAS) lösning tillsattes till supernatanten för att ge 25% SAS slutkoncentration. Efter 30 minuter vid rumstemperatur uppsamlades fäll- ningen genom centrifiigering under 10 minuter vid 17000xg, 4°C. Fällningen upp- löstes i 10 ml destillerat vatten och avsaltades på en Sephadex G-25, PD- 10 kolonn (Pharmacia, Sverige) järnviktad med startbufferten använd i det efterföljande jon- bytarkromatografisteget. Detta utfördes på en DEAE-Sepharos CL-6B kolonn (3 x 6 cm) (Pharmacia, Sverige) jåmviktad med 20 mM diaminopropan, justerad till pH ,1 med saltsyra, vid rumstemperatur. Proteiner eluerades med användning av en gradient av 1 M natriumklorid i startbuffert. Ett efterföljande gelfiltreringssteg ut- fördes på en Superdex-75 kolonn (1 x 30 cm) (Pharmacia, Sverige) jämviktad med 0,1 M ammoniumbikarbonat.

Cirka 1,5 mg renat gloverin utvanns från 50 ml hemolymfa uppsamlad från 50 puppor. Det isolerade proteinets renhet utvärderades genom natriumdodecylsulfat- polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och masspektrometri såsom beskrivs nedan.

Elektrofores. SDS-PAGE utfördes i l2,5% (vikt/volym) slabgeler genom metoden enligt Laemmli [17] men med en 4,5% stackinggel, innehållande 9% glycerol. Iso- elektrisk fokusering utfördes med användning av ett Phast-system, (Pharmacia, Sverige) enligt tillverkarens standardprotokoll.

Automatiserad aminosyrasekvensanalys. [18] utfördes med användning av en ABI 477A (Applied Biosystems) proteinsekvenserare med en on-line ABI 120A PTH- analyseringsanordning enligt standardprotokoll. n u v | .n 519 350 4 Gloverin klyvdes med användning av cyanogenbromid, Glu-C, Lys-C eller Arg-C endoproteinas (Boehringer Mannheim). Efter klyvning med cyanogenbromid eller Glu-C-endoproteinas separerades digestionsmaterialet på en Superdex-75 gel- ñltreringskolonn i 0, 1 M ammoniumbikarbonat. Vid klyvning med Lys-C eller Arg-C endoproteinas separerades digestionsmaterialet genom RP-HPLC på en Brownlee C- 18, 5 m kolonn, 2,1x30 mm, eluerades med en gradient av O-70% acetonitril i vatten innehållande O, 1% trifluoroättiksyra under 60 minuter med en flödeshastig- het av 0,3 rnl/min.

Kromatografi utfördes med användning av ett FPLC-system (Pharmacia, Sverige).

Utflödet registrerades vid 214 nm. Alla fraktioner som uppsamlades analyserades genom masspektrometri.

Sekvensjämfórelse. Databasema Swiss protein (utgåva 27.0) och PIR-protein (ut- gåva 35.0) genomsöktes med programmet FASTA [19] med användning av mjukvara från Genetic computer group [20].

Aminosyraanalys. Arninosyraanalyser utfördes med jonbytar-ninhydrinmetoden.

Masspektrometri. Plasmadesorptionsmasspektra för klyvningsprodukter under sekvensarbete erhölls med användning av en BIOION 20 masspektrometer (Applied Biosystems) .

Cirkulär dikroism. Cirkulåra dikroism (CD) mätningar utfördes på en Jasco 41A spektropolariometer. d- 10 karnfersulfonsyra användes för kalibrering med D e taget som +2,37 vid 290 nm. Alla spektra registrerades vid 25°C med användning av en 0,1 cm cell. Proteinkoncentrationer som användes var 0,1 mg/ ml för uppskattning av den optimala koncentrationen av hexafluoro-iso-propanol respektive 0,3 mg/ ml för registrering av fullständiga spektra.

Proteinkoncentrationer bestämdes spektrofotometriskt vid 280 nm med använd- ning av det absoluta värdet av 18350 M-lcm-1. Medelvärdet för rest-ellipticiteten uttryckt i grad.cm/ dmol beräknades vid varje nm och anges som genomsnitt av två analyser. Medelvärdet för restvikten som användes var 106,4 g/mol. n | » | f: 519 350 NHR-analyser. 1D lH-NMR-analyser utfördes på en Varian 400 MHz FT NMR spektrometer.

Ultracentrifugering. Jämviktning och sedimentationsexperiment utfördes med användning av en Optima XL-A (Beckman Inc.) analytisk ultracentrifug.

Bakteriestammar_D2 1f2[21] är en rfa-mutant av E. coli K-12 stam D21[22], med en djup grov (deep rough), heptosfri lipopolysackarid (LPS) (= kemotyp Re). Den gram-positiva stammen som användes var Bacillus megaterium Bm 1 1 [23]. Termen "djup grov" (deep rough) som användes här avser att LPS-kedjan är förkortad.

Antibakteriell analys. Den antibakteriella aktiviteten hos renat gloverin ana- lyserades genom att registrera tillväxten av flytande kulturer i míkrotiterplattor (NUNC, Danmark), 200 ul/ brunn. Gloverin tillsattes till LB-medíum vid 5-10 uM slutkoncentration och denna blandning inokulerades med 5x106 celler i rnitt-logfas.

Kulturerna inkuberades vid 37°C på en roterande skakanordning och tillväxt registrerades var tjugonde minut genom registrering av absorbansen vid 560 nm med en Titertek Multiskan Spectrofotometer.

I vissa experiment togs prov från växande kulturer vid olika tider och spriddes på LB-agarplattor för att bestämma korrelationen mellan antalet viabla celler och absorbans.

Radioaktiv märkning av bakteriella proteiner. Celler odlades såsom beskrivits ovan för den antibakteriella analysen förutom att LB ersattes med M9 minimalt medium utökat med 0,4% (vikt/volym) glukos och aminosyror, förutom metionin.

L-[35S] metionin (>37 TBq/mmol; Amersham, UK) tillsattes till kulturerna efter 2 h, till en slutkoncentration av 25 pCi / ml. Märkning fortsattes under 10 minuter och stoppades därefter genom tillsats av trikloroåttiksyra till en slutkoncentration av % (vikt/ volym). De märkta och utfållda cellerna analyserades på SDS-PAGE och de torkade gelema överlades med Kodax-X-omat AR-film och exponerades under två dagar vid rumstemperatur.

Uppfinningen kommer nu att beskrivas med hänvisning till de medföljande ritning- arna, i vilka: 519 350 6 Figur l representerar SDS-PAGE-analys av SDS-utfällda hemolymfa och renade proteiner.

Banor: (1) Icke-immun hemolymfa, (2) immun hemolymfa vid dag 7, (3) renat gloverin, (4) renat basiskt attacin, (5) renat neutralt attacin.

Figur 2. Aminosyrasekvens för gloverin.

Peptidema som användes för sekvensering år understrukna för att visa överlapp- ningar. Peptiden erhållen genom klyvning med cyanogenbromid är betecknad "CNBr. l". Peptiderna erhållna genom digestion med endoproteinas Glu-C, Arg-C och Lys-C år betecknade "Glu-C.1-2.", "Arg-C.1." resp. "Lys-C.1-3.". Ett potentiellt glykosyleringsställe indikeras med *.

Figur 3. Laserdesorptionsmasspektrum för gloverin.

Figur 4. Cirkulärt dikroismspektrum för gloverin.

Gloverin upplöst i 10 mM fosfat pH 6,4 (1) och med tillsats av 20% (volym / volym) hexafluoro-iso-propanol (2).

Figur 5. Effekt av gloverin på tillväxten av D21f2.

Gloverin tillsattes vid tiden noll vid en koncentration av 5mM (1) eller 10 mM (2).

Kontrollen (C) representerar tillväxt i frånvaro av gloverin. Panel A visar den optiska densiteten för de växande kulturerna. Panel B visar antalet viabla celler i prov tagna från kulturema vid de angivna tiderna.

Figur 6. Effekt av Triton X- 100 och lysozym på D2lf2 behandlad med gloverin.

Triton X-100 (slutkoncentration; 1% (vikt/volym) (panel A); eller kycklinglysozym (slutkoncentration; 200 mg/ m1) (panel B); tillsattes vid den tid som anges med pilen till kulturer odlade i frånvaro (1) eller närvaro (3) av gloverin (6 uM). Kurvoma (2) representerar tillväxt i närvaro av gloverin (5 pM) enbart och kurvorna (C) är kontroller utan att några tillsatser.

Figur 7. Effekt av lipopolysackarid (LPS) och magnesium på den tillväxtinhiberan- de aktiviteten hos gloverin på D2 lf2. . n n ø »o 519 350 7 I panel A representerar kurva (1) tillväxt med tillsats av 50 pM LPS. Kurvoma (2) och (3) representerar tillväxt med tillsats av 10 (LM gloverin och 50 uM resp. 30 uM LPS. Kurva (4) representerar tillväxt med tillsats av 10 uM gloverin enbart och kurva (C) representerar tillväxt av D2lf2 utan några tillsatser. I panel B represente- rar kurva (1) tillväxt av D2lf2 i närvaro av 10 pM gloverin och 40 mM MgClz. Kurva (2) visar tillväxt i 10 uM gloverin enbart och (C) representerar tillväxt av D2 lf2 utan några tillsatser.

Tillsats av 40 mM MgClg till kontrollkulturen hade ingen effekt (ej visat).

Figur 8. Autoradiogram av SDS-PAGE som visar effekten av gloverin på syntes av yttermembranproteinerna Omp F/ C och Omp A. i 35S-metioninmärkta D2 1f2- celler.

Banor: (1) Kontroll, obehandlade bakterier; (2) Bakterier inkuberade med gloverin (10 uM) under 2 h.

RESULTAT Isolering av protein. Jonbytarkromatografi av ammoniumsulfatutfälld immun hemolymfa resulterade i två stora toppar enligt bestämning vid 280 nm. Analys genom SDS-PAGE visade att den första som eluerades av dessa bestod av gloverin och den basiska formen av attacin, medan den andra toppen innehöll den neutrala forrnen av attacin och några ytterligare proteiner (data ej visat). I syfte att ytterliga- re separera gloverin från attacin applicerades den gloverin-innehållande toppen från jonbytaren på en Superdex 75 kolonn vilket gav gloverinfritt från attacin.

SDS-PAGE-analys (figur 1) av renade proteiner och hemolyrnfa från irnmuniserade och icke-irnmuniserade puppor demonstrerar att gloverin induceras genom infek- tion. Isoelektrisk fokusering visade att det renade gloverinet har en isoelektrisk punkt av 8,5 (data ej visade).

Sekvensanalys. Aminosyrasekvensen för ovan beskrivna gloverin visas i figur 2, som också innefattar sekvensen för olika använda klyvningsfragrnent. En digestion med Glu-C-endoproteas utfördes av en händelse utan tillräcklig buffring, vilket orde att enzymet klyvde efter både glutaminsyra och asparaginsyra. Detta produ- cerade peptiden från aminosyra 98 till 113 och gav en överlappande sekvens i 1 9 3 5 0 Åk - - ..;: :::= 8 regionen av aminosyra nr. 100. Jämförelse av sekvensen för gloverin med andra sekvenser i tillgängliga databanker visade inga proteiner med kraftiga sekvenslik- heter.

Med kännedom om aminosyrasekvenserna är det möjligt att producera gloverin genom kemisk syntes. Uppfmningen avser gloverin och gloverinliknande sekvenser.

Det huvudsakliga kriteriet år att den specifika gloverinaktiviteten bibehålls i proteinet/ fragmentet.

Det inses av fackmannen på teknikområdet att DNA-sekvensen som kodar för gloverin kan erhållas från ovanstående information. Således innefattar uppfinning- en också DNA-sekvenser som kodar för gloverin och gloverinliknande proteiner.

Vidare avser uppfinningen sådana proteiner som produceras genom konventionell genetisk manipulering.

Aminosyraanalys. Resultaten från aminosyraanalyserna av gloverin presenteras i Tabell 1 och jämförs med sammansättningen härledd från denna sekvens. Dess- utom innefattas arninosyrasamrnansåttningen för motsvarande protein isolerat från Hyalophora cecropia. nnn n.. n n n n. nn n II Hu n nn nn nn nn n n nn c I- n un, nn n n n» a n nn n nu» n.. nu n no n; n-n unna n n n n n n n n nn n n n n n n n n o n nn n. .n n - n n o ~ nn 9 Tabell 1 Aminosyrasammansåttning för gloverin Aminosyra- Aminosyra- Aminosyra- sammansättning sammansättning sammansättning för gloverin från för gloverin från för gloverin från Hyalophora gloven' Hyalophora glouerí Hyalophora cecropia Aminosyra enligt sekvens g enligt a.s.-analys enligt a.s.-ana1ys Ala 1 0 9,8 1 0,3 Arg 6 5,8 5,1 Asn 9 Asp 13 20,5 20,1 CyS 0 0 0,8 Gln 7 Glu 1 7,3 7,7 Gly 24 22, 5 21 ,7 His 2 2,1 2,0 Ile 3 3,2 3,5 Leu 8 8,0 7,8 Lys 9 7,9 8,7 Met 1 1,1 1,2 Phe 1 0 9,7 9,4 Pro 3 3,3 3,8 Ser 7 7,2 7,4 Thr 7 6,8 7,3 Trp 3 - _ Tyr 1 1,1 1,7 Val 6 5,8 6,2 Masspektrometri. Laserdesorptionsmasspektra för gloverin (figur 3) indikerar en molekylmassa av 13786 Da, vilket är i god överensstämmelse med värdet 13785 Da som beräknats från aminosyrasekvensen. Det finns inga tecken på att gloverin är glykosylerat men det finns ett potentiellt glykosyleringsställe vid asparagin 87". 519 350 Konformationsstudier. CD-spektrumet för gloverin i 10 mM fosfat pH 6,4, kan tolkas som en avspegling av en struktur bestående huvudsakligen av en random- coil (figur 4). För att uppskatta den eventuella strukturen som är närvarande i en mer hydrofob, membranliknande miljö, registrerades CD-spektra i olika koncentra- tioner av hexafluoro-iso-propanol. I en hydrofob miljö förändras spektrumet till att avspegla en konfirmation som har stora mängder (ca. 50%) alfa-helix-süuktur (fi- gur 4). Graden av förrnodad alfa-helix når ett maximum vid en koncentration av % hexafluoro-iso-propanol. Resultatet från NMR-analysen bekräftar konforrna- tionsförändringen som indikerades genom CD-experimenten (data ej visade).

Från ultracentrifugeringssedimenteringsexperiment av gloverin i 10 mM fosfat, pH 6,4, beräknades följande parametrar: sedimentationskoefficient (S°20 (vikt)) = 1,4 S, diffusionskoefficient (D) = 8,95x10-7 cm 2 s-l och ett friktionsförhållande (f/fO) = 1,5. Dessa värden är i enlighet med de förväntade värdena man erhåller för ett protein av uppskattad molekylvikt 13,8 kDa och som år närvarande i en utsträckt konfonnation.

Jåmviktningsexperimenten gav en molekylvikt av 13,8 kDa vilket visar att proteinet föreligger som en monomer i vattenlösning.

Antibakteriell aktivitet Tillväxten av E. coli K- 12 inhiberas. Tillsats av gloverin till växande kulturer av känsliga E. coli, gav upphov till en minskning i tillväxthastigheten. Denna effekt var noterbar efter 1 h. Efter 2-3 h, var tillväxten fullständigt inhiberad (figur 5) och förlängd exponering för gloverin resulterade i en minskning i celldensitet. De åter- stående cellerna var fortfarande viabla eftersom kulturema återhämtades och fort- satte att växa när de inkuberades över natt (data ej visade).

I figur 5 visas också ett viabelt räkningsexperiment som visar korrelatíonen mellan celldensitet och antalet viabla celler. Ingen inhibitorisk effekt av gloverin på den gram-positiva cellen Bacillus megaterum kunde observeras med användning av koncentrationer upp till 100 mM gloverin (data ej visade). Den tillväxtinhiberande effekten av gloverin påverkas inte signifikant genom uppvärmning av proteinet till l0O°C under 10 minuter (data ej visade).

Perrneabiliteten av yttermembranet ökar. Tillsats av den icke-joniska detergenten Triton X-100 till en kultur av E. coli D2 112 odlade 2,2 h i närvaro av gloverin 519 350 11 resulterade i en drastisk minskning i absorbans, i kontrast till den mycket mindre effekten av Triton X- 100 på obehandlade kontrollkulturer (figur 6). Känsligheten för lysozym ökade också genom gloverinbehandling (figur 6). Dessa resultat tyder på att gloverin påverkar integriteten av yttermembranet, varvid inträde av substanser tillåts som normalt exkluderas genom denna permeabilitetsbarriär, såsom konven- tionella antibiotika. Kombinerad terapi med gloverin och konventionellt anti- biotikum(a) kommer att minska den dos som normalt krävs för detta anti- biotikum(a).

Mg2+ inhiberar aktiviteten av gloverin. Effekten av gloverin på tillväxten av D2 lf2 inhiberades i närvaro av 40 mM Mg2+ (figur 7B). Detta resultat är i enlighet med rollen för magnesium att stabilisera yttermembranet. Bindning till fritt LPS inhi- berar aktivitet. För-inkubering av gloverin med löslig LPS (Rd) (Sigma) under 30 minuter vid 37°C före tillsats av blandningen till en växande kultur av D2lf2-celler blockerar den antibakteriella effekten av gloverin (figur 7A). Den inhibitoriska effekten av LPS är koncentrationsberoende.

Syntesen av yttermembranproteiner påverkas. SDS-PAGE-analys av proteinhalten i gloverinbehandlade och radioaktivt märkta D2 1f2-celler visade att det inte förekom någon allmän effekt på proteinsyntes. Emellertid orsakade gloverin en specifik inhibition av syntesen av ytterrnembranproteinerna Omp F, Omp C och OmpA.

Några ytterligare, oidentifierade proteiner påverkades också (figur 8).

DISKUSSION Ett nytt, antibakteriellt protein isolerat från immun hemolymfa av Hyalophora glo- veri-puppor, har beskrivits i funktionella och strukturella termer.

Det studerade gloverinet har en molekylmassa av 13785 Da och består av 130 aminosyror utan några cysteiner men med en hög halt (18,5%) glycin. Ultracentri- fugering och cirkulär dikroism visar att gloverin föreligger som en monomer random-coil i vattenlösning medan, enligt cirkulär dikroism, en alfa-helix-struktur kan induccras genom tillsats av hexafluoro-iso-propanol. Direkt mätning av mole- kylvikt genom masspektrometri jämfört med massan hårledd från aminosyra- 519 350 12 sekvensen indikerar att gloverin inte är föremål för modifikationer efter trans- lationen, t.ex. glykosylering.

Ett protein motsvarande gloverin isolerades från den nära besläktade lepidoptera Hyalophora cecropía och sekvensen för de 38 N-terrninala aminosyrorna befanns vara identisk. Dessutom gav aminosyraanalys för de två proteinema liknande re- sultat. Jämförelse av gloverinsekvensen med sekvensema för andra proteiner funna i databasen visade ingen strukturell likhet med kända proteiner. Således drar vi slutsatsen att gloverin representerar en ny klass av antibakteriella proteiner.

Den antibakteriella effekten av gloverin förefaller vara riktad mot vissa gram- negativa bakterier. Känsligheten hos E. coli K-12 ökar med minskande längd av polysackaridkejdan av lipopolysackariden (LPS). Stam D2 lf2 som använts i experimenten är en LPS-mutant med en Re-typ av LPS och den mest känsliga stammen. Föräldrastamrnen D2l(LPS Ra) är cirka 10 gånger mindre känslig.

Faktumet att gloverin gör dessa bakterier känsliga för detergentet Triton X- 100 och för lysozym, - föreningar som normalt är inaktiva mot dessa celler på grund av deras oförmåga att penetrera yttermembranet - indikerar att gloverin har en effekt som är riktad med cellhöljet. Denna effekt kunde nästan fullständigt inhiberas genom Mg2+ som är känd för att ha en viktig roll vid Stabilisering av yttermembra- net hos gram-negativa bakterier. Den observerade ökningen i permeabilitet åtföljs av en minskning i yttermembranproteiner, en effekt som ytterligare tyder på att yttennembranet är målet för gloverin.

Observationen att känsligheten hos en cell för gloverin ökar med minskande längd av polysackaridkedjan av LPS, i kombination med faktumet att effekten av gloverin på tillväxt inhiberas genom förinkubering med LPS i lösning, indikerar att bindning till LPS år betydelsefullt för gloverinets verkan. Polysackaridkedjorna av LPS kan förhindra gloverin helt enkelt genom steriska interaktioner. Ju kortare kedjan är, desto enklare är det för gloverin att få tillträde till de inre delarna av LPS-lagret.

Eventuella bindningsställen för det basiska gloverinet kan tillhandahållas genom lipid A-delen av LPS och/ eller fosfatgruppema som finns både på lipid A och på 2- u . n n n o .o 519 350 13 keto-3-deoxyoktonsyran (KDO). Aktiviteten hos gloverin liknar i många hänseenden (permeabilitet, Omp-syntes, inhibition genom fri LPS) den för attacin [6,7].

En jämförelse av gloverin och dåggdjurs-BPI, visar att effekten av BPI också är omvänt beroende på längden av LPS-polysackaridkedjorna [14]. Tillsats av magnesiumjoner inhiberar också effekten av BPI. Emellertid, i motsats till gloverin och attacin, förefaller BPI inte att ha samma uttalade effekten på syntesen av ytter- membranproteiner {15]. Gloverin bibehåller dess antibakteriella egenskaper efter kokning, vilket visar att aktiviteten inte beror på någon katalytisk effekt. Detta gäller också för attaciner, cekropiner och BPI.

De nya antibakteriella proteinerna enligt uppfinningen möjliggör ny antimikrobiell terapi med nya antimikrobiella ämnen, dvs. gloveriner. Gloverin kan kombineras med andra konventionella antimikrobiella medel, såsom penicilliner, för att förhöja den antimikrobiella effekten. Vidare tillhandahåller de användbara verktyg för studier av regleringen av sammansättning och syntes av det bakteriella ytter- membranet. - - . ; ø -ø 1 9 3 5 o - ...: :::= 14 REFERENSER 1. Boman H.G., Faye l., Gudmundsson G.H., Lee J-Y & Lindholm D.A. (1991) Cell-free immunity in Cecropia. A model system for antibacterial proteins, Eur.

J. Biochem. 201, 23-31. 2. Powning R.F. & Davidson W.J. (1976) Studies on insect bacteriolytic enzymes-ll. Some physical and enzymatic properties of Iysozyme from hemolymph of Galleria me/Ionella, Comp. Biochem. Physiol. 55, 221-228. 3. Hultmark D., Steiner H., Rasmuson T., & Boman H.G. (1980) lnsect immunity: purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hya/ophora cecropia, Eur. J. Biochem. 106, 7-16. 4. Steiner H., Hultmark D., Engström Å., Bennich H. & Boman H.G. (1981) Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity,Nature 292, 246-248.

. Hultmark D., Engström Å., Andersson K., Steiner H., Bennich H. & Boman H.G. (1983) insect immunity. Attacins, a family of antibacterial proteins from Hya/ophora cecropia, EMBO J. 4, 571-576. 6. Engström P., Carlsson A., Engström E., Tao Z-J. & Bennich H. (1984) The antibacterial effect of attacins from the silk moth Hya/ophora cecropia is dlrected against the outer membrane of Escherichia coli, EMBO J. 3, 3347- 3351. 7. Carlsson A., Engström P., Palva E.T. & Bennich H. (1991) Attacin, an antibacterial protein from Hya/ophora cecropia, inhibits synthesis of outer membrane proteins in Escherichia coli by interfering with omp gene transoription, lnfect. lmmun. 59, 3040-3045. 8. Lee, J.-Y., Boman, A., Sun, C., Andersson, M., Jörnvall, H., Mutt, V. & Boman, H. G. (1989) Antibacterial peptides from pig intestine: isolation of a mammalian cecropin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9159-9162. 9. Ando K. & Natori S. (1988) lnhibitory effect of sarcotoxin llA, an antibacterial protein of Sarcophaga peregrina, on growth of Escherichia coli, J.

Biochem. 103, 735-739. 519 350 . Hoffman J.A. & Hetru C. (1992) lnsect defensins: inducible antibacterial peptides, lmmunol. Today. 13, 411-415. 11. Keppi E. Pugsley A.P. Lambert J. Wicker C. Dimarcq J-L., Hoffman J.A. & Hoffman D. (1989) Mode of action of diptericin A, a bactericidal peptide induced in the hemolymph of Phormia terranovae larvae, Arch. lnsect.

Biochem. Physiol. 10, 229-239. 12. Sun S-C., Lindström I., Boman H.G., Faye l. & Schmidt O. (1990) Hemolin: An insect immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily, Science. 250, 1729-1732. 13. Ladendorff N.E. & Kanost M.R. (1991) Bacteria-induced protein P4 . (hemolin) from Manduca sexta: A member of the immunoglobulin superfamily which can inhibit hemocyte aggregation, Arch. lnsect Biochem. Physiol. 18, 285-300. 14. Elsbach P. & Weiss J. (1993) lmmunobiol. 187, 417-429.

. Elsbach P. & Weiss J. (1986) Phagocytic cells: Oxygen-independent antimicrobial systems, in inflammation: Basic principles and clinical correlates (Gallin J.|., Goldstein l.M. & Snyderman R., eds) pp. 445-470, Raven Press Ltd, New York. 16. Lehrer R.l., Lichtenstein A.K & Ganz T. (1993) Defensins: Antimicrobial and cytotoxic peptides of mammalian cells, Annu. Rev. lmmunol. 11, 105-128. 17. Laemmli UK. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 277, 680-685. 18. Edman P. & Begg G. (1967) A protein sequenator, Eur. J. Biochem. 1, 80- 91. 19. Pearson W.P. & Lipman D. J. (1988) improved tools for biological sequence comparison, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448.

. Devereaux J., Haeberli P. & Smithies O. (1984) A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX, Nucleic Acid Res. 12, 387-395. 21. Boman H.G. & Monner D.A. (1975) Characterization of lipopolysaccharides from Escherichia coli K-12 mutants, J. Bact. 121, 455-464. 22. Boman H.G. Eriksson-Grennberg K.G., Normark S. & Matsson E. (1968) Resistance of Escherichia co/i to penicillins. IV. Genetic study of mutants v . | o ~ o nu 519 350 16 resistant to D, l-ampicillin concentrations of 100 ug/ml, Genet. Res (Cambridge) 12, 169-185. 23. Rasmuson T. & Boman H.G. (1977) in Developmental lmmunology( Solomon J.B & Horton J.D., eds) pp. 83-90, Elsevier/North-Holland Biomedícal Press, Amsterdam.

Claims (10)

519 350 :..=_¿¿_ ..¿,:..; /7 PATENTKRAV

1. Antibakteriellt protein som endast har effekt mot gram-negativa bakterier, kännetecknar. av att det har aminosyrasekvensen som visas i figur 2 eller en aminosyrasekvens som är väsentligen homolog med denna.

2. Antibakteriellt protein enligt krav l, kännetecknat av att det har en approximativ molekylvikt av 14 kD och en approximativ isoelektrisk punkt av 9.

3. Antibakteriellt protein enligt krav 1 eller 2, härlett från Lepídoptera.

4. Antibakteriellt protein enligt krav 3, härlett från Hyalophora-íjärilar, varvid molekylvikten är cirka 13,8 kD och pl är 8,5.

5. Antibakteriellt protein enligt krav 4, kännetecknar. av att det kodas av en DNA-sekvens härledd från aminosyrasekvensen visad i figur 2 eller från en aminosyrasekvens som är väsentligen homolog med denna.

6. Antibakteriellt protein enligt krav 1, som har producerats genom genetisk manipulering eller kemisk syntes.

7. Farmaceutisk komposition, kännetecknad av att den innefattar antibakteriellt protein enligt något av kraven 1-6 eller godtyckligt antibakteriellt aktivt fragment därav som endast har effekt mot gram-negativa bakterier.

8. Farmaceutisk komposition enligt krav 7, kännetecknad av att den innefattar konventionella antibakteriella medel förutom det antibakteriella proteinet eller fragmenten.

9. Farmaceutisk komposition enligt krav 8, kännetecknad av att de konventionella antibakteriella medlen är antibiotika och / eller cellnedbrytande medel, såsom enzymer och detergenter. IX

10. Antibakteriellt protein enligt krav 1 eller farmaceutisk aktiva fragment därav som endast har effekt mot gram-negativa bakterier för användning som ett läkemedel.