JP3521331B2 - 新規ポリペプチド - Google Patents
新規ポリペプチドInfo
- Publication number
- JP3521331B2 JP3521331B2 JP2002545153A JP2002545153A JP3521331B2 JP 3521331 B2 JP3521331 B2 JP 3521331B2 JP 2002545153 A JP2002545153 A JP 2002545153A JP 2002545153 A JP2002545153 A JP 2002545153A JP 3521331 B2 JP3521331 B2 JP 3521331B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- seq
- sequence represented
- amino acid
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規ポリペプチドに関する。
背景技術
変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；以
下、ＯＡと略称することがある）は、関節軟骨の損傷及
び／又は変性を主病変とする関節疾患の中でも、最も患
者数の多い疾患である。ＯＡ疾患に対する現行の薬物治
療法では、痛みを軽減する目的で対症療法的に鎮痛消炎
剤やヒアルロン酸製剤が用いられていて、充分な治療効
果を上げているとは言えない状況にあり、最終的には外
科的治療が必要な状態に至る。
下、ＯＡと略称することがある）は、関節軟骨の損傷及
び／又は変性を主病変とする関節疾患の中でも、最も患
者数の多い疾患である。ＯＡ疾患に対する現行の薬物治
療法では、痛みを軽減する目的で対症療法的に鎮痛消炎
剤やヒアルロン酸製剤が用いられていて、充分な治療効
果を上げているとは言えない状況にあり、最終的には外
科的治療が必要な状態に至る。
関節軟骨は自己修復能に乏しい組織と考えられてお
り、ＯＡ病態における関節軟骨の修復を目的とした治療
法の開発の一例としては、関節軟骨細胞を生体から取り
出して、イン・ビトロ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ）で培養して
増殖させ、欠損した関節部位に埋め戻すという方法があ
る。しかし、この方法は、外科手術を必要とする上に多
くの問題点を抱えていて、治療法としては確立していな
い（Ｏｎｓｔｏｔｔ Ａ．Ｔ．ら，ＡＯＲＮ Ｊ．，７
１，８４３−８４５，８４８−８５１，２０００）。ま
た、軟骨細胞の分化誘導活性を示す各種生理活性物質を
治療剤として用いる試みがされているが、軟骨を欠損さ
せた関節を作成した動物モデルで効果を検証している段
階に留まっていて、臨床応用まで至っていない（Ｓｅｌ
ｌｅｒｓ Ｒ．Ｓ．ら，Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ
Ｓｕｒｇ．Ａｍ．，７９Ａ，１４５２−１４６３，１９
９７；及びＴｒｉｐｐｅｌ Ｓ．Ｂ．，Ｊ．Ｒｈｅｕｍ
ａｔｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．，４３，１２９−１３２，１９
９５）。
り、ＯＡ病態における関節軟骨の修復を目的とした治療
法の開発の一例としては、関節軟骨細胞を生体から取り
出して、イン・ビトロ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ）で培養して
増殖させ、欠損した関節部位に埋め戻すという方法があ
る。しかし、この方法は、外科手術を必要とする上に多
くの問題点を抱えていて、治療法としては確立していな
い（Ｏｎｓｔｏｔｔ Ａ．Ｔ．ら，ＡＯＲＮ Ｊ．，７
１，８４３−８４５，８４８−８５１，２０００）。ま
た、軟骨細胞の分化誘導活性を示す各種生理活性物質を
治療剤として用いる試みがされているが、軟骨を欠損さ
せた関節を作成した動物モデルで効果を検証している段
階に留まっていて、臨床応用まで至っていない（Ｓｅｌ
ｌｅｒｓ Ｒ．Ｓ．ら，Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ
Ｓｕｒｇ．Ａｍ．，７９Ａ，１４５２−１４６３，１９
９７；及びＴｒｉｐｐｅｌ Ｓ．Ｂ．，Ｊ．Ｒｈｅｕｍ
ａｔｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．，４３，１２９−１３２，１９
９５）。
軟骨組織の内部には、血管、神経、及びリンパ管が存
在しない。関節軟骨は、軟骨細胞と、軟骨細胞が産生す
る細胞外基質とで構成されており、関節軟骨細胞が産生
するII型コラーゲンやプロテオグリカンなどの細胞外基
質は、軟骨組織に特有の弾性と硬度、圧力に対する抵抗
性を持たせて、関節軟骨として機能するために重要な役
割を担っている［Ｈｕｂｅｒ Ｍ．ら，Ｉｎｖｅｓｔｉ
ｇａｔｉｖｅ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，３５（１０），５
７３−５８０，２０００］。しかし、ＯＡ疾患では、関
節軟骨組織の変性破壊やコラーゲンの繊維化が引き起こ
されており、特に、II型コラーゲンが分解されて、正常
に機能するII型コラーゲンの減少が顕著である［Ｈｏｌ
ｌａｎｄｅｒ Ａ．Ｐ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．，９３（４），１７２２−１７３２，１９９４］。
在しない。関節軟骨は、軟骨細胞と、軟骨細胞が産生す
る細胞外基質とで構成されており、関節軟骨細胞が産生
するII型コラーゲンやプロテオグリカンなどの細胞外基
質は、軟骨組織に特有の弾性と硬度、圧力に対する抵抗
性を持たせて、関節軟骨として機能するために重要な役
割を担っている［Ｈｕｂｅｒ Ｍ．ら，Ｉｎｖｅｓｔｉ
ｇａｔｉｖｅ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，３５（１０），５
７３−５８０，２０００］。しかし、ＯＡ疾患では、関
節軟骨組織の変性破壊やコラーゲンの繊維化が引き起こ
されており、特に、II型コラーゲンが分解されて、正常
に機能するII型コラーゲンの減少が顕著である［Ｈｏｌ
ｌａｎｄｅｒ Ａ．Ｐ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．，９３（４），１７２２−１７３２，１９９４］。
アグリカンは、II型コラーゲン同様、関節軟骨細胞よ
り産生されていて、軟骨組織を構成する主要なプロテオ
グリカンである。アグリカンは、関節軟骨として機能す
るために重要な役割を担っているが、ＯＡ疾患では、ア
グリカンの分解及び変性が観察されている［Ｎｅａｍｅ
Ｐ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｆｌａ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，８
１（３），１９１−１９３，１９９４］。
り産生されていて、軟骨組織を構成する主要なプロテオ
グリカンである。アグリカンは、関節軟骨として機能す
るために重要な役割を担っているが、ＯＡ疾患では、ア
グリカンの分解及び変性が観察されている［Ｎｅａｍｅ
Ｐ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｆｌａ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，８
１（３），１９１−１９３，１９９４］。
発明の開示
本発明は、ＯＡ治療に有用な、II型コラーゲン産生促
進活性及び／又はアグリカン産生促進活性を有する物質
の提供、並びに、新規なＯＡ治療及び／又は予防用医薬
組成物の提供を課題としている。
進活性及び／又はアグリカン産生促進活性を有する物質
の提供、並びに、新規なＯＡ治療及び／又は予防用医薬
組成物の提供を課題としている。
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行
なった結果、II型コラーゲン産生促進活性を示す新規ポ
リペプチドをコードする新規ポリヌクレオチドを見出し
た。次いで、前記ポリヌクレオチドのｍＲＮＡの発現分
布を解析し、関節軟骨組織に特異的に発現していること
を確認した。また、前記ポリヌクレオチドは、ＯＡの遺
伝的要因となる感受性遺伝子が存在するとして知られて
いる。ヒト染色体の１１ｑ２２に存在することを確認し
た。そして、前記ポリペプチドをヒト関節軟骨細胞中で
過剰発現させることにより、II型コラーゲン産生及びア
グリカン産生を促進することを確認し、前記ポリペプチ
ドが、ＯＡ治療及び／又は予防用に有用であることを明
らかにし、本発明を完成した。
なった結果、II型コラーゲン産生促進活性を示す新規ポ
リペプチドをコードする新規ポリヌクレオチドを見出し
た。次いで、前記ポリヌクレオチドのｍＲＮＡの発現分
布を解析し、関節軟骨組織に特異的に発現していること
を確認した。また、前記ポリヌクレオチドは、ＯＡの遺
伝的要因となる感受性遺伝子が存在するとして知られて
いる。ヒト染色体の１１ｑ２２に存在することを確認し
た。そして、前記ポリペプチドをヒト関節軟骨細胞中で
過剰発現させることにより、II型コラーゲン産生及びア
グリカン産生を促進することを確認し、前記ポリペプチ
ドが、ＯＡ治療及び／又は予防用に有用であることを明
らかにし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列におけ
る第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列を有す
るポリペプチド、又は（２）配列番号２で表されるアミ
ノ酸配列における第２３番〜第３８８番のアミノ酸から
なる配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個の
アミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸
配列を有し、しかも、II型コラーゲン産生促進活性及び
／又はアグリカン産生促進活性を示すポリペプチド； ［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２
３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列を含み、しか
も、II型コラーゲン産生促進活性及び／又はアグリカン
産生促進活性を示すポリペプチド； ［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２
３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列、又は配列番
号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上で
あるアミノ酸配列を有し、しかも、II型コラーゲン産生
促進活性及び／又はアグリカン産生促進活性を示すポリ
ペプチド； ［４］II型コラーゲン産生促進活性及びアグリカン産生
促進活性を有する、［１］〜［３］記載のポリペプチ
ド； ［５］配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１
番〜第３８８番又は第２３番〜第３８８番のアミノ酸か
らなる配列を有するポリペプチド； ［６］［１］〜［５］記載のポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド； ［７］［６］記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクタ
ー； ［８］［７］記載の発現ベクターでトランスフェクショ
ンされた細胞； ［９］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記載
のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクター
と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含む、II
型コラーゲン産生促進用医薬組成物； ［１０］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記
載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクター
と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含む、ア
グリカン産生促進用医薬組成物； ［１１］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記
載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクター
と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含む、変
形性関節症治療及び／又は予防用医薬組成物； ［１２］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記
載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクター
を、II型コラーゲン産生促進が必要な対象に、有効量で
投与することを含む、II型コラーゲン産生を促進する方
法； ［１３］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記
載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクター
を、アグリカン産生促進が必要な対象に、有効量で投与
することを含む、アグリカン産生を促進する方法； ［１４］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記
載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクター
を、変形性関節症の治療及び／又は予防が必要な対象
に、有効量で投与することを含む、変形性関節症を治療
及び／又は予防する方法； ［１５］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記
載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクター
の、II型コラーゲン産生促進用医薬組成物、アグリカン
産生促進用医薬組成物、あるいは、変形性関節症治療及
び／又は予防用医薬組成物を製造するための使用；並び
に ［１６］［１］〜［５］記載のポリペプチドに結合する
抗体又はその断片 に関する。
る第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列を有す
るポリペプチド、又は（２）配列番号２で表されるアミ
ノ酸配列における第２３番〜第３８８番のアミノ酸から
なる配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個の
アミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸
配列を有し、しかも、II型コラーゲン産生促進活性及び
／又はアグリカン産生促進活性を示すポリペプチド； ［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２
３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列を含み、しか
も、II型コラーゲン産生促進活性及び／又はアグリカン
産生促進活性を示すポリペプチド； ［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２
３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列、又は配列番
号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上で
あるアミノ酸配列を有し、しかも、II型コラーゲン産生
促進活性及び／又はアグリカン産生促進活性を示すポリ
ペプチド； ［４］II型コラーゲン産生促進活性及びアグリカン産生
促進活性を有する、［１］〜［３］記載のポリペプチ
ド； ［５］配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１
番〜第３８８番又は第２３番〜第３８８番のアミノ酸か
らなる配列を有するポリペプチド； ［６］［１］〜［５］記載のポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド； ［７］［６］記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクタ
ー； ［８］［７］記載の発現ベクターでトランスフェクショ
ンされた細胞； ［９］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記載
のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクター
と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含む、II
型コラーゲン産生促進用医薬組成物； ［１０］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記
載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクター
と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含む、ア
グリカン産生促進用医薬組成物； ［１１］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記
載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクター
と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含む、変
形性関節症治療及び／又は予防用医薬組成物； ［１２］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記
載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクター
を、II型コラーゲン産生促進が必要な対象に、有効量で
投与することを含む、II型コラーゲン産生を促進する方
法； ［１３］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記
載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクター
を、アグリカン産生促進が必要な対象に、有効量で投与
することを含む、アグリカン産生を促進する方法； ［１４］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記
載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクター
を、変形性関節症の治療及び／又は予防が必要な対象
に、有効量で投与することを含む、変形性関節症を治療
及び／又は予防する方法； ［１５］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記
載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクター
の、II型コラーゲン産生促進用医薬組成物、アグリカン
産生促進用医薬組成物、あるいは、変形性関節症治療及
び／又は予防用医薬組成物を製造するための使用；並び
に ［１６］［１］〜［５］記載のポリペプチドに結合する
抗体又はその断片 に関する。
図面の簡単な説明
図１は、ヒト間葉系幹細胞の軟骨分化前後での、配列
番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明のポリペ
プチドをコードする遺伝子の発現を示すグラフである。
番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明のポリペ
プチドをコードする遺伝子の発現を示すグラフである。
図２は、感染後７日目のII型コラーゲン遺伝子の発現
量を示すグラフである。
量を示すグラフである。
図３は、感染後４日目のアグリカン遺伝子の発現量を
示すグラフである。
示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２
３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列を有するポリ
ペプチド（以下、「ポリペプチド２３／３８８」と称す
ることがある）； （２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２
３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列（すなわち、
「ポリペプチド２３／３８８」のアミノ酸配列）の１又
は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠
失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、
しかも、II型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関
節軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進活性）及び／又は
アグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞の
アグリカン産生促進活性）を示すポリペプチド（以下、
機能的等価改変体と称する）；及び （３）「ポリペプチド２３／３８８」のアミノ酸配列又
は配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０
％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、II型コラー
ゲン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のII型コ
ラーゲン産生促進活性）及び／又はアグリカン産生促進
活性（好ましくは、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進
活性）を示すポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと
称する）が含まれる。
３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列を有するポリ
ペプチド（以下、「ポリペプチド２３／３８８」と称す
ることがある）； （２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２
３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列（すなわち、
「ポリペプチド２３／３８８」のアミノ酸配列）の１又
は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠
失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、
しかも、II型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関
節軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進活性）及び／又は
アグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞の
アグリカン産生促進活性）を示すポリペプチド（以下、
機能的等価改変体と称する）；及び （３）「ポリペプチド２３／３８８」のアミノ酸配列又
は配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０
％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、II型コラー
ゲン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のII型コ
ラーゲン産生促進活性）及び／又はアグリカン産生促進
活性（好ましくは、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進
活性）を示すポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと
称する）が含まれる。
本発明のポリペプチドである前記ポリペプチド（１）
〜（３）の内、II型コラーゲン産生促進活性（好ましく
は、関節軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進活性）及び
アグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞の
アグリカン産生促進活性）を併せ持つポリペプチドがよ
り好ましい。
〜（３）の内、II型コラーゲン産生促進活性（好ましく
は、関節軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進活性）及び
アグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞の
アグリカン産生促進活性）を併せ持つポリペプチドがよ
り好ましい。
本発明のポリペプチドの１つである、分泌シグナル配
列が切断されたポリペプチド（Ｎ末端が、配列番号２で
表されるアミノ酸配列における第２３番目のアミノ酸、
すなわち、ポリペプチド２３／３８８であると推定され
る）は、II型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関
節軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進活性）を示し、し
かも、アグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨
細胞のアグリカン産生促進活性）も併せ持つ。
列が切断されたポリペプチド（Ｎ末端が、配列番号２で
表されるアミノ酸配列における第２３番目のアミノ酸、
すなわち、ポリペプチド２３／３８８であると推定され
る）は、II型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関
節軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進活性）を示し、し
かも、アグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨
細胞のアグリカン産生促進活性）も併せ持つ。
本明細書において、或るポリペプチドが「II型コラー
ゲン産生促進活性（特には、関節軟骨細胞のII型コラー
ゲン産生促進活性）」を示すか否かは、特に限定される
ものではないが、例えば、以下の方法（好ましくは、後
述の実施例１２に記載の方法、又は後述の実施例１６に
記載の方法）により確認することができる。すなわち、
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む
発現ベクターと、前記ポリヌクレオチドを含まないコン
トロール用発現ベクターとで、それぞれ、所望の細胞
（特には、ヒト関節軟骨細胞）をトランスフェクション
し、所定日数（例えば、３日間）が経過した後、それぞ
れの細胞におけるII型コラーゲンｍＲＮＡの発現量を測
定する。コントロール用発現ベクターでトランスフェク
ションした細胞に比べて、前記ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェ
クションした細胞におけるII型コラーゲンｍＲＮＡの発
現量が上昇していれば、前記ポリペプチドが「II型コラ
ーゲン産生促進活性（特には、関節軟骨細胞のII型コラ
ーゲン産生促進活性）」を示すと判定することができ
る。
ゲン産生促進活性（特には、関節軟骨細胞のII型コラー
ゲン産生促進活性）」を示すか否かは、特に限定される
ものではないが、例えば、以下の方法（好ましくは、後
述の実施例１２に記載の方法、又は後述の実施例１６に
記載の方法）により確認することができる。すなわち、
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む
発現ベクターと、前記ポリヌクレオチドを含まないコン
トロール用発現ベクターとで、それぞれ、所望の細胞
（特には、ヒト関節軟骨細胞）をトランスフェクション
し、所定日数（例えば、３日間）が経過した後、それぞ
れの細胞におけるII型コラーゲンｍＲＮＡの発現量を測
定する。コントロール用発現ベクターでトランスフェク
ションした細胞に比べて、前記ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェ
クションした細胞におけるII型コラーゲンｍＲＮＡの発
現量が上昇していれば、前記ポリペプチドが「II型コラ
ーゲン産生促進活性（特には、関節軟骨細胞のII型コラ
ーゲン産生促進活性）」を示すと判定することができ
る。
あるいは、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドを含むウイルスベクターをトランスフェクトして
得られるウイルスと、前記ポリヌクレオチドを含まない
コントロール用ウイルスベクターをトランスフェクトし
て得られるコントロール用ウイルスとを、それぞれ、所
望の細胞（特には、ヒト関節軟骨細胞）に感染させ、所
定日数（例えば、４日間又は７日間）が経過した後、そ
れぞれの細胞におけるII型コラーゲンｍＲＮＡの発現量
を測定する。コントロール用ウイルスを感染させた細胞
に比べて、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを含むウイルスベクターをトランスフェクトして得
られるウイルスを感染させた細胞におけるII型コラーゲ
ンｍＲＮＡの発現量が上昇していれば、前記ポリペプチ
ドが「II型コラーゲン産生促進活性（特には、関節軟骨
細胞のII型コラーゲン産生促進活性）」を示すと判定す
ることができる。
オチドを含むウイルスベクターをトランスフェクトして
得られるウイルスと、前記ポリヌクレオチドを含まない
コントロール用ウイルスベクターをトランスフェクトし
て得られるコントロール用ウイルスとを、それぞれ、所
望の細胞（特には、ヒト関節軟骨細胞）に感染させ、所
定日数（例えば、４日間又は７日間）が経過した後、そ
れぞれの細胞におけるII型コラーゲンｍＲＮＡの発現量
を測定する。コントロール用ウイルスを感染させた細胞
に比べて、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを含むウイルスベクターをトランスフェクトして得
られるウイルスを感染させた細胞におけるII型コラーゲ
ンｍＲＮＡの発現量が上昇していれば、前記ポリペプチ
ドが「II型コラーゲン産生促進活性（特には、関節軟骨
細胞のII型コラーゲン産生促進活性）」を示すと判定す
ることができる。
本明細書において、或るポリペプチドが「アグリカン
産生促進活性（特には、関節軟骨細胞のアグリカン産生
促進活性）」を示すか否かは、特に限定されるものでは
ないが、例えば、以下の方法（好ましくは、後述の実施
例１６に記載の方法）により確認することができる。す
なわち、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを含むウイルスベクターをトランスフェクトして得ら
れるウイルスと、前記ポリヌクレオチドを含まないコン
トロール用ウイルスベクターをトランスフェクトして得
られるコントロール用ウイルスとを、それぞれ、所望の
細胞（特には、ヒト関節軟骨細胞）に感染させ、所定日
数（例えば、４日間又は７日間）が経過した後、それぞ
れの細胞におけるアグリカンｍＲＮＡの発現量を測定す
る。コントロール用ウイルスを感染させた細胞に比べ
て、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
含むウイルスベクターをトランスフェクトして得られる
ウイルスを感染させた細胞におけるアグリカンｍＲＮＡ
の発現量が上昇していれば、前記ポリペプチドが「アグ
リカン産生促進活性（特には、関節軟骨細胞のアグリカ
ン産生促進活性）」を示すと判定することができる。
産生促進活性（特には、関節軟骨細胞のアグリカン産生
促進活性）」を示すか否かは、特に限定されるものでは
ないが、例えば、以下の方法（好ましくは、後述の実施
例１６に記載の方法）により確認することができる。す
なわち、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを含むウイルスベクターをトランスフェクトして得ら
れるウイルスと、前記ポリヌクレオチドを含まないコン
トロール用ウイルスベクターをトランスフェクトして得
られるコントロール用ウイルスとを、それぞれ、所望の
細胞（特には、ヒト関節軟骨細胞）に感染させ、所定日
数（例えば、４日間又は７日間）が経過した後、それぞ
れの細胞におけるアグリカンｍＲＮＡの発現量を測定す
る。コントロール用ウイルスを感染させた細胞に比べ
て、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
含むウイルスベクターをトランスフェクトして得られる
ウイルスを感染させた細胞におけるアグリカンｍＲＮＡ
の発現量が上昇していれば、前記ポリペプチドが「アグ
リカン産生促進活性（特には、関節軟骨細胞のアグリカ
ン産生促進活性）」を示すと判定することができる。
本発明の機能的等価改変体は、ポリペプチド２３／３
８８のアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又
は複数個（好ましくは１〜２２個、より好ましくは１〜
１０個、更に好ましくは１〜５個）、例えば、１〜数個
のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ
酸配列を有し、しかも、II型コラーゲン産生促進活性
（好ましくは、関節軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進
活性）及び／又はアグリカン産生促進活性（好ましく
は、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性）を示すこ
とができるポリペプチド（例えば、ポリペプチド２３／
３８８のアミノ酸配列を含み、しかも、II型コラーゲン
産生促進活性及び／又はアグリカン産生促進活性を示す
ポリペプチド）である限り、特に限定されるものではな
いが、II型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関節
軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進活性）及びアグリカ
ン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のアグリカ
ン産生促進活性）を併せ持つポリペプチドであることが
より好ましい。
８８のアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又
は複数個（好ましくは１〜２２個、より好ましくは１〜
１０個、更に好ましくは１〜５個）、例えば、１〜数個
のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ
酸配列を有し、しかも、II型コラーゲン産生促進活性
（好ましくは、関節軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進
活性）及び／又はアグリカン産生促進活性（好ましく
は、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性）を示すこ
とができるポリペプチド（例えば、ポリペプチド２３／
３８８のアミノ酸配列を含み、しかも、II型コラーゲン
産生促進活性及び／又はアグリカン産生促進活性を示す
ポリペプチド）である限り、特に限定されるものではな
いが、II型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関節
軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進活性）及びアグリカ
ン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のアグリカ
ン産生促進活性）を併せ持つポリペプチドであることが
より好ましい。
本発明の機能的等価改変体の起源はヒトに限定されな
い。例えば、ポリペプチド２３／３８８のヒトにおける
変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例え
ば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来の機
能的等価改変体が含まれる。更には、それらの天然ポリ
ペプチド（すなわち、ヒト由来の変異体、又はヒト以外
の生物由来の機能的等価改変体）又はポリペプチド２３
／３８８を元にして遺伝子工学的に人為的に改変したポ
リペプチドなどが含まれる。なお、本明細書において
「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同
一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の
相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
い。例えば、ポリペプチド２３／３８８のヒトにおける
変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例え
ば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来の機
能的等価改変体が含まれる。更には、それらの天然ポリ
ペプチド（すなわち、ヒト由来の変異体、又はヒト以外
の生物由来の機能的等価改変体）又はポリペプチド２３
／３８８を元にして遺伝子工学的に人為的に改変したポ
リペプチドなどが含まれる。なお、本明細書において
「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同
一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の
相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
ポリペプチド２３／３８８のヒトにおける変異体、又
はヒト以外の生物由来の機能的等価改変体は、当業者で
あれば、ポリペプチド２３／３８８の遺伝子の塩基配列
（例えば、配列表の配列番号１で表される塩基配列にお
ける第１０３番〜第１２０３番の塩基からなる配列）の
情報を基にして、取得することができる。なお、遺伝子
組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方
法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｕｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９等の遺
伝子操作実験マニュアル）に従って実施することが可能
である。
はヒト以外の生物由来の機能的等価改変体は、当業者で
あれば、ポリペプチド２３／３８８の遺伝子の塩基配列
（例えば、配列表の配列番号１で表される塩基配列にお
ける第１０３番〜第１２０３番の塩基からなる配列）の
情報を基にして、取得することができる。なお、遺伝子
組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方
法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｕｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９等の遺
伝子操作実験マニュアル）に従って実施することが可能
である。
例えば、ポリペプチド２３／３８８の遺伝子の塩基配
列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設
計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物
［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、
ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮ
Ａ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又は
ファージライブラリー）とを用いてポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）又はハイブ
リダイゼーション法を実施することにより、ポリペプチ
ドの遺伝子を取得し、その遺伝子を適当な発現系を用い
て発現させ、発現したポリペプチドが、例えば、実施例
１２に記載の方法により、関節軟骨細胞のII型コラーゲ
ン産生促進活性を示すことを確認することにより、ある
いは、実施例１６に記載の方法により、関節軟骨細胞の
アグリカン産生促進活性を示すことを確認することによ
り、所望のポリペプチドを取得することができる。
列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設
計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物
［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、
ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮ
Ａ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又は
ファージライブラリー）とを用いてポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）又はハイブ
リダイゼーション法を実施することにより、ポリペプチ
ドの遺伝子を取得し、その遺伝子を適当な発現系を用い
て発現させ、発現したポリペプチドが、例えば、実施例
１２に記載の方法により、関節軟骨細胞のII型コラーゲ
ン産生促進活性を示すことを確認することにより、ある
いは、実施例１６に記載の方法により、関節軟骨細胞の
アグリカン産生促進活性を示すことを確認することによ
り、所望のポリペプチドを取得することができる。
また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変したポリペ
プチドは、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法
（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１
９８４）により、ポリペプチドの遺伝子を取得し、その
遺伝子を適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリ
ペプチドが、例えば、実施例１２に記載の方法により、
関節軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進活性を示すこと
を確認することにより、あるいは、実施例１６に記載の
方法により、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性を
示すことを確認することにより、所望のポリペプチドを
取得することができる。
プチドは、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法
（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１
９８４）により、ポリペプチドの遺伝子を取得し、その
遺伝子を適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリ
ペプチドが、例えば、実施例１２に記載の方法により、
関節軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進活性を示すこと
を確認することにより、あるいは、実施例１６に記載の
方法により、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性を
示すことを確認することにより、所望のポリペプチドを
取得することができる。
また、本発明の機能的等価改変体には、ポリペプチド
２３／３８８［あるいは、ポリペプチド２３／３８８の
アミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数
個（好ましくは１〜２２個、より好ましくは１〜１０
個、更に好ましくは１〜５個）、例えば、１〜数個のア
ミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配
列を有するポリペプチド］を含むポリペプチド、例え
ば、Ｎ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等
を付加したポリペプチド（すなわち、融合ポリペプチ
ド）も、II型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関
節軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進活性）及び／又は
アグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞の
アグリカン産生促進活性）を示す限り、含まれる。
２３／３８８［あるいは、ポリペプチド２３／３８８の
アミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数
個（好ましくは１〜２２個、より好ましくは１〜１０
個、更に好ましくは１〜５個）、例えば、１〜数個のア
ミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配
列を有するポリペプチド］を含むポリペプチド、例え
ば、Ｎ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等
を付加したポリペプチド（すなわち、融合ポリペプチ
ド）も、II型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関
節軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進活性）及び／又は
アグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞の
アグリカン産生促進活性）を示す限り、含まれる。
前記マーカー配列としては、ポリペプチドの発現の確
認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行な
うための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧエ
ピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン
・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができ
る。
認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行な
うための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧエ
ピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン
・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができ
る。
更に、本発明の機能的等価改変体には、配列番号２で
表されるアミノ酸配列（すなわち、配列番号２で表され
アミノ酸配列における第１番〜第３８８番のアミノ酸か
らなる配列）からなるポリペプチドそれ自体、配列番号
２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所におい
て、１又は複数個（好ましくは１〜２２個、より好まし
くは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個）、例えば、
１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加され
たアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは、これ
らのポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当な
マーカー配列等を付加したポリペプチド（すなわち、融
合ポリペプチド）も、II型コラーゲン産生促進活性（好
ましくは、関節軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進活
性）及び／又はアグリカン産生促進活性（好ましくは、
関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性）を示す限り、
含まれる。
表されるアミノ酸配列（すなわち、配列番号２で表され
アミノ酸配列における第１番〜第３８８番のアミノ酸か
らなる配列）からなるポリペプチドそれ自体、配列番号
２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所におい
て、１又は複数個（好ましくは１〜２２個、より好まし
くは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個）、例えば、
１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加され
たアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは、これ
らのポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当な
マーカー配列等を付加したポリペプチド（すなわち、融
合ポリペプチド）も、II型コラーゲン産生促進活性（好
ましくは、関節軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進活
性）及び／又はアグリカン産生促進活性（好ましくは、
関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性）を示す限り、
含まれる。
本発明の相同ポリペプチドは、ポリペプチド２３／３
８８のアミノ酸配列又は配列番号２で表されるアミノ酸
配列（すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列に
おける第１番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列）と
の相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しか
も、II型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関節軟
骨細胞のII型コラーゲン産生促進活性）及び／又はアグ
リカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のアグ
リカン産生促進活性）を示すポリペプチドである限り、
特に限定されるものではないが、ポリペプチド２３／３
８８のアミノ酸配列又は配列番号２で表されるアミノ酸
配列に関して、好ましくは９５％以上、より好ましくは
９８％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有す
るアミノ酸配列を有することができる。また、II型コラ
ーゲン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のII型
コラーゲン産生促進活性）及びアグリカン産生促進活性
（好ましくは、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活
性）を併せ持つポリペプチドであることがより好まし
い。
８８のアミノ酸配列又は配列番号２で表されるアミノ酸
配列（すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列に
おける第１番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列）と
の相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しか
も、II型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関節軟
骨細胞のII型コラーゲン産生促進活性）及び／又はアグ
リカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のアグ
リカン産生促進活性）を示すポリペプチドである限り、
特に限定されるものではないが、ポリペプチド２３／３
８８のアミノ酸配列又は配列番号２で表されるアミノ酸
配列に関して、好ましくは９５％以上、より好ましくは
９８％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有す
るアミノ酸配列を有することができる。また、II型コラ
ーゲン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のII型
コラーゲン産生促進活性）及びアグリカン産生促進活性
（好ましくは、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活
性）を併せ持つポリペプチドであることがより好まし
い。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡ
ＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｎｇｍｅｎｔ
ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．
ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１
０，１９９０）検索により得られた値を意味し、アミノ
酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用い
て決定することができる。具体的には、ＢＬＡＳＴパッ
ケージ（ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１
２；ＮＣＢＩより入手）のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔ
ａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ及びＴｈｏｍａｓ
Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用
い、デフォルトパラメーターに従って算出することがで
きる。ペアワイズ・アラインメント・パラメーターとし
て、プログラム名「ｂｌａｓｔｐ」を使用し、Ｇａｐ挿
入Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値を
「０」で、Ｑｕｅｒｙ配列のフィルターとして「ＳＥ
Ｇ」を、Ｍａｔｒｉｘとして「ＢＬＯＳＵＭ６２」をそ
れぞれ使用する。
ＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｎｇｍｅｎｔ
ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．
ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１
０，１９９０）検索により得られた値を意味し、アミノ
酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用い
て決定することができる。具体的には、ＢＬＡＳＴパッ
ケージ（ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１
２；ＮＣＢＩより入手）のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔ
ａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ及びＴｈｏｍａｓ
Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用
い、デフォルトパラメーターに従って算出することがで
きる。ペアワイズ・アラインメント・パラメーターとし
て、プログラム名「ｂｌａｓｔｐ」を使用し、Ｇａｐ挿
入Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値を
「０」で、Ｑｕｅｒｙ配列のフィルターとして「ＳＥ
Ｇ」を、Ｍａｔｒｉｘとして「ＢＬＯＳＵＭ６２」をそ
れぞれ使用する。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド
をコードする限り、特に限定されるものではなく、例え
ば、配列表の配列番号１で表される塩基配列における第
１０３番〜第１２０３番の塩基からなる配列、あるい
は、配列表の配列番号１で表される塩基配列における第
３７番〜第１２０３番の塩基からなる配列を有するポリ
ヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書に
おける用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮ
Ａの両方が含まれる。配列表の配列番号１で表される塩
基配列における第１０３番〜第１２０３番の塩基からな
る配列を有する前記ポリヌクレオチドは、ポリペプチド
２３／３８８をコードする。また、配列表の配列番号１
で表される塩基配列における第３７番〜第１２０３番の
塩基からなる配列を有する前記ポリヌクレオチドは、配
列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードする。
をコードする限り、特に限定されるものではなく、例え
ば、配列表の配列番号１で表される塩基配列における第
１０３番〜第１２０３番の塩基からなる配列、あるい
は、配列表の配列番号１で表される塩基配列における第
３７番〜第１２０３番の塩基からなる配列を有するポリ
ヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書に
おける用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮ
Ａの両方が含まれる。配列表の配列番号１で表される塩
基配列における第１０３番〜第１２０３番の塩基からな
る配列を有する前記ポリヌクレオチドは、ポリペプチド
２３／３８８をコードする。また、配列表の配列番号１
で表される塩基配列における第３７番〜第１２０３番の
塩基からなる配列を有する前記ポリヌクレオチドは、配
列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードする。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の組換えポリペ
プチドを製造するために用いることができるばかりでな
く、遺伝子治療により体内で本発明のポリペプチドを産
生させるために用いることもできる。
プチドを製造するために用いることができるばかりでな
く、遺伝子治療により体内で本発明のポリペプチドを産
生させるために用いることもできる。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定さ
れるものではないが、例えば、（１）ＰＣＲを用いた方
法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮ
Ａライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望の
ｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方
法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。
以下、各製造方法について、順次、説明する。
れるものではないが、例えば、（１）ＰＣＲを用いた方
法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮ
Ａライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望の
ｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方
法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。
以下、各製造方法について、順次、説明する。
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、以下の手順によ
り、本発明のポリヌクレオチドを製造することができ
る。
り、本発明のポリヌクレオチドを製造することができ
る。
すなわち、本発明のポリペプチドを産生する能力を有
するヒト細胞又は組織からｍＲＮＡを抽出する。次い
で、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドの塩基配列に基づいて、本発明のポリペプチドに相当
するｍＲＮＡの全長を挟むことのできる２個１組のプラ
イマーセット、あるいは、その一部のｍＲＮＡ領域を挟
むことのできる２個１組のプライマーセットを作成す
る。変性温度又は変性剤添加条件などを適宜選択し、作
成した各々のプライマーセットに適した逆転写酵素−ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なうことによ
り、本発明のポリペプチドの全長ｃＤＮＡ又はその一部
を得ることができる。
するヒト細胞又は組織からｍＲＮＡを抽出する。次い
で、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドの塩基配列に基づいて、本発明のポリペプチドに相当
するｍＲＮＡの全長を挟むことのできる２個１組のプラ
イマーセット、あるいは、その一部のｍＲＮＡ領域を挟
むことのできる２個１組のプライマーセットを作成す
る。変性温度又は変性剤添加条件などを適宜選択し、作
成した各々のプライマーセットに適した逆転写酵素−ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なうことによ
り、本発明のポリペプチドの全長ｃＤＮＡ又はその一部
を得ることができる。
あるいは、本発明のポリペプチドを産生する能力を有
するヒト細胞又は組織から調製したｍＲＮＡから逆転写
酵素により作製したｃＤＮＡ、あるいは、市販のヒト細
胞又は組織由来のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行な
うことにより、本発明のポリペプチドの全長ｃＤＮＡ又
はその一部を得ることができる。
するヒト細胞又は組織から調製したｍＲＮＡから逆転写
酵素により作製したｃＤＮＡ、あるいは、市販のヒト細
胞又は組織由来のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行な
うことにより、本発明のポリペプチドの全長ｃＤＮＡ又
はその一部を得ることができる。
より詳細には、まず、本発明のポリペプチドの産生能
力を有する細胞又は組織から、本発明のポリペプチドを
コードするｍＲＮＡを含む総ＲＮＡを既知の方法により
抽出する。抽出法としては、例えば、グアニジン・チオ
シアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオ
シアネート−グアニジン・塩酸法、又はグアニジン・チ
オシアネート塩化セシウム法等を挙げることができる
が、グアニジン・チオシアネート塩化セシウム法を用い
ることが好ましい。本発明のポリペプチドの産生能力を
有する細胞又は組織は、例えば、本発明のポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノ
ーザンブロッティング法、あるいは、本発明のポリペプ
チドに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング
法などにより特定することができる。
力を有する細胞又は組織から、本発明のポリペプチドを
コードするｍＲＮＡを含む総ＲＮＡを既知の方法により
抽出する。抽出法としては、例えば、グアニジン・チオ
シアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオ
シアネート−グアニジン・塩酸法、又はグアニジン・チ
オシアネート塩化セシウム法等を挙げることができる
が、グアニジン・チオシアネート塩化セシウム法を用い
ることが好ましい。本発明のポリペプチドの産生能力を
有する細胞又は組織は、例えば、本発明のポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノ
ーザンブロッティング法、あるいは、本発明のポリペプ
チドに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング
法などにより特定することができる。
続いて、抽出したｍＲＮＡを精製する。ｍＲＮＡの精
製は常法に従えばよく、例えば、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロースカラムに吸着後、溶出させることにより
精製することができる。所望により、ショ糖密度勾配遠
心法等によりｍＲＮＡを更に分画することもできる。ま
た、ｍＲＮＡを抽出しなくても、市販されている抽出精
製済みのｍＲＮＡを用いることもできる。
製は常法に従えばよく、例えば、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロースカラムに吸着後、溶出させることにより
精製することができる。所望により、ショ糖密度勾配遠
心法等によりｍＲＮＡを更に分画することもできる。ま
た、ｍＲＮＡを抽出しなくても、市販されている抽出精
製済みのｍＲＮＡを用いることもできる。
次に、精製されたｍＲＮＡを、例えば、ランダムプラ
イマー、オリゴｄＴプライマー、及び／又はカスタム合
成したプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行な
い、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は、常法によ
って行なうことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用
い、目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟ん
だ２種類のプライマーを用いてＰＣＲを実施し、目的と
するｃＤＮＡを増幅することができる。得られたＤＮＡ
をアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望によ
り、前記ＤＮＡを制限酵素等で切断し、接続することに
よって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
イマー、オリゴｄＴプライマー、及び／又はカスタム合
成したプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行な
い、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は、常法によ
って行なうことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用
い、目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟ん
だ２種類のプライマーを用いてＰＣＲを実施し、目的と
するｃＤＮＡを増幅することができる。得られたＤＮＡ
をアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望によ
り、前記ＤＮＡを制限酵素等で切断し、接続することに
よって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、
以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造す
ることができる。
以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造す
ることができる。
まず、先述の方法で調製したｍＲＮＡを鋳型として、
逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この
１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方
法としては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ法（Ｅｆｓｔｒ
ａｔｉａｄｉｓ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ，７，２７９−２８
８，１９７６）、Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ，Ｈ．ら，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，２２５１−２
２６６，１９８１）、Ｏ．Ｊｏｏｎ Ｙｏｏ法（Ｙｏ
ｏ，Ｏ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７９，１０４９−１０５３，１９８３）、
又はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ，
Ｈ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２，１６１−１７０，１９８２）などを挙げるこ
とができる。
逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この
１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方
法としては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ法（Ｅｆｓｔｒ
ａｔｉａｄｉｓ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ，７，２７９−２８
８，１９７６）、Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ，Ｈ．ら，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，２２５１−２
２６６，１９８１）、Ｏ．Ｊｏｏｎ Ｙｏｏ法（Ｙｏ
ｏ，Ｏ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７９，１０４９−１０５３，１９８３）、
又はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ，
Ｈ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２，１６１−１７０，１９８２）などを挙げるこ
とができる。
次に、前記２本鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを
作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１
株、又はＪＭ１０９株等）に導入して形質転換させ、例
えば、テトラサイクリン、アンピシリン、又はカナマイ
シン等に対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択す
る。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌
の場合には、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，
Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７−５８
０，１９８３）、すなわち、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、又
はＲｂＣｌを共存させて調製したコンピテント細胞に、
前記組換えＤＮＡ体を加える方法により実施することが
できる。もちろん、市販のコンピテント細胞を使用する
こともできる。なお、ベクターとしては、プラスミド以
外にもラムダ系などのファージベクターを用いることも
できる。
作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１
株、又はＪＭ１０９株等）に導入して形質転換させ、例
えば、テトラサイクリン、アンピシリン、又はカナマイ
シン等に対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択す
る。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌
の場合には、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，
Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７−５８
０，１９８３）、すなわち、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、又
はＲｂＣｌを共存させて調製したコンピテント細胞に、
前記組換えＤＮＡ体を加える方法により実施することが
できる。もちろん、市販のコンピテント細胞を使用する
こともできる。なお、ベクターとしては、プラスミド以
外にもラムダ系などのファージベクターを用いることも
できる。
このようにして得られる形質転換株から、目的のｃＤ
ＮＡを有する形質転換株を選択する方法としては、例え
ば、以下に示す（１）合成オリゴヌクレオチドプローブ
を用いるスクリーニング法、（２）ＰＣＲにより作製し
たプローブを用いるスクリーニング法、（３）他の動物
細胞で目的ポリペプチドを産生させてスクリーニングす
る方法、（４）本発明のポリペプチドに対する抗体を用
いて選択する方法、又は（５）セレクティブ・ハイブリ
ダイゼーション・トランスレーション系を用いる方法を
採用することができる。
ＮＡを有する形質転換株を選択する方法としては、例え
ば、以下に示す（１）合成オリゴヌクレオチドプローブ
を用いるスクリーニング法、（２）ＰＣＲにより作製し
たプローブを用いるスクリーニング法、（３）他の動物
細胞で目的ポリペプチドを産生させてスクリーニングす
る方法、（４）本発明のポリペプチドに対する抗体を用
いて選択する方法、又は（５）セレクティブ・ハイブリ
ダイゼーション・トランスレーション系を用いる方法を
採用することができる。
合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニ
ング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮ
Ａを有する形質転換株を選択することができる。
ング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮ
Ａを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの全部又は一部に対
応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブ（
32Ｐ又は33Ｐで標識する）として、形質転換株のＤＮＡ
を変性固定したニトロセルロースフィルター又はポリア
ミドフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性株
を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオリ
ゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を
用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、
あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数
個のヌクレオチド配列とすることもできる。後者の場合
には、イノシンを含ませてその種類を減らすことができ
る。
応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブ（
32Ｐ又は33Ｐで標識する）として、形質転換株のＤＮＡ
を変性固定したニトロセルロースフィルター又はポリア
ミドフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性株
を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオリ
ゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を
用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、
あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数
個のヌクレオチド配列とすることもできる。後者の場合
には、イノシンを含ませてその種類を減らすことができ
る。
ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニン
グ法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡ
を有する形質転換株を選択することができる。
グ法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡ
を有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの一部に対応するセ
ンスプライマー及びアンチンセンスプライマーの各オリ
ゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲを行
ない、目的ポリペプチドの全部又は一部をコードするＤ
ＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとして
は、本発明のポリペプチドを産生する細胞のｍＲＮＡよ
り逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡ
を用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ
断片を、例えば、32Ｐ又は33Ｐで標識し、これをプロー
ブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプ
ラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、目
的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
ンスプライマー及びアンチンセンスプライマーの各オリ
ゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲを行
ない、目的ポリペプチドの全部又は一部をコードするＤ
ＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとして
は、本発明のポリペプチドを産生する細胞のｍＲＮＡよ
り逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡ
を用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ
断片を、例えば、32Ｐ又は33Ｐで標識し、これをプロー
ブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプ
ラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、目
的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
他の動物細胞で目的ポリペプチドを産生させてスクリ
ーニングする方法では、例えば、以下の手順により、目
的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができ
る。
ーニングする方法では、例えば、以下の手順により、目
的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができ
る。
すなわち、形質転換株を培養し、ポリヌクレオチドを
増幅させ、そのポリヌクレオチドを動物細胞にトランス
フェクトし、ポリヌクレオチドにコードされたポリペプ
チドを細胞外に産生させる。なお、この場合、自己複製
可能で転写プロモーター領域を含むプラスミド、あるい
は、動物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミ
ドのいずれを用いることもできる。本発明のポリペプチ
ドに対する抗体を用いて、本発明のポリペプチドを検出
することにより、元の形質転換株の中から、目的のｃＤ
ＮＡを有する形質転換株を選択する。
増幅させ、そのポリヌクレオチドを動物細胞にトランス
フェクトし、ポリヌクレオチドにコードされたポリペプ
チドを細胞外に産生させる。なお、この場合、自己複製
可能で転写プロモーター領域を含むプラスミド、あるい
は、動物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミ
ドのいずれを用いることもできる。本発明のポリペプチ
ドに対する抗体を用いて、本発明のポリペプチドを検出
することにより、元の形質転換株の中から、目的のｃＤ
ＮＡを有する形質転換株を選択する。
本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて選択する
方法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡ
を有する形質転換株を選択することができる。
方法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡ
を有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、予め、ｃＤＮＡを発現ベクターに組込み、
形質転換株の培養上清、細胞内、又は細胞表面にポリペ
プチドを産生させ、本発明のポリペプチドに対する抗体
及び前記抗体に対する２次抗体を用いて、所望のポリペ
プチド産生株を検出し、目的のｃＤＮＡを有する形質転
換株を選択する。
形質転換株の培養上清、細胞内、又は細胞表面にポリペ
プチドを産生させ、本発明のポリペプチドに対する抗体
及び前記抗体に対する２次抗体を用いて、所望のポリペ
プチド産生株を検出し、目的のｃＤＮＡを有する形質転
換株を選択する。
セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレ
ーション系を用いる方法では、例えば、以下の手順によ
り、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択すること
ができる。
ーション系を用いる方法では、例えば、以下の手順によ
り、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択すること
ができる。
すなわち、形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニト
ロセルロースフィルター等にブロットし、本発明のポリ
ペプチドの産生能力を有する細胞から別途調製したｍＲ
ＮＡをハイブリダイズさせた後、ｃＤＮＡに結合したｍ
ＲＮＡを解離させ、回収する。回収されたｍＲＮＡを適
当なポリペプチド翻訳系、例えば、アフリカツメガエル
の卵母細胞への注入したり、あるいは、ウサギ網状赤血
球ライゼート又は小麦胚芽等の無細胞系を用いて、ポリ
ペプチドに翻訳させる。本発明のポリペプチドに対する
抗体を用いて検出して、目的のｃＤＮＡを有する形質転
換株を選択する。
ロセルロースフィルター等にブロットし、本発明のポリ
ペプチドの産生能力を有する細胞から別途調製したｍＲ
ＮＡをハイブリダイズさせた後、ｃＤＮＡに結合したｍ
ＲＮＡを解離させ、回収する。回収されたｍＲＮＡを適
当なポリペプチド翻訳系、例えば、アフリカツメガエル
の卵母細胞への注入したり、あるいは、ウサギ網状赤血
球ライゼート又は小麦胚芽等の無細胞系を用いて、ポリ
ペプチドに翻訳させる。本発明のポリペプチドに対する
抗体を用いて検出して、目的のｃＤＮＡを有する形質転
換株を選択する。
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオ
チドを採取する方法は、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，ＮＹ，１９８９等の遺伝子操作実験マニュア
ル）に従って実施することができる。例えば、細胞より
プラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、得られたプ
ラスミドＤＮＡからｃＤＮＡ領域を切り出すことにより
行なうことができる。
チドを採取する方法は、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，ＮＹ，１９８９等の遺伝子操作実験マニュア
ル）に従って実施することができる。例えば、細胞より
プラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、得られたプ
ラスミドＤＮＡからｃＤＮＡ領域を切り出すことにより
行なうことができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、化学合成法に
よって製造したＤＮＡ断片を結合することによって、本
発明のポリヌクレオチドを製造することができる。各Ｄ
ＮＡは、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ １０００
Ｍ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ
社製）、又は３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
製）など］を用いて合成することができる。
よって製造したＤＮＡ断片を結合することによって、本
発明のポリヌクレオチドを製造することができる。各Ｄ
ＮＡは、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ １０００
Ｍ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ
社製）、又は３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
製）など］を用いて合成することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペ
プチドの情報に基づいて、例えば、ホスファイト・トリ
エステル法（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔ
ｕｒｅ，１０，１０５−１１１，１９８４）等の常法に
従い、核酸の化学合成により製造することもできる。な
お、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であ
り、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコ
ドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定することが
できる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８
１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常
法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオ
チドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異
誘発法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ａＵＳ，８１，５６６２−５６
６６，１９８４）等により実施することができる。
プチドの情報に基づいて、例えば、ホスファイト・トリ
エステル法（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔ
ｕｒｅ，１０，１０５−１１１，１９８４）等の常法に
従い、核酸の化学合成により製造することもできる。な
お、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であ
り、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコ
ドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定することが
できる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８
１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常
法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオ
チドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異
誘発法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ａＵＳ，８１，５６６２−５６
６６，１９８４）等により実施することができる。
これまで述べた種々の方法により得られるＤＮＡの配
列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法
（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，
“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，６
５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオ
チド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒ
ａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８
２）等により行なうことができる。
列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法
（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，
“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，６
５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオ
チド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒ
ａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８
２）等により行なうことができる。
単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベク
ターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生物又は原核
生物の宿主細胞を形質転換させることができる。また、
これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現に
かかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細
胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能で
ある。
ターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生物又は原核
生物の宿主細胞を形質転換させることができる。また、
これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現に
かかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細
胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能で
ある。
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチド
を含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用
いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクター
に、本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより得
られる発現ベクターを挙げることができる。
を含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用
いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクター
に、本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより得
られる発現ベクターを挙げることができる。
また、本発明の細胞も、本発明の前記発現ベクターで
トランスフェクションされ、本発明のポリヌクレオチド
を含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本
発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込
まれた細胞であることもできるし、あるいは、本発明に
よるポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有す
る細胞であることもできる。また、本発明のポリペプチ
ドを発現している細胞であることもできるし、あるい
は、本発明のポリペプチドを発現していない細胞である
こともできる。本発明の細胞は、例えば、本発明の発現
ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクショ
ンすることにより得ることができる。
トランスフェクションされ、本発明のポリヌクレオチド
を含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本
発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込
まれた細胞であることもできるし、あるいは、本発明に
よるポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有す
る細胞であることもできる。また、本発明のポリペプチ
ドを発現している細胞であることもできるし、あるい
は、本発明のポリペプチドを発現していない細胞である
こともできる。本発明の細胞は、例えば、本発明の発現
ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクショ
ンすることにより得ることができる。
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、
及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、サ
ルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃ
ｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニ
ーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉ
ｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト
胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、及び前記ＨＥＫ２９３
細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝
子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ社）等を挙げることができる。
及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、サ
ルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃ
ｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニ
ーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉ
ｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト
胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、及び前記ＨＥＫ２９３
細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝
子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ社）等を挙げることができる。
本発明の発現ベクターには、本発明の組換えポリペプ
チドを製造するための発現ベクターと、遺伝子治療によ
り体内で本発明のポリペプチドを産生させるための発現
ベクターとが含まれる。
チドを製造するための発現ベクターと、遺伝子治療によ
り体内で本発明のポリペプチドを産生させるための発現
ベクターとが含まれる。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しよ
うとするポリヌクレオチドの上流に位置するプロモータ
ー、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及
び転写終結配列等を有するものを使用することができ、
更に必要により、複製起点を有していることができる。
前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初
期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａ
ｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，
１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロ
モーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍ
ａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又
はサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ
４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができ
る。
うとするポリヌクレオチドの上流に位置するプロモータ
ー、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及
び転写終結配列等を有するものを使用することができ、
更に必要により、複製起点を有していることができる。
前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初
期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａ
ｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，
１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロ
モーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍ
ａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又
はサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ
４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができ
る。
宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合には、発現ベ
クターとして、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞に
おいて自律増殖が可能であり、更に、転写プロモータ
ー、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備
えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ
（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍ
ｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９
０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及び
Ｎａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ，１８，５３２２，１９９０）、又はｐＣＤＭ８
（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８
４２，１９８７）等を挙げることができる。
クターとして、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞に
おいて自律増殖が可能であり、更に、転写プロモータ
ー、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備
えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ
（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍ
ｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９
０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及び
Ｎａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ，１８，５３２２，１９９０）、又はｐＣＤＭ８
（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８
４２，１９８７）等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，
Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１，
１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−
ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ
ｄｅｒ Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４
５６−４５７，１９７３）、市販のトランスフェクショ
ン試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥTM６ Ｔｒａｎｓｆｅｃ
ｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏ
ｓｔｉｃｓ社製）を用いた方法、あるいは、電気パスル
穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，
１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞
に取り込ませることができる。
ン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，
Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１，
１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−
ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ
ｄｅｒ Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４
５６−４５７，１９７３）、市販のトランスフェクショ
ン試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥTM６ Ｔｒａｎｓｆｅｃ
ｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏ
ｓｔｉｃｓ社製）を用いた方法、あるいは、電気パスル
穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，
１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞
に取り込ませることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして
機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクタ
ー、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．
ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，
１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，
Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．
Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ
・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択
することにより、本発明のポリペプチドを安定に産生す
る形質転換細胞を得ることができる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして
機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクタ
ー、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．
ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，
１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，
Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．
Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ
・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択
することにより、本発明のポリペプチドを安定に産生す
る形質転換細胞を得ることができる。
更に、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる
場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウ
イルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己
増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）な
どを用いることができる。
場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウ
イルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己
増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）な
どを用いることができる。
遺伝子治療のベクターとしては、例えば、（１）ウイ
ルスベクター、又は（２）非ウイルスベクターがあり、
一般的に使用されているベクター（ウイルスベクターと
しては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、又
はセンダイウイルス等）を用いることができる［高久史
麿監修，実験医学（増刊号）「遺伝子治療の最前線」，
第１２巻，第１５号，１９９４年］。
ルスベクター、又は（２）非ウイルスベクターがあり、
一般的に使用されているベクター（ウイルスベクターと
しては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、又
はセンダイウイルス等）を用いることができる［高久史
麿監修，実験医学（増刊号）「遺伝子治療の最前線」，
第１２巻，第１５号，１９９４年］。
本発明の細胞は、常法に従って培養することができ、
前記培養により細胞外に本発明のポリペプチドが生産さ
れる。前記培養に用いることのできる培地としては、採
用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選
択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、
例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修飾イ
ーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応
じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地
を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞
の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加
したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）
等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができ
る。
前記培養により細胞外に本発明のポリペプチドが生産さ
れる。前記培養に用いることのできる培地としては、採
用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選
択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、
例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修飾イ
ーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応
じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地
を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞
の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加
したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）
等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができ
る。
本発明の細胞を培養することにより、前記細胞の細胞
外に生産される本発明のポリペプチドは、前記ポリペプ
チドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公
知の分離操作法により、分離精製することができる。具
体的には、例えば、本発明のポリペプチドを含む培養液
を、通常のポリペプチド沈殿剤による処理、限外濾過、
各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロ
マトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィ
ー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティク
ロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合
せ等を用いて処理することにより、本発明のポリペプチ
ドを精製することができる。
外に生産される本発明のポリペプチドは、前記ポリペプ
チドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公
知の分離操作法により、分離精製することができる。具
体的には、例えば、本発明のポリペプチドを含む培養液
を、通常のポリペプチド沈殿剤による処理、限外濾過、
各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロ
マトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィ
ー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティク
ロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合
せ等を用いて処理することにより、本発明のポリペプチ
ドを精製することができる。
本発明のポリペプチドは、マーカー配列とインフレー
ムで融合して発現させることにより、本発明のポリペプ
チドの発現の確認及び精製等が容易になる。前記マーカ
ー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ
−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙ
ｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカ
ー配列と本発明のポリペプチドとの間に、プロテアーゼ
（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はト
ロンビンなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入
することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテア
ーゼにより切断除去することが可能である。例えば、ム
スカリンアセチルコリン受容体とヘキサ−ヒスチジン・
タグとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（Ｈ
ａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｋ．及びＨａｇａ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，１２０，１２３２−１２３８（１９９
６）。
ムで融合して発現させることにより、本発明のポリペプ
チドの発現の確認及び精製等が容易になる。前記マーカ
ー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ
−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙ
ｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカ
ー配列と本発明のポリペプチドとの間に、プロテアーゼ
（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はト
ロンビンなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入
することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテア
ーゼにより切断除去することが可能である。例えば、ム
スカリンアセチルコリン受容体とヘキサ−ヒスチジン・
タグとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（Ｈ
ａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｋ．及びＨａｇａ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，１２０，１２３２−１２３８（１９９
６）。
本発明のポリペプチドの内、関節軟骨細胞のII型コラ
ーゲンの発現量を上昇させるポリペプチドは、関節軟骨
細胞のII型コラーゲン産生促進用医薬組成物の有効成分
として有用である。また、II型コラーゲンは、関節軟骨
として機能するために重要な役割をもつことが知られて
いるので、前記ポリペプチドは、変形性関節症治療及び
／又は予防用医薬組成物の有効成分としても有用であ
る。
ーゲンの発現量を上昇させるポリペプチドは、関節軟骨
細胞のII型コラーゲン産生促進用医薬組成物の有効成分
として有用である。また、II型コラーゲンは、関節軟骨
として機能するために重要な役割をもつことが知られて
いるので、前記ポリペプチドは、変形性関節症治療及び
／又は予防用医薬組成物の有効成分としても有用であ
る。
本発明のポリペプチドの内、アグリカンの産生を促進
する活性を有するポリペプチドは、アグリカン産生促進
用医薬組成物の有効成分として有用である。また、アグ
リカンは軟骨組織を構成する主要なプロテオグリカンで
あるので、変形性関節症の治療及び／又は予防用医薬組
成物の有効成分としてより有用である。
する活性を有するポリペプチドは、アグリカン産生促進
用医薬組成物の有効成分として有用である。また、アグ
リカンは軟骨組織を構成する主要なプロテオグリカンで
あるので、変形性関節症の治療及び／又は予防用医薬組
成物の有効成分としてより有用である。
本発明においては、本発明のポリペプチドを、それ単
独で、あるいは、所望により薬剤学的又は獣医学的に許
容することのできる通常の担体と共に、動物、好ましく
は哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。
独で、あるいは、所望により薬剤学的又は獣医学的に許
容することのできる通常の担体と共に、動物、好ましく
は哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。
また、本発明のポリペプチドは、II型コラーゲン産生
促進用医薬組成物、アグリカン産生促進用医薬組成物、
あるいは、変形性関節症治療及び／又は予防用医薬組成
物を製造するために使用することができる。
促進用医薬組成物、アグリカン産生促進用医薬組成物、
あるいは、変形性関節症治療及び／又は予防用医薬組成
物を製造するために使用することができる。
本発明による関節軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進
用医薬組成物、アグリカン産生促進用医薬組成物、又は
変形性関節症治療及び／又は予防用医薬組成物は、有効
成分に応じて、それらの製剤化に通常用いられる添加剤
を用いて調製することができる。
用医薬組成物、アグリカン産生促進用医薬組成物、又は
変形性関節症治療及び／又は予防用医薬組成物は、有効
成分に応じて、それらの製剤化に通常用いられる添加剤
を用いて調製することができる。
投与方法としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル
剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる
経口投与、あるいは、静注、若しくは関節注などの注射
剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非
経口投与を挙げることができる。特に酵素の影響を受け
るポリペプチドにあっては、静注等の非経口投与とする
か、あるいは、消化酵素の影響の少ない消化管の下部
（例えば、空腸、回腸、結腸、又は大腸）に前記ポリペ
プチドが分解されずに送達される製剤技術を用いること
が好ましい。このような製剤技術としては、例えば、徐
放性製剤（例えば、国際公開パンフレットＷＯ９４／０
６４１４号）、結腸放出製剤（例えば、国際公開パンフ
レットＷＯ９５／２８９６３号）、又は時間放出型若し
くはパルス放出型製剤（国際公開パンフレットＷＯ９３
／０５７７１号）を挙げることができる。
剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる
経口投与、あるいは、静注、若しくは関節注などの注射
剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非
経口投与を挙げることができる。特に酵素の影響を受け
るポリペプチドにあっては、静注等の非経口投与とする
か、あるいは、消化酵素の影響の少ない消化管の下部
（例えば、空腸、回腸、結腸、又は大腸）に前記ポリペ
プチドが分解されずに送達される製剤技術を用いること
が好ましい。このような製剤技術としては、例えば、徐
放性製剤（例えば、国際公開パンフレットＷＯ９４／０
６４１４号）、結腸放出製剤（例えば、国際公開パンフ
レットＷＯ９５／２８９６３号）、又は時間放出型若し
くはパルス放出型製剤（国際公開パンフレットＷＯ９３
／０５７７１号）を挙げることができる。
非経口のための注射剤には、無菌の水性若しくは非水
性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤が含まれる。水溶性の
溶液剤又は懸濁剤における希釈剤としては、例えば、注
射用蒸留水又は生理用食塩水などを挙げることができ
る。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例
えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例
えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を挙げ
ることができる。
性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤が含まれる。水溶性の
溶液剤又は懸濁剤における希釈剤としては、例えば、注
射用蒸留水又は生理用食塩水などを挙げることができ
る。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例
えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例
えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を挙げ
ることができる。
前記注射剤は、更に、溶解補助剤、保存剤、安定剤、
乳化剤、無痛化剤、等張化剤、緩衝剤、賦形剤、着色
剤、又は増粘剤などの添加剤を配合することができる。
前記溶解補助剤としては、例えば、シクロデキストリン
類等を挙げることができる。前記保存剤としては、例え
ば、パラ安息香酸メチル等を挙げることができる。前記
乳化剤としては、例えば、レシチン等を挙げることがで
きる。前記無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコ
ール等を挙げることができる。前記等張化剤としては、
例えば、塩化ナトリウム等を挙げることができる。前記
賦形剤としては、例えば、マルトース等を挙げることが
できる。前記増粘剤としては、例えば、ヒアルロン酸等
を挙げることができる。
乳化剤、無痛化剤、等張化剤、緩衝剤、賦形剤、着色
剤、又は増粘剤などの添加剤を配合することができる。
前記溶解補助剤としては、例えば、シクロデキストリン
類等を挙げることができる。前記保存剤としては、例え
ば、パラ安息香酸メチル等を挙げることができる。前記
乳化剤としては、例えば、レシチン等を挙げることがで
きる。前記無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコ
ール等を挙げることができる。前記等張化剤としては、
例えば、塩化ナトリウム等を挙げることができる。前記
賦形剤としては、例えば、マルトース等を挙げることが
できる。前記増粘剤としては、例えば、ヒアルロン酸等
を挙げることができる。
前記注射剤は、例えば、バクテリア保留フィルターを
通過させる濾過、殺菌剤の配合、あるいは、照射によっ
て無菌化することができる。また、無菌の固体組成物と
して製造し、使用に際して、無菌水又はその他の無菌用
注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
通過させる濾過、殺菌剤の配合、あるいは、照射によっ
て無菌化することができる。また、無菌の固体組成物と
して製造し、使用に際して、無菌水又はその他の無菌用
注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、例えば、症状、投与対象の年齢、又は性別
等を考慮して適宜決定することができる。
等を考慮して適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人
（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．０
１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇで
ある。また、非経口投与の場合、注射剤の形では、１日
につき約０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１
〜１００ｍｇである。
（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．０
１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇで
ある。また、非経口投与の場合、注射剤の形では、１日
につき約０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１
〜１００ｍｇである。
遺伝子治療のための、遺伝子伝達方法としては、例え
ば、（１）ウイルスベクター、（２）非ウイルスベクタ
ー、又は（３）むきだしのＤＮＡを用いることができ
る。また、遺伝子治療の方法としては、遺伝子導入細胞
を患者に移植する方法（ｅｘ ｖｉｖｏ法）、あるい
は、細胞を介さずに直接個体にこれらの遺伝子自体を注
入する方法（ｉｎ ｖｉｖｏ法）を用いることができる
［新津洋司郎ら編集，蛋白質核酸酵素（増刊号）「遺伝
子治療」，第４０巻，第１７号，１９９５年］。
ば、（１）ウイルスベクター、（２）非ウイルスベクタ
ー、又は（３）むきだしのＤＮＡを用いることができ
る。また、遺伝子治療の方法としては、遺伝子導入細胞
を患者に移植する方法（ｅｘ ｖｉｖｏ法）、あるい
は、細胞を介さずに直接個体にこれらの遺伝子自体を注
入する方法（ｉｎ ｖｉｖｏ法）を用いることができる
［新津洋司郎ら編集，蛋白質核酸酵素（増刊号）「遺伝
子治療」，第４０巻，第１７号，１９９５年］。
投与方法は、その有効量が患部に到達するような方法
で投与される限り、特に限定されるものではない。例え
ば、全身的投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮
下投与、筋肉内投与、又は経口投与など）、局所投与
（例えば、関節腔内投与又は髄腔内投与など）、経粘膜
投与（例えば、鼻腔内投与、気管内投与、又は口腔内投
与など）、又は腸管内投与（例えば、座剤投与など）な
どによる治療方法が含まれるが、関節腔内投与が好まし
い［Ｂａｒａｇｉ，Ｖ．Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍ
ｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２（２），２１６−２２０，２００
０］。
で投与される限り、特に限定されるものではない。例え
ば、全身的投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮
下投与、筋肉内投与、又は経口投与など）、局所投与
（例えば、関節腔内投与又は髄腔内投与など）、経粘膜
投与（例えば、鼻腔内投与、気管内投与、又は口腔内投
与など）、又は腸管内投与（例えば、座剤投与など）な
どによる治療方法が含まれるが、関節腔内投与が好まし
い［Ｂａｒａｇｉ，Ｖ．Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍ
ｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２（２），２１６−２２０，２００
０］。
また、本発明のポリヌクレオチド又は本発明の発現ベ
クターと、薬学的に許容することのできる担体又は溶媒
（例えば、生理食塩水、ｐＨ緩衝液、安定剤、保存剤、
又は懸濁剤など）とを混合して、II型コラーゲン産生促
進、アグリカン産生促進、及び／又は治療及び／又は予
防のための組成物とすることができる。また、遺伝子治
療の効果をあげるために、例えば、ベクター自身を生分
解性のゲルに包埋する技術を用いることができる。具体
的には、アテロコラーゲン（ＫＯＫＥＮ Ｔｏｋｙｏ，
Ｊａｐａｎ）を用いて、ＤＮＡの放出を持続させる方法
（Ｔ．ＯＣＨＩＹＡら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ，５，７０７−７１０，１９９９）を用いることがで
きる。あるいは、遺伝子の細胞導入効率を向上させる目
的で、リン脂質及び／又はコレステロールを配合するこ
とができる。
クターと、薬学的に許容することのできる担体又は溶媒
（例えば、生理食塩水、ｐＨ緩衝液、安定剤、保存剤、
又は懸濁剤など）とを混合して、II型コラーゲン産生促
進、アグリカン産生促進、及び／又は治療及び／又は予
防のための組成物とすることができる。また、遺伝子治
療の効果をあげるために、例えば、ベクター自身を生分
解性のゲルに包埋する技術を用いることができる。具体
的には、アテロコラーゲン（ＫＯＫＥＮ Ｔｏｋｙｏ，
Ｊａｐａｎ）を用いて、ＤＮＡの放出を持続させる方法
（Ｔ．ＯＣＨＩＹＡら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ，５，７０７−７１０，１９９９）を用いることがで
きる。あるいは、遺伝子の細胞導入効率を向上させる目
的で、リン脂質及び／又はコレステロールを配合するこ
とができる。
本発明のポリペプチドに反応する抗体（例えば、ポリ
クローナル抗体又はモノクローナル抗体）は、各種動物
に、本発明のポリペプチド、又はその断片を直接投与す
ることで得ることができる。また、本発明のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミド
を用いて、ＤＮＡワクチン法（Ｒａｚ，Ｅ．ら，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９５
１９−９５２３，１９９４；又はＤｏｎｎｅｌｌｙ，
Ｊ．Ｊら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，３１
４−３２０，１９９６）によっても得ることができる。
クローナル抗体又はモノクローナル抗体）は、各種動物
に、本発明のポリペプチド、又はその断片を直接投与す
ることで得ることができる。また、本発明のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミド
を用いて、ＤＮＡワクチン法（Ｒａｚ，Ｅ．ら，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９５
１９−９５２３，１９９４；又はＤｏｎｎｅｌｌｙ，
Ｊ．Ｊら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，３１
４−３２０，１９９６）によっても得ることができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のポリペプチ
ド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイ
ント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、腹
腔、皮下、又は静脈等に免疫して感作した動物（例え
ば、ウサギ、ラット、ヤギ、又はニワトリ等）の血清又
は卵から製造することができる。このように製造された
血清又は卵から、常法のポリペプチド単離精製法により
ポリクローナル抗体を分離精製することができる。その
ような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透
析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セル
ロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテイン
Ａアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げるこ
とができる。
ド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイ
ント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、腹
腔、皮下、又は静脈等に免疫して感作した動物（例え
ば、ウサギ、ラット、ヤギ、又はニワトリ等）の血清又
は卵から製造することができる。このように製造された
血清又は卵から、常法のポリペプチド単離精製法により
ポリクローナル抗体を分離精製することができる。その
ような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透
析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セル
ロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテイン
Ａアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げるこ
とができる。
モノクローナル抗体は、例えば、ケーラーとミルスタ
インの細胞融合法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．及びＭｉｌｓｔ
ｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９
７，１９７５）により、当業者が容易に製造することが
可能である。
インの細胞融合法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．及びＭｉｌｓｔ
ｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９
７，１９７５）により、当業者が容易に製造することが
可能である。
すなわち、本発明のポリペプチド又はその断片を適当
なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント
など）に乳濁した乳濁液を、数週間おきにマウスの腹
腔、皮下、又は静脈に数回繰り返し接種することにより
免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエロー
マ細胞と融合してハイブリドーマを作製する。
なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント
など）に乳濁した乳濁液を、数週間おきにマウスの腹
腔、皮下、又は静脈に数回繰り返し接種することにより
免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエロー
マ細胞と融合してハイブリドーマを作製する。
ハイブリドーマを得るためのミエローマ細胞として
は、例えば、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠損の
ようなマーカーを有するミエローマ細胞（例えば、マウ
スミエローマ細胞株Ｐ３×６３Ａｇ８．Ｕ１）を利用す
ることができる。また、融合剤としては、例えば、ポリ
エチレングリコールを利用することができる。更には、
ハイブリドーマ作製における培地として、例えば、イー
グル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、
又はＲＰＭＩ−１６４０などの通常よく用いられている
培地に、１０〜３０％のウシ胎仔血清を適宜加えて用い
ることができる。融合株は、ＨＡＴ選択法により選択す
ることができる。ハイブリドーマのスクリーニングは培
養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法又は免疫組織染色法などの
周知の方法により行ない、目的の抗体を分泌しているハ
イブリドーマのクローンを選択することができる。ま
た、限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すこ
とにより、ハイブリドーマの単クローン性を保証するこ
とができる。このようにして得られるハイブリドーマ
は、培地中で２〜４日間、あるいは、プリスタンで前処
理したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内で１０〜２０日間
培養することで、精製可能な量の抗体を産生することが
できる。このように製造されたモノクローナル抗体は、
培養上清又は腹水から常法のポリペプチド単離精製法に
より分離精製することができる。
は、例えば、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠損の
ようなマーカーを有するミエローマ細胞（例えば、マウ
スミエローマ細胞株Ｐ３×６３Ａｇ８．Ｕ１）を利用す
ることができる。また、融合剤としては、例えば、ポリ
エチレングリコールを利用することができる。更には、
ハイブリドーマ作製における培地として、例えば、イー
グル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、
又はＲＰＭＩ−１６４０などの通常よく用いられている
培地に、１０〜３０％のウシ胎仔血清を適宜加えて用い
ることができる。融合株は、ＨＡＴ選択法により選択す
ることができる。ハイブリドーマのスクリーニングは培
養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法又は免疫組織染色法などの
周知の方法により行ない、目的の抗体を分泌しているハ
イブリドーマのクローンを選択することができる。ま
た、限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すこ
とにより、ハイブリドーマの単クローン性を保証するこ
とができる。このようにして得られるハイブリドーマ
は、培地中で２〜４日間、あるいは、プリスタンで前処
理したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内で１０〜２０日間
培養することで、精製可能な量の抗体を産生することが
できる。このように製造されたモノクローナル抗体は、
培養上清又は腹水から常法のポリペプチド単離精製法に
より分離精製することができる。
以上のように分離精製された抗体について、常法によ
り、ポリペプチド分解酵素（例えば、ペプシン又はパパ
イン等）によって消化を行ない、引き続き、常法のポリ
ペプチド単離精製法により分離精製することで、活性の
ある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、Ｆ（ａ
ｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖを得ることがで
きる。
り、ポリペプチド分解酵素（例えば、ペプシン又はパパ
イン等）によって消化を行ない、引き続き、常法のポリ
ペプチド単離精製法により分離精製することで、活性の
ある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、Ｆ（ａ
ｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖを得ることがで
きる。
更には、本発明のポリペプチドに反応する抗体を、ク
ラクソンらの方法又はゼベデらの方法（Ｃｌａｃｋｓｏ
ｎ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４−６２８，
１９９１；又はＺｅｂｅｄｅｅ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３１７５−
３１７９，１９９２）により、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ
ｃｈａｉｎ）Ｆｖ又はＦａｂとして得ることも可能であ
る。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き
換えたトランスジェニックマウス（Ｌｏｎｂｅｒｇ，
Ｎ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８５６−８５９，１９
９４）に免疫することで、ヒト抗体を得ることも可能で
ある。
ラクソンらの方法又はゼベデらの方法（Ｃｌａｃｋｓｏ
ｎ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４−６２８，
１９９１；又はＺｅｂｅｄｅｅ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３１７５−
３１７９，１９９２）により、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ
ｃｈａｉｎ）Ｆｖ又はＦａｂとして得ることも可能であ
る。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き
換えたトランスジェニックマウス（Ｌｏｎｂｅｒｇ，
Ｎ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８５６−８５９，１９
９４）に免疫することで、ヒト抗体を得ることも可能で
ある。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、
これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、
特に断らない限り、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ，Ｊら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，ＮＹ，１９８９等の遺伝子操作実験マニュアル）に
従って実施した。
これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、
特に断らない限り、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ，Ｊら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，ＮＹ，１９８９等の遺伝子操作実験マニュアル）に
従って実施した。
実施例１：配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドの全長ＯＲＦ遺伝子配列の決定 市販のｃＤＮＡライブラリーと本発明者が設計したプ
ライマーを使用し、５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）
及び３’−ＲＡＣＥを行なった。
ポリペプチドの全長ＯＲＦ遺伝子配列の決定 市販のｃＤＮＡライブラリーと本発明者が設計したプ
ライマーを使用し、５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）
及び３’−ＲＡＣＥを行なった。
まず、５’−ＲＡＣＥの初段ＰＣＲでは、市販のヒト
卵巣及びヒト子宮のｃＤＮＡライブラリー（Ｍａｒａｔ
ｈｏｎ−ＲｅａｄｙTM ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社
製）を鋳型とし、配列番号３で表される塩基配列からな
るＧＳＰ２プライマーと、ＡＰ１プライマー［Ｍａｒａ
ｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙTM ｃＤＮＡ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ社）に添付］とをプライマーとし、Ｔａｑポリ
メラーゼ（ＬＡ−ＴａｑTM；宝酒造社製）をＤＮＡポリ
メラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、
９４℃（２分間）の初期変性反応を実施した後、９８℃
（５秒間）と７２℃（９０秒間）とからなるサイクル反
応を５回、９８℃（５秒間）と７０℃（９０秒間）とか
らなるサイクル反応を５回、及び９８℃（５秒間）と６
８℃（９０秒間）とからなるサイクル反応を２５回、そ
れぞれ繰り返し、最後に、６８℃（５分間）の最終伸長
反応を行なった。
卵巣及びヒト子宮のｃＤＮＡライブラリー（Ｍａｒａｔ
ｈｏｎ−ＲｅａｄｙTM ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社
製）を鋳型とし、配列番号３で表される塩基配列からな
るＧＳＰ２プライマーと、ＡＰ１プライマー［Ｍａｒａ
ｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙTM ｃＤＮＡ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ社）に添付］とをプライマーとし、Ｔａｑポリ
メラーゼ（ＬＡ−ＴａｑTM；宝酒造社製）をＤＮＡポリ
メラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、
９４℃（２分間）の初期変性反応を実施した後、９８℃
（５秒間）と７２℃（９０秒間）とからなるサイクル反
応を５回、９８℃（５秒間）と７０℃（９０秒間）とか
らなるサイクル反応を５回、及び９８℃（５秒間）と６
８℃（９０秒間）とからなるサイクル反応を２５回、そ
れぞれ繰り返し、最後に、６８℃（５分間）の最終伸長
反応を行なった。
続いて、前記の初段ＰＣＲで得られた反応液を鋳型と
して、第２段のネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを
実施した。第２段ＰＣＲでは、初段ＰＣＲ産物を鋳型と
し、配列番号４で表される塩基配列からなるＧＳＰ１プ
ライマーと、ＡＰ２プライマー［Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒ
ｅａｄｙTM ｃＤＮＡ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）
に添付］とをプライマーとし、前記Ｔａｑポリメラーゼ
をＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記
ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実施し
た後、９８℃（５秒間）と７２℃（９０秒間）とからな
るサイクル反応を５回、９８℃（５秒間）と７０℃（９
０秒間）とからなるサイクル反応を５回、及び９８℃
（５秒間）と６８℃（９０秒間）とからなるサイクル反
応を２０回、それぞれ繰り返し、最後に、６８℃（５分
間）の最終伸長反応を行なった。
して、第２段のネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを
実施した。第２段ＰＣＲでは、初段ＰＣＲ産物を鋳型と
し、配列番号４で表される塩基配列からなるＧＳＰ１プ
ライマーと、ＡＰ２プライマー［Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒ
ｅａｄｙTM ｃＤＮＡ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）
に添付］とをプライマーとし、前記Ｔａｑポリメラーゼ
をＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記
ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実施し
た後、９８℃（５秒間）と７２℃（９０秒間）とからな
るサイクル反応を５回、９８℃（５秒間）と７０℃（９
０秒間）とからなるサイクル反応を５回、及び９８℃
（５秒間）と６８℃（９０秒間）とからなるサイクル反
応を２０回、それぞれ繰り返し、最後に、６８℃（５分
間）の最終伸長反応を行なった。
得られた第２段ＰＣＲ産物を電気泳動し、切り出した
バンドをＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ｇｅ
ｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社
製）を用いて精製した。得られたＤＮＡ断片を鋳型と
し、前記ＧＳＰ１プライマーと、シークエンス用キット
（Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ，パーキンエルマー社）とを用いてＤＮＡ伸
長反応を行なった後、蛍光式自動シークエンサー（ＤＮ
Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｐｒｉｓｍ ３７７；Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，パーキンエルマー
社）を用いて塩基配列を解読し、配列番号１で表される
塩基配列における第１番〜第５８４番の塩基配列を決定
した。
バンドをＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ｇｅ
ｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社
製）を用いて精製した。得られたＤＮＡ断片を鋳型と
し、前記ＧＳＰ１プライマーと、シークエンス用キット
（Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ，パーキンエルマー社）とを用いてＤＮＡ伸
長反応を行なった後、蛍光式自動シークエンサー（ＤＮ
Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｐｒｉｓｍ ３７７；Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，パーキンエルマー
社）を用いて塩基配列を解読し、配列番号１で表される
塩基配列における第１番〜第５８４番の塩基配列を決定
した。
一方、３’−ＲＡＣＥでは、初段ＰＣＲのプライマー
として、配列番号５で表される塩基配列からなるＦ２プ
ライマーと、前記ＡＰ１プライマーとを使用し、第２段
ＰＣＲのプライマーとして、配列番号６で表される塩基
配列からなるＦ１プライマーと、前記ＡＰ２プライマー
とを使用したこと以外は、前記５’−ＲＡＣＥと同様の
操作を繰り返すことにより、ＤＮＡ断片を得た。
として、配列番号５で表される塩基配列からなるＦ２プ
ライマーと、前記ＡＰ１プライマーとを使用し、第２段
ＰＣＲのプライマーとして、配列番号６で表される塩基
配列からなるＦ１プライマーと、前記ＡＰ２プライマー
とを使用したこと以外は、前記５’−ＲＡＣＥと同様の
操作を繰り返すことにより、ＤＮＡ断片を得た。
３’−ＲＡＣＥで得られたＤＮＡ断片を鋳型とし、前
記Ｆ１プライマーを用いること以外は、前記５’−ＲＡ
ＣＥの場合と同様にして塩基配列を解読し、配列番号１
で表される塩基配列における第１０３３番〜第１７０２
番の塩基配列を決定した。
記Ｆ１プライマーを用いること以外は、前記５’−ＲＡ
ＣＥの場合と同様にして塩基配列を解読し、配列番号１
で表される塩基配列における第１０３３番〜第１７０２
番の塩基配列を決定した。
次に、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポ
リペプチドのＯＲＦの配列決定を行なった。すなわち、
市販のヒト卵巣のｃＤＮＡライブラリー（Ｍａｒａｔｈ
ｏｎ−ＲｅａｄｙTM ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社
製）を鋳型とし、配列番号７で表される塩基配列からな
るＮＣ５Ａプライマーと、前記ＧＳＰ１プライマーとを
プライマーとし、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎａｔ
ｉｖｅ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅTM；ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＤＮＡポリメラーゼとし
て、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分
間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒間）
と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからなるサ
イクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５分
間）の最終伸長反応を行なった。得られたＰＣＲ産物
を、ライゲーションキット（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２；宝酒造社製）を用いて、クロー
ニング用ベクター（ｐＺｅｒＯTM−２；Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ社製）へサブクローンし、前記蛍光式自動シーク
エンサーを用いて塩基配列を解読した。
リペプチドのＯＲＦの配列決定を行なった。すなわち、
市販のヒト卵巣のｃＤＮＡライブラリー（Ｍａｒａｔｈ
ｏｎ−ＲｅａｄｙTM ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社
製）を鋳型とし、配列番号７で表される塩基配列からな
るＮＣ５Ａプライマーと、前記ＧＳＰ１プライマーとを
プライマーとし、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎａｔ
ｉｖｅ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅTM；ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＤＮＡポリメラーゼとし
て、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分
間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒間）
と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからなるサ
イクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５分
間）の最終伸長反応を行なった。得られたＰＣＲ産物
を、ライゲーションキット（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２；宝酒造社製）を用いて、クロー
ニング用ベクター（ｐＺｅｒＯTM−２；Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ社製）へサブクローンし、前記蛍光式自動シーク
エンサーを用いて塩基配列を解読した。
更に、前記ＮＣ５Ａプライマーと前記ＧＳＰ１プライ
マーとの組み合わせの代わりに、配列番号８で表される
塩基配列からなるＦ３プライマーと、配列番号９で表さ
れる塩基配列からなる１５５Ｎ３プライマーとの組み合
わせを用いること以外は、前記ＰＣＲ操作と、それに続
く、ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物の塩基配列解読の操作
とを繰り返した。
マーとの組み合わせの代わりに、配列番号８で表される
塩基配列からなるＦ３プライマーと、配列番号９で表さ
れる塩基配列からなる１５５Ｎ３プライマーとの組み合
わせを用いること以外は、前記ＰＣＲ操作と、それに続
く、ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物の塩基配列解読の操作
とを繰り返した。
以上の結果から、本発明による配列番号２で表される
アミノ酸配列からなるポリペプチドの全長ＯＲＦは、配
列番号１で表される塩基配列における第３７番〜第１２
０３番の塩基からなる配列から構成されており、配列番
号２で表されるアミノ酸配列（アミノ酸残基数＝３８
８）からなる新規ポリペプチドであることが判明した。
そのドメイン構造は、Ｎ末端からＣ末端の方向に向かっ
て、分泌シグナル配列、コイルドコイルドメイン、及び
フィブリノーゲン様ドメインから構成される分子である
ことが判った。この新規分子は、アンギオポイエチン
（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）ファミリー（Ｄａｖｉｓ
Ｓ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，２３７，１７３−１８５，１９９９）
及びフィブリノーゲン様因子のｐＴ４９（Ｒｕｅｇｇ
Ｃ．ら，Ｇｅｎｅ，１６０，２５７−２６２，１９９
５）と同様のドメイン構造をしていた。市販の配列相同
性解析プログラム（ＭｅｇＡｌｉｇｎ；ＤＮＡＳＴＡＲ
社製）でアミノ酸配列の相同性を調べた結果、最もホモ
ロジーが高いものでも、アンギオポイエチン−１（Ａｎ
ｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）と約２１％であり、ｐＴ４
９と約２２％であり、いずれも低かった。
アミノ酸配列からなるポリペプチドの全長ＯＲＦは、配
列番号１で表される塩基配列における第３７番〜第１２
０３番の塩基からなる配列から構成されており、配列番
号２で表されるアミノ酸配列（アミノ酸残基数＝３８
８）からなる新規ポリペプチドであることが判明した。
そのドメイン構造は、Ｎ末端からＣ末端の方向に向かっ
て、分泌シグナル配列、コイルドコイルドメイン、及び
フィブリノーゲン様ドメインから構成される分子である
ことが判った。この新規分子は、アンギオポイエチン
（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）ファミリー（Ｄａｖｉｓ
Ｓ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，２３７，１７３−１８５，１９９９）
及びフィブリノーゲン様因子のｐＴ４９（Ｒｕｅｇｇ
Ｃ．ら，Ｇｅｎｅ，１６０，２５７−２６２，１９９
５）と同様のドメイン構造をしていた。市販の配列相同
性解析プログラム（ＭｅｇＡｌｉｇｎ；ＤＮＡＳＴＡＲ
社製）でアミノ酸配列の相同性を調べた結果、最もホモ
ロジーが高いものでも、アンギオポイエチン−１（Ａｎ
ｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）と約２１％であり、ｐＴ４
９と約２２％であり、いずれも低かった。
なお、本願の優先日後に公開されたＷＯ０１／０５８
２５号公報には、配列番号２で表されるアミノ酸配列と
１アミノ酸のみ異なるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードする塩基配列（ＣＧ１４４）、及びその推定
アミノ酸配列の記載がある。ＷＯ０１／０５８２５号公
報には、ＣＧ１４４がコードするポリペプチドが、アン
ギオポイエチンであると記載されているが、実験的裏付
けはなく、また、本発明のポリペプチドが有するII型コ
ラーゲン産生促進活性及びアグリカン産生促進活性につ
いては何ら記載されていない。
２５号公報には、配列番号２で表されるアミノ酸配列と
１アミノ酸のみ異なるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードする塩基配列（ＣＧ１４４）、及びその推定
アミノ酸配列の記載がある。ＷＯ０１／０５８２５号公
報には、ＣＧ１４４がコードするポリペプチドが、アン
ギオポイエチンであると記載されているが、実験的裏付
けはなく、また、本発明のポリペプチドが有するII型コ
ラーゲン産生促進活性及びアグリカン産生促進活性につ
いては何ら記載されていない。
実施例２：Ｃ末端ＦＬＡＧ付加型発現ベクターの作製
ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を
制限酵素ＣｌａＩ及びＮｓｉＩで切断し、平滑末端化処
理を行なった後、自己連結反応を行ない、ＥＢＮＡ１発
現ユニットを除去した発現ベクターｐＣＥＰ４ｄを作製
した。このベクターを制限酵素ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩ
で切断した後、アガロースゲル抽出した約７．７ｋｂｐ
のＤＮＡ断片に、配列番号１０で表される塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドと配列番号１１で表される塩基
配列からなるオリゴヌクレオチドとをアニールさせた二
重鎖オリゴヌクレオチドを挿入した。得られたプラスミ
ドの塩基配列を解析することにより、目的の配列を有す
ることを確認し、プラスミドｐＣＥＰ４ｄ−ＦＬＡＧと
命名した。
制限酵素ＣｌａＩ及びＮｓｉＩで切断し、平滑末端化処
理を行なった後、自己連結反応を行ない、ＥＢＮＡ１発
現ユニットを除去した発現ベクターｐＣＥＰ４ｄを作製
した。このベクターを制限酵素ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩ
で切断した後、アガロースゲル抽出した約７．７ｋｂｐ
のＤＮＡ断片に、配列番号１０で表される塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドと配列番号１１で表される塩基
配列からなるオリゴヌクレオチドとをアニールさせた二
重鎖オリゴヌクレオチドを挿入した。得られたプラスミ
ドの塩基配列を解析することにより、目的の配列を有す
ることを確認し、プラスミドｐＣＥＰ４ｄ−ＦＬＡＧと
命名した。
このベクターｐＣＥＰ４ｄ−ＦＬＡＧを鋳型とし、配
列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チドと、配列番号１３で表される塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチドとをプライマーとし、ＤＮＡポリメラー
ゼ（ＰｙｒｏＢｅｓｔTM ＤＮＡポリメラーゼ；宝酒造
社）を用いて、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９
４℃（２分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃
（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（１分間）
とからなるサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７
４℃（５分間）の最終伸長反応を行なった。生じた約
０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩで切断し
た後、ＸｂａＩで切断したベクターｐＣＥＰ４ｄ−ＦＬ
ＡＧ（約７．７ｋｂｐ）に挿入した。得られたクローン
の中から、目的どおりに、プロモーターから下流に向か
って、クローニングサイトであるＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、
ＮｏｔＩ、及びＢａｍＨＩの各認識配列、並びにＦＬＡ
Ｇタグがこの順に並んでいるクローンを選択し、ベクタ
ーｐＣＥＰ４ｄＥ２−ＦＬＡＧと命名した。
列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チドと、配列番号１３で表される塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチドとをプライマーとし、ＤＮＡポリメラー
ゼ（ＰｙｒｏＢｅｓｔTM ＤＮＡポリメラーゼ；宝酒造
社）を用いて、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９
４℃（２分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃
（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（１分間）
とからなるサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７
４℃（５分間）の最終伸長反応を行なった。生じた約
０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩで切断し
た後、ＸｂａＩで切断したベクターｐＣＥＰ４ｄ−ＦＬ
ＡＧ（約７．７ｋｂｐ）に挿入した。得られたクローン
の中から、目的どおりに、プロモーターから下流に向か
って、クローニングサイトであるＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、
ＮｏｔＩ、及びＢａｍＨＩの各認識配列、並びにＦＬＡ
Ｇタグがこの順に並んでいるクローンを選択し、ベクタ
ーｐＣＥＰ４ｄＥ２−ＦＬＡＧと命名した。
実施例３：Ｃ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチド発現プラ
スミドの構築 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプ
チドは、Ｎ端の分泌シグナル配列が切断されて分泌発現
される。この分泌発現されたポリペプチドのＣ末端にＦ
ＬＡＧを付加した本発明のポリペプチドを発現するため
のプラスミドは、以下の手順で構築した。
スミドの構築 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプ
チドは、Ｎ端の分泌シグナル配列が切断されて分泌発現
される。この分泌発現されたポリペプチドのＣ末端にＦ
ＬＡＧを付加した本発明のポリペプチドを発現するため
のプラスミドは、以下の手順で構築した。
まず、配列番号１で表される塩基配列における第３７
番〜第１２００番の塩基からなる配列を有するポリヌク
レオチドを、ＰＣＲにより取得した。すなわち、配列番
号７で表される塩基配列からなるＮＣ５Ａプライマーと
配列番号４で表される塩基配列からなるＧＳＰ１プライ
マーとをプライマーとし、市販のヒト卵巣のｃＤＮＡラ
イブラリー（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙTM ｃＤＮ
Ａ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型とし、Ｐｆｕ ＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｎａｔｉｖｅ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅTM；ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＤ
ＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣ
Ｒでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実施した
後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７４℃
（２分間）とからなるサイクル反応を４０回繰り返し、
最後に、７４℃（５分間）の最終伸長反応を行なった。
得られたＰＣＲ産物を、ＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡ ｑ
ｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ；Ｑ
ＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
番〜第１２００番の塩基からなる配列を有するポリヌク
レオチドを、ＰＣＲにより取得した。すなわち、配列番
号７で表される塩基配列からなるＮＣ５Ａプライマーと
配列番号４で表される塩基配列からなるＧＳＰ１プライ
マーとをプライマーとし、市販のヒト卵巣のｃＤＮＡラ
イブラリー（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙTM ｃＤＮ
Ａ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型とし、Ｐｆｕ ＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｎａｔｉｖｅ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅTM；ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＤ
ＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣ
Ｒでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実施した
後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７４℃
（２分間）とからなるサイクル反応を４０回繰り返し、
最後に、７４℃（５分間）の最終伸長反応を行なった。
得られたＰＣＲ産物を、ＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡ ｑ
ｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ；Ｑ
ＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
更に、前記ＮＣ５Ａプライマーと前記ＧＳＰ１プライ
マーとの組み合わせの代わりに、配列番号８で表される
塩基配列からなるＦ３プライマーと、配列番号９で表さ
れる塩基配列からなる１５５Ｎ３プライマーとの組み合
わせを用いること以外は、前記ＰＣＲ操作と、それに続
く、ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物の精製操作とを繰り返
した。
マーとの組み合わせの代わりに、配列番号８で表される
塩基配列からなるＦ３プライマーと、配列番号９で表さ
れる塩基配列からなる１５５Ｎ３プライマーとの組み合
わせを用いること以外は、前記ＰＣＲ操作と、それに続
く、ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物の精製操作とを繰り返
した。
これらの２種類の精製したＰＣＲ産物（すなわち、Ｎ
Ｃ５ＡプライマーとＧＳＰ１プライマーとの組み合わせ
を用いて得られたＰＣＲ産物、及びＦ３プライマーと１
５５Ｎ３プライマーとの組み合わせを用いて得られたＰ
ＣＲ産物）を鋳型とし、前記ＮＣ５Ａプライマーと前記
１５５Ｎ３プライマーとをプライマーとし、前記Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡポリメラーゼとして、Ｐ
ＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の
初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒間）と５５
℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからなるサイクル
反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５分間）の最
終伸長反応を行なった。得られたＰＣＲ産物を、ＤＮＡ
抽出キット（ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａ
ｃｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製
した。
Ｃ５ＡプライマーとＧＳＰ１プライマーとの組み合わせ
を用いて得られたＰＣＲ産物、及びＦ３プライマーと１
５５Ｎ３プライマーとの組み合わせを用いて得られたＰ
ＣＲ産物）を鋳型とし、前記ＮＣ５Ａプライマーと前記
１５５Ｎ３プライマーとをプライマーとし、前記Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡポリメラーゼとして、Ｐ
ＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の
初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒間）と５５
℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからなるサイクル
反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５分間）の最
終伸長反応を行なった。得られたＰＣＲ産物を、ＤＮＡ
抽出キット（ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａ
ｃｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製
した。
続いて、この精製したＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番
号１４で表される塩基配列からなるＫ５Ａプライマー
と、前記１５５Ｎ３プライマーとをプライマーとし、前
記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡポリメラーゼと
して、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２
分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒
間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからな
るサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５
分間）の最終伸長反応を行なった。こうして生成した目
的ＤＮＡ断片には、５’側にＫｐｎＩ認識配列及びコザ
ック（Ｋｏｚａｋ）配列が付加され、３’側にＮｏｔＩ
認識配列が付加される。このＤＮＡ断片をクローニング
用ベクター（ｐＺｅｒＯTM−２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
社製）にサブクローンして配列を確認した後、制限酵素
ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで切断し、前記実施例２で先に作
製したｐＣＥＰ４ｄＥ２−ＦＬＡＧのＫｐｎＩ及びＮｏ
ｔＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＣＥＰ−
ＣＤＦ−ＦＬＡＧと命名した。
号１４で表される塩基配列からなるＫ５Ａプライマー
と、前記１５５Ｎ３プライマーとをプライマーとし、前
記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡポリメラーゼと
して、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２
分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒
間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからな
るサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５
分間）の最終伸長反応を行なった。こうして生成した目
的ＤＮＡ断片には、５’側にＫｐｎＩ認識配列及びコザ
ック（Ｋｏｚａｋ）配列が付加され、３’側にＮｏｔＩ
認識配列が付加される。このＤＮＡ断片をクローニング
用ベクター（ｐＺｅｒＯTM−２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
社製）にサブクローンして配列を確認した後、制限酵素
ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで切断し、前記実施例２で先に作
製したｐＣＥＰ４ｄＥ２−ＦＬＡＧのＫｐｎＩ及びＮｏ
ｔＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＣＥＰ−
ＣＤＦ−ＦＬＡＧと命名した。
更に、配列番号１５で表される塩基配列からなる１５
５ＸＢ５プライマーと、配列番号１６で表される塩基配
列からなる１５５Ｘ３プライマーとをプライマーとし、
プラスミドｐＣＥＰ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧを鋳型とし、前
記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡポリメラーゼと
して、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２
分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒
間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからな
るサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５
分間）の最終伸長反応を行なった。こうして生成した目
的ＤＮＡ断片には、５’側にＸｂａＩ認識配列及びコザ
ック配列が付加され、３’側にＸｂａＩ認識配列が付加
される。このＤＮＡ断片をクローニング用ベクター（ｐ
ＺｅｒＯTM−２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブク
ローンして配列を確認した後、制限酵素ＸｂａＩで切断
し、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，
Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９９）のＸｂａ
Ｉ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＢＯＳ−Ｃ
ＤＦ−ＦＬＡＧと命名した。
５ＸＢ５プライマーと、配列番号１６で表される塩基配
列からなる１５５Ｘ３プライマーとをプライマーとし、
プラスミドｐＣＥＰ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧを鋳型とし、前
記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡポリメラーゼと
して、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２
分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒
間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからな
るサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５
分間）の最終伸長反応を行なった。こうして生成した目
的ＤＮＡ断片には、５’側にＸｂａＩ認識配列及びコザ
ック配列が付加され、３’側にＸｂａＩ認識配列が付加
される。このＤＮＡ断片をクローニング用ベクター（ｐ
ＺｅｒＯTM−２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブク
ローンして配列を確認した後、制限酵素ＸｂａＩで切断
し、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，
Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９９）のＸｂａ
Ｉ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＢＯＳ−Ｃ
ＤＦ−ＦＬＡＧと命名した。
実施例４：シグナル配列及びＮ末端ＦＬＡＧ付加型発現
ベクターの作製 ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を
制限酵素ＣｌａＩ及びＮｓｉＩで切断し、平滑末端化処
理を行なった後、自己連結反応を行ない、ＥＢＮＡ１発
現ユニットを除去した発現ベクターｐＣＥＰ４ｄを作製
した。このベクターを制限酵素ＨｉｎｄIII及びＸｈｏ
Ｉで切断した後、アガロースゲル抽出した約７．７Ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片に、配列番号１７で表される塩基配列か
らなるオリゴヌクレオチドと配列番号１８で表される塩
基配列からなるオリゴヌクレオチドとをアニールさせた
二重鎖オリゴヌクレオチドを挿入した。目的の配列を有
するクローンを選択し、プラスミドｐＣＥＰ４ｄ−Ｓｉ
ｇｎａｌＦＬＡＧと命名した。
ベクターの作製 ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を
制限酵素ＣｌａＩ及びＮｓｉＩで切断し、平滑末端化処
理を行なった後、自己連結反応を行ない、ＥＢＮＡ１発
現ユニットを除去した発現ベクターｐＣＥＰ４ｄを作製
した。このベクターを制限酵素ＨｉｎｄIII及びＸｈｏ
Ｉで切断した後、アガロースゲル抽出した約７．７Ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片に、配列番号１７で表される塩基配列か
らなるオリゴヌクレオチドと配列番号１８で表される塩
基配列からなるオリゴヌクレオチドとをアニールさせた
二重鎖オリゴヌクレオチドを挿入した。目的の配列を有
するクローンを選択し、プラスミドｐＣＥＰ４ｄ−Ｓｉ
ｇｎａｌＦＬＡＧと命名した。
実施例５：Ｎ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチド発現プラ
スミドの構築 配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３番
〜第３８８番のアミノ酸からなる配列（すなわち、ポリ
ペプチド２３／３８８のアミノ酸配列）を有する、シグ
ナル配列を欠失したポリペプチドのＮ末端に、外来のシ
グナルペプチド及びＦＬＡＧを付加した本発明のポリペ
プチドを発現するためのプラスミドは、以下の手順で構
築した。前記の本発明のポリペプチドは、Ｎ末端の分泌
シグナル配列が切断されて分泌発現される。
スミドの構築 配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３番
〜第３８８番のアミノ酸からなる配列（すなわち、ポリ
ペプチド２３／３８８のアミノ酸配列）を有する、シグ
ナル配列を欠失したポリペプチドのＮ末端に、外来のシ
グナルペプチド及びＦＬＡＧを付加した本発明のポリペ
プチドを発現するためのプラスミドは、以下の手順で構
築した。前記の本発明のポリペプチドは、Ｎ末端の分泌
シグナル配列が切断されて分泌発現される。
まず、配列番号１で表される塩基配列における第１０
３番〜第１２０３番の塩基からなる配列を有するポリヌ
クレオチドを、ＰＣＲにより取得した。すなわち、配列
番号１９で表される塩基配列からなる１５５ＳＦＢプラ
イマーと、配列番号２０で表される塩基配列からなる１
５５ＴＸプライマーとをプライマーとし、前記実施例３
で先に作製したプラスミドｐＣＥＰ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧ
を鋳型とし、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎａｔｉｖ
ｅ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅTM；ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ社製）をＤＮＡポリメラーゼとして、Ｐ
ＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の
初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒間）と５５
℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからなるサイクル
反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５分間）の最
終伸長反応を行なった。こうして生成した目的ＤＮＡ断
片には、５’側にＢｃｌＩ認識配列が付加され、３’側
にＸｈｏＩ認識配列が付加される。このＤＮＡ断片をク
ローニング用ベクター（ｐＺｅｒＯTM−２；Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ社製）にサブクローンして配列を確認した
後、制限酵素ＢｃｌＩ及びＸｈｏＩで切断し、ｐＣＥＰ
４ｄ−ＳｉｇｎａｌＦＬＡＧのＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ
部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＣＥＰ−ＳＦ
−ＣＤＦと命名した。
３番〜第１２０３番の塩基からなる配列を有するポリヌ
クレオチドを、ＰＣＲにより取得した。すなわち、配列
番号１９で表される塩基配列からなる１５５ＳＦＢプラ
イマーと、配列番号２０で表される塩基配列からなる１
５５ＴＸプライマーとをプライマーとし、前記実施例３
で先に作製したプラスミドｐＣＥＰ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧ
を鋳型とし、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎａｔｉｖ
ｅ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅTM；ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ社製）をＤＮＡポリメラーゼとして、Ｐ
ＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の
初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒間）と５５
℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからなるサイクル
反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５分間）の最
終伸長反応を行なった。こうして生成した目的ＤＮＡ断
片には、５’側にＢｃｌＩ認識配列が付加され、３’側
にＸｈｏＩ認識配列が付加される。このＤＮＡ断片をク
ローニング用ベクター（ｐＺｅｒＯTM−２；Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ社製）にサブクローンして配列を確認した
後、制限酵素ＢｃｌＩ及びＸｈｏＩで切断し、ｐＣＥＰ
４ｄ−ＳｉｇｎａｌＦＬＡＧのＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ
部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＣＥＰ−ＳＦ
−ＣＤＦと命名した。
更に、配列番号２１で表される塩基配列からなるＸｂ
ａＳＦプライマーと、配列番号２２で表される塩基配列
からなる１５５ＴｅｒＸプライマーとをプライマーと
し、プラスミドｐＣＥＰ−ＳＦ−ＣＤＦを鋳型とし、前
記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡポリメラーゼと
して、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２
分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒
間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからな
るサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５
分間）の最終伸長反応を行なった。こうして生成した目
的ＤＮＡ断片には、５’側及び３’側にＸｂａＩ認識配
列がそれぞれ付加される。このＤＮＡ断片をクローニン
グ用ベクター（ｐＺｅｒＯTM−２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ社製）にサブクローンして配列を確認した後、制限酵
素ＸｂａＩで切断し、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉ
ｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１
９９９）のＸｂａＩ部位に挿入した。得られたプラスミ
ドをｐＢＯＳ−ＳＦ−ＣＤＦと命名した。
ａＳＦプライマーと、配列番号２２で表される塩基配列
からなる１５５ＴｅｒＸプライマーとをプライマーと
し、プラスミドｐＣＥＰ−ＳＦ−ＣＤＦを鋳型とし、前
記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡポリメラーゼと
して、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２
分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒
間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからな
るサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５
分間）の最終伸長反応を行なった。こうして生成した目
的ＤＮＡ断片には、５’側及び３’側にＸｂａＩ認識配
列がそれぞれ付加される。このＤＮＡ断片をクローニン
グ用ベクター（ｐＺｅｒＯTM−２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ社製）にサブクローンして配列を確認した後、制限酵
素ＸｂａＩで切断し、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉ
ｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１
９９９）のＸｂａＩ部位に挿入した。得られたプラスミ
ドをｐＢＯＳ−ＳＦ−ＣＤＦと命名した。
実施例６：Ｃ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチド発現プラ
スミド及びバクミドの構築 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプ
チドは、Ｎ末端の分泌シグナル配列が切断されて分泌発
現される。この分泌発現されたポリペプチドのＣ末端に
ＦＬＡＧを付加した本発明のポリペプチドを発現するた
めのプラスミド及びバクミドは、以下の手順で構築し
た。
スミド及びバクミドの構築 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプ
チドは、Ｎ末端の分泌シグナル配列が切断されて分泌発
現される。この分泌発現されたポリペプチドのＣ末端に
ＦＬＡＧを付加した本発明のポリペプチドを発現するた
めのプラスミド及びバクミドは、以下の手順で構築し
た。
まず、配列番号１５で表される塩基配列からなる１５
５ＸＢ５プライマーと、配列番号１６で表される塩基配
列からなる１５５Ｘ３プライマーとをプライマーとし、
前記実施例３で先に作製したプラスミドｐＣＥＰ−ＣＤ
Ｆ−ＦＬＡＧを鋳型とし、前記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラ
ーゼをＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。
前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実
施した後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と
７４℃（２分間）とからなるサイクル反応を４０回繰り
返し、最後に、７４℃（５分間）の最終伸長反応を行な
った。こうして生成した目的ＤＮＡ断片には、５’側に
ＢｃｌＩ認識配列及びコザック配列が付加され、３’側
にＸｂａＩ認識配列が付加される。このＤＮＡ断片をク
ローニング用ベクター（ｐＺｅｒＯTM−２；Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ社製）にサブクローンして配列を確認した
後、制限酵素ＢｃｌＩ及びＸｂａＩで切断し、プラスミ
ドｐＦＡＳＴＢＡＣ１（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧ
ＩＥＳ社製）のＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ部位に挿入し
た。得られたプラスミドをｐＦＢ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧと
命名した。
５ＸＢ５プライマーと、配列番号１６で表される塩基配
列からなる１５５Ｘ３プライマーとをプライマーとし、
前記実施例３で先に作製したプラスミドｐＣＥＰ−ＣＤ
Ｆ−ＦＬＡＧを鋳型とし、前記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラ
ーゼをＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。
前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実
施した後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と
７４℃（２分間）とからなるサイクル反応を４０回繰り
返し、最後に、７４℃（５分間）の最終伸長反応を行な
った。こうして生成した目的ＤＮＡ断片には、５’側に
ＢｃｌＩ認識配列及びコザック配列が付加され、３’側
にＸｂａＩ認識配列が付加される。このＤＮＡ断片をク
ローニング用ベクター（ｐＺｅｒＯTM−２；Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ社製）にサブクローンして配列を確認した
後、制限酵素ＢｃｌＩ及びＸｂａＩで切断し、プラスミ
ドｐＦＡＳＴＢＡＣ１（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧ
ＩＥＳ社製）のＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ部位に挿入し
た。得られたプラスミドをｐＦＢ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧと
命名した。
更に、得られたプラスミドｐＦＢ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧ
と、市販のコンピテント細胞（ＤＨ１０ ＢＡＣ ｃｏ
ｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ；ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯ
ＬＯＧＩＥＳ社製）とを用いて、製品添付文書に従って
リコンビナントバクミドＤＮＡを調製した。得られたバ
クミドＤＮＡをＢＡＣ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧと命名した。
と、市販のコンピテント細胞（ＤＨ１０ ＢＡＣ ｃｏ
ｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ；ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯ
ＬＯＧＩＥＳ社製）とを用いて、製品添付文書に従って
リコンビナントバクミドＤＮＡを調製した。得られたバ
クミドＤＮＡをＢＡＣ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧと命名した。
実施例７：Ｎ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチド発現プラ
スミド及びバクミドの構築 配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３番
〜第３８８番のアミノ酸からなる配列（すなわち、ポリ
ペプチド２３／３８８のアミノ酸配列）を有する、シグ
ナル配列を欠失したポリペプチドのＮ末端に、外来のシ
グナル配列及びＦＬＡＧを付加した本発明のポリペプチ
ドを発現するためのプラスミド及びバクミドは、以下の
手順で構築した。前記の本発明のポリペプチドは、Ｎ末
端の分泌シグナル配列が切断されて分泌発現される。
スミド及びバクミドの構築 配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３番
〜第３８８番のアミノ酸からなる配列（すなわち、ポリ
ペプチド２３／３８８のアミノ酸配列）を有する、シグ
ナル配列を欠失したポリペプチドのＮ末端に、外来のシ
グナル配列及びＦＬＡＧを付加した本発明のポリペプチ
ドを発現するためのプラスミド及びバクミドは、以下の
手順で構築した。前記の本発明のポリペプチドは、Ｎ末
端の分泌シグナル配列が切断されて分泌発現される。
まず、配列番号２１で表される塩基配列からなるＸｂ
ａＳＦプライマーと、配列番号２２で表される塩基配列
からなる１５５ＴｅｒＸプライマーとをプライマーと
し、前記実施例５で先に作製したプラスミドｐＣＥＰ−
ＳＦ−ＣＤＦを鋳型とし、前記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラ
ーゼをＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。
前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実
施した後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と
７４℃（２分間）とからなるサイクル反応を４０回繰り
返し、最後に、７４℃（５分間）の最終伸長反応を行な
った。こうして生成した目的ＤＮＡ断片には、５’側及
び３’側にＸｂａＩ認識配列がそれぞれ付加される。こ
のＤＮＡ断片をクローニング用ベクター（ｐＺｅｒＯTM
−２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローンして
配列を確認した後、制限酵素ＸｂａＩで切断し、プラス
ミドｐＦＡＳＴＢＡＣ１（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯ
ＧＩＥＳ社製）のＸｂａＩ部位に挿入した。得られたプ
ラスミドをｐＦＢ−ＳＦ−ＣＤＦと命名した。
ａＳＦプライマーと、配列番号２２で表される塩基配列
からなる１５５ＴｅｒＸプライマーとをプライマーと
し、前記実施例５で先に作製したプラスミドｐＣＥＰ−
ＳＦ−ＣＤＦを鋳型とし、前記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラ
ーゼをＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。
前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実
施した後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と
７４℃（２分間）とからなるサイクル反応を４０回繰り
返し、最後に、７４℃（５分間）の最終伸長反応を行な
った。こうして生成した目的ＤＮＡ断片には、５’側及
び３’側にＸｂａＩ認識配列がそれぞれ付加される。こ
のＤＮＡ断片をクローニング用ベクター（ｐＺｅｒＯTM
−２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローンして
配列を確認した後、制限酵素ＸｂａＩで切断し、プラス
ミドｐＦＡＳＴＢＡＣ１（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯ
ＧＩＥＳ社製）のＸｂａＩ部位に挿入した。得られたプ
ラスミドをｐＦＢ−ＳＦ−ＣＤＦと命名した。
更に、得られたプラスミドｐＦＢ−ＳＦ−ＣＤＦと、
市販のコンピテント細胞（ＤＨ１０ ＢＡＣ ｃｏｍｐ
ｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ；ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯ
ＧＩＥＳ社製）とを用いて、製品添付文書に従ってリコ
ンビナントバクミドＤＮＡを調製した。得られたバクミ
ドＤＮＡをＢＡＣ−ＳＦ−ＣＤＦと命名した。
市販のコンピテント細胞（ＤＨ１０ ＢＡＣ ｃｏｍｐ
ｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ；ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯ
ＧＩＥＳ社製）とを用いて、製品添付文書に従ってリコ
ンビナントバクミドＤＮＡを調製した。得られたバクミ
ドＤＮＡをＢＡＣ−ＳＦ−ＣＤＦと命名した。
実施例８：Ｎ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチドの動物細
胞株での発現 前記実施例５で先に作製した発現プラスミドｐＣＥＰ
−ＳＦ−ＣＤＦを、市販のトランスフェクション試薬
（ＦｕＧＥＮＥTM６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅ
ａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社
製）を用いて、添付指示書に従って、２９３−ＥＢＮＡ
細胞（ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ社製）に導入した。プラスミ
ド導入後、２〜３日間培養して得た培養上清中に目的ポ
リペプチドが存在することを、Ｎ末端に付加したＦＬＡ
Ｇタグに対する抗体（マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル
抗体Ｍ２；Ｓｉｇｍａ社製）を用いたウエスタンブロッ
ティングにより確認した。
胞株での発現 前記実施例５で先に作製した発現プラスミドｐＣＥＰ
−ＳＦ−ＣＤＦを、市販のトランスフェクション試薬
（ＦｕＧＥＮＥTM６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅ
ａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社
製）を用いて、添付指示書に従って、２９３−ＥＢＮＡ
細胞（ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ社製）に導入した。プラスミ
ド導入後、２〜３日間培養して得た培養上清中に目的ポ
リペプチドが存在することを、Ｎ末端に付加したＦＬＡ
Ｇタグに対する抗体（マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル
抗体Ｍ２；Ｓｉｇｍａ社製）を用いたウエスタンブロッ
ティングにより確認した。
すなわち、前記培養上清を、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２モノク
ローナル抗体アガロースアフィニティーゲル（ＡＮＴＩ
−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ Ａｇａｒｏｓｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ；
Ｓｉｇｍａ社製）にアプライし、リン酸緩衝溶液（ＰＢ
Ｓ）で洗浄した後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ３．０）で溶出した。溶出された精製ポリペプ
チドをＳＤＳ含有アクリルアミドゲル（ＳＤＳ／４％〜
２０％アクリルアミドゲル；第一化学薬品社製）を用い
て電気泳動した後、ブロッティング装置を用いてポリビ
ニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。転写
後のＰＶＤＦ膜に、ブロックエース（大日本製薬社製）
を添加してブロッキングした後、マウス抗ＦＬＡＧモノ
クローナル抗体Ｍ２と、西洋わさびパーオキシダーゼ標
識ウサギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅ
ｄ社製又はＴＡＧＯ社製）とを、順次反応させた。ある
いは、ブロッキング後、ビオチン化したマウス抗ＦＬＡ
Ｇモノクローナル抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ社製）と、西洋
わさびパーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマ
シャムファルマシア社製）とを、順次反応させた。反応
後、ウエスタンブロッティング検出システム（ＥＣＬ
Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム；アマ
シャムファルマシア社製）を用いて、ポリペプチドの発
現を確認した。
ローナル抗体アガロースアフィニティーゲル（ＡＮＴＩ
−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ Ａｇａｒｏｓｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ；
Ｓｉｇｍａ社製）にアプライし、リン酸緩衝溶液（ＰＢ
Ｓ）で洗浄した後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ３．０）で溶出した。溶出された精製ポリペプ
チドをＳＤＳ含有アクリルアミドゲル（ＳＤＳ／４％〜
２０％アクリルアミドゲル；第一化学薬品社製）を用い
て電気泳動した後、ブロッティング装置を用いてポリビ
ニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。転写
後のＰＶＤＦ膜に、ブロックエース（大日本製薬社製）
を添加してブロッキングした後、マウス抗ＦＬＡＧモノ
クローナル抗体Ｍ２と、西洋わさびパーオキシダーゼ標
識ウサギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅ
ｄ社製又はＴＡＧＯ社製）とを、順次反応させた。ある
いは、ブロッキング後、ビオチン化したマウス抗ＦＬＡ
Ｇモノクローナル抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ社製）と、西洋
わさびパーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマ
シャムファルマシア社製）とを、順次反応させた。反応
後、ウエスタンブロッティング検出システム（ＥＣＬ
Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム；アマ
シャムファルマシア社製）を用いて、ポリペプチドの発
現を確認した。
発現したポリペプチドの分子量は、還元条件のＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）では５５ｋＤａであるのに対して、非還元条件のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥでは１３０ｋＤａ以上の異なる分子量で
あり、マルチマー構造をしていることが判明した。
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）では５５ｋＤａであるのに対して、非還元条件のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥでは１３０ｋＤａ以上の異なる分子量で
あり、マルチマー構造をしていることが判明した。
実施例９：Ｃ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチドの昆虫細
胞株での発現 前記実施例６で先に作製した発現用バクミドＢＡＣ−
ＣＤＦ−ＦＬＡＧを、市販のトランスフェクション試薬
（ＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎTM Ｒｅａｇｅｎｔ；ＬＩＦＥ
ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用いて、添付指示
書に従って、Ｓｆ９細胞（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯ
ＧＩＥＳ社製）に導入した。バクミド導入後、２〜３日
間培養して得た培養上清中に目的ポリペプチドが存在す
ることを、Ｃ末端に付加したＦＬＡＧタグに対する抗体
を用いて確認した。
胞株での発現 前記実施例６で先に作製した発現用バクミドＢＡＣ−
ＣＤＦ−ＦＬＡＧを、市販のトランスフェクション試薬
（ＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎTM Ｒｅａｇｅｎｔ；ＬＩＦＥ
ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用いて、添付指示
書に従って、Ｓｆ９細胞（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯ
ＧＩＥＳ社製）に導入した。バクミド導入後、２〜３日
間培養して得た培養上清中に目的ポリペプチドが存在す
ることを、Ｃ末端に付加したＦＬＡＧタグに対する抗体
を用いて確認した。
すなわち、前記培養上清を、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２モノク
ローナル抗体アガロースアフィニティーゲル（ＡＮＴＩ
−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ Ａｇａｒｏｓｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ；
Ｓｉｇｍａ社製）にアプライし、リン酸緩衝溶液（ＰＢ
Ｓ）で洗浄した後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ３．０）で溶出した。溶出された精製ポリペプ
チドをＳＤＳ含有アクリルアミドゲル（ＳＤＳ／４％〜
２０％アクリルアミドゲル；第一化学薬品社製）を用い
て電気泳動した後、ブロッティング装置を用いてＰＶＤ
Ｆ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜に、ブロックエー
ス（大日本製薬社製）を添加してブロッキングした後、
マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ
社製）と、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ウサギ抗マ
ウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ社製又はＴ
ＡＧＯ社製）とを、順次反応させた。あるいは、ブロッ
キング後、ビオチン化したマウス抗ＦＬＡＧモノクロー
ナル抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ社製）と、西洋わさびパーオ
キシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャムファル
マシア社製）とを、順次反応させた。反応後、ウエスタ
ンブロッティング検出システム（ＥＣＬ Ｐｌｕｓウエ
スタンブロッティング検出システム；アマシャムファル
マシア社製）を用いて、ポリペプチドの発現を確認し
た。
ローナル抗体アガロースアフィニティーゲル（ＡＮＴＩ
−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ Ａｇａｒｏｓｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ；
Ｓｉｇｍａ社製）にアプライし、リン酸緩衝溶液（ＰＢ
Ｓ）で洗浄した後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ３．０）で溶出した。溶出された精製ポリペプ
チドをＳＤＳ含有アクリルアミドゲル（ＳＤＳ／４％〜
２０％アクリルアミドゲル；第一化学薬品社製）を用い
て電気泳動した後、ブロッティング装置を用いてＰＶＤ
Ｆ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜に、ブロックエー
ス（大日本製薬社製）を添加してブロッキングした後、
マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ
社製）と、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ウサギ抗マ
ウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ社製又はＴ
ＡＧＯ社製）とを、順次反応させた。あるいは、ブロッ
キング後、ビオチン化したマウス抗ＦＬＡＧモノクロー
ナル抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ社製）と、西洋わさびパーオ
キシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャムファル
マシア社製）とを、順次反応させた。反応後、ウエスタ
ンブロッティング検出システム（ＥＣＬ Ｐｌｕｓウエ
スタンブロッティング検出システム；アマシャムファル
マシア社製）を用いて、ポリペプチドの発現を確認し
た。
発現したポリペプチドの分子量は、還元条件のＳＤＳ
−ＰＡＧＥでは５０ｋＤａであるのに対して、非還元条
件のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは１００ｋＤａ以上の異なる分
子量であり、マルチマー構造をしていることが判明し
た。
−ＰＡＧＥでは５０ｋＤａであるのに対して、非還元条
件のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは１００ｋＤａ以上の異なる分
子量であり、マルチマー構造をしていることが判明し
た。
実施例１０：配列番号２で表されるアミノ酸配列からな
るポリペプチドのｍＲＮＡの発現分布解析 （１）鋳型ｃＤＮＡの調製 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプ
チドのｍＲＮＡの発現分布解析は、定量ＰＣＲ法で実施
した。ヒト組織での発現分布解析は、市販のｃＤＮＡパ
ネル［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉ
ｓｓｕｅ ｃＤＮＡ（ＭＴＣTM）Ｐａｎｅｌの内、Ｈｕ
ｍａｎ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ Ｉ、Ｈｕｍａｎ ＭＴＣ
Ｐａｎｅｌ II、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓ
ｔｅｍ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ、Ｈｕｍａｎ Ｆｅｔａｌ
ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ、Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｄｉｏｖａ
ｓｃｕｌａｒ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ、及びＨｕｍａｎ
Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＭＴＣ Ｐａｎｅ
ｌ］を用いて実施した。
るポリペプチドのｍＲＮＡの発現分布解析 （１）鋳型ｃＤＮＡの調製 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプ
チドのｍＲＮＡの発現分布解析は、定量ＰＣＲ法で実施
した。ヒト組織での発現分布解析は、市販のｃＤＮＡパ
ネル［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉ
ｓｓｕｅ ｃＤＮＡ（ＭＴＣTM）Ｐａｎｅｌの内、Ｈｕ
ｍａｎ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ Ｉ、Ｈｕｍａｎ ＭＴＣ
Ｐａｎｅｌ II、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓ
ｔｅｍ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ、Ｈｕｍａｎ Ｆｅｔａｌ
ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ、Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｄｉｏｖａ
ｓｃｕｌａｒ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ、及びＨｕｍａｎ
Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＭＴＣ Ｐａｎｅ
ｌ］を用いて実施した。
また、ヒト膝関節軟骨組織及びヒト培養細胞での発現
分布解析では、ヒト膝関節軟骨組織及びヒト培養細胞か
ら、市販の総ＲＮＡ精製試薬（ＩＳＯＧＥＮ；Ｎｉｐｐ
ｏｎ Ｇｅｎｅ社製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得
られた総ＲＮＡをＤＮアーゼ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ
社製）を用いて、３７℃で１５分間反応させた。ＤＮア
ーゼ処理した総ＲＮＡ０．５μｇを、スーパースクリプ
ト・ファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ用）
（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用いて
ｃＤＮＡに変換した。
分布解析では、ヒト膝関節軟骨組織及びヒト培養細胞か
ら、市販の総ＲＮＡ精製試薬（ＩＳＯＧＥＮ；Ｎｉｐｐ
ｏｎ Ｇｅｎｅ社製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得
られた総ＲＮＡをＤＮアーゼ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ
社製）を用いて、３７℃で１５分間反応させた。ＤＮア
ーゼ処理した総ＲＮＡ０．５μｇを、スーパースクリプ
ト・ファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ用）
（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用いて
ｃＤＮＡに変換した。
（２）定量ＰＣＲによる配列番号２で表されるアミノ酸
配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡの定量 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプ
チドのｍＲＮＡのヒト組織及びヒト培養細胞での発現分
布解析は、前記実施例１０（１）で調製したｃＤＮＡ、
あるいは、前記実施例１０（１）で説明した市販のｃＤ
ＮＡパネルを鋳型にして、シークエンスディテクター
（Ｐｒｉｓｍ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃ
ｔｏｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
を用いて行なった。なお、配列番号６で表される塩基配
列からなるＦ１プライマーと、配列番号２３で表される
塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを、プライマー
セットとして用いた。ＰＣＲは、市販のＰＣＲ試薬（Ｓ
ＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｃｏｒｅ ｒｅａｇｅｎ
ｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用
い、９５℃（１０分間）の初期変性反応を実施した後、
９４℃（１５秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（６
０秒間）とからなるサイクル反応を４５回繰り返すこと
により実施した。
配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡの定量 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプ
チドのｍＲＮＡのヒト組織及びヒト培養細胞での発現分
布解析は、前記実施例１０（１）で調製したｃＤＮＡ、
あるいは、前記実施例１０（１）で説明した市販のｃＤ
ＮＡパネルを鋳型にして、シークエンスディテクター
（Ｐｒｉｓｍ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃ
ｔｏｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
を用いて行なった。なお、配列番号６で表される塩基配
列からなるＦ１プライマーと、配列番号２３で表される
塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを、プライマー
セットとして用いた。ＰＣＲは、市販のＰＣＲ試薬（Ｓ
ＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｃｏｒｅ ｒｅａｇｅｎ
ｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用
い、９５℃（１０分間）の初期変性反応を実施した後、
９４℃（１５秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（６
０秒間）とからなるサイクル反応を４５回繰り返すこと
により実施した。
また、ｍＲＮＡ発現量算出の標準曲線を得るために、
ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセット
を用いて同条件のＰＣＲを行なった。更に、内部標準と
してヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（ｇ３ｐｄｈ）の発現量を算出するために、前記ｃ
ＤＮＡ及びヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２
４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、
配列番号２５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチドとをプライマーセットとして、同条件のＰＣＲを
行なった。一定量のｍＲＮＡ当たりの、配列番号２で表
されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡの
発現量を得るために、各組織及び細胞における配列番号
２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲ
ＮＡの発現量は、各組織及び細胞でのｇ３ｐｄｈのｍＲ
ＮＡの発現量に対する割合で示した。
ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセット
を用いて同条件のＰＣＲを行なった。更に、内部標準と
してヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（ｇ３ｐｄｈ）の発現量を算出するために、前記ｃ
ＤＮＡ及びヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２
４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、
配列番号２５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチドとをプライマーセットとして、同条件のＰＣＲを
行なった。一定量のｍＲＮＡ当たりの、配列番号２で表
されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡの
発現量を得るために、各組織及び細胞における配列番号
２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲ
ＮＡの発現量は、各組織及び細胞でのｇ３ｐｄｈのｍＲ
ＮＡの発現量に対する割合で示した。
本発明による配列番号２で表されるアミノ酸配列から
なるポリペプチドのｍＲＮＡは、ヒト組織の内、関節軟
骨及び卵巣に特異的に発現していた。関節軟骨及び卵巣
以外のヒト組織については、市販のｃＤＮＡパネルを用
いて４７種類の異なるヒト組織を用いて発現を調べた
が、いずれの組織でもほとんど発現していなかった。ま
た、ヒト培養癌細胞株では、軟骨肉腫細胞株であるＨＣ
Ｓ−２／８でのみ発現が確認され、その他の９６種類の
ヒト癌細胞ではほとんど発現していなかった。更に、ヒ
ト初代培養正常細胞では、ヒト関節軟骨細胞でのみ発現
が確認され、４種類のヒト血管内皮細胞及び間葉系幹細
胞ではほとんど発現していなかった。
なるポリペプチドのｍＲＮＡは、ヒト組織の内、関節軟
骨及び卵巣に特異的に発現していた。関節軟骨及び卵巣
以外のヒト組織については、市販のｃＤＮＡパネルを用
いて４７種類の異なるヒト組織を用いて発現を調べた
が、いずれの組織でもほとんど発現していなかった。ま
た、ヒト培養癌細胞株では、軟骨肉腫細胞株であるＨＣ
Ｓ−２／８でのみ発現が確認され、その他の９６種類の
ヒト癌細胞ではほとんど発現していなかった。更に、ヒ
ト初代培養正常細胞では、ヒト関節軟骨細胞でのみ発現
が確認され、４種類のヒト血管内皮細胞及び間葉系幹細
胞ではほとんど発現していなかった。
実施例１１：軟骨細胞分化に伴う配列番号２で表される
アミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡの発現誘
導 （１）間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導 ヒト間葉系幹細胞は、ＴＧＦ−β３等の刺激下でスフ
ェロイド培養することにより、軟骨細胞に分化すること
が知られている（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ Ｍ．Ｆ．ら，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２８４，１４３−１４７，１９９９）。
アミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡの発現誘
導 （１）間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導 ヒト間葉系幹細胞は、ＴＧＦ−β３等の刺激下でスフ
ェロイド培養することにより、軟骨細胞に分化すること
が知られている（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ Ｍ．Ｆ．ら，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２８４，１４３−１４７，１９９９）。
正常ヒト間葉系幹細胞（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ
社製）を、ヒト間葉系幹細胞増殖培地キット（Ｂｉｏ
Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）で培養して５×１０5個の細
胞を得た。続いて、２．５×１０5個の細胞を、不完全
軟骨分化誘導培地［ＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓ
ｅ（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）、１ｍ
ｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨ
ＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）、０．３５ｍｍｏｌ／Ｌプロリ
ン（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）、０．
１μｍｏｌ／Ｌデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）、
０．１７ｍｍｏｌ／Ｌアスコルビン酸−２−リン酸（Ｓ
ｉｇｍａ社製）、及びＩＴＳ＋１ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓ
ｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ社製）］で洗浄した
後、完全軟骨分化誘導培地［０．０１μｇ／ｍＬのＴＧ
Ｆ−β３（Ｓｉｇｍａ社製）を含む不完全軟骨分化誘導
培地］５００μｌに細胞を懸濁し、ポリプロピレンチュ
ーブを用いて１５０×ｇで５分間遠心分離することによ
り細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットを、その
まま細胞培養装置中で培養して、３〜４日に一度、完全
軟骨分化誘導培地に培地交換しながら、２週間培養を継
続して、軟骨細胞に分化させた。
社製）を、ヒト間葉系幹細胞増殖培地キット（Ｂｉｏ
Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）で培養して５×１０5個の細
胞を得た。続いて、２．５×１０5個の細胞を、不完全
軟骨分化誘導培地［ＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓ
ｅ（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）、１ｍ
ｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨ
ＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）、０．３５ｍｍｏｌ／Ｌプロリ
ン（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）、０．
１μｍｏｌ／Ｌデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）、
０．１７ｍｍｏｌ／Ｌアスコルビン酸−２−リン酸（Ｓ
ｉｇｍａ社製）、及びＩＴＳ＋１ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓ
ｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ社製）］で洗浄した
後、完全軟骨分化誘導培地［０．０１μｇ／ｍＬのＴＧ
Ｆ−β３（Ｓｉｇｍａ社製）を含む不完全軟骨分化誘導
培地］５００μｌに細胞を懸濁し、ポリプロピレンチュ
ーブを用いて１５０×ｇで５分間遠心分離することによ
り細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットを、その
まま細胞培養装置中で培養して、３〜４日に一度、完全
軟骨分化誘導培地に培地交換しながら、２週間培養を継
続して、軟骨細胞に分化させた。
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリ
ペプチドのｍＲＮＡの発現誘導 未分化ヒト間葉系幹細胞及び分化した軟骨細胞から、
それぞれ、市販の総ＲＮＡ製薬試薬（ＩＳＯＧＥＮ；Ｎ
ｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ社製）を用いて総ＲＮＡを調製し
た。得られた総ＲＮＡをＤＮアーゼ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇ
ｅｎｅ社製）を用いて、３７℃で１５分間反応させた。
ＤＮアーゼ処理した総ＲＮＡ０．５μｇをスーパースク
リプト・ファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ
用）（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用
いてｃＤＮＡに変換した。
ペプチドのｍＲＮＡの発現誘導 未分化ヒト間葉系幹細胞及び分化した軟骨細胞から、
それぞれ、市販の総ＲＮＡ製薬試薬（ＩＳＯＧＥＮ；Ｎ
ｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ社製）を用いて総ＲＮＡを調製し
た。得られた総ＲＮＡをＤＮアーゼ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇ
ｅｎｅ社製）を用いて、３７℃で１５分間反応させた。
ＤＮアーゼ処理した総ＲＮＡ０．５μｇをスーパースク
リプト・ファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ
用）（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用
いてｃＤＮＡに変換した。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプ
チドのｍＲＮＡの未分化ヒト間葉系幹細胞及び分化した
軟骨細胞での発現分布解析は、前記実施例１０（２）と
同様にして行なった。また、間葉系幹細胞が軟骨細胞に
分化したことを確認するために、軟骨細胞に特異的に発
現しているII型コラーゲン及びIX型コラーゲンの各ｍＲ
ＮＡ発現を確認した。II型コラーゲンの発現は、配列番
号２６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
と、配列番号２７で表される塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチドとをプライマーセットとして、そして、IX型
コラーゲンは、配列番号２８で表される塩基配列からな
るオリゴヌクレオチドと、配列番号２９で表される塩基
配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーセット
として、前記実施例１０（２）に記載した方法により遺
伝子発現量を測定した。
チドのｍＲＮＡの未分化ヒト間葉系幹細胞及び分化した
軟骨細胞での発現分布解析は、前記実施例１０（２）と
同様にして行なった。また、間葉系幹細胞が軟骨細胞に
分化したことを確認するために、軟骨細胞に特異的に発
現しているII型コラーゲン及びIX型コラーゲンの各ｍＲ
ＮＡ発現を確認した。II型コラーゲンの発現は、配列番
号２６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
と、配列番号２７で表される塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチドとをプライマーセットとして、そして、IX型
コラーゲンは、配列番号２８で表される塩基配列からな
るオリゴヌクレオチドと、配列番号２９で表される塩基
配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーセット
として、前記実施例１０（２）に記載した方法により遺
伝子発現量を測定した。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明の
ポリペプチドをコードする遺伝子の、ヒト間葉系幹細胞
の軟骨分化前後での発現を測定した結果を、図１に示
す。軟骨への分化前の間葉系幹細胞では、II型コラーゲ
ン及びIX型コラーゲンは共にほとんど発現していない
が、軟骨細胞へ分化することで、II型コラーゲン及びIX
型コラーゲンの各遺伝子発現が誘導された。このことに
より、間葉系幹細胞が軟骨細胞へ分化したことが確認さ
れた。また、図１に示すように、本発明による配列番号
２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲ
ＮＡは、分化前の間葉系幹細胞では殆ど発現していなか
ったが、軟骨細胞に分化することにより、４０倍と顕著
に発現が誘導された。
ポリペプチドをコードする遺伝子の、ヒト間葉系幹細胞
の軟骨分化前後での発現を測定した結果を、図１に示
す。軟骨への分化前の間葉系幹細胞では、II型コラーゲ
ン及びIX型コラーゲンは共にほとんど発現していない
が、軟骨細胞へ分化することで、II型コラーゲン及びIX
型コラーゲンの各遺伝子発現が誘導された。このことに
より、間葉系幹細胞が軟骨細胞へ分化したことが確認さ
れた。また、図１に示すように、本発明による配列番号
２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲ
ＮＡは、分化前の間葉系幹細胞では殆ど発現していなか
ったが、軟骨細胞に分化することにより、４０倍と顕著
に発現が誘導された。
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリ
ペプチドのｍＲＮＡの発現誘導の経時的分析 次いで、ヒト間葉系幹細胞の軟骨細胞分化の過程で
の、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現誘
導を詳細に調べた。実施例１１（１）に記載の方法で、
ヒト間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させた。未分化ヒト
間葉系幹細胞並びに分化誘導後、２、４、８、１４、１
７、２２、及び２８日間培養した細胞を用い、実施例１
１（２）に記載の方法で総ＲＮＡ及びｃＤＮＡを調製し
た。各細胞での、配列番号２で表されるアミノ酸配列か
らなるポリペプチドの遺伝子発現量は、実施例１０
（２）に記載の方法で調べた。その結果、未分化ヒト間
葉系幹細胞に比べて、分化誘導後２、４、８、１４、１
７、２２、及び２８日間の培養により、配列番号２で表
されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの遺伝子発現
量は、それぞれ１、２、５、４、６、１２、及び１６倍
増加した。本結果より、配列番号２で表されるアミノ酸
配列からなるポリペプチドの遺伝子は、軟骨分化に伴
い、発現が誘導されることがより明確になった。
ペプチドのｍＲＮＡの発現誘導の経時的分析 次いで、ヒト間葉系幹細胞の軟骨細胞分化の過程で
の、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現誘
導を詳細に調べた。実施例１１（１）に記載の方法で、
ヒト間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させた。未分化ヒト
間葉系幹細胞並びに分化誘導後、２、４、８、１４、１
７、２２、及び２８日間培養した細胞を用い、実施例１
１（２）に記載の方法で総ＲＮＡ及びｃＤＮＡを調製し
た。各細胞での、配列番号２で表されるアミノ酸配列か
らなるポリペプチドの遺伝子発現量は、実施例１０
（２）に記載の方法で調べた。その結果、未分化ヒト間
葉系幹細胞に比べて、分化誘導後２、４、８、１４、１
７、２２、及び２８日間の培養により、配列番号２で表
されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの遺伝子発現
量は、それぞれ１、２、５、４、６、１２、及び１６倍
増加した。本結果より、配列番号２で表されるアミノ酸
配列からなるポリペプチドの遺伝子は、軟骨分化に伴
い、発現が誘導されることがより明確になった。
実施例１２：Ｃ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチドによる
軟骨細胞の分化誘導活性 ヒト関節軟骨細胞（ＢＩＯ ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社
製）を、軟骨細胞増殖培地（ＢＩＯ ＷＨＩＴＴＡＫＥ
Ｒ社製）を用いて６ウエルプレートで約７０％コンフル
エントまで培養した。前記実施例３で先に作製した発現
プラスミドｐＢＯＳ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧ（２μｇ）又は
コントロール用プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（２μｇ）
を、それぞれ、トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮ
ＥTM６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；
Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、
添付指示書に従って、前記ヒト関節軟骨細胞に導入し
た。軟骨細胞分化培地（ＢＩＯ ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社
製）で３日間培養した細胞から、前記実施例１０（１）
に記載の方法と同様にして、総ＲＮＡの調製及びｃＤＮ
Ａへの変換を実施した。
軟骨細胞の分化誘導活性 ヒト関節軟骨細胞（ＢＩＯ ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社
製）を、軟骨細胞増殖培地（ＢＩＯ ＷＨＩＴＴＡＫＥ
Ｒ社製）を用いて６ウエルプレートで約７０％コンフル
エントまで培養した。前記実施例３で先に作製した発現
プラスミドｐＢＯＳ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧ（２μｇ）又は
コントロール用プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（２μｇ）
を、それぞれ、トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮ
ＥTM６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；
Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、
添付指示書に従って、前記ヒト関節軟骨細胞に導入し
た。軟骨細胞分化培地（ＢＩＯ ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社
製）で３日間培養した細胞から、前記実施例１０（１）
に記載の方法と同様にして、総ＲＮＡの調製及びｃＤＮ
Ａへの変換を実施した。
II型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量は、得られた前記ｃ
ＤＮＡを鋳型にして、シークエンスディテクター（Ｐｒ
ｉｓｍ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏ
ｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用
いて行なった。なお、配列番号２６で表される塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２７で表され
る塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを、プライマ
ーセットとして用いた。ＰＣＲは、ＰＣＲ試薬（ＳＹＢ
Ｒ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｃｏｒｅ ｒｅａｇｅｎｔ；
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、
９５℃（１０分間）の初期変性反応を実施した後、９４
℃（１５秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（６０秒
間）とからなるサイクル反応を４５回繰り返すことによ
り実施した。
ＤＮＡを鋳型にして、シークエンスディテクター（Ｐｒ
ｉｓｍ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏ
ｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用
いて行なった。なお、配列番号２６で表される塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２７で表され
る塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを、プライマ
ーセットとして用いた。ＰＣＲは、ＰＣＲ試薬（ＳＹＢ
Ｒ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｃｏｒｅ ｒｅａｇｅｎｔ；
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、
９５℃（１０分間）の初期変性反応を実施した後、９４
℃（１５秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（６０秒
間）とからなるサイクル反応を４５回繰り返すことによ
り実施した。
また、ｍＲＮＡ発現量算出の標準曲線を得るために、
ヒト軟骨肉腫細胞株であるＨＣＳ−２／８細胞から調製
したｃＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットを用
いて同条件のＰＣＲを行なった。更に、内部標準として
ヒトｇ３ｐｄｈの発現量を算出するために、前記ｃＤＮ
Ａ及びヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２４で
表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列
番号２５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチ
ドとをプライマーセットとして、同条件のＰＣＲを行な
った。一定量のｍＲＮＡ当たりのII型コラーゲンのｍＲ
ＮＡの発現量を得るために、各細胞でのII型コラーゲン
のｍＲＮＡの発現量は、各細胞でのｇ３ｐｄｈのｍＲＮ
Ａの発現量に対する割合で示した。
ヒト軟骨肉腫細胞株であるＨＣＳ−２／８細胞から調製
したｃＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットを用
いて同条件のＰＣＲを行なった。更に、内部標準として
ヒトｇ３ｐｄｈの発現量を算出するために、前記ｃＤＮ
Ａ及びヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２４で
表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列
番号２５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチ
ドとをプライマーセットとして、同条件のＰＣＲを行な
った。一定量のｍＲＮＡ当たりのII型コラーゲンのｍＲ
ＮＡの発現量を得るために、各細胞でのII型コラーゲン
のｍＲＮＡの発現量は、各細胞でのｇ３ｐｄｈのｍＲＮ
Ａの発現量に対する割合で示した。
Ｃ末端にＦＬＡＧ配列を付加した本発明のポリペプチ
ドの発現プラスミドｐＢＯＳ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧを、関
節軟骨細胞にトランスフェクションすることにより、コ
ントロール用プラスミドであるｐＥＦ−ＢＯＳをトラン
スフェクションした場合に比べて、II型コラーゲンの発
現量が約２倍上昇した。
ドの発現プラスミドｐＢＯＳ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧを、関
節軟骨細胞にトランスフェクションすることにより、コ
ントロール用プラスミドであるｐＥＦ−ＢＯＳをトラン
スフェクションした場合に比べて、II型コラーゲンの発
現量が約２倍上昇した。
以上より、本発明のポリペプチドをヒト関節軟骨細胞
で発現させることにより、II型コラーゲンの発現を促進
することが明らかである。
で発現させることにより、II型コラーゲンの発現を促進
することが明らかである。
実施例１３：配列番号２で表されるアミノ酸配列からな
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのゲノム
構造と染色体マッピング 配列番号１で表される塩基配列と、アクセッションＮ
ｏ．ＡＣ０１５５００のヒトゲノムドラフト配列とにつ
いて、配列相同性解析プログラム（ＭｅｇＡｌｉｇｎ；
ＤＮＡＳＴＡＲ社製）を用いてアライメントを行ない、
前記ゲノムドラフト配列から、配列番号２で表されるア
ミノ酸配列からなるポリペプチドのｃＤＮＡのエクソン
及びイントロンを明らかにした。その結果、配列番号２
で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｃＤＮ
Ａは、配列番号１で表される塩基配列における１番〜１
３２番の塩基からなる配列を有するエクソン１、配列番
号１で表される塩基配列における１３３番〜２７７番の
塩基からなる配列を有するエクソン２、配列番号１で表
される塩基配列における２７８番〜３８１番の塩基から
なる配列を有するエクソン３、配列番号１で表される塩
基配列における３８２番〜４７５番の塩基からなる配列
を有するエクソン４、配列番号１で表される塩基配列に
おける４７６番〜５７６番の塩基からなる配列を有する
エクソン５、配列番号１で表される塩基配列における５
７７番〜６９７番の塩基からなる配列を有するエクソン
６、配列番号１で表される塩基配列における６９８番〜
８８３番の塩基からなる配列を有するエクソン７、及び
配列番号１で表される塩基配列における８８４番〜１７
０２番の塩基からなる配列を有するエクソン８の合計８
個のエクソンから構成されていることが判った。
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのゲノム
構造と染色体マッピング 配列番号１で表される塩基配列と、アクセッションＮ
ｏ．ＡＣ０１５５００のヒトゲノムドラフト配列とにつ
いて、配列相同性解析プログラム（ＭｅｇＡｌｉｇｎ；
ＤＮＡＳＴＡＲ社製）を用いてアライメントを行ない、
前記ゲノムドラフト配列から、配列番号２で表されるア
ミノ酸配列からなるポリペプチドのｃＤＮＡのエクソン
及びイントロンを明らかにした。その結果、配列番号２
で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｃＤＮ
Ａは、配列番号１で表される塩基配列における１番〜１
３２番の塩基からなる配列を有するエクソン１、配列番
号１で表される塩基配列における１３３番〜２７７番の
塩基からなる配列を有するエクソン２、配列番号１で表
される塩基配列における２７８番〜３８１番の塩基から
なる配列を有するエクソン３、配列番号１で表される塩
基配列における３８２番〜４７５番の塩基からなる配列
を有するエクソン４、配列番号１で表される塩基配列に
おける４７６番〜５７６番の塩基からなる配列を有する
エクソン５、配列番号１で表される塩基配列における５
７７番〜６９７番の塩基からなる配列を有するエクソン
６、配列番号１で表される塩基配列における６９８番〜
８８３番の塩基からなる配列を有するエクソン７、及び
配列番号１で表される塩基配列における８８４番〜１７
０２番の塩基からなる配列を有するエクソン８の合計８
個のエクソンから構成されていることが判った。
前記実施例１で得られた配列番号２で表されるアミノ
酸配列からなるポリペプチドのｃＤＮＡに関して、Ｇｅ
ｎＢａｎｋに対するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａ
ｌ ａｌｉｇｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）
（Ｓ．Ｆ．ＡＬｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２１５．４０３−４１０，１９９０）検索を行な
った。その結果、アクセッションＮｏ．ＡＰ００２３７
２及びアクセッションＮｏ．ＡＰ０００６３４の各ＢＡ
Ｃクローンに、配列番号２で表されるアミノ酸配列から
なるポリペプチドのｃＤＮＡが含まれることが判った。
これらのＢＡＣクローンはそれぞれ、約１５万及び約４
万塩基対から構成されていて、いずれもヒト染色体の１
１ｑ２２にマッピングされている。従って、配列番号２
で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの遺伝子
は、ヒト染色体の１１ｑ２２にマッピングされることが
判った。ヒト染色体の１１ｑ２２には、ＯＡになりやす
い家系やＯＡ患者の遺伝学的調査により、ＯＡ疾患に関
連する感受性遺伝子が連鎖することが報告されている
（Ｃｈａｐｍａｎ Ｋ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ
ｅｔ．，６５，１６７−１７４，１９９９）。従って、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチ
ドの遺伝子の変異が、ＯＡの感受性を規定している変異
である可能性が考えられる。
酸配列からなるポリペプチドのｃＤＮＡに関して、Ｇｅ
ｎＢａｎｋに対するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａ
ｌ ａｌｉｇｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）
（Ｓ．Ｆ．ＡＬｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２１５．４０３−４１０，１９９０）検索を行な
った。その結果、アクセッションＮｏ．ＡＰ００２３７
２及びアクセッションＮｏ．ＡＰ０００６３４の各ＢＡ
Ｃクローンに、配列番号２で表されるアミノ酸配列から
なるポリペプチドのｃＤＮＡが含まれることが判った。
これらのＢＡＣクローンはそれぞれ、約１５万及び約４
万塩基対から構成されていて、いずれもヒト染色体の１
１ｑ２２にマッピングされている。従って、配列番号２
で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの遺伝子
は、ヒト染色体の１１ｑ２２にマッピングされることが
判った。ヒト染色体の１１ｑ２２には、ＯＡになりやす
い家系やＯＡ患者の遺伝学的調査により、ＯＡ疾患に関
連する感受性遺伝子が連鎖することが報告されている
（Ｃｈａｐｍａｎ Ｋ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ
ｅｔ．，６５，１６７−１７４，１９９９）。従って、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチ
ドの遺伝子の変異が、ＯＡの感受性を規定している変異
である可能性が考えられる。
実施例１４：Ｃ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチド発現ア
デノウイルスベクターの構築 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプ
チドは、Ｎ末端の分泌シグナル配列が切断されて分泌発
現される。この分泌発現されたポリペプチドのＣ末端に
ＦＬＡＧを付加した本発明のポリペプチドを発現するた
めのウイルスベクターは、以下の手順で構築した。
デノウイルスベクターの構築 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプ
チドは、Ｎ末端の分泌シグナル配列が切断されて分泌発
現される。この分泌発現されたポリペプチドのＣ末端に
ＦＬＡＧを付加した本発明のポリペプチドを発現するた
めのウイルスベクターは、以下の手順で構築した。
まず、配列番号３０で表される塩基配列からなる１５
５ＫＢ５プライマーと配列番号３１で表される塩基配列
からなる１５５Ｘｈ３プライマーとをプライマーとし、
実施例３で先に作製したプラスミドｐＣＥＰ−ＣＤＦ−
ＦＬＡＧを鋳型とし、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎ
ａｔｉｖｅ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅTM；ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＤＮＡポリメラー
ゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃
（２分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０
秒間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とから
なるサイクルを４０回繰り返し、最後に７４℃（５分
間）の最終伸長反応を行なった。こうして生成した５’
側にＫｐｎＩ認識配列及びコザック配列を、３’側にＸ
ｈｏＩ認識配列が付加された目的ＤＮＡ断片を、クロー
ニング用ベクター（ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ社製）にサブクローンして配列を確認した後、
制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで切断し、プラスミドｐ
ＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ（Ｈｅ Ｔ．−Ｃ．ら，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，２５
０９−２５１４，１９９８）のＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ部
位に挿入した。得られたプラスミドをｐＡｄＴｒａｃｋ
−ＣＤＦ−Ｆｌａｇと命名した。
５ＫＢ５プライマーと配列番号３１で表される塩基配列
からなる１５５Ｘｈ３プライマーとをプライマーとし、
実施例３で先に作製したプラスミドｐＣＥＰ−ＣＤＦ−
ＦＬＡＧを鋳型とし、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎ
ａｔｉｖｅ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅTM；ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＤＮＡポリメラー
ゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃
（２分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０
秒間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とから
なるサイクルを４０回繰り返し、最後に７４℃（５分
間）の最終伸長反応を行なった。こうして生成した５’
側にＫｐｎＩ認識配列及びコザック配列を、３’側にＸ
ｈｏＩ認識配列が付加された目的ＤＮＡ断片を、クロー
ニング用ベクター（ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ社製）にサブクローンして配列を確認した後、
制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで切断し、プラスミドｐ
ＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ（Ｈｅ Ｔ．−Ｃ．ら，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，２５
０９−２５１４，１９９８）のＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ部
位に挿入した。得られたプラスミドをｐＡｄＴｒａｃｋ
−ＣＤＦ−Ｆｌａｇと命名した。
大腸菌ＢＪ５１８３（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）
を、プラスミドｐＡｄＥａｓｙ−１（Ｈｅ Ｔ．−Ｃ．
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
９５，２５０９−２５１４，１９９８）でトランスフォ
ームして、プラスミドｐＡｄＥａｓｙ−１を含む大腸菌
ＢＪ５１８３［以下、大腸菌ＢＪ５１８３（ｐＡｄＥａ
ｓｙ−１）と称する］を作製した。先に調製したプラス
ミドｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇを制限酵素Ｐ
ｍｅＩで切断し、これを用いて大腸菌ＢＪ５１８３（ｐ
ＡｄＥａｓｙ−１）をトランスフォームした。プラスミ
ドｐＡｄＥａｓｙ−１とプラスミドｐＡｄＴｒａｃｋ−
ＣＤＦ−Ｆｌａｇとがリコンビネーションしたクローン
を選択するために、得られたトランスフォーマントのク
ローンからプラスミドを調製して、制限酵素ＸｈｏＩに
よる切断パターンを調べた。プラスミドｐＡｄＴｒａｃ
ｋ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇの場合、４．５ｋｂのエキストラ
バンド（ｅｘｔｒａ ｂａｎｄ）が出現するクローンを
選択した。その結果、プラスミドのアーム部位で、デザ
インどおりにリコンビネーションを起こしたクローンを
得ることができ、ウイルスベクターｐＡｄ−ＣＤＦ−Ｆ
ｌａｇと命名した。
を、プラスミドｐＡｄＥａｓｙ−１（Ｈｅ Ｔ．−Ｃ．
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
９５，２５０９−２５１４，１９９８）でトランスフォ
ームして、プラスミドｐＡｄＥａｓｙ−１を含む大腸菌
ＢＪ５１８３［以下、大腸菌ＢＪ５１８３（ｐＡｄＥａ
ｓｙ−１）と称する］を作製した。先に調製したプラス
ミドｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇを制限酵素Ｐ
ｍｅＩで切断し、これを用いて大腸菌ＢＪ５１８３（ｐ
ＡｄＥａｓｙ−１）をトランスフォームした。プラスミ
ドｐＡｄＥａｓｙ−１とプラスミドｐＡｄＴｒａｃｋ−
ＣＤＦ−Ｆｌａｇとがリコンビネーションしたクローン
を選択するために、得られたトランスフォーマントのク
ローンからプラスミドを調製して、制限酵素ＸｈｏＩに
よる切断パターンを調べた。プラスミドｐＡｄＴｒａｃ
ｋ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇの場合、４．５ｋｂのエキストラ
バンド（ｅｘｔｒａ ｂａｎｄ）が出現するクローンを
選択した。その結果、プラスミドのアーム部位で、デザ
インどおりにリコンビネーションを起こしたクローンを
得ることができ、ウイルスベクターｐＡｄ−ＣＤＦ−Ｆ
ｌａｇと命名した。
また、プラスミドｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＤＦ−Ｆｌａ
ｇの代わりに、プラスミドｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ
（すなわち、空ベクター）を用いること以外は、前記手
順を繰り返すことにより、ウイルスベクターｐＡｄ−Ｃ
ＭＶを作製した。なお、プラスミドｐＡｄＴｒａｃｋ−
ＣＭＶの場合には、３ｋｂのエキストラバンドの出現を
指標にクローンを選択した。
ｇの代わりに、プラスミドｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ
（すなわち、空ベクター）を用いること以外は、前記手
順を繰り返すことにより、ウイルスベクターｐＡｄ−Ｃ
ＭＶを作製した。なお、プラスミドｐＡｄＴｒａｃｋ−
ＣＭＶの場合には、３ｋｂのエキストラバンドの出現を
指標にクローンを選択した。
実施例１５：ウイルスの産生及び精製
実施例１４で作製したウイルスベクターｐＡｄ−ＣＤ
Ｆ−Ｆｌａｇを制限酵素ＰａｃＩで切断し、市販のトラ
ンスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２
０００；ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製］を
用いて、添付指示書に従って、ＨＥＫ２９３細胞（大日
本製薬社製）に導入した。トランスフェクションした
後、８日間培養し、ウイルスの産生が確認できた時点で
細胞を回収した。ウイルスベクターｐＡｄ−ＣＤＦ−Ｆ
ｌａｇはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ユニッ
トを有しているため、このプラスミドを導入した細胞は
蛍光顕微鏡を用いて容易に判別することができる。回収
した細胞をＰＢＳに縣濁して、数回の凍結融解後、遠心
分離した上清を回収して、一次ウイルス溶液ｖＡｄ−Ｃ
ＤＦ−Ｆｌａｇを得た。得られたウイルスを、ＨＥＫ２
９３細胞に添加後、３日間培養を行ない、約５０％の細
胞が剥がれた時点で細胞を回収して、凍結融解によりウ
イルス画分を調製して、二次ウイルス溶液を得た。前記
のウイルス感染、細胞回収、及びウイルス画分調製を、
更に２回繰り返すことにより、最終的に、フラスコ（底
面積＝１５０ｃｍ2）１０枚で培養したウイルス感染Ｈ
ＥＫ２９３細胞よりウイルス溶液を得た。塩化セシウム
密度勾配法によりウイルス溶液を更に精製した。精製し
たウイルス溶液を緩衝液［１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣ
ｌ2，１３５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ］に透析した後、
２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ260）を測定して、ウイ
ルスのパーティクル濃度（単位＝パーティクル／ｍｌ）
を、式： Ａ260×１．１×１０12 により求めた。その結果、ウイルスベクターｐＡｄ−Ｃ
ＤＦ−Ｆｌａｇをトランスフェクトして得られたウイル
スｖＡｄ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇについては、１．２×１０
11パーティクル／ｍＬのウイルスパーティクルが得られ
た。
Ｆ−Ｆｌａｇを制限酵素ＰａｃＩで切断し、市販のトラ
ンスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２
０００；ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製］を
用いて、添付指示書に従って、ＨＥＫ２９３細胞（大日
本製薬社製）に導入した。トランスフェクションした
後、８日間培養し、ウイルスの産生が確認できた時点で
細胞を回収した。ウイルスベクターｐＡｄ−ＣＤＦ−Ｆ
ｌａｇはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ユニッ
トを有しているため、このプラスミドを導入した細胞は
蛍光顕微鏡を用いて容易に判別することができる。回収
した細胞をＰＢＳに縣濁して、数回の凍結融解後、遠心
分離した上清を回収して、一次ウイルス溶液ｖＡｄ−Ｃ
ＤＦ−Ｆｌａｇを得た。得られたウイルスを、ＨＥＫ２
９３細胞に添加後、３日間培養を行ない、約５０％の細
胞が剥がれた時点で細胞を回収して、凍結融解によりウ
イルス画分を調製して、二次ウイルス溶液を得た。前記
のウイルス感染、細胞回収、及びウイルス画分調製を、
更に２回繰り返すことにより、最終的に、フラスコ（底
面積＝１５０ｃｍ2）１０枚で培養したウイルス感染Ｈ
ＥＫ２９３細胞よりウイルス溶液を得た。塩化セシウム
密度勾配法によりウイルス溶液を更に精製した。精製し
たウイルス溶液を緩衝液［１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣ
ｌ2，１３５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ］に透析した後、
２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ260）を測定して、ウイ
ルスのパーティクル濃度（単位＝パーティクル／ｍｌ）
を、式： Ａ260×１．１×１０12 により求めた。その結果、ウイルスベクターｐＡｄ−Ｃ
ＤＦ−Ｆｌａｇをトランスフェクトして得られたウイル
スｖＡｄ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇについては、１．２×１０
11パーティクル／ｍＬのウイルスパーティクルが得られ
た。
また、ウイルスベクターｐＡｄ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇの
代わりに、ウイルスベクターｐＡｄ−ＣＭＶを用いるこ
と以外は、前記手順を繰り返すことにより、ウイルスベ
クターｐＡｄ−ＣＭＶをトランスフェクトして得られた
ウイルスｖＡｄ−ＣＭＶについては、５．９×１０10パ
ーティクル／ｍＬのウイルスパーティクルが得られた。
代わりに、ウイルスベクターｐＡｄ−ＣＭＶを用いるこ
と以外は、前記手順を繰り返すことにより、ウイルスベ
クターｐＡｄ−ＣＭＶをトランスフェクトして得られた
ウイルスｖＡｄ−ＣＭＶについては、５．９×１０10パ
ーティクル／ｍＬのウイルスパーティクルが得られた。
実施例１６：Ｃ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチドによる
軟骨細胞の分化誘導活性 ヒト関節軟骨細胞（ＢＩＯ ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社
製）を軟骨細胞増殖培地（ＢＩＯ ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ
社製）を用いて６ウエルプレートで約７０％コンフルエ
ントまで培養した。前記実施例１５で先に作製した各ウ
イルス（ウイルスｖＡｄ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇ、又はネガ
ティブコントロール用ウイルスｖＡｄ−ＣＭＶ）を、各
ウイルスについて、３×１０7パーティクル／ｗｅｌｌ
又は１×１０8パーティクル／ｗｅｌｌの２段階のパー
ティクル濃度で添加した。軟骨細胞分化培地（ＢＩＯ
ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社製）で４日間又は７日間培養した
後、細胞を回収して、ＲＮＡ調製キット（ＲＮｅａｓ
ｙ；ＱＩＡＧＥＮ社製）及びＤＮアーゼＩ（ＤＮａｓｅ
Ｉ；ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、添付文書に従ってＤ
Ｎａｓｅ処理を行なった総ＲＮＡを調製した。更に、Ｄ
Ｎアーゼ処理した総ＲＮＡ０．５μｇを、スーパースク
リプト・ファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ
用）（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用
いてｃＤＮＡに変換した。
軟骨細胞の分化誘導活性 ヒト関節軟骨細胞（ＢＩＯ ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社
製）を軟骨細胞増殖培地（ＢＩＯ ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ
社製）を用いて６ウエルプレートで約７０％コンフルエ
ントまで培養した。前記実施例１５で先に作製した各ウ
イルス（ウイルスｖＡｄ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇ、又はネガ
ティブコントロール用ウイルスｖＡｄ−ＣＭＶ）を、各
ウイルスについて、３×１０7パーティクル／ｗｅｌｌ
又は１×１０8パーティクル／ｗｅｌｌの２段階のパー
ティクル濃度で添加した。軟骨細胞分化培地（ＢＩＯ
ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社製）で４日間又は７日間培養した
後、細胞を回収して、ＲＮＡ調製キット（ＲＮｅａｓ
ｙ；ＱＩＡＧＥＮ社製）及びＤＮアーゼＩ（ＤＮａｓｅ
Ｉ；ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、添付文書に従ってＤ
Ｎａｓｅ処理を行なった総ＲＮＡを調製した。更に、Ｄ
Ｎアーゼ処理した総ＲＮＡ０．５μｇを、スーパースク
リプト・ファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ
用）（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用
いてｃＤＮＡに変換した。
II型コラーゲンの遺伝子発現量は、作製したｃＤＮＡ
を鋳型にして、シークエンスディテクター（ｐｒｉｓｍ
７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、リ
アルタイムの蛍光量を計測することで測定した。配列番
号３２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
と、配列番号３３で表される塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチドとを、プライマーセットとして用いた。ＰＣ
Ｒは、市販のＰＣＲ試薬（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣ
Ｒ ｃｏｒｅ ｒｅａｇｅｎｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、９５℃（１０分間）の
初期変性反応を実施した後、９４℃（１５秒間）と６０
℃（３０秒間）と７２℃（６０秒間）とからなるサイク
ル反応を４５回繰り返すことにより実施した。また、ｍ
ＲＮＡ発現量算出の標準曲線を得るため、３週間の軟骨
分化刺激を行ったヒト間葉系幹細胞から調製したｃＤＮ
Ａを鋳型として、前記プライマーセットを用いて同条件
のＰＣＲを行なった。
を鋳型にして、シークエンスディテクター（ｐｒｉｓｍ
７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、リ
アルタイムの蛍光量を計測することで測定した。配列番
号３２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
と、配列番号３３で表される塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチドとを、プライマーセットとして用いた。ＰＣ
Ｒは、市販のＰＣＲ試薬（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣ
Ｒ ｃｏｒｅ ｒｅａｇｅｎｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、９５℃（１０分間）の
初期変性反応を実施した後、９４℃（１５秒間）と６０
℃（３０秒間）と７２℃（６０秒間）とからなるサイク
ル反応を４５回繰り返すことにより実施した。また、ｍ
ＲＮＡ発現量算出の標準曲線を得るため、３週間の軟骨
分化刺激を行ったヒト間葉系幹細胞から調製したｃＤＮ
Ａを鋳型として、前記プライマーセットを用いて同条件
のＰＣＲを行なった。
アグリカンの遺伝子発現量は、作製したｃＤＮＡを鋳
型にして、シークエンスディテクター（Ｐｒｉｓｍ７７
００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、リアル
タイムの蛍光を計測することで測定した。配列番号３４
で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォ
ワードプライマー、配列番号３５で表される塩基配列か
らなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマー、そし
て、配列番号３６で表される塩基配列からなる蛍光標識
オリゴヌクレオチド（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ社製）をタックマン（ＴａｑＭａｎ）プローブと
して用いた。ＰＣＲは、タックマンバッファー（Ｔａｑ
Ｍａｎ Ｂｕｆｆｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ社製）を用い、９５℃（１０分間）の初期変性
反応を実施した後、９５℃（１５秒間）と６０℃（６０
秒間）とからなるサイクル反応を４５回繰り返すことに
より実施した。また、ｍＲＮＡ発現量算出の標準曲線を
得るため、未刺激のヒト関節軟骨細胞、あるいは、３週
間の軟骨分化刺激を行なったヒト間葉系幹細胞から調製
したｃＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットを用
いて同条件のＰＣＲを行なった。
型にして、シークエンスディテクター（Ｐｒｉｓｍ７７
００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、リアル
タイムの蛍光を計測することで測定した。配列番号３４
で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォ
ワードプライマー、配列番号３５で表される塩基配列か
らなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマー、そし
て、配列番号３６で表される塩基配列からなる蛍光標識
オリゴヌクレオチド（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ社製）をタックマン（ＴａｑＭａｎ）プローブと
して用いた。ＰＣＲは、タックマンバッファー（Ｔａｑ
Ｍａｎ Ｂｕｆｆｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ社製）を用い、９５℃（１０分間）の初期変性
反応を実施した後、９５℃（１５秒間）と６０℃（６０
秒間）とからなるサイクル反応を４５回繰り返すことに
より実施した。また、ｍＲＮＡ発現量算出の標準曲線を
得るため、未刺激のヒト関節軟骨細胞、あるいは、３週
間の軟骨分化刺激を行なったヒト間葉系幹細胞から調製
したｃＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットを用
いて同条件のＰＣＲを行なった。
更に、内部標準としてヒトｇ３ｐｄｈの発現量を算出
するため、前記ｃＤＮＡ及びヒトゲノムＤＮＡを鋳型と
して、配列番号２４で表される塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチドと、配列番号２５で表される塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドとをプライマーセットとして、
同条件のＰＣＲを行なった。
するため、前記ｃＤＮＡ及びヒトゲノムＤＮＡを鋳型と
して、配列番号２４で表される塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチドと、配列番号２５で表される塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドとをプライマーセットとして、
同条件のＰＣＲを行なった。
一定量のｍＲＮＡ当たりの本発明のポリペプチドの発
現量を得るため、各細胞でのII型コラーゲン遺伝子及び
アグリカン遺伝子の発現量は、各細胞でのｇ３ｐｄｈ発
現量に対する割合で示した。
現量を得るため、各細胞でのII型コラーゲン遺伝子及び
アグリカン遺伝子の発現量は、各細胞でのｇ３ｐｄｈ発
現量に対する割合で示した。
各培養日数及び各感染ウイルス濃度におけるII型コラ
ーゲン遺伝子及びアグリカン遺伝子の各発現量を、コン
トロール用ウイルスｖＡｄ−ＣＭＶを感染させた場合の
発現量に対する相対値として、表１に示す。その内、感
染後７日目のII型コラーゲン遺伝子の発現量を図２に示
し、感染後４日目のアグリカン遺伝子の発現量を図３に
示す。
ーゲン遺伝子及びアグリカン遺伝子の各発現量を、コン
トロール用ウイルスｖＡｄ−ＣＭＶを感染させた場合の
発現量に対する相対値として、表１に示す。その内、感
染後７日目のII型コラーゲン遺伝子の発現量を図２に示
し、感染後４日目のアグリカン遺伝子の発現量を図３に
示す。
ヒト関節軟骨細胞は、もともとII型コラーゲン及びア
グリカン遺伝子を産生しているが、本発明のポリペプチ
ドをアデノウイルスベクターを用いて細胞に強制発現さ
せることにより、表１に示すように、両遺伝子の発現量
を上昇させた。ネガティブコントロールとしては、本発
明のポリペプチドのｃＤＮＡを含まないウイルス（ｖＡ
ｄ−ＣＭＶ）を用いた。
グリカン遺伝子を産生しているが、本発明のポリペプチ
ドをアデノウイルスベクターを用いて細胞に強制発現さ
せることにより、表１に示すように、両遺伝子の発現量
を上昇させた。ネガティブコントロールとしては、本発
明のポリペプチドのｃＤＮＡを含まないウイルス（ｖＡ
ｄ−ＣＭＶ）を用いた。
ウイルスｖＡｄ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇを感染させて本発
明のポリペプチドを発現する関節軟骨細胞は、コントロ
ールのウイルスｖＡｄ−ＣＭＶを感染させた場合に比べ
て、II型コラーゲンの発現量については、３×１０7パ
ーティクル／ｗｅｌｌ又は１×１０8パーティクル／ｗ
ｅｌｌの濃度でウイルスを添加した場合、４日間の培養
でいずれも約２倍上昇し、７日間の培養でそれぞれ約６
倍又は約９倍上昇した。また、アグリカンの発現量につ
いては、３×１０7パーティクル／ｗｅｌｌ又は１×１
０8パーティクル／ｗｅｌｌの濃度でウイルスを添加し
た場合、４日間の培養でそれぞれ約２倍又は約７倍上昇
し、７日間の培養で約２倍又は約３倍上昇した。
明のポリペプチドを発現する関節軟骨細胞は、コントロ
ールのウイルスｖＡｄ−ＣＭＶを感染させた場合に比べ
て、II型コラーゲンの発現量については、３×１０7パ
ーティクル／ｗｅｌｌ又は１×１０8パーティクル／ｗ
ｅｌｌの濃度でウイルスを添加した場合、４日間の培養
でいずれも約２倍上昇し、７日間の培養でそれぞれ約６
倍又は約９倍上昇した。また、アグリカンの発現量につ
いては、３×１０7パーティクル／ｗｅｌｌ又は１×１
０8パーティクル／ｗｅｌｌの濃度でウイルスを添加し
た場合、４日間の培養でそれぞれ約２倍又は約７倍上昇
し、７日間の培養で約２倍又は約３倍上昇した。
以上より、本発明のポリペプチドをヒト関節軟骨細胞
で発現させることにより、II型コラーゲン及びアグリカ
ンの発現を促進することが明らかである。
で発現させることにより、II型コラーゲン及びアグリカ
ンの発現を促進することが明らかである。
産業上の利用可能性
本発明のポリペプチドの内、II型コラーゲン産生促進
活性を有するポリペプチドは、II型コラーゲンが関節軟
骨として機能するために重要な役割を担っているので、
関節軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進用医薬組成物の
有効成分として有用である。また、ＯＡ疾患ではII型コ
ラーゲンが減少しているため、変形性関節症治療及び／
又は予防用医薬組成物の有効成分としても有用である。
活性を有するポリペプチドは、II型コラーゲンが関節軟
骨として機能するために重要な役割を担っているので、
関節軟骨細胞のII型コラーゲン産生促進用医薬組成物の
有効成分として有用である。また、ＯＡ疾患ではII型コ
ラーゲンが減少しているため、変形性関節症治療及び／
又は予防用医薬組成物の有効成分としても有用である。
本発明のポリペプチドの内、アグリカン産生促進活性
を有するポリペプチドは、アグリカンが関節軟骨として
機能するために重要な役割を担っているので、アグリカ
ン産生促進用医薬組成物の有効成分として有用である。
また、アグリカンは軟骨組織を構成する主要なプロテオ
グリカンであり、ＯＡ疾患ではアグリカンが分解及び変
性されるので、変形性関節症の治療及び／又は予防用医
薬組成物の有効成分としても有用である。
を有するポリペプチドは、アグリカンが関節軟骨として
機能するために重要な役割を担っているので、アグリカ
ン産生促進用医薬組成物の有効成分として有用である。
また、アグリカンは軟骨組織を構成する主要なプロテオ
グリカンであり、ＯＡ疾患ではアグリカンが分解及び変
性されるので、変形性関節症の治療及び／又は予防用医
薬組成物の有効成分としても有用である。
本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞、及
び抗体は、本発明のポリペプチドを製造するのに有用で
ある。
び抗体は、本発明のポリペプチドを製造するのに有用で
ある。
また、本発明のポリヌクレオチド及び発現ベクター
は、II型コラーゲン産生促進、アグリカン産生促進、及
び／又は変形性関節症治療及び／又は予防のための遺伝
子治療に用いることができる。
は、II型コラーゲン産生促進、アグリカン産生促進、及
び／又は変形性関節症治療及び／又は予防のための遺伝
子治療に用いることができる。
配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔ
ｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載す
る。具体的には、配列表の配列番号９、１２〜１６、１
９〜２２、３０、及び３１の配列で表される各塩基配列
は、人工的に合成したプライマー配列であり、また、配
列表の配列番号１０、１１、１７、及び１８の配列で表
される各塩基配列は、人工的に合成したリンカー配列で
ある。
ｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載す
る。具体的には、配列表の配列番号９、１２〜１６、１
９〜２２、３０、及び３１の配列で表される各塩基配列
は、人工的に合成したプライマー配列であり、また、配
列表の配列番号１０、１１、１７、及び１８の配列で表
される各塩基配列は、人工的に合成したリンカー配列で
ある。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業
者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ａ６１Ｐ 43/00 １０７ Ｃ０７Ｋ 16/18
Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15
16/18 1/19
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21
1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
5/10 5/00 Ａ
// Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ)
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (12)
- 【請求項１】 （１）配列番号２で表されるアミノ酸配
列における第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配
列を有するポリペプチド、又は（２）配列番号２で表さ
れるアミノ酸配列における第２３番〜第３８８番のアミ
ノ酸からなる配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置
換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しか
も、II型コラーゲン産生促進活性及び／又はアグリカン
産生促進活性を示すポリペプチド。 - 【請求項２】 配列番号２で表されるアミノ酸配列にお
ける第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列を含
み、しかも、II型コラーゲン産生促進活性及び／又はア
グリカン産生促進活性を示すポリペプチド。 - 【請求項３】 配列番号２で表されるアミノ酸配列にお
ける第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列、又
は配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０
％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、II型コラー
ゲン産生促進活性及び／又はアグリカン産生促進活性を
示すポリペプチド。 - 【請求項４】 II型コラーゲン産生促進活性及びアグリ
カン産生促進活性を有する、請求項１〜３のいずれか一
項に記載のポリペプチド。 - 【請求項５】 配列番号２で表されるアミノ酸配列にお
ける第１番〜第３８８番又は第２３番〜第３８８番のア
ミノ酸からなる配列を有するポリペプチド。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項に記載のポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド。 - 【請求項７】 請求項６に記載のポリヌクレオチドを含
む発現ベクター。 - 【請求項８】 請求項７に記載の発現ベクターでトラン
スフェクションされた細胞。 - 【請求項９】 請求項１〜５のいずれか一項に記載のポ
リペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチド、又は
請求項７に記載の発現ベクターと、薬剤学的に許容する
ことのできる担体とを含む、II型コラーゲン産生促進用
医薬組成物。 - 【請求項１０】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の
ポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチド、又
は請求項７に記載の発現ベクターと、薬剤学的に許容す
ることのできる担体とを含む、アグリカン産生促進用医
薬組成物。 - 【請求項１１】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の
ポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチド、又
は請求項７に記載の発現ベクターと、薬剤学的に許容す
ることのできる担体とを含む、変形性関節症治療及び／
又は予防用医薬組成物。 - 【請求項１２】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の
ポリペプチドに結合する抗体又はその断片。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000-356378 | 2000-11-22 | ||
| JP2000356378 | 2000-11-22 | ||
| JP2000356378 | 2000-11-22 | ||
| PCT/JP2001/010150 WO2002042448A1 (fr) | 2000-11-22 | 2001-11-21 | Nouveau polypeptide |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2002042448A1 JPWO2002042448A1 (ja) | 2004-03-25 |
| JP3521331B2 true JP3521331B2 (ja) | 2004-04-19 |
Family
ID=18828639
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002545153A Expired - Fee Related JP3521331B2 (ja) | 2000-11-22 | 2001-11-21 | 新規ポリペプチド |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7125715B2 (ja) |
| EP (1) | EP1354947A4 (ja) |
| JP (1) | JP3521331B2 (ja) |
| AU (1) | AU2002224056A1 (ja) |
| WO (1) | WO2002042448A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1575497A4 (en) * | 2002-09-11 | 2010-11-03 | Genentech Inc | NEW COMPOSITION AND METHOD FOR TREATING PSORIASIS |
| JP6253875B2 (ja) * | 2012-09-19 | 2017-12-27 | 三洋化成工業株式会社 | コラーゲン産生促進剤、コラーゲン産生促進用培養液、抗老化剤、コラーゲン産生促進用ゲル、及び、コラーゲン産生用ゲルの製造方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5770209A (en) * | 1991-08-30 | 1998-06-23 | University Of South Florida | Acceleration of wound healing using connective tissue growth factor |
| CA2288690A1 (en) * | 1997-05-13 | 1998-11-19 | Osiris Therapeutics, Inc. | Osteoarthritis cartilage regeneration using human mesenchymal stem cells |
| WO2001053456A2 (en) | 1999-12-23 | 2001-07-26 | Hyseq, Inc. | Methods and materials relating to prothrombinase-like polypeptides and polynucleotides |
| AU6605900A (en) * | 1999-07-16 | 2001-02-05 | Hyseq, Inc. | Novel angiopoietin materials and methods |
| US6635742B1 (en) * | 2000-01-25 | 2003-10-21 | Nuvelo, Inc. | Antibodies specific for semaphorin-like polypeptides |
| US6586390B1 (en) * | 2000-01-21 | 2003-07-01 | Hyseq, Inc. | Methods and materials relating to novel prothrombinase-like polypeptides and polynucleotides |
-
2001
- 2001-11-21 EP EP01997548A patent/EP1354947A4/en not_active Withdrawn
- 2001-11-21 US US10/240,535 patent/US7125715B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-11-21 WO PCT/JP2001/010150 patent/WO2002042448A1/ja not_active Application Discontinuation
- 2001-11-21 JP JP2002545153A patent/JP3521331B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-11-21 AU AU2002224056A patent/AU2002224056A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1354947A4 (en) | 2005-01-19 |
| WO2002042448A1 (fr) | 2002-05-30 |
| JPWO2002042448A1 (ja) | 2004-03-25 |
| AU2002224056A1 (en) | 2002-06-03 |
| US20030153732A1 (en) | 2003-08-14 |
| US7125715B2 (en) | 2006-10-24 |
| EP1354947A1 (en) | 2003-10-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4411330B2 (ja) | 腫瘍壊死因子関連リガンド | |
| CZ2000490A3 (cs) | Interleukin-18-vazebné proteiny, příprava a použití | |
| MXPA06000974A (es) | Antagonistas y agonistas de ldcam y metodos para su uso. | |
| JPH11279196A (ja) | Ｖａｎｉｌｒｅｐ１ポリペプチドおよびｖａｎｉｌｒｅｐ１ポリヌクレオチ ド | |
| JPH025865A (ja) | ヒトの血小板由来の成長因子受容体 | |
| HU219674B (hu) | Glukagon-receptort kódoló DNS-molekulák, glukagon-receptor peptidek, glukagon-receptort blokkoló monoklonális ellenanyagok, és eljárások előállításukra | |
| JP2002501751A (ja) | 新規化合物 | |
| JP2002511233A (ja) | Ｔｒｅｋ１様の２孔カリウムチャネル | |
| JP4118336B2 (ja) | メルトリン | |
| JP2001509372A (ja) | 血小板凝集に関与する細胞表面受容体であるヒトｆ１１抗原 | |
| JP2000083669A (ja) | Ｃｘｃｒ４ケモカイン受容体のヒトスプライス変異体ｃｘｃｒ４ｂ | |
| JP3800175B2 (ja) | 新規なアグリカナーゼ | |
| JP3356771B2 (ja) | アグリカナーゼ活性を有する新規な金属プロテアーゼ | |
| JPH1142092A (ja) | ヒト心臓／脳トロイド様タンパク質 | |
| JP3521331B2 (ja) | 新規ポリペプチド | |
| JPWO2002051998A1 (ja) | 新規プロテアーゼ | |
| JPH1118786A (ja) | 腫瘍壊死関連受容体ｔｒ７ | |
| JP2005229804A (ja) | 新規なメラニンコンセントレーティングホルモン受容体 | |
| JPH06505629A (ja) | ヒト 血小板由来増殖因子レセプター | |
| JPH11253183A (ja) | Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−３ポリペプチドおよびポリヌクレオチド | |
| JP2001500386A (ja) | インテグリンリガンドであるヒトＭｉｎｄｉｎ | |
| JP2002527037A (ja) | サイトカインファミリーメンバーｅｆ−７ | |
| JPH11253182A (ja) | Ｇａｂａ ｂｐ ポリペプチドおよびポリヌクレオチド | |
| JPH11318472A (ja) | Ｍｐｒｏｔ１５ポリペプチドおよびｍｐｒｏｔ１５ポリヌクレオチド | |
| JP2002511388A (ja) | ヒトｇタンパク質共役受容体（ｇｐｒ２５） |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040127 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040127 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080220 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090220 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100220 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100220 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110220 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120220 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120220 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130220 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130220 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130220 Year of fee payment: 9 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |