JP3325939B2 - 蛍光エネルギー移転イムノアッセイ - Google Patents

蛍光エネルギー移転イムノアッセイ

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、光学的イムノアッセイ
方法に、より詳しくは免疫反応の反応体が別個に光ルミ
ネセンスエネルギーの移転のドナーおよびアクセプター
によってラベルされているイムノアッセイ方法に関す
る。免疫反応が起こり、ドナーとアクセプターが互いに
きわめて近接した場合に生じるエネルギーの移転が、検
出可能なルミネセンス寿命の変化を生じる。
【０００２】
【従来の技術】イムノアッセイは、可視的および放射活
性計測を含む数多くの手法によっている。また、蛍光強
度測定を用いることによって免疫反応を光学的に評価す
ることができることも知られている。蛍光強度測定はそ
の簡単さによって望ましいものであるが、この手法の有
効性は、ノイズ、ドリフトなどによる光源の変動、蛍光
団褪色およびバックグラウンドの蛍光のような問題によ
って制限されている。さらに、媒体が濁っていたり着色
していたりすれば、蛍光強度の測定値は大きく影響され
るであろう。そのうえ、強度は各段階における蛍光団の
合計、活性化強度、活性化および放射光の波長幅、検出
器の波長感受性などのような多数の要因を直線回帰した
ものであるので、複雑なキャリブレーションカーブがこ
れらの要因を補正するのに必要である。そして最後に、
プローブの強度の変化はかならずしも抗原と抗体の反応
による必要はない。このように蛍光強度測定は、有用で
高い感受性をある環境では有するが、上記にその概要を
示した問題による用途の制限に苦しめられている。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明は、光ルミネセン
スエネルギー移転のドナーまたはアクセプターの、みか
けのルミネセンス寿命の変化をある免疫反応生成物と相
関させる方法を提供する。本明細書においては、免疫反
応とは、ある抗原が少なくともひとつの、それを認識し
ている抗体と特異的に非共有結合で結合した結合がある
場合に生じるものとする。光ルミネセンスのドナーおよ
びアクセプターは免疫反応の反応体に担われており、免
疫反応が生じた場合には、このドナーおよびアクセプタ
ーが相互作用することができる、すなわちドナーおよび
アクセプター間でのエネルギーの授受が生じ、これが検
出可能なルミネセンス寿命の変化となって現れようにな
っている。寿命を測定することによって、強度測定の場
合の問題を排除することができる。見かけ上の寿命は、
位相変調蛍光定量法あるいは時間分解蛍光定量法によっ
て測定することができる。本方法の使用により、イムノ
アッセイはイン・ビボ、イン・ビトロあるいはイン・サ
イチュで行うことができる。比較的長波長の蛍光でラベ
ルするのが特に有用である。
【０００４】
【好ましい具体例の説明】本発明の方法によって、イム
ノアッセイに用いられる結合反応を計測、定量すること
ができる。本発明の方法においては、免疫反応の反応体
をそれぞれ、光ルミネセンスエネルギー移転のドナーお
よびアクセプターであって、このうち少なくともドナー
が光ルミネセンス性であるものでラベルする。ラベルさ
れた反応体相互の免疫反応によってドナーおよびアクセ
プターが、反応生成物を照射により励起した場合にドナ
ーとアクセプターの間にエネルギーの移転が生じるほど
密接に近接し、このためルミネセンスの寿命の変化を検
出できる。異方性、または偏光性あるいは衝突する消光
剤に対する感受性の増加あるいは減少もまたエネルギー
の移転による寿命の検出に用いられる性質である。反応
生成物の合計量および各反応体の濃度あるいは拮抗アッ
セイにおける拮抗反応体の濃度もまた定量することがで
きる。本発明の方法は様々な、拮抗、非拮抗反応を含
み、単純な抗原抗体反応あるいは様々なサンドイッチ型
反応を含む免疫反応に用いることができる。抗原および
／または抗体には１以上のドナーあるいはアクセプター
またはラベルを付してもよい。
【０００５】「試料」という語は、ここでは広く、免疫
反応反応体、例えば抗原および抗体が反応できるように
なっているイムノアッセイ系を指す。この言葉には、溶
液あるいは懸濁液の状態で第二反応体を作用させるべ
く、第一反応体が結合されている重合性の支持体のよう
な標準的実験環境のごときものも含まれる。また、液体
サンプルおよび／または懸濁液、血液、尿および分泌物
を含むようなものも含むことができる。また、本発明の
方法では容易なイン・ビボで試験する場合には、患者の
ことを指す場合もある。
【０００６】本発明の方法には、さらに試料を適当な照
射源、例えば連続波（ＣＷ）レーザー、電気ルミネセン
スランプ、アークランプ、光照射ダイオードあるいはレ
ーザーダイオードまたはその類似物のようなものでの照
射により励起することを含む。光源として、特に本発明
の方法に用いるのに有効なのは、緑および赤のヘリウム
−ネオンレーザー、ヘリウム−カドミウムレーザー、チ
タン−サファイアレーザー、色素レーザーと同調ポンピ
ングするアルゴンイオンまたはＮｄ：ＹＡＧレーザー、
および赤および赤外線レーザーダイオードである。
【０００７】好ましい具体例のひとつにおいては、励起
照射の強度を特定の変調周波数、たとえばシヌソイド型
に変調し、寿命を公知の位相変調、すなわち周波数−ド
メイン法によって定量する。変わりにスクエア波光源の
ようなパルス波照射を用いてもよく、また寿命を既知の
時間分解法で定量してもよい。位相変調および時間分解
の両方の蛍光定量方法が従来からよく知られており、ラ
コウィッツ（Lakowicz）のPrinciples of Fluorescence
Spectroscopy（Plenum Press, 1983,第３章）を参照す
ればよい。しかしながら現在の機器環境においては位相
変調の方がより便利となっている。ラコウィッツのLumi
nescence Techniques in Chemical andBiochemical Ana
lyses第141〜177頁(Baeyers,(Keukeleire and Kurkidis
編集)1991年、Maroel-Dekker, Inc.)、バーンドら(Bernd
t, Gryczynski and Lakowicz)のReviews of Scientific
Instrumentation(1990年、61、第1816〜1820頁)およびバ
ーンドとラコウィッツのAnalytical Biochemistry(1991
年、印刷中)を参照せよ。簡単にするため、これ以降位相
変調方法のみ論ずるが、おなじ原理は一般に、時間分解定
量方法にも適応できることは理解されるべきである。
【０００８】試料を、その強度が変調、例えばシヌソイ
ド様に変調されている照射によって励起したとき、吸光
と発光の間の時間のラグが発光の位相を遅れさせ、励起
照射に対して復調される。この位相の移転およびそれに
伴う復調の要因ｍは測定することができ、そして良く知
られた式を用いて光ルミネセンスの寿命の計算に用いる
ことができる。ラコウィッツのPrinciples of Fluoresc
ence Spectroscopy上巻参照のこと。本発明では、位相
角の差が約４５度であることが特に望ましい、というの
はこの角度が有意に大きいあるいは小さい場合には精度
およびダイナミックレンジが減少するからである。
【０００９】本発明においては、エネルギーの移転は光
ルミネセンスエネルギー移転のドナーおよび光ルミネセ
ンスエネルギー移転のアクセプターの間で生じ、少なく
ともこのドナーは光ルミネセンス性である。ドナーとア
クセプターの間のエネルギーの移転は免疫反応の存在に
相関した蛍光の寿命の変化となる。エネルギー移転の効
率はドナーから与えられる量、ドナーの発光スペクトル
とアクセプターの吸光スペクトルの重なり、およびドナ
ーとアクセプターの間の相対距離と方向に依存する。
【００１０】本発明に用いられるドナーは良好な発光
量、寿命および消衰係数を有し、衝突による消光および
漂白に抵抗性であるべきであり、好ましくは水溶性で、
たやすく免疫反応の反応体に抱合されるものである。特
に好ましくは、赤および近赤外領域において吸光と発光
を示すドナーであり、これらは散乱および背景の蛍光の
問題がないため全血および生体組織の分析に有用であ
る。好都合なことに、比較的高価でないため、さほど強
力ではないが簡単に変調させることができるレーザーダ
イオードをこのようなドナーに対する光源として用いる
ことができる。このドナーは好ましくは約０.１ナノ秒
から１秒の寿命を有しており、代表的なドナーとしては
１から３０ナノ秒オーダーの、より好ましくは約５ナノ
秒の寿命を有する。短命のドナーは約０.１ナノ秒およ
びそれ以上、長命のドナーは約３０から４００ナノ秒で
あり、そしてランタニド類は１秒までである。
【００１１】このようなドナーの例としては、シアニン
類、オキサジン類、チアジン類、ポルフィリン類、フタ
ロシアニン類、ビオラントロン類、フィコビリ蛋白質
類、マレイミド類、スルスルフヒドリル類、イソチオシ
アネート類、スクシンイミジルエステル類、カルボイミ
ド類、スルホニルクロリド類、ハロアセチル誘導体等の
蛍光赤外発光多核芳香族炭化水素類（fluorescent infr
ared-emitting polynuclear aromatic hydrocarbons)、
例えばDyes and Pigments第17巻第19〜27頁(1991)年に
記載されているもの、および米国特許第4,745,076号、
同第4,670,572号に記載されたレチニウムおよびランタ
ニド錯体のような有機金属錯体等の近赤外スクアライン
色素（near IR squaraine dye)が挙げられる。上記米国
特許の記載は本明細書に参考として含まれる。ランタニ
ド錯体は酸素によって消光されないという利点を有し、
その長い寿命は生物試料の自己蛍光をたやすく抑制する
ことができるであろう。特に好ましい物質としては、フ
ルオレセインイソチオシアネート（特に、フルオレセイ
ン−５−イソチオシアネート）、ジクロロトリアジニル
アミノフルオレセイン、テトラメチルローダニン−５−
（および−６−）イソチオシアネート、１，３−ビス
（２−ジアルキルアミノ−５−チオニル）−置換スクア
ライン類、５（および６）−カルボキシフルオレセイ
ン、５（および６）−カルボキシテトラメチルローダニ
ン；および７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸
のスクシンイミジルエステル類、
【００１２】
【化１６】
【００１３】
【化１７】
【００１４】
【化１８】
【００１５】
【化１９】
【００１６】
【化２０】
【００１７】
【化２１】
【００１８】
【化２２】 が挙げられる。
【００１９】本発明に用いられる光ルミネセンスエネル
ギー移転のアクセプターとして好ましくは、光ルミネセ
ンスエネルギー移転のドナーに関しての上述の性質と、
アクセプター自身が光ルミネセンス性を有している必要
はないことを除いては同様の性質を有するものが好まし
い。それゆえ、ドナーとして上に挙げたようなクラスの
化合物はアクセプターとしても用いることができる。こ
れに加えて、アゾ色素類のような適当な波長を吸収する
化合物もアクセプターとして用いることができる。特に
好ましい化合物として上に挙げた化合物はアクセプター
としても有用であり、これに加えて、エオシンイソチオ
シアネート、
【００２０】
【化２３】
【００２１】も有用である。免疫反応の反応体は、免疫
反応が生じた時にその内部の一対(intra-pair)の距離お
よび方向が好ましいものとなる確率が最大となるようド
ナーあるいはアクセプターでラベルされなくてはならな
い。このことによって最適な結果が得られる。
【００２２】図１は、本発明の典型的な具体例の概念図
である。免疫反応がドナーであるフルオレセインイソチ
オシアネート（ＦＩＴＣ）でラベルされている抗体とア
クセプターであるエオシンイソチオシアネート（ＥＯＳ
ＩＮ）でラベルされている抗原の間で生じたことを示
す。その結果、ドナーとアクセプターはエネルギーの移
転（波線矢印で図中に示す）がドナーとアクセプターの
間で生じるよう十分密に近接している。続いてドナーの
光ルミネセンスの寿命の検出可能な変化となって現れる
結果となり、これは所望によりラベルされた抗原の量に
相関させることができる。同様にして、所望により抗体
をアクセプターでラベルし、抗原をドナーでラベルして
もよい。これは図２に示されており、抗原Ｔ4はドナー
であるＢ−フィコエリトン複合体（B-phycoerythrin co
njugate)でラベルされ、抗体である抗−Ｔ4ＩｇＧ（Ｍ
Ａｂ）はアクセプターであるＣＹ５でラベルされてい
る。
【００２３】図３は、５０ＭＨｚにおけるＦＩＴＣでラ
ベルした抗体の見かけの寿命あるいは位相角と、ラベル
した抗原、エオシン−ＩｇＧの量の相関を示したグラフ
である。計測された位相角および誘導されたみかけの寿
命は（アクセプターでラベルした）抗原の量の増加に従
って減少している。
【００２４】図４から図７は抗体としてヤギの抗マウス
ＩｇＧ（マウスのイムノグロブリンＧを認識するように
ヤギで作製した抗体）をドナーであるジクロロトリアジ
ニルアミノフルオレセインでラベルしたもの（"ＤＴＡ
Ｆ−ＧＡＭＧＧ"）を用い、抗原としてマウスのＩｇＧ
にアクセプターであるテトラメチルローダミンイソチオ
シアネートでラベルしたもの（"ＴＲＩＴＣ−ＭＩＧ
Ｇ"）を用いて行った試験の結果を示す。
【００２５】図４は、ＤＴＡＦ−ＧＡＭＧＧ単独、およ
びこれをＴＲＩＴＣ−ＭＩＧＧと反応させた場合の位相
角（および変調）と周波数の関係を示す。試料はＨｅ／
Ｃｄレーザーで励起波長４２２ｎｍにて励起した。発光
波長は５２０ｎｍとした。ＴＲＩＴＣ−ＭＩＧＧのＤＴ
ＡＦ−ＧＡＭＧＧに対するモル比は０．３８とした。
【００２６】図５はレーザーを、ピリジン色素レーザー
と同調ポンピングする連続波周波数２倍モード固定Ｎ
ｄ：ＹＡＧレーザー（continuous wave frequency-doub
led mode-locked Nd:YAG laser synch-pumping a pyrid
ine 1 dye laser)で、その出力の周波数が２倍であり、
３８０ｎｍの励起波長の照射をするものを用いる以外は
図４と同じ相関図である。
【００２７】図６は図４及び５の反応における位相角と
周波数の間の相関を示す。両方の波長に対して、位相角
の変化は周波数の増加に従って増加している。
【００２８】図７はピリジン1色素レーザーと同調ポン
ピングする連続波周波数２倍モード固定Ｎｄ：ＹＡＧレ
ーザーの図示したような異なる周波数に変調した場合の
位相角と抗原量の間の相関を示す。位相角は抗原量の増
加に伴って減少する。
【００２９】図８は図２の反応における位相角あるいは
変調と周波数の間の相関を、異なるアクセプター濃度に
おいて、励起波長５６０ｎｍのＹＡＧ／Ｒ６Ｇレーザー
を用いて調べた相関図である。発光波長は５８０ｎｍと
した。
【００３０】本発明の方法に用いるための好ましい機器
の具体例のひとつの概念図を図９に示した。これにかぎ
られず、適当な機器を用いることができることは理解さ
れるべきである。
【００３１】図９に示したように、照射源１０、この場
合にはヘリウム−ネオンレーザーで照射波長５４３ｎｍ
で、励起ビーム１２を発光し、これは音響光学（acoust
ooptic)変調器１４にて周波数ｆ１でシヌソイド様に変
調された励起ビーム１６を発するように調節される。変
調器１４は音響光学変調器である必要はなく、電気的変
調器のような適当な変調器であればどれでも使用してよ
い。さらに、変調はシヌソイド型である必要もなく、ど
のような好ましい形状でもよい。また、変調器は外部に
設置する必要はなく、かわりに、レーザーダイオードで
可能なように、光源をもとから変調させてもよい。
【００３２】シヌソイド型に変調された励起ビーム１６
は、ラベルした免疫反応の反応体を含む試料を照射す
る。この照射されたサンプルは発光ビーム１８を発光
し、これは光電子増倍管(photomultipiler tube)２０で
検出される。この代わりに、アバランク型（avalanche)
光ダイオードを検出器として、特に赤外線の検出に用い
てもよい。発光されたビーム１８は増幅され、励起光と
同じ周波数に変調されるが、励起光に対して位相はシフ
トし、そして励起光に応じて復調される。発光ビーム１
８を光学フィルターＦのフィルターを通して検出器の効
率的な感受性域に変化させても良い。
【００３３】相互相関回路（cross-correlation circui
t)２２には音響光学変調器１４を駆動するために変調周
波数ｆＭの半分の周波数ｆ１を生み出す第１周波数シン
セサイザー２４を含む。相互相関回路２２にはまた光り
倍率器管２０を駆動するために、変調周波数ｆＭに相互
相関周波数△ｆを加えた周波数と等しい周波数ｆ２を生
じさせる第２周波数シンセサイザー２６も含まれる。第
１周波数シンセサイザー２４は周波数２倍器２８と一対
をなし、これは変調周波数ｆＭと等しい周波数を有する
シグナルをミキサー３０へ向ける。第２周波数シンセサ
イザー２６もまた、変調周波数ｆＭに相互相関周波数△
ｆを加えたものに等しい周波数ｆ２を有するシグナルを
ミキサー３０へ向ける。ミキサー３０は、ｆＭとｆ２の
差である△ｆに等しい周波数のシグナルを出力する。
【００３４】ミキサー３０および光電子増倍管２０はそ
れぞれ位相計／デジタル式電圧計３２に接続されてい
る。位相計／デジタル式電圧計３２は△ｆの周波数を有
するミキサー３０より得られるシグナルと△ｆ（シフト
している）の周波数を有する光倍率器官２０から得られ
るシグナルを比較して位相シフトφおよび変調要因ｍを
計算する。位相シフトφおよび変調要因ｍはその後コン
ピューター３４にかけられる。上記解説は説明のためだ
けであり、これに限定されるものではない。添付の請求
の範囲により規定される発明の範囲内での修飾も本発明
の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の好ましい具体例のひとつに関する免
疫反応の概念図である。
【図２】 本発明の好ましい具体例のひとつに関する免
疫反応の概念図である。
【図３】 図１の免疫反応のひとつの抗原の量に対する
見かけ上の寿命あるいは位相角の相関を示すグラフであ
る。
【図４】 本発明の他の好ましい具体例の免疫反応にお
ける周波数に対する位相角あるいは変調の相関を示すグ
ラフである。
【図５】 図４と同じ免疫反応において、異なった励起
波長を用いた場合の周波数に対する位相角あるいは変調
の相関を示すグラフである。
【図６】 図３及び図４の励起波長における周波数に対
する位相角の相関を示すグラフである。
【図７】 図４の免疫反応に対して異なる周波数におけ
る抗原の量に対する位相角の相関を示すグラフである。
【図８】 図２に示した免疫反応において、周波数に対
する免疫反応時の位相角の変化および変調を示すグラフ
である。
【図９】 本発明の好ましい具体例を実施するために使
用する機器の概念図である。
【符号の説明】
１０：ヘリウム−ネオンレーザー、１２：励起ビーム、
１４：音響光学変調器、１６：励起ビーム、１８：発光
ビーム、２０：光電子増倍管、２２：相互相関回路、２
４、２６周波数シンセサイザー、２８：周波数２倍器、
３０：ミキサー、３２：位相計／デジタル電圧計、３
４：コンピューター
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リチャード・トンプソン アメリカ合衆国21212メリーランド州バ ルティモア、ブリストル・ロード7106番 (72)発明者 アルビダス・オジンスカス アメリカ合衆国21036メリーランド州デ イトン、セントーラス・コート5002番 (56)参考文献 米国特許4822733（ＵＳ，Ａ) Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．59 （1987）ｐ．423−427 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 - 33/579

Claims (28)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 実質的に免疫反応の第一および第二反応
    体の一方が光ルミネセンスのエネルギー移転のドナーで
    ラベルされており、他方が該ドナーと相補的な光ルミネ
    センスのエネルギー移転のアクセプターでラベルされて
    おり、該ドナーが光ルミネセンス性を有し、この光ルミ
    ネセンス性ドナーおよびアクセプターが免疫反応の第一
    反応体が免疫反応の第二反応体と反応したときに、ドナ
    ーとアクセプターが相互作用してドナーが検出可能なル
    ミネセンスの寿命の変化を生ずるように選択されている
    ものである、免疫反応の第一反応体を該第一反応体と反
    応する第二反応体に暴露することによって試料を調製
    し； 試料を照射により励起させ； その結果の発光を検出し； ドナーのみかけのルミネセンス寿命を免疫反応の第一お
    よび第二反応体による反応生成物の存在量を定量するた
    めに計算する； ことのみからなる、光ルミネセンスを利用したイムノア
    ッセイ法。
  2. 【請求項２】 光ルミネセンスのドナーが、シアニン
    類、オキサジン類、チアジン類、ポルフィリン類、フタ
    ロシアニン類、蛍光赤外線発光多核芳香族炭化水素類、
    フィコビリタンパク質類、スルホニルクロライド類、カ
    ルボジイミド類、ハロアセチル誘導体類、スククアライ
    ン類および有機−金属錯体類からなる群から選択される
    請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 光ルミネセンスのアクセプターがシアニ
    ン類、オキサジン類、チアジン類、ポルフィリン類、フ
    タロシアニン類、多核芳香族炭化水素類、フィコビリタ
    ンパク質類、スクアライン類、有機−金属錯体、カルボ
    ジイミド類、スルホニルクロライド類、ハロアセチル類
    およびアゾ色素類からなる群から選択される請求項１記
    載の方法。
  4. 【請求項４】 免疫反応の第一反応体が免疫反応の第二
    反応体と反応した時にドナーとアクセプター間にエネル
    ギーの移転が生じる請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 みかけの寿命を位相変調蛍光定量法を用
    いて計算する請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 みかけの寿命を時間分解蛍光定量法を用
    いて計算する請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 免疫反応の第一および第二反応体が拮抗
    アッセイに関するものである請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 免疫反応の第一および第二反応体が非拮
    抗アッセイに関するものである請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 免疫反応の第一および第二反応体がサン
    ドイッチアッセイに関するものである請求項１記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】 光ルミネセンスのドナーが、フルオレ
    セインイソチオシアネート、ジクロロトリアジニルアミ
    ノフルオレセイン、１，３−ビス−（２−ジアルキルア
    ミノ−５−チオニル−置換スクアライン類、 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 【化６】 【化７】 からなる群から選択される、請求項２記載の方法。
  11. 【請求項１１】 光ルミネセンスのアクセプターが、エ
    オシンイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイ
    ソチオシアネート、１，３−ビス−（２−ジアルキルア
    ミノ−５−チオニル）−置換スクアライン類、 【化８】 【化９】 【化１０】 【化１１】 【化１２】 【化１３】 【化１４】 【化１５】 からなる群から選択される請求項３記載の方法。
  12. 【請求項１２】 免疫反応の第一および第二の反応体に
    よる免疫反応生成物の量を、みかけの光ルミネセンスの
    寿命に基づいて定量するステップをさらに有する請求項
    １記載の方法。
  13. 【請求項１３】 試料をイン・ビトロで調製する請求項
    １記載の方法。
  14. 【請求項１４】 試料をイン・ビボで調製する請求項１
    記載の方法。
  15. 【請求項１５】 試料をイン・サイチュで調製する請求
    項１記載の方法。
  16. 【請求項１６】 試料を変調光あるいはパルス光で励起
    する請求項１記載の方法。
  17. 【請求項１７】 試料をシヌソイド型に変調した光ある
    いはスクエアー波光にて励起する請求項１記載の方法。
  18. 【請求項１８】 試料をヘリウム−カドミウムレーザー
    を用いて励起する請求項１記載の方法。
  19. 【請求項１９】 試料をチタン−サファイアレーザー、
    レーザーダイオードあるいは色素レーザーと同調ポンピ
    ングする連続波周波数２倍モード固定アルゴンイオンあ
    るいはＮｄ：ＹＡＧレーザーによって励起する請求項１
    記載の方法。
  20. 【請求項２０】 試料を４４２ｎｍの波長で励起する請
    求項１８記載の方法。
  21. 【請求項２１】 試料を３８０ｎｍの波長で励起する請
    求項１９記載の方法。
  22. 【請求項２２】 ドナーの寿命を計算する請求項１記載
    の方法。
  23. 【請求項２３】 アクセプターの寿命を計算する請求項
    １記載の方法。
  24. 【請求項２４】 ドナーが約０.１ナノ秒から１ナノ秒
    の寿命を有する請求項１記載の方法。
  25. 【請求項２５】 寿命が約５ナノ秒である請求項２２記
    載の方法。
  26. 【請求項２６】 位相角の差が約４５度である請求項５
    記載の方法。
  27. 【請求項２７】 試料をＨｅＮｅレーザーあるいはレー
    ザーダイオードで励起する請求項１記載の方法。
  28. 【請求項２８】 ドナーあるいはアクセプターが５−６
    −カルボキシフルオレセイン；５−６−カルボキシテト
    ラ−メチルロ−ダミン；および７−アミノ−４−メチル
    クマリン−３−酢酸のスクシンイミジルエステルからな
    る群から選択される請求項１記載の方法。
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