JP3317443B2 - 試料観察装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、共焦点光学顕微鏡
を用いて試料断層像を観察する試料観察装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、共焦点検出法によって、所定
の厚さを持つ試料のある一断面を観察する共焦点光学顕
微鏡が知られており、例えば特開昭６３−３０６４１４
号公報に記載されている。

【０００３】この共焦点光学顕微鏡は、図１０に示すよ
うに、光源１からの光を対物レンズ２によって、厚みを
持った試料３の１点Ｐ１に集束させる。そして試料３を
通過した光を集光レンズ４で再び集光し、その集光位置
に配置されたピンホール５を通過した光を光検出器で検
出する。

【０００４】このとき、対物レンズ２の集光位置Ｐ１以
外からの光、例えば試料の点Ｐ２からの光は、図中点線
で示すようにピンホール５で遮断されて光検出器６に入
射しない。従って、試料３内の点Ｐ１からのみの画像デ
ータを得ることができる。

【０００５】そこで、対物レンズ２によるスポット光、
若しくは試料３を載せたステージ（不図示）を、光軸と
直交する平面で２次元走査することにより、所定の断層
面が走査されて、その断層像を得ることができる。そし
て走査する断層面を光軸方向へ順次移動させることによ
り、光軸方向に連続する複数の試料断層像を得ることが
できる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ところで、上述した共
焦点光学顕微鏡は、試料３の３次元構造を観察するため
に、試料３の全体を観察できるように、走査範囲が断層
面の全範囲をカバーする範囲に設定され、かつ試料の一
番下から一番上にかけての各断層面を順番に連続して走
査するように設定されている。

【０００７】ところで、生きている細胞に様々な刺激を
与えて、その刺激に対する反応を観察する場合、上述し
たような細胞の全体ではなく、各断層面における特定の
微小領域とその領域の深さの違う位置での様子を任意の
順番で観察する必要がある。しかしながら、上記した従
来の共焦点光学顕微鏡では、上記した全体観察の設定に
従って動作するので、各断層面における特定の領域のみ
を走査したり、その領域の深さの違う位置での様子を任
意の順番で観察することができなかった。

【０００８】また、常に試料全体を観察するため、所望
領域の画像データを得るまでに時間が掛かり、刺激に対
する反応を観察する場合には、細胞の反応時間に間に合
わない可能性があった。

【０００９】本発明は以上のような実情に鑑みてなされ
たもので、観察したい領域のみを観察でき、刺激による
細胞の状態の変化等を観察するのに好適な試料観察装置
を提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は上記目的を達成
するために、第１の発明となる試料観察装置を、試料に
対して光源からの光をスポット状に集光させるレンズ
と、前記試料と共役な位置に配置されたピンホールと、
このピンホールを通過した光を光電変換して画像信号を
出力する光検出器と、前記レンズでスポット状に集光さ
れた光で前記試料上を２次元走査する第１の走査手段
と、前記試料に刺激を与える手段と、前記光検出器から
出力される画像信号を記憶する画像記憶手段と、この画
像記憶手段に記憶された試料像データを表示する表示器
とを備えた試料観察装置において、前記画像記憶手段か
ら前記試料像データを読出して、該試料像データに基づ
く試料像を前記表示器に表示させる表示制御手段と、前
記表示器に表示された試料像を基に、前記試料の観察し
たい領域を設定し、設定した領域のみに限って走査を行
なうようにした領域設定手段と、刺激に対する試料の反
応を観察する場合、前記試料に刺激を与える手段と前記
第１の走査手段とを同期させる同期手段とを具備し、試
料に刺激を与えるのに同期して走査を開始するものとし
た。

【００１１】

【作用】第１の発明によれば、画像記憶手段から試料像
データが読出されて、該試料像データに基づく試料像が
表示器に表示される。この表示器に表示された試料像を
基に、試料の観察したい領域を設定し、設定した領域の
みに限って走査を行なうようにする。次いで、試料に刺
激を与える手段と第１の走査手段とを同期させること
で、試料に刺激を与えるのに同期して走査を開始させ、
刺激に対する試料の反応を観察する。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。図１には、第１の実施の形態に係る試料観
察装置の概略的な機能ブロックが示されている。本実施
の形態の試料観察装置は、共焦点顕微鏡１０、ピエゾス
テージ１１、コントローラ１２、画像処理装置１３、表
示器としてのＣＲＴ１４から構成されている。

【００１３】共焦点顕微鏡１０は、図１０に示す共焦点
検出法を実現する光学系を備えている。すなわち、試料
に対して光源からの光をスポット状に集光させるレン
ズ、試料と共役な位置に配置されたピンホール、このピ
ンホールを通過した光を光電変換して画像信号を出力す
る光検出器を有している。また共焦点顕微鏡１０は、第
１の走査手段としての機能を備えていて、コントローラ
１２からの観察開始指令を受けて試料を光軸と直交する
２次元面内で走査する機構を備えている。なお、２次元
走査範囲は、コントローラ１２からのＸ，Ｙ制御信号に
よって制御可能になっている。

【００１４】ピエゾステージ１１は、第２の走査手段と
しての機能を備え、コントローラ１２からのＺ制御信号
により試料に入射する光の光軸方向に一致するＺ方向に
移動する。

【００１５】コントローラ１２は、設定条件記憶手段及
び走査制御手段としての機能を備えていて、後述する設
定条件に基づき，Ｙ，Ｚ制御信号で共焦点顕微鏡１０及
びピエゾステージ１１を制御し、また画像処理装置１３
に対してピエゾステージ１１の位置情報や対応する画像
信号を送出する。

【００１６】画像処理装置１３は、画像記憶手段及び表
示制御手段としての機能を備え、コントローラ１２から
送られて来る画像信号および位置情報を、内蔵するメモ
リに記憶し、そのメモリに記憶しているデータを後述す
る各種の表示パターンに従ってＣＲＴ１４に表示するも
のである。またＣＲＴ１４上に表示された画像に、カー
ソルを重ねて表示し、観察者からの指示入力に応じて観
察領域を設定する機能を備えている。ＣＲＴ１４は、画
像処理装置１３のメモリから読み出されたデータを表示
するものである。以下、本実施の形態の動作について説
明する。図２には本実施の形態によって実行される試料
の観察手順が示されおり、同図に従って本実施の形態の
動作を説明する。

【００１７】まず、観察者は細胞内部のどの部分を観察
するか決めるために、細胞全体の断層像を取る。例え
ば、図３に示すように、細胞１５から光軸方向に９枚の
断層像を取る。

【００１８】そのため、試料をピエゾステージ１１上に
セットし、コントローラ１２に試料全体観察を行うため
の指示入力を与える。コントローラ１２は１枚目の断層
像Ｌ１が得られるようにピエゾステージ１１にＺ制御信
号を出力する。そしてＺ方向の位置が決定したところ
で、コントローラ１２から共焦点顕微鏡１０に２次元走
査の開始指令を出す。

【００１９】１枚目の断層像Ｌ１を走査することによっ
て得られた画像データは、画像処理装置１３のメモリに
取込まれる。この時、断層像には識別名が付けられると
共に、ピエゾステージ１１の位置情報が取込まれる。

【００２０】次に、コントローラ１２は次の断層像Ｌ２
を取るために、ピエゾステージ１１に対して上へ移動す
る指示をＺ制御信号によって与える。そして１枚目と同
様に動作して断層像Ｌ２がメモリに記憶される。以下、
９枚目の断層像Ｌ９が得られるまで上記同様の動作が繰
り返し行われる（Ｓ１）。なお、ピエゾステージ１１の
移動方向は上方向に限定されるものではなく、試料の位
置により下方向またはランダムに移動させることもでき
る。

【００２１】次に、画像処理装置１３のメモリに格納さ
れた各断層像Ｌ１〜Ｌ９を、図４に示すように、各断層
像ごとに９分割してＣＲＴ１４に表示する。各分割領域
の左上隅に表示されている番号が、各断層像Ｌ１〜Ｌ９
の識別番号を示している。

【００２２】ここで、観察者は９枚の断層像Ｌ１〜Ｌ９
の中から観察したい断層像を選択し、さらに選択した断
層像のどの領域を観察するのか以下のようにして設定す
る（Ｓ２）。例えば図５に示す５番目の断層像Ｌ５を例
にして領域設定手順を説明する。

【００２３】画像処理装置１３からＣＲＴ１４の表示画
面上に、水平方向及び垂直方向に各位置を指定する２つ
のカーソルが、断層像Ｌ５に重ねて表示される。観察者
は垂直方向のカーソルを動かして左端Ｋ１及び右端Ｋ２
を決める。次に、水平方向のカーソルを動かして上端Ｋ
３及び下端Ｋ４を決める。この様にして、断層像Ｌ５の
任意の領域に観察領域Ｒ１を設定する。さらに、必要が
あれば同図に点線で示すように断層像Ｌ５の他の領域に
観察領域Ｒ２を設定する。なお、任意の領域の設定方法
は上記手段に限られたものではなく、例えば大きさを自
由に変えられる四角の枠を使っても良い。また領域の形
も四角でなくても円，三角等自由に設定できる。断層像
Ｌ５に対して観察領域を設定すると、観察領域Ｒ１はエ
リア１、観察領域Ｒ２はエリア２といった具合にエリア
番号を付ける。

【００２４】なお、断層像に対して観察領域を設定する
場合、図３に示すように、９分割した状態で設定するこ
ともできるが、細かい部分を設定する場合には、１つの
分割領域のみをＣＲＴ１４の全画面に拡大した状態で設
定することもできる。以上の設定操作を選択した全断層
像について行う（Ｓ３）。図６には断層像Ｌ１，Ｌ５，
Ｌ８，Ｌ９に対し６つの観察領域を設定した例が示され
ている。

【００２５】次に、観察者は各観察領域の観察順位を決
定する（Ｓ４）。これは、図６に示すように設定された
各観察領域を、図７に示すようにエリア番号順にＣＲＴ
１４上の表示領域２１に表示して、観察者からの指示入
力を受け付けることによって行われる。観察者はカーソ
ル２０を観察順位の速い順に該当するエリア上に移動さ
せて指定スイッチを押して順番に指定していく。

【００２６】この様にして指定された各エリアの観察順
番は、表示領域２１の下に表示されるインフォメーショ
ン領域２２のシーケンスの部分に表示される。例えば、
エリアを３，１，６，５，２，４と指定すれば、シーケ
ンスの部分に同じ順番でエリア番号を表示させる。

【００２７】さらに、エリアを３，１，６，５，２，４
の順に観察するシーケンスを何回繰り返すかを設定す
る。例えば、そのシーケンスを８回繰り返すのであれ
ば、ループの部分に８を入力する。

【００２８】そしてあるループから次のループへ移行す
るまでの待ち時間を設定する。例えば、各ループ間の待
ち時間を５秒に設定すると、インターバルの部分に５を
表示させる。

【００２９】また、シーケンス設定では同じエリアを設
定することもできる。ループ間の待ち時間もランダムに
設定できる。さらに、シーケンスの各エリアの間にイン
ターバルを設定することもできる。以上のようにして、
観察領域の設定が終了すると、上記各設定条件がコント
ローラ１２へ送られて記憶される。

【００３０】次に、観察者からコントローラ１２に対し
て観察開始を指示する指示入力があると、コントローラ
１２が設定条件に従ってピエゾステージ１１及び共焦点
顕微鏡１０を動作させる（Ｓ５）。

【００３１】図７に示す設定条件であれば、まずエリア
３を走査するために、ピエゾステージ１１を断層像Ｌ５
を取った位置まで移動させ、エリア３の観察領域のみを
走査させるＸ，Ｙ制御信号を共焦点顕微鏡１０へ与えて
走査を行う。この走査に同期してエリア３の画像データ
が画像処理装置１３のメモリへ記憶される。

【００３２】エリア３の走査が終了すると、次にエリア
１を走査するために、ピエゾステージ１１が断層像Ｌ１
を取った位置まで移動させられて上記同様にしてエリア
１のみが走査される。

【００３３】以下、順番にエリア６，５，２，４を走査
して画像データを画像処理装置１３のメモリへ記憶して
いく。エリア４の画像データを記憶した後（Ｓ７）、コ
ントローラ１２は指定された時間だけ待ち（Ｓ８）、再
びエリア３から走査を開始する。この動作を８回行って
すべての取り込み動作を終了する。

【００３４】図８には、以上のようにして取り込んだ各
エリアの画像データを、ＣＲＴ１４に表示させる際の表
示例が示されている。この表示例は、シーケンス順に順
次縦方向に表示し、左端にはエリア番号表示され、右上
隅にシーケンス番号が示されている。また、図９には他
の表示例が示されている。この表示例は、各エリア毎に
画像データをまとめて表示たものである。この他にも、
画像間の割り算を施したデータを表示させたり、鳥瞰図
表示など各種の表示方法を用いることができる。

【００３５】なお、刺激に対する細胞の反応を観察する
場合は、細胞に刺激を与えるのに同期して観察を開始す
る。このために、コントローラ１２は、外部からの同期
信号によって動作を開始する機能及び走査の開始を外部
へ知らせる同期信号を出力する機能とを備えている。

【００３６】この様に本実施の形態によれば、観察した
い領域のみに限って走査を行うようにしたので、試料の
各断層面における複数の観察領域とその領域の深さの違
う位置での様子を、比較的短時間の内に画像として捕ら
えることができ、刺激に対する細胞の反応を観察するの
に好適である。

【００３７】また、観察したい領域の画像データのみを
取り込むので、例えば試料全体の画像データを複数回に
渡って取り込む場合に比べて、比較的小容量のメモリを
使用することができる。

【００３８】

【発明の効果】以上詳記したように本発明によれば、観
察したい領域のみを観察でき、刺激による細胞の状態等
を観察するのに好適な試料観察装置を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１の実施の形態に係る試料観察装置
の概略的な機能ブロック図。

【図２】第１の実施の形態に係る試料観察装置の動作説
明図。

【図３】細胞全体における各断層像のスライス位置を示
す斜視図。

【図４】各断層像のＣＲＴ表示例を示す図。

【図５】断層像に対するエリア設定操作を説明するため
の図。

【図６】エリア設定された各断層像のＣＲＴ表示例を示
す図。

【図７】観察領域及び設定条件のＣＲＴ表示例を示す
図。

【図８】各エリアを操作して得られた画像データのＣＲ
Ｔ表示例を示す図。

【図９】各エリアを操作して得られた画像データの他の
ＣＲＴ表示例を示す図。

【図１０】共焦点顕微鏡の光学系を示す図。

【符号の説明】

１ 光源 ２ 対物レンズ ３ 試料 ４ 集光レンズ ５ ピンホール ６ 光検出器 １０ 共焦点顕微鏡 １１ ピエゾステージ １２ コントローラ １３ 画像処理装置 １４ ＣＲＴ １５ 細胞

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料に対して光源からの光をスポット状
   に集光させるレンズと、 前記試料と共役な位置に配置されたピンホールと、 このピンホールを通過した光を光電変換して画像信号を
   出力する光検出器と、 前記レンズでスポット状に集光された光で前記試料上を
   ２次元走査する第１の走査手段と、 前記試料に刺激を与える手段と、 前記光検出器から出力される画像信号を記憶する画像記
   憶手段と、 この画像記憶手段に記憶された試料像データを表示する
   表示器とを備えた試料観察装置において、 前記画像記憶手段から前記試料像データを読出して、該
   試料像データに基づく試料像を前記表示器に表示させる
   表示制御手段と、 前記表示器に表示された試料像を基に、前記試料の観察
   したい領域を設定し、設定した領域のみに限って走査を
   行なうようにした領域設定手段と、 刺激に対する試料の反応を観察する場合、前記試料に刺
   激を与える手段と前記第１の走査手段とを同期させる同
   期手段とを具備し、 試料に刺激を与えるのに同期して走査を開始することを
   特徴とする試料観察装置。