JP3304959B2 - Ｄ−リンゴ酸の製造方法 - Google Patents
Ｄ−リンゴ酸の製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、微生物を利用した光学
活性なＤ−リンゴ酸の工業的な製造方法に関するもので
ある。光学活性なＤ−リンゴ酸は光学活性を有する種々
の天然物、または医薬品などの生理活性物質を合成する
際有用な中間体である。
活性なＤ−リンゴ酸の工業的な製造方法に関するもので
ある。光学活性なＤ−リンゴ酸は光学活性を有する種々
の天然物、または医薬品などの生理活性物質を合成する
際有用な中間体である。
【０００２】
【従来技術及び発明が解決しようとする問題点】工業的
に有用なＤ−リンゴ酸の製造法は、従来ラセミ体のリン
ゴ酸をジアステレオマー塩法により光学分割する方法
（特開昭５７−５６４３９号公報、特開昭６０−２０４
７４１号公報）が知られている。しかしながら、ジアス
テレオマー塩法による光学分割では、キニーネなどの使
用する分割剤が高価なため経済的な方法とはいえない。
に有用なＤ−リンゴ酸の製造法は、従来ラセミ体のリン
ゴ酸をジアステレオマー塩法により光学分割する方法
（特開昭５７−５６４３９号公報、特開昭６０−２０４
７４１号公報）が知られている。しかしながら、ジアス
テレオマー塩法による光学分割では、キニーネなどの使
用する分割剤が高価なため経済的な方法とはいえない。
【０００３】また、Ｄ−リンゴ酸の製造に微生物を用い
る方法として、ラセミ体リンゴ酸を含有する培地でＬ−
リンゴ酸のみを選択的に資化する菌を培養し、残留する
Ｄ−リンゴ酸を回収する方法（米国特許第４９１２０４
２号公報、特開平２−２４２６９９号公報）が知られて
いるが、得られるＤ−リンゴ酸の光学純度が低く、また
収率が５０％を超え得ないなど効率的な方法とはいえな
い。
る方法として、ラセミ体リンゴ酸を含有する培地でＬ−
リンゴ酸のみを選択的に資化する菌を培養し、残留する
Ｄ−リンゴ酸を回収する方法（米国特許第４９１２０４
２号公報、特開平２−２４２６９９号公報）が知られて
いるが、得られるＤ−リンゴ酸の光学純度が低く、また
収率が５０％を超え得ないなど効率的な方法とはいえな
い。
【０００４】マレイン酸に作用しＤ−リンゴ酸を生成す
る酵素反応については、これまで植物や動物の腎臓（Ｓ
ａｃｋｓ，Ｗ．Ｊｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｏ．（１９５１）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９２ ２３１−２３６，
Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｓ．Ｂｒｉｔｔｅｎ，Ｊ．Ｓ．（１９
６７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２ ２２５５−
２２５９）に存在することが知られている。微生物にお
いてはシュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属
する細菌の菌体抽出液によるマレイン酸からＤ−リンゴ
酸の生成が報告されている（Ｈ．Ｉ．Ｒａｈａｔｅｋａ
ｒ（１９６８）Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
３，１４３−１４４）。しかしながらこれらの研究は、
生物的な方法によりマレイン酸からＤ−リンゴ酸生産の
可能性を示したものであるが基礎的な検討であり、Ｄ−
リンゴ酸を工業的に大量生産する方法を示したものでは
なかった。
る酵素反応については、これまで植物や動物の腎臓（Ｓ
ａｃｋｓ，Ｗ．Ｊｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｏ．（１９５１）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９２ ２３１−２３６，
Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｓ．Ｂｒｉｔｔｅｎ，Ｊ．Ｓ．（１９
６７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２ ２２５５−
２２５９）に存在することが知られている。微生物にお
いてはシュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属
する細菌の菌体抽出液によるマレイン酸からＤ−リンゴ
酸の生成が報告されている（Ｈ．Ｉ．Ｒａｈａｔｅｋａ
ｒ（１９６８）Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
３，１４３−１４４）。しかしながらこれらの研究は、
生物的な方法によりマレイン酸からＤ−リンゴ酸生産の
可能性を示したものであるが基礎的な検討であり、Ｄ−
リンゴ酸を工業的に大量生産する方法を示したものでは
なかった。
【０００５】また、マレイン酸にある種の微生物を作用
させて、Ｄ−リンゴ酸を製造する方法（特開平３−５３
８８８号公報）もあるが、培養に高価なシトラコン酸を
用いる上に、Ｌ−リンゴ酸が副生し、反応後期にＤ−リ
ンゴ酸が減少するため、生成物の収率及び光学純度が低
いなどの問題点があり、また菌体の酵素活性が低いなど
工業的に安価な製造法とはいえない。
させて、Ｄ−リンゴ酸を製造する方法（特開平３−５３
８８８号公報）もあるが、培養に高価なシトラコン酸を
用いる上に、Ｌ−リンゴ酸が副生し、反応後期にＤ−リ
ンゴ酸が減少するため、生成物の収率及び光学純度が低
いなどの問題点があり、また菌体の酵素活性が低いなど
工業的に安価な製造法とはいえない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、微生物を
用いてマレイン酸からＤ−リンゴ酸を製造するにあた
り、マレイン酸含有培地で培養を行った微生物を使用す
ることにより、Ｄ−リンゴ酸を効率よく生産することを
見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発
明の要旨は、微生物またはそれらの処理物を用いてマレ
イン酸からＤ−リンゴ酸を製造するにあたり、マレイン
酸含有培地で培養を行った微生物を使用することを特徴
とするＤ−リンゴ酸の製造方法に存する。以下、本発明
につき詳細に説明する。
用いてマレイン酸からＤ−リンゴ酸を製造するにあた
り、マレイン酸含有培地で培養を行った微生物を使用す
ることにより、Ｄ−リンゴ酸を効率よく生産することを
見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発
明の要旨は、微生物またはそれらの処理物を用いてマレ
イン酸からＤ−リンゴ酸を製造するにあたり、マレイン
酸含有培地で培養を行った微生物を使用することを特徴
とするＤ−リンゴ酸の製造方法に存する。以下、本発明
につき詳細に説明する。
【０００７】Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＭＣＩ
２６１２（以下、「ＭＣＩ２６１２号菌」と略すことが
ある）及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏ
ｒｍｉｓＭＣＩ２６１３（以下、「ＭＣＩ２６１３号
菌」と略すことがある）は、本発明者等により、天然土
壌から分離された細菌であり、それぞれ工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研菌寄第１２５６２号（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１２５６２）および同１２５６１号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２５６１）として寄託されている。その菌学的
性状は次の通りである。 １．形態的性状 ○ハートインフュージョン寒天培地上、３０℃、１週間
のコロニーの特徴
２６１２（以下、「ＭＣＩ２６１２号菌」と略すことが
ある）及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏ
ｒｍｉｓＭＣＩ２６１３（以下、「ＭＣＩ２６１３号
菌」と略すことがある）は、本発明者等により、天然土
壌から分離された細菌であり、それぞれ工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研菌寄第１２５６２号（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１２５６２）および同１２５６１号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２５６１）として寄託されている。その菌学的
性状は次の通りである。 １．形態的性状 ○ハートインフュージョン寒天培地上、３０℃、１週間
のコロニーの特徴
【０００８】
【表１】
【０００９】○ハートインフュージョン寒天培地上、３
０℃、３〜４８時間培養中の形態的性質 １）細胞形態：両菌株とも培養後６〜１２時間ぐらいま
では、細胞は不均一に伸長し、長い桿状になる。その後
中央部に隔壁が形成され、細胞は湾曲状に曲がり、漸次
分節を繰り返す。１８時間以降はほとんど細胞が短桿状
の斉一な形態に変化する。
０℃、３〜４８時間培養中の形態的性質 １）細胞形態：両菌株とも培養後６〜１２時間ぐらいま
では、細胞は不均一に伸長し、長い桿状になる。その後
中央部に隔壁が形成され、細胞は湾曲状に曲がり、漸次
分節を繰り返す。１８時間以降はほとんど細胞が短桿状
の斉一な形態に変化する。
【表２】 ＭＣＩ２６１２号菌 ＭＣＩ２６１３号菌 ２）細胞分裂様式 ：Ｂｅｎｄｉｎｇ ｔｙｐｅ Ｂｅｎｄｉｎｇ ｔｙｐｅ ３）運動性 ： なし なし ４）胞子形成 ： なし なし ５）グラム染色 ： 不定 不定 ６）抗酸性 ： 陰性 陰性 ２．生理的性質
【００１０】
【表３】
【００１１】２５）唯一炭素源からの酸の生成（培養後
１〜２週間後観察）
１〜２週間後観察）
【００１２】
【表４】
【００１３】２６）有機酸の資化性
【００１４】
【表５】
【００１５】３．化学分類学的性状
【００１６】
【表６】
【００１７】４．分類学的考察 ○属レベルの同定 本菌株ＭＣＩ２６１２号菌および２６１３号菌は、１）
セル・サイクル（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ）に桿状〜短桿
状（Ｒｏｄｓ−ｃｏｃｃｕｓ）の多形性を有する、２）
絶対好気性菌である。、３）グルコース等ほとんどの糖
類から酸を生成しない、３）ＤＮＡ中のＧＣ含量は６
４．４％と高いＧＣを示す、４）細胞壁のジアミノーア
ミノ酸はリジンを有する、５）主要メナキノンはＭＫ−
９（Ｈ2）を有するなどの特徴を示す。
セル・サイクル（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ）に桿状〜短桿
状（Ｒｏｄｓ−ｃｏｃｃｕｓ）の多形性を有する、２）
絶対好気性菌である。、３）グルコース等ほとんどの糖
類から酸を生成しない、３）ＤＮＡ中のＧＣ含量は６
４．４％と高いＧＣを示す、４）細胞壁のジアミノーア
ミノ酸はリジンを有する、５）主要メナキノンはＭＫ−
９（Ｈ2）を有するなどの特徴を示す。
【００１８】これらの特徴から、本菌はＢｅｒｇｅｙ’
ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ 第２巻に記載されている、Ｉｒ
ｒｅｇｕｌａｒ，Ｎｏｎｓｐｏｒｉｎｇ，Ｇｒａｍ−Ｐ
ｏｓｉｔｉｖｅ Ｒｏｄｓ群のアースロバクター属菌に
帰属することが判明した。
ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ 第２巻に記載されている、Ｉｒ
ｒｅｇｕｌａｒ，Ｎｏｎｓｐｏｒｉｎｇ，Ｇｒａｍ−Ｐ
ｏｓｉｔｉｖｅ Ｒｏｄｓ群のアースロバクター属菌に
帰属することが判明した。
【００１９】○種レベルの同定 アースロバクター属菌には今日までに約１８種が含まれ
ている。これらの種類は各種の生理学的、化学分類学的
性状において識別されているが、特にメナキノン組成の
相違、細胞壁を構成している架橋ペプチド構造、及び糖
組成の相違が種レベルの重要な分類基準と見なされてい
る。（Ｋ．Ｈ．Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ ＆Ｏ．Ｋａｎｄｌ
ｅｒ，１９７２，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．Ｖｏ
ｌ．３６：４０７−４７７，Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎ
ｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ 第２巻）
ている。これらの種類は各種の生理学的、化学分類学的
性状において識別されているが、特にメナキノン組成の
相違、細胞壁を構成している架橋ペプチド構造、及び糖
組成の相違が種レベルの重要な分類基準と見なされてい
る。（Ｋ．Ｈ．Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ ＆Ｏ．Ｋａｎｄｌ
ｅｒ，１９７２，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．Ｖｏ
ｌ．３６：４０７−４７７，Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎ
ｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ 第２巻）
【００２０】ＭＣＩ２６１２号菌について 本菌株は１）主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ2）、２）
細胞壁の架橋ペプチド構造はＬｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−
Ａｌａを有する、３）細胞壁の糖組成はガラクトース、
及びラムノースを有するという化学分類学的特徴を持っ
ている。Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙ
ｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ に記載
されている種のうち、本菌株と同じ細胞壁の架橋ペプチ
ド構造をもつ種としてＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｏｘ
ｙｄａｎｓ １種のみが知られている。しかしながら、
細胞壁の糖組成において本菌株はガラクトースとラムノ
ースを含有することから、Ａ． ｏｘｙｄａｎｓ（ガラ
クトースとグルコース）とは異なっていた。
細胞壁の架橋ペプチド構造はＬｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−
Ａｌａを有する、３）細胞壁の糖組成はガラクトース、
及びラムノースを有するという化学分類学的特徴を持っ
ている。Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙ
ｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ に記載
されている種のうち、本菌株と同じ細胞壁の架橋ペプチ
ド構造をもつ種としてＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｏｘ
ｙｄａｎｓ １種のみが知られている。しかしながら、
細胞壁の糖組成において本菌株はガラクトースとラムノ
ースを含有することから、Ａ． ｏｘｙｄａｎｓ（ガラ
クトースとグルコース）とは異なっていた。
【００２１】従って細胞壁の架橋ペプチド構造および他
の化学分類的性状から、本菌株（ＭＣＩ２６１２号菌）
はＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓに近縁の
種と推定されたが、糖組成の相違からＡｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ｓｐ．と同定した。
の化学分類的性状から、本菌株（ＭＣＩ２６１２号菌）
はＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓに近縁の
種と推定されたが、糖組成の相違からＡｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ｓｐ．と同定した。
【００２２】ＭＣＩ２６１３号菌について 本菌株は１）主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ2）、２）
細胞壁の架橋ペプチド構造はＬｙｓ−Ａｌａ3を有す
る、３）細胞壁の糖組成はガラクトース、及びグルコー
スを有するという化学分類学的特徴を持ち、４）運動性
がないことからＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙに
記載されているＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉ
ｆｏｒｍｉｓ の特徴によく合致した。よって、本菌株
（ＭＣＩ２６１３号菌）をＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓと同定した。
細胞壁の架橋ペプチド構造はＬｙｓ−Ａｌａ3を有す
る、３）細胞壁の糖組成はガラクトース、及びグルコー
スを有するという化学分類学的特徴を持ち、４）運動性
がないことからＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙに
記載されているＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉ
ｆｏｒｍｉｓ の特徴によく合致した。よって、本菌株
（ＭＣＩ２６１３号菌）をＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓと同定した。
【００２３】本発明においては、前記の菌を通常に微生
物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養することに
より容易に増殖させることができる。栄養源としては、
グルコース、水飴、デキストリン、シュクロース、デン
プン、糖アルコール、糖蜜、動・植物油等を使用でき
る。また窒素源として、大豆粉、小麦はい芽、コーンス
ティープリカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エ
キス、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウ
ム、尿素等を使用できる。その他、必要に応じ、ナトリ
ウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバル
ト、塩素、リン酸、硫酸及びその他のイオンを生成する
ことができる無機塩類を添加することは有効である。
物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養することに
より容易に増殖させることができる。栄養源としては、
グルコース、水飴、デキストリン、シュクロース、デン
プン、糖アルコール、糖蜜、動・植物油等を使用でき
る。また窒素源として、大豆粉、小麦はい芽、コーンス
ティープリカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エ
キス、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウ
ム、尿素等を使用できる。その他、必要に応じ、ナトリ
ウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバル
ト、塩素、リン酸、硫酸及びその他のイオンを生成する
ことができる無機塩類を添加することは有効である。
【００２４】また、ビタミン等の通常の培養に用いられ
る栄養源を適宜混合した培地を用いることができる。培
養方法としては、栄養培地のｐＨを、４．０−９．５の
範囲で好気的に２０−４０℃の範囲で１０−９６時間培
養する。
る栄養源を適宜混合した培地を用いることができる。培
養方法としては、栄養培地のｐＨを、４．０−９．５の
範囲で好気的に２０−４０℃の範囲で１０−９６時間培
養する。
【００２５】マレイン酸に微生物を作用させてＤ−リン
ゴ酸へ変換する方法として、微生物を栄養培地で培養
し、得られた菌体懸濁液、あるいは菌体破砕液、あるい
はアクリル酸アミド系樹脂やカラギーナン等の水不溶性
ポリマー、合成吸着剤等を用いて酵素もしくは菌体を公
知の方法で固定化担体に吸着、結合、包括し適当な緩衝
液に懸濁したもの、あるいは固定化微生物または固定化
酵素をカラムに充填したもの等に基質を加え反応させＤ
−リンゴ酸を得る方法、あるいは、培養終了後基質を添
加しさらに反応させる方法等を用いることができる。従
って、本発明でいう「処理物」とはこれらを意味する。
反応時の温度は２０−５０℃が好ましく、ｐＨは５．０
−１０．０の範囲で行う。基質濃度は０．１％−１０％
の範囲が好ましい。また反応時にトルエン等の有機溶媒
の添加により反応速度を早めることができる。
ゴ酸へ変換する方法として、微生物を栄養培地で培養
し、得られた菌体懸濁液、あるいは菌体破砕液、あるい
はアクリル酸アミド系樹脂やカラギーナン等の水不溶性
ポリマー、合成吸着剤等を用いて酵素もしくは菌体を公
知の方法で固定化担体に吸着、結合、包括し適当な緩衝
液に懸濁したもの、あるいは固定化微生物または固定化
酵素をカラムに充填したもの等に基質を加え反応させＤ
−リンゴ酸を得る方法、あるいは、培養終了後基質を添
加しさらに反応させる方法等を用いることができる。従
って、本発明でいう「処理物」とはこれらを意味する。
反応時の温度は２０−５０℃が好ましく、ｐＨは５．０
−１０．０の範囲で行う。基質濃度は０．１％−１０％
の範囲が好ましい。また反応時にトルエン等の有機溶媒
の添加により反応速度を早めることができる。
【００２６】培養及び反応で得られた光学活性Ｄ−リン
ゴ酸の採取方法としては、通常の公知抽出精製方法が利
用しうるが、次のごとき方法も使用しうる。たとえば、
得られたＤ−リンゴ酸含有液のｐＨを硫酸等で１．０付
近まで下げ、さらに飽和に達するまで硫酸アンモニウム
を加える。しかる後、等量の酢酸エチルで数回抽出を行
う。これを減圧下で溶剤をのぞくとＤ−リンゴ酸含有物
が得られる。さらにこのものを少量のヘキサンに溶解
し、ヘキサン−酢酸エチル混合溶剤で溶出するシリカゲ
ルクロマトグラフィを行うことにより容易に他の不純物
と分離することができる。
ゴ酸の採取方法としては、通常の公知抽出精製方法が利
用しうるが、次のごとき方法も使用しうる。たとえば、
得られたＤ−リンゴ酸含有液のｐＨを硫酸等で１．０付
近まで下げ、さらに飽和に達するまで硫酸アンモニウム
を加える。しかる後、等量の酢酸エチルで数回抽出を行
う。これを減圧下で溶剤をのぞくとＤ−リンゴ酸含有物
が得られる。さらにこのものを少量のヘキサンに溶解
し、ヘキサン−酢酸エチル混合溶剤で溶出するシリカゲ
ルクロマトグラフィを行うことにより容易に他の不純物
と分離することができる。
【００２７】このようにして得られたものは、元素分
析、ＮＭＲ、液体クロマトグラフィにより高純度なリン
ゴ酸であることが確認された。光学純度の決定はＳ−α
−メソキシ−α−トリフルオロメチル−フェニルアセチ
ルクロリド（ＭＴＰＡ−Ｃｌ）とのエステルを合成し、
精製したジアステレオマーの比率をガスクロマトグラフ
ィで分析することにより行った。実施例におけるＤ−リ
ンゴ酸の定量は液体クロマトグラフィによった。
析、ＮＭＲ、液体クロマトグラフィにより高純度なリン
ゴ酸であることが確認された。光学純度の決定はＳ−α
−メソキシ−α−トリフルオロメチル−フェニルアセチ
ルクロリド（ＭＴＰＡ−Ｃｌ）とのエステルを合成し、
精製したジアステレオマーの比率をガスクロマトグラフ
ィで分析することにより行った。実施例におけるＤ−リ
ンゴ酸の定量は液体クロマトグラフィによった。
【００２８】
【実施例】以下に実施例をあげて本発明の方法をさらに
具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り
これらに限定されるものではない。 実施例１ ソルビトール １０ｇ、ＮＨ4ＮＯ3 ６ｇ、ＫＨ2ＰＯ4
３ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4１０．５ｇ、ＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ
２５０ｍｇ、イーストエキス ５．５ｇ、Ｌ−プロリン
２ｇ、マレイン酸 ２ｇ、水 １ｌ、ｐＨ ６．０の
組成からなる液体培地に、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ ＭＣＩ−２６１３を接種し２
８℃で２０時間培養した。
具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り
これらに限定されるものではない。 実施例１ ソルビトール １０ｇ、ＮＨ4ＮＯ3 ６ｇ、ＫＨ2ＰＯ4
３ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4１０．５ｇ、ＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ
２５０ｍｇ、イーストエキス ５．５ｇ、Ｌ−プロリン
２ｇ、マレイン酸 ２ｇ、水 １ｌ、ｐＨ ６．０の
組成からなる液体培地に、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ ＭＣＩ−２６１３を接種し２
８℃で２０時間培養した。
【００２９】得た培養液を遠心分離し、菌体を集め２５
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。これにマ
レイン酸２３．７ｇ、トルエン１０ｍｌを含む２５ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え全量を１ｌとし、２
７℃で反応させた経時変化が表１である。反応は速やか
に進行し、４５時間後光学純度１００％のＤ−リンゴ酸
が収率８８％で得られた。
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。これにマ
レイン酸２３．７ｇ、トルエン１０ｍｌを含む２５ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え全量を１ｌとし、２
７℃で反応させた経時変化が表１である。反応は速やか
に進行し、４５時間後光学純度１００％のＤ−リンゴ酸
が収率８８％で得られた。
【００３０】
【表７】
【００３１】実施例２ 実施例１に記載した微生物菌株、生育培地、培養法を用
いて得た菌体に、マレイン酸３％、トルエン１％を含む
２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え全量を１ｌ
とし、３７℃で反応を行い、途中マレイン酸を遂次添加
することによって反応を行った。３０時間の反応の後、
生成したリンゴ酸は８１ｇ／ｌでＤ−リンゴ酸の光学純
度は１００％であった。
いて得た菌体に、マレイン酸３％、トルエン１％を含む
２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え全量を１ｌ
とし、３７℃で反応を行い、途中マレイン酸を遂次添加
することによって反応を行った。３０時間の反応の後、
生成したリンゴ酸は８１ｇ／ｌでＤ−リンゴ酸の光学純
度は１００％であった。
【００３２】実施例３ 使用菌株としてＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ｍ
ＣＩ−２６１２を用い、実施例１に記載した培養、反応
方法を実施し、表２に示す結果がえられた。
ＣＩ−２６１２を用い、実施例１に記載した培養、反応
方法を実施し、表２に示す結果がえられた。
【００３３】
【表８】
【００３４】実施例４ 使用菌株としてＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ｍ
ＣＩ−２６１２を用い、実施例２と同様の方法で実施し
た結果、３０時間の反応で生成したリンゴ酸は８１ｇ／
ｌでＤ−リンゴ酸の光学純度は１００％であった。
ＣＩ−２６１２を用い、実施例２と同様の方法で実施し
た結果、３０時間の反応で生成したリンゴ酸は８１ｇ／
ｌでＤ−リンゴ酸の光学純度は１００％であった。
【００３５】
【発明の効果】本発明によれば、マレイン酸からＤ−リ
ンゴ酸を微生物反応で製造するにあたり、高い反応速度
で効率的に製造することが出来る。
ンゴ酸を微生物反応で製造するにあたり、高い反応速度
で効率的に製造することが出来る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:06） Ｃ１２Ｒ 1:06） (72)発明者 指田 玲子 神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地 三菱化学株式会社横浜総合研究所内 (56)参考文献 特開 平３−53888（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 7/46 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (1)
- 【請求項１】 アルスロバクター属に属する微生物また
はそれらの処理物を用いてマレイン酸からＤ−リンゴ酸
を製造するにあたり、マレイン酸含有培地で培養した後
に当該培地から単離した微生物の菌体又はその処理物を
反応に使用することを特徴とするＤ−リンゴ酸の製造方
法。
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