JP3299768B2 - カラム凝集分析法および装置 - Google Patents
カラム凝集分析法および装置Info
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Description
【０００１】
【発明の背景】本発明は、リガンドの結合を詳細には、
血液型血清学（「免疫血液学」）に関連するような免疫
学的結合（抗原抗体結合）を検出するための凝集分析に
関する。
血液型血清学（「免疫血液学」）に関連するような免疫
学的結合（抗原抗体結合）を検出するための凝集分析に
関する。
【０００２】血液型血清学は、その患者に関する輸血も
しくは臓器移植を行う前に、血液供与者と患者である受
容者との間の血液細胞適合性の決定を要求する。血液細
胞の適合性は、患者の血清中に含まれている抗体と、供
与者からの血液細胞上に存在している抗原との間で免疫
学的反応が生じないことによって決定される。
しくは臓器移植を行う前に、血液供与者と患者である受
容者との間の血液細胞適合性の決定を要求する。血液細
胞の適合性は、患者の血清中に含まれている抗体と、供
与者からの血液細胞上に存在している抗原との間で免疫
学的反応が生じないことによって決定される。
【０００３】数多くの異なる血液型の抗原が、全ての個
人の赤血球の表面上に見いだされている。これらの抗
原、即ち遺伝で受け継がれている遺伝子の生産物は、一
卵生双生児を除いて、全ての人の中にユニークな組み合
わせとして存在している。血液分類は、一般に、どの抗
原が存在しておりそしてどの抗原が存在していないかを
決定するための赤血球に関する試験方法であり、通常、
試験する抗原に対する抗体を用いる。
人の赤血球の表面上に見いだされている。これらの抗
原、即ち遺伝で受け継がれている遺伝子の生産物は、一
卵生双生児を除いて、全ての人の中にユニークな組み合
わせとして存在している。血液分類は、一般に、どの抗
原が存在しておりそしてどの抗原が存在していないかを
決定するための赤血球に関する試験方法であり、通常、
試験する抗原に対する抗体を用いる。
【０００４】さらに、人がその人の赤血球上に特別な赤
血球抗原を有していない場合、その人の血清はその抗原
に対する抗体を有している可能性がある。血清中に抗体
が存在しているか否かは、その人の免疫系が、その特定
の抗原またはそれに非常に類似したなにかによって以前
に攻撃を受け、それに反応したかに依存している。例え
ば、赤血球がＡ型の人、即ち赤血球上に「Ａ」抗原を有
する人は、その人の血清中に抗Ｂ抗体を有している。こ
のように、上記の人にＢ型血液を与えると、起こり得る
重大な臨床的結果と共に免疫反応が生じる。
血球抗原を有していない場合、その人の血清はその抗原
に対する抗体を有している可能性がある。血清中に抗体
が存在しているか否かは、その人の免疫系が、その特定
の抗原またはそれに非常に類似したなにかによって以前
に攻撃を受け、それに反応したかに依存している。例え
ば、赤血球がＡ型の人、即ち赤血球上に「Ａ」抗原を有
する人は、その人の血清中に抗Ｂ抗体を有している。こ
のように、上記の人にＢ型血液を与えると、起こり得る
重大な臨床的結果と共に免疫反応が生じる。
【０００５】追加的考察として、人の体は常に花粉、食
物、バクテリアおよびウイルス中の抗原にさらされてい
ることを特記しなければならないる。これらの「天然」
の抗原のいくつかは、明らかに、人の血液型抗原に非常
に類似しているため、それらは、ほとんど全ての感受性
の人を刺激して、抗体を生産させる。従って、対応する
抗原を欠く赤血球を有する全ての人の血清中に特定の抗
体が生じることが予想される。このことは特にＡＢＯ系
に関して事実である。従って、患者／供与者血清に対し
て第二確認試験がしばしば行われる。血清中のＡＢＯ血
液型系の期待される抗体に関する試験は、「逆」血液型
分類と呼ばれる。
物、バクテリアおよびウイルス中の抗原にさらされてい
ることを特記しなければならないる。これらの「天然」
の抗原のいくつかは、明らかに、人の血液型抗原に非常
に類似しているため、それらは、ほとんど全ての感受性
の人を刺激して、抗体を生産させる。従って、対応する
抗原を欠く赤血球を有する全ての人の血清中に特定の抗
体が生じることが予想される。このことは特にＡＢＯ系
に関して事実である。従って、患者／供与者血清に対し
て第二確認試験がしばしば行われる。血清中のＡＢＯ血
液型系の期待される抗体に関する試験は、「逆」血液型
分類と呼ばれる。
【０００６】このＡＢＯ血液分類システムの抗体は、一
般に免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）である。これらの抗体
は、１分子当たり１０個の抗原結合部位を有する。この
ＩｇＭ抗体は、赤血球間の距離を橋かけするのに充分に
大きく、従ってそれらを遠心分離したとき、これらの細
胞は格子「細胞−抗体−細胞−抗体」中で一緒に結合
し、そして凝集体中で一緒になった集塊のまま存在して
いる。例えば、抗Ａを血液型Ａまたは血液型ＡＢ細胞に
加えた後、この混合物を遠心分離すると、これらの細胞
は、再び懸濁させたとき集塊中に残存する。同じ抗体を
用いたとき、Ｏ型とＢ型の細胞は個々の細胞として再懸
濁される。ＩｇＭ抗体の如き１つの抗体によって生じる
凝集は直接凝集と呼ばれる。
般に免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）である。これらの抗体
は、１分子当たり１０個の抗原結合部位を有する。この
ＩｇＭ抗体は、赤血球間の距離を橋かけするのに充分に
大きく、従ってそれらを遠心分離したとき、これらの細
胞は格子「細胞−抗体−細胞−抗体」中で一緒に結合
し、そして凝集体中で一緒になった集塊のまま存在して
いる。例えば、抗Ａを血液型Ａまたは血液型ＡＢ細胞に
加えた後、この混合物を遠心分離すると、これらの細胞
は、再び懸濁させたとき集塊中に残存する。同じ抗体を
用いたとき、Ｏ型とＢ型の細胞は個々の細胞として再懸
濁される。ＩｇＭ抗体の如き１つの抗体によって生じる
凝集は直接凝集と呼ばれる。
【０００７】抗Ｒｈ血液型反応は、より弱い凝集を生じ
させる傾向にあり、これは高分子量ポリマー類を添加す
ることによって増強され得る。いくつかの抗Ｒｈ抗血清
は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体から成り、そして
２５％ウシのアルブミン（しばしば市販の抗Ｄ試薬調剤
中に見いだされる）の如き高蛋白濃度が存在しているこ
とによって促進された場合、直接凝集を生じる。
させる傾向にあり、これは高分子量ポリマー類を添加す
ることによって増強され得る。いくつかの抗Ｒｈ抗血清
は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体から成り、そして
２５％ウシのアルブミン（しばしば市販の抗Ｄ試薬調剤
中に見いだされる）の如き高蛋白濃度が存在しているこ
とによって促進された場合、直接凝集を生じる。
【０００８】上記促進は必要である、と言うのは、Ｉｇ
Ｇは、お互いに反発する傾向にある細胞間の距離を容易
には橋渡しすることができないからである。従って、こ
れは、これが有する特異性に合致する赤血球抗原と結合
するが、より大きなＩｇＭ抗体が凝集するようには効率
良く上記赤血球を凝集させない。従って、赤血球に結合
したＩｇＧ抗体の存在は、通常、必要な凝集を生じさせ
る抗ＩｇＧを添加することで、「赤血球−ＩｇＧ／抗Ｉ
ｇＧ／ＩｇＧ−赤血球」の格子を生じさせることにより
検出される。
Ｇは、お互いに反発する傾向にある細胞間の距離を容易
には橋渡しすることができないからである。従って、こ
れは、これが有する特異性に合致する赤血球抗原と結合
するが、より大きなＩｇＭ抗体が凝集するようには効率
良く上記赤血球を凝集させない。従って、赤血球に結合
したＩｇＧ抗体の存在は、通常、必要な凝集を生じさせ
る抗ＩｇＧを添加することで、「赤血球−ＩｇＧ／抗Ｉ
ｇＧ／ＩｇＧ−赤血球」の格子を生じさせることにより
検出される。
【０００９】血清は、赤血球と結合させるために加えた
抗ＩｇＧ抗体を中和するＩｇＧを天然に含有している。
従って、上記抗ＩｇＧを細胞に添加する前に、血清を除
去する必要がある。インビボで赤血球と結合するＩｇＧ
に関する試験は、直接抗グロブリン試験と呼ばれてい
る。インビトロで赤血球と結合するＩｇＧに関する試験
は、間接抗グロブリン試験と呼ばれている。上記抗グロ
ブリン試験はまたクームス・テストと呼ばれている。
抗ＩｇＧ抗体を中和するＩｇＧを天然に含有している。
従って、上記抗ＩｇＧを細胞に添加する前に、血清を除
去する必要がある。インビボで赤血球と結合するＩｇＧ
に関する試験は、直接抗グロブリン試験と呼ばれてい
る。インビトロで赤血球と結合するＩｇＧに関する試験
は、間接抗グロブリン試験と呼ばれている。上記抗グロ
ブリン試験はまたクームス・テストと呼ばれている。
【００１０】人の血液サンプルに対するＡ、ＢおよびＤ
（ＲＨ-）抗原に関する試験を行い（そして、選択され
た場合、他の抗原に対する試験を行い）、そしてその人
の血清を試験することによってその結果をクロスチェッ
クして、存在している可能性のある後天性抗体を測定す
ることが、血液銀行で実施されている標準的試験であ
る。前者は「前方型」と呼ばれ、一方後者は「逆型」と
呼ばれる。これらの型決めの実施の各々から得られる結
果は一致する必要がある。
（ＲＨ-）抗原に関する試験を行い（そして、選択され
た場合、他の抗原に対する試験を行い）、そしてその人
の血清を試験することによってその結果をクロスチェッ
クして、存在している可能性のある後天性抗体を測定す
ることが、血液銀行で実施されている標準的試験であ
る。前者は「前方型」と呼ばれ、一方後者は「逆型」と
呼ばれる。これらの型決めの実施の各々から得られる結
果は一致する必要がある。
【００１１】１９００年代初期から、血液型抗体（例え
ば抗Ａまたは抗Ｂ）が入っている標準実験室試験管に患
者の赤血球を入れ、混合して、抗体／抗原結合反応を生
じさせた後、遠心分離するところの、“Landsteiner”
法として知られている一般的な方法が存在していた。試
験する抗原が存在している場合、この抗体／抗原結合が
生じ、その結果、患者の赤血球の凝集が生じる。この試
験管を手で振って、その底に存在している遠心分離され
たボタン状の「集塊」細胞を動かす。その後、この動か
された細胞が「集塊」しているか否かそしてそれがどの
程度であるかについて、主観的決定を行う。
ば抗Ａまたは抗Ｂ）が入っている標準実験室試験管に患
者の赤血球を入れ、混合して、抗体／抗原結合反応を生
じさせた後、遠心分離するところの、“Landsteiner”
法として知られている一般的な方法が存在していた。試
験する抗原が存在している場合、この抗体／抗原結合が
生じ、その結果、患者の赤血球の凝集が生じる。この試
験管を手で振って、その底に存在している遠心分離され
たボタン状の「集塊」細胞を動かす。その後、この動か
された細胞が「集塊」しているか否かそしてそれがどの
程度であるかについて、主観的決定を行う。
【００１２】１９００年代中期の間、この試験の主観的
特徴を減少させそして誤りを減少させるため、この技術
を簡潔化する試みが成された。表面の少なくとも一部に
必要な免疫化学試薬を有する、湿潤可能な、非吸収性で
あるか或はある場合には吸収性を示す試験スライドもし
くは試験カードを用いることで、適合性の試験結果のい
くつかの永久的な記録が得られることが認められてい
た。米国特許２,７７０,５７２、２,８５０,４３０、
３,０７４,８５３、３,２７２,３１９、３,４２４,５５
８、３,５０２,４３７および３,６６６,４２１およびヨ
ーロッパ特許出願０１０４ ８８１-Ａ２には、上記試験
カードおよびそれに関係したアパルチ（apparti）に関
する選択された実施例が記述されている。
特徴を減少させそして誤りを減少させるため、この技術
を簡潔化する試みが成された。表面の少なくとも一部に
必要な免疫化学試薬を有する、湿潤可能な、非吸収性で
あるか或はある場合には吸収性を示す試験スライドもし
くは試験カードを用いることで、適合性の試験結果のい
くつかの永久的な記録が得られることが認められてい
た。米国特許２,７７０,５７２、２,８５０,４３０、
３,０７４,８５３、３,２７２,３１９、３,４２４,５５
８、３,５０２,４３７および３,６６６,４２１およびヨ
ーロッパ特許出願０１０４ ８８１-Ａ２には、上記試験
カードおよびそれに関係したアパルチ（apparti）に関
する選択された実施例が記述されている。
【００１３】より最近になって、特定の抗グロブリン試
験に関する鋭敏性および正確さを向上させるための技
術、例えばいわゆるクームス・テストが開発された。Gr
aham他の米国特許４,４３５,２９３には、初期のクーム
ス・テスト方法の洗浄段階を除く、試験管システムを用
いた血液型分類システム（SimwashR）が記述されてお
り、このようにSimwashRのシステムは、赤血球の「自己
洗浄」を提供している。前述したような抗グロブリン試
験は、赤血球がそれらの血清（これは、未結合のＩｇＧ
抗体を含有している）を含んでいないことを必要として
いる。このSimwashRのシステムを用いる場合、密度の高
いな細胞をカラム内に遠心分離させ、一方密どの低い血
清はその上部に残存させている。
験に関する鋭敏性および正確さを向上させるための技
術、例えばいわゆるクームス・テストが開発された。Gr
aham他の米国特許４,４３５,２９３には、初期のクーム
ス・テスト方法の洗浄段階を除く、試験管システムを用
いた血液型分類システム（SimwashR）が記述されてお
り、このようにSimwashRのシステムは、赤血球の「自己
洗浄」を提供している。前述したような抗グロブリン試
験は、赤血球がそれらの血清（これは、未結合のＩｇＧ
抗体を含有している）を含んでいないことを必要として
いる。このSimwashRのシステムを用いる場合、密度の高
いな細胞をカラム内に遠心分離させ、一方密どの低い血
清はその上部に残存させている。
【００１４】ヨーロッパ特許出願０ １９４ ２１２に
は、カラム中のゲルを用いた血液適合性試験システムが
記述されており、該ゲルは特に、エピクロルヒドリンを
用いて架橋させたデキストラン鎖の三次元網目構造もし
くはマトリックスであるSephadexR（Pharmacia Fine Ch
emicals、 Uppsala、 Sweden and Piscataway、 N.J.）で
あり、これは、凝集した赤血球を捕捉し、そして未凝集
の細胞をその底に通過させる。
は、カラム中のゲルを用いた血液適合性試験システムが
記述されており、該ゲルは特に、エピクロルヒドリンを
用いて架橋させたデキストラン鎖の三次元網目構造もし
くはマトリックスであるSephadexR（Pharmacia Fine Ch
emicals、 Uppsala、 Sweden and Piscataway、 N.J.）で
あり、これは、凝集した赤血球を捕捉し、そして未凝集
の細胞をその底に通過させる。
【００１５】この最後に述べたシステムを使用した場合
の欠点の１つ、そして特に媒体としてゲルを用いた上記
試験システムの製作における欠点は、このゲルの分離能
力を妨害する、汚染物である低分子量化合物もしくは断
片であるいわゆる「微細物」を取り除くため、試験管に
挿入する前にそのSephadexRの如きゲルを純化させる必
要があることである。歴史的に、ゲルの微細物がクロマ
トグラフィー用分離カラムを詰まらせることは知られて
いた。
の欠点の１つ、そして特に媒体としてゲルを用いた上記
試験システムの製作における欠点は、このゲルの分離能
力を妨害する、汚染物である低分子量化合物もしくは断
片であるいわゆる「微細物」を取り除くため、試験管に
挿入する前にそのSephadexRの如きゲルを純化させる必
要があることである。歴史的に、ゲルの微細物がクロマ
トグラフィー用分離カラムを詰まらせることは知られて
いた。
【００１６】ゲルはまた、この試験システムに関連して
用いられる試薬の量を正確に計算する目的で、使用前に
膨潤させる必要がある。試薬、緩衝剤などの必要量の計
算において、ゲルの膨潤希釈ファクターを考慮に入れる
必要がある。更に、いくらかの試薬がその多孔性ゲルに
よって吸収されるため損失が生じ、そして試験される分
析物との結合に利用されなくなる。この損失を補うため
多量の試薬を添加しなければならない。このゲルはま
た、本来、機械的取り扱いに対して壊れ易く、そしてこ
の膨潤過程で分裂して、ゲルの粒子サイズに制御不可能
な変化を生じさせ得る。
用いられる試薬の量を正確に計算する目的で、使用前に
膨潤させる必要がある。試薬、緩衝剤などの必要量の計
算において、ゲルの膨潤希釈ファクターを考慮に入れる
必要がある。更に、いくらかの試薬がその多孔性ゲルに
よって吸収されるため損失が生じ、そして試験される分
析物との結合に利用されなくなる。この損失を補うため
多量の試薬を添加しなければならない。このゲルはま
た、本来、機械的取り扱いに対して壊れ易く、そしてこ
の膨潤過程で分裂して、ゲルの粒子サイズに制御不可能
な変化を生じさせ得る。
【００１７】SephadexRの使用で遭遇するもう１つの欠
点は、それが温度の極端な変化に弱く、そして乾燥して
しまうか或は分裂して、収縮を含む安定性、輸送および
保存の問題、並びにそれに伴う試験特性の変化を生じさ
せる。この崩壊の結果、その材料を通過する血球の正常
な流れを変化させるか或は制限する、上述したような微
細物を生じさせる。SephadexR含有試験装置は凍結でき
ないことによっても、追加的な、輸送および保存問題を
生じさせる。
点は、それが温度の極端な変化に弱く、そして乾燥して
しまうか或は分裂して、収縮を含む安定性、輸送および
保存の問題、並びにそれに伴う試験特性の変化を生じさ
せる。この崩壊の結果、その材料を通過する血球の正常
な流れを変化させるか或は制限する、上述したような微
細物を生じさせる。SephadexR含有試験装置は凍結でき
ないことによっても、追加的な、輸送および保存問題を
生じさせる。
【００１８】
【発明の要約】本発明は、結合リガンド、特に血液型抗
原もしくは抗体の存在を検出するための方法および装置
［これらは、本質的に非圧縮性のミクロ粒子から成るマ
トリックス（このマトリックスは、非凝集反応体、特に
赤血球の動きを可能にする一方、好適には、凝集された
反応体、特に赤血球をいわゆる「帯層」中に拘束する優
れた性能を与える）を利用］を提供するものである。
原もしくは抗体の存在を検出するための方法および装置
［これらは、本質的に非圧縮性のミクロ粒子から成るマ
トリックス（このマトリックスは、非凝集反応体、特に
赤血球の動きを可能にする一方、好適には、凝集された
反応体、特に赤血球をいわゆる「帯層」中に拘束する優
れた性能を与える）を利用］を提供するものである。
【００１９】好適な具体例において、本発明の装置は、
本質的に非圧縮性のミクロ粒子から成るマトリックス
（このマトリックスは、凝集した反応体の存在もしくは
不在の検出を可能にするような量で容器内に配置されて
いる）がその中に配置されている、本質的に透明な細長
く伸びた容器である。該マトリックスを該装置に加える
に先立って、結合リガンド、例えば血液型抗原もしくは
抗体を検出するための試薬内に該ミクロ粒子を埋め込む
か或は含浸させてもよい。二者択一的に、上記試薬の液
状形態のものを、その中に含まれているミクロ粒子を通
して濾過させるように、該容器の開口部に加えてもよ
い。該試薬と結合しそして凝集反応を生じさせる、対象
となる分析物を含有している可能性のある液状サンプル
を、上述した試薬と同時か、或は該試薬を添加後、該容
器に加える。この容器を遠心分離した後、凝集体の有無
を検出する。
本質的に非圧縮性のミクロ粒子から成るマトリックス
（このマトリックスは、凝集した反応体の存在もしくは
不在の検出を可能にするような量で容器内に配置されて
いる）がその中に配置されている、本質的に透明な細長
く伸びた容器である。該マトリックスを該装置に加える
に先立って、結合リガンド、例えば血液型抗原もしくは
抗体を検出するための試薬内に該ミクロ粒子を埋め込む
か或は含浸させてもよい。二者択一的に、上記試薬の液
状形態のものを、その中に含まれているミクロ粒子を通
して濾過させるように、該容器の開口部に加えてもよ
い。該試薬と結合しそして凝集反応を生じさせる、対象
となる分析物を含有している可能性のある液状サンプル
を、上述した試薬と同時か、或は該試薬を添加後、該容
器に加える。この容器を遠心分離した後、凝集体の有無
を検出する。
【００２０】下記は、本発明の特定の鍵となる点に関す
るより詳細な説明である。本発明の好適な装置は、一般
的にここではしばしば入り口と呼んでいる少なくとも１
つの開口末端を有する、容器または細長く伸びた本質的
に透明な中空部材である。入り口は、本発明のマトリッ
クスとの実際的な接触を達成するために、サンプルおよ
び／または試薬、緩衝剤などを加えるための領域を意味
している。いくつかの具体例において、この細長く伸び
た部材は、該入り口に対して反対側にある本質的に密封
された末端を有している。本質的に密封された末端は、
該マトリックスが該部材内に保持されており、こぼれ出
すことなく、そしてそのマトリックス内に保持されてい
ることが望まれている反応体もまた保持されるような度
合で密封されていることを意味している。細長く伸びた
ものは、その幅に比較していくらか長く、そして縦軸に
沿って１直線になっている容器を意味している。従っ
て、本発明のマトリックスは、反応体が凝集していない
場合、その長さに沿ってそれらが移動し、そして凝集し
た場合、該マトリックスによって捕捉されるようなカラ
ム状に近いものの中に入れられている。この分離を可能
にしそしてそれらの検出を可能にするマトリックスを入
れて置く領域に関して充分な長さを有する容器形状は、
本発明の目的に適切であり、この容器の形状に関する残
りの点はかなり異なっていてもよいと理解されるべきで
ある。このマトリックスを入れておくための中空部材の
領域もしくは容器を、ここでは、一般に「凝集検出ゾー
ン」と呼んでいる。
るより詳細な説明である。本発明の好適な装置は、一般
的にここではしばしば入り口と呼んでいる少なくとも１
つの開口末端を有する、容器または細長く伸びた本質的
に透明な中空部材である。入り口は、本発明のマトリッ
クスとの実際的な接触を達成するために、サンプルおよ
び／または試薬、緩衝剤などを加えるための領域を意味
している。いくつかの具体例において、この細長く伸び
た部材は、該入り口に対して反対側にある本質的に密封
された末端を有している。本質的に密封された末端は、
該マトリックスが該部材内に保持されており、こぼれ出
すことなく、そしてそのマトリックス内に保持されてい
ることが望まれている反応体もまた保持されるような度
合で密封されていることを意味している。細長く伸びた
ものは、その幅に比較していくらか長く、そして縦軸に
沿って１直線になっている容器を意味している。従っ
て、本発明のマトリックスは、反応体が凝集していない
場合、その長さに沿ってそれらが移動し、そして凝集し
た場合、該マトリックスによって捕捉されるようなカラ
ム状に近いものの中に入れられている。この分離を可能
にしそしてそれらの検出を可能にするマトリックスを入
れて置く領域に関して充分な長さを有する容器形状は、
本発明の目的に適切であり、この容器の形状に関する残
りの点はかなり異なっていてもよいと理解されるべきで
ある。このマトリックスを入れておくための中空部材の
領域もしくは容器を、ここでは、一般に「凝集検出ゾー
ン」と呼んでいる。
【００２１】この容器の全体的形状は、一般に、この分
離過程を容易にするようなものであるべきである。例え
ば、好適な具体例において、この全体の容器は、基本的
には実験室の試験管の形状のものであり、これらには、
それらの全体もしくは部分が「円錐形」といわれている
試験管が含まれる。他の好適な具体例には、この容器の
一部（例えば、該マトリックスが含まれている部分）の
みが円錐形である構造が含まれる。この場合、利用者が
添加するサンプルもしくは試薬を入れるのに適切な形
状、そして構造が円形、立方形などであってもよい、サ
ンプルを受け取り部分に、該円錐形領域が連結していて
もよい。例示の目的でのみ、図１〜４には、本発明の方
法を実施するための装置の一部に関する種々の形状およ
び配置が示されている。
離過程を容易にするようなものであるべきである。例え
ば、好適な具体例において、この全体の容器は、基本的
には実験室の試験管の形状のものであり、これらには、
それらの全体もしくは部分が「円錐形」といわれている
試験管が含まれる。他の好適な具体例には、この容器の
一部（例えば、該マトリックスが含まれている部分）の
みが円錐形である構造が含まれる。この場合、利用者が
添加するサンプルもしくは試薬を入れるのに適切な形
状、そして構造が円形、立方形などであってもよい、サ
ンプルを受け取り部分に、該円錐形領域が連結していて
もよい。例示の目的でのみ、図１〜４には、本発明の方
法を実施するための装置の一部に関する種々の形状およ
び配置が示されている。
【００２２】各々がその適切な形で範囲が限定されてい
るところの、２つの領域を有する入れ物は、血球と血清
の混合物を該マトリックスを通して移動させる前に、保
温するための「上部」チャンバの追加的利点を与えてい
る。このことは、この上部チャンバ（サンプル受け取り
部分）と、凝集検出ゾーン（或はそのちょうど上にある
部分）と、の間の連結部が、サンプルおよび試薬を加え
るための開口部よりも小さい開口によって限定されてい
るとき、特に本当である（後者は入り口部分である）。
これは、そのより大きい入り口開口部が血球および血清
の添加を容易にする一方、利用者が遠心分離の如き力を
与えてそれらを動かす前にそれらが該マトリックスを通
過するのを、そのより小さい開口部が妨げているからで
ある。従って、利用者は、凝集分析のタイミングに関す
る制御を行うことが可能となる。図２および３はこの概
念を説明している。図２は、サンプルを受け取るためそ
こに配置されている上部チャンバが備わっている入れ物
を表しており、上記上部チャンバは利用者が適当な方法
で動きを与えるまで、該上部チャンバに付けられたサン
プルの動きを止めておく開口部を有している。図２はま
た、緩衝剤の入っている「初期反応領域」、そしてこの
分析に関する結合および凝集段階のための試薬を表して
いる。凝集した反応体の帯が該マトリックス内で生じ
る。図３は、該初期反応ゾーンが欠損している代替具体
例である。この具体例中、この結合反応は、その装置に
反応体が添加される前に行われ、そして該マトリックス
は、その凝集物のためのフィルターとして働いてもよ
い。二者択一的に、この反応体を該上部チャンバに直接
加えた後、遠心分離および下にある該マトリックスへの
通過に先立って、ある期間反応させてもよい。次に、遠
心分離して開口部を通過させた後、これらの凝集物は該
マトリックスの上部もしくはその中に捕捉させる。図４
は、この装置の凝集検出ゾーンに関する更にもう１つの
配置を示しており、そしてまた、該マトリックスの上部
よりはむしろ該マトリックス内に存在している帯の形成
を表している。
るところの、２つの領域を有する入れ物は、血球と血清
の混合物を該マトリックスを通して移動させる前に、保
温するための「上部」チャンバの追加的利点を与えてい
る。このことは、この上部チャンバ（サンプル受け取り
部分）と、凝集検出ゾーン（或はそのちょうど上にある
部分）と、の間の連結部が、サンプルおよび試薬を加え
るための開口部よりも小さい開口によって限定されてい
るとき、特に本当である（後者は入り口部分である）。
これは、そのより大きい入り口開口部が血球および血清
の添加を容易にする一方、利用者が遠心分離の如き力を
与えてそれらを動かす前にそれらが該マトリックスを通
過するのを、そのより小さい開口部が妨げているからで
ある。従って、利用者は、凝集分析のタイミングに関す
る制御を行うことが可能となる。図２および３はこの概
念を説明している。図２は、サンプルを受け取るためそ
こに配置されている上部チャンバが備わっている入れ物
を表しており、上記上部チャンバは利用者が適当な方法
で動きを与えるまで、該上部チャンバに付けられたサン
プルの動きを止めておく開口部を有している。図２はま
た、緩衝剤の入っている「初期反応領域」、そしてこの
分析に関する結合および凝集段階のための試薬を表して
いる。凝集した反応体の帯が該マトリックス内で生じ
る。図３は、該初期反応ゾーンが欠損している代替具体
例である。この具体例中、この結合反応は、その装置に
反応体が添加される前に行われ、そして該マトリックス
は、その凝集物のためのフィルターとして働いてもよ
い。二者択一的に、この反応体を該上部チャンバに直接
加えた後、遠心分離および下にある該マトリックスへの
通過に先立って、ある期間反応させてもよい。次に、遠
心分離して開口部を通過させた後、これらの凝集物は該
マトリックスの上部もしくはその中に捕捉させる。図４
は、この装置の凝集検出ゾーンに関する更にもう１つの
配置を示しており、そしてまた、該マトリックスの上部
よりはむしろ該マトリックス内に存在している帯の形成
を表している。
【００２３】「本質的に透明なもの」は、裸眼、或はそ
の目的のための検出装置の使用によって、凝集物の有無
を容易に確かめることのできるくらい半透明もしくは透
明な、いかなる材料も意味している。この装置は、その
全体もしくは選択された領域のみ、例えば陽性を示すサ
ンプル中の凝集帯形成の領域において、本質的に透明で
あり得る。凝集反応ゾーンの特定領域内の束になった凝
集物および／または帯またはボタン状物の形成を光学的
もしくは他の方法で検出するように設計された装置を用
いて、陽性もしくは陰性の凝集反応の観察を行うことも
本発明に包含される。この観察方法は、この装置を用い
て手動で行うか、或はいわゆる「利用者が離れ得る」自
動化された観察方法であってもよい。
の目的のための検出装置の使用によって、凝集物の有無
を容易に確かめることのできるくらい半透明もしくは透
明な、いかなる材料も意味している。この装置は、その
全体もしくは選択された領域のみ、例えば陽性を示すサ
ンプル中の凝集帯形成の領域において、本質的に透明で
あり得る。凝集反応ゾーンの特定領域内の束になった凝
集物および／または帯またはボタン状物の形成を光学的
もしくは他の方法で検出するように設計された装置を用
いて、陽性もしくは陰性の凝集反応の観察を行うことも
本発明に包含される。この観察方法は、この装置を用い
て手動で行うか、或はいわゆる「利用者が離れ得る」自
動化された観察方法であってもよい。
【００２４】免疫分析および血液銀行に関する本分野で
一般的に知られている実験用試験管およびカラムの如き
容器が、それらが、配置そして望まれるならば装置を用
いた観察に、適合している限り、本発明の方法を実施す
る目的で使用されてもよい。適切な容器は、ガラス、ポ
リスチレン、ポリエチレン類、ポリプロピレン、ポリカ
ーボネート類などの如き材料から成っていてもよい。好
適なものは、一般に、いくつかの管が入っている予め成
型された四角形のカートリッジであるところの、試験管
カートリッジである。図１は、このようなカートリッジ
の１つの具体例を表している。特に好適なものは、分析
を行うためにこの装置を使用するとき、特に試験管がカ
ートリッジの形のものであり、そして自動化されたピペ
ット装置を用いて試薬、緩衝剤、マトリックスなどを、
該装置もしくは後者を製造するとき充填するに適合して
いる場合、特に、前述したものの如き２つの部分から成
るチャンバの実験室用試験管である。
一般的に知られている実験用試験管およびカラムの如き
容器が、それらが、配置そして望まれるならば装置を用
いた観察に、適合している限り、本発明の方法を実施す
る目的で使用されてもよい。適切な容器は、ガラス、ポ
リスチレン、ポリエチレン類、ポリプロピレン、ポリカ
ーボネート類などの如き材料から成っていてもよい。好
適なものは、一般に、いくつかの管が入っている予め成
型された四角形のカートリッジであるところの、試験管
カートリッジである。図１は、このようなカートリッジ
の１つの具体例を表している。特に好適なものは、分析
を行うためにこの装置を使用するとき、特に試験管がカ
ートリッジの形のものであり、そして自動化されたピペ
ット装置を用いて試薬、緩衝剤、マトリックスなどを、
該装置もしくは後者を製造するとき充填するに適合して
いる場合、特に、前述したものの如き２つの部分から成
るチャンバの実験室用試験管である。
【００２５】本発明のマトリックスは、本質的に非圧縮
性のミクロ粒子から成る。「本質的に非圧縮性」は、該
マトリックスに与えられる力、例えば遠心分離力、磁気
力、電気力、静水圧、負もしくは正圧による力など、或
は正常な重力下での長期間の保存、によって生じ得る、
形もしくは大きさの変化に対する抵抗力を意味してい
る。未凝集の反応体の動きが不規則さによって妨害され
ない限り、これらの粒子はいかなる形状のものであって
もよい。これらの粒子の大きさは、この凝集分析に関係
している特別な結合リガンドに従ってかなり変化し得
る。本分野の技術者は、凝縮した反応体が該マトリック
スの上部内もしくはその上に保持される一方、凝縮して
いない反応体が該マトリックスを通ってその底もしくは
その装置の外側に一緒に出て行くべきであることが分か
るであろう。しかしながら、赤血球の凝縮の場合、好適
なマトリックスのミクロ粒子サイズは、一般に約５０ミ
クロン〜約３００ミクロン、より好適には約５０ミクロ
ン〜約２００ミクロン、最も好適には約５０ミクロン〜
約１５０ミクロンの範囲である。
性のミクロ粒子から成る。「本質的に非圧縮性」は、該
マトリックスに与えられる力、例えば遠心分離力、磁気
力、電気力、静水圧、負もしくは正圧による力など、或
は正常な重力下での長期間の保存、によって生じ得る、
形もしくは大きさの変化に対する抵抗力を意味してい
る。未凝集の反応体の動きが不規則さによって妨害され
ない限り、これらの粒子はいかなる形状のものであって
もよい。これらの粒子の大きさは、この凝集分析に関係
している特別な結合リガンドに従ってかなり変化し得
る。本分野の技術者は、凝縮した反応体が該マトリック
スの上部内もしくはその上に保持される一方、凝縮して
いない反応体が該マトリックスを通ってその底もしくは
その装置の外側に一緒に出て行くべきであることが分か
るであろう。しかしながら、赤血球の凝縮の場合、好適
なマトリックスのミクロ粒子サイズは、一般に約５０ミ
クロン〜約３００ミクロン、より好適には約５０ミクロ
ン〜約２００ミクロン、最も好適には約５０ミクロン〜
約１５０ミクロンの範囲である。
【００２６】ここでの使用に適切な非圧縮性材料は、ガ
ラスおよび砂を含む種々の二酸化ケイ素化合物、望まれ
るならば凝集の可視的観察が可能な程充分に明るい色を
有する限り金属化合物、種々のプラスチック化合物など
から成る。上記材料の例は、Polysciences, Inc.から得
られるが如き市販のポリスチレン製ビード、Fisherまた
はMallinkrodtから入手可能な海砂、Whatmanから入手可
能な如きセルロース粒子、およびJaygo Incorporated
（Dragonite）およびHuels Petrach Systemsから入手可
能な如きガラス製ビードである。これらのより特別な例
は、本明細書の実験実施例項中に列挙する。
ラスおよび砂を含む種々の二酸化ケイ素化合物、望まれ
るならば凝集の可視的観察が可能な程充分に明るい色を
有する限り金属化合物、種々のプラスチック化合物など
から成る。上記材料の例は、Polysciences, Inc.から得
られるが如き市販のポリスチレン製ビード、Fisherまた
はMallinkrodtから入手可能な海砂、Whatmanから入手可
能な如きセルロース粒子、およびJaygo Incorporated
（Dragonite）およびHuels Petrach Systemsから入手可
能な如きガラス製ビードである。これらのより特別な例
は、本明細書の実験実施例項中に列挙する。
【００２７】上述した如きマトリックスは、本発明の装
置の凝集検出ゾーン内に備えられている。この装置の形
がカラム状である場合、このマトリックスはしばしば、
その長さに沿って閉じてある末端に近づくように備えら
れている。しかしながら、ある具体例においては、この
マトリックスはこの装置の「中間」部分を通してのみ備
えられており、そしてまた、ある具体例中では、グラス
ファイバーもしくは他の種類の繊維の如きプラグとして
働く２番目の材料の上部に乗せられている。この装置は
また、１カ所以上の部位で、使用器具と接触していても
よい。例えば、該入り口は、そこを通してサンプルを受
け取るピペット装置の如き使用器具と連結していてもよ
い。この装置は、該反応体の移動を生じさせるところ
の、例えばそれらを該マトリックスを通して押出すか或
は吸い込むように設計された使用器具と接触していても
よい。いくつかの具体例において、試薬液を吸い込み、
凝集物を該マトリックス内もしくはその上部に保持させ
ながら非凝集物をその装置を通して通過させるため、真
空が使用できる。他の具体例において、液体の流れの如
き力を与えて該マトリックスを通して反応体を移動させ
るための使用器具が、該装置の一部と接触していてもよ
い。
置の凝集検出ゾーン内に備えられている。この装置の形
がカラム状である場合、このマトリックスはしばしば、
その長さに沿って閉じてある末端に近づくように備えら
れている。しかしながら、ある具体例においては、この
マトリックスはこの装置の「中間」部分を通してのみ備
えられており、そしてまた、ある具体例中では、グラス
ファイバーもしくは他の種類の繊維の如きプラグとして
働く２番目の材料の上部に乗せられている。この装置は
また、１カ所以上の部位で、使用器具と接触していても
よい。例えば、該入り口は、そこを通してサンプルを受
け取るピペット装置の如き使用器具と連結していてもよ
い。この装置は、該反応体の移動を生じさせるところ
の、例えばそれらを該マトリックスを通して押出すか或
は吸い込むように設計された使用器具と接触していても
よい。いくつかの具体例において、試薬液を吸い込み、
凝集物を該マトリックス内もしくはその上部に保持させ
ながら非凝集物をその装置を通して通過させるため、真
空が使用できる。他の具体例において、液体の流れの如
き力を与えて該マトリックスを通して反応体を移動させ
るための使用器具が、該装置の一部と接触していてもよ
い。
【００２８】このゾーンに該マトリックスのミクロ粒子
を添加するに先立って、それらをいずれかの適切な方法
で最初に洗浄することで、望ましくない汚染物を除去
し、そして非特異的結合を回避してもよい。単独もしく
は組み合わせのいかんに拘らず、抗血清、緩衝剤、或は
他の所望の試薬、或は希釈剤中の粒子から成るスラリー
状の粒子を該装置に加えてもよい。これらの粒子はま
た、乾燥した形態でこのゾーンに加えられてもよく、そ
して望まれるならば、抗血清、適当な緩衝剤などを次に
添加する。好適な具体例において、該入れ物の凝集物検
出ゾーン内にある適当な反応溶液もしくは緩衝剤中に該
ミクロ粒子を完全に含浸させた後、該溶液の層のみをこ
のマトリックスの上部から広がらせる。この広がった領
域は「初期反応ゾーン」と呼ばれ、そして該２つの部分
から成るチャンバ装置以外のカラム状装置中、反応体が
最初に互いに接触し、混合した後、反応し始める領域で
ある。説明のため、本発明のカラム凝集方法を、特定の
血液型および適合性操作に関連して記述する。本発明の
マトリックスが加えられているカラム状装置を用い、こ
こに記述したようなカラム凝集装置を利用して、前方血
液型分析を行うことができる。抗血清を含有している単
クローン抗体または多クローン抗体を、生理学的に適合
し得る緩衝剤中に分散させた後、それらを含浸させるた
めのミクロ粒子から成るマトリックスに加え、そしてそ
のマトリックスから入り口に向かって広がり、初期反応
ゾーンを生じる。一般的にこれらの抗体の抗原親和性お
よび特異性に応じて、本分野の技術者は常規通り、上記
抗原の適切な量を最適に決定し得る。抗体の活性を増強
する助けを与えそして非特異的結合を防止するための本
分野で公知の適切な添加剤、例えば高分子量ポリマー類
などを含有していてもよい緩衝剤中に該抗体を分散させ
る。これらの例には、ポリビニル類、デキストラン、ゼ
ラチン、およびポリエチレングリコールが含まれる。こ
の溶液の密度を上昇させるため、低分子量のポリマーも
また添加され得る。
を添加するに先立って、それらをいずれかの適切な方法
で最初に洗浄することで、望ましくない汚染物を除去
し、そして非特異的結合を回避してもよい。単独もしく
は組み合わせのいかんに拘らず、抗血清、緩衝剤、或は
他の所望の試薬、或は希釈剤中の粒子から成るスラリー
状の粒子を該装置に加えてもよい。これらの粒子はま
た、乾燥した形態でこのゾーンに加えられてもよく、そ
して望まれるならば、抗血清、適当な緩衝剤などを次に
添加する。好適な具体例において、該入れ物の凝集物検
出ゾーン内にある適当な反応溶液もしくは緩衝剤中に該
ミクロ粒子を完全に含浸させた後、該溶液の層のみをこ
のマトリックスの上部から広がらせる。この広がった領
域は「初期反応ゾーン」と呼ばれ、そして該２つの部分
から成るチャンバ装置以外のカラム状装置中、反応体が
最初に互いに接触し、混合した後、反応し始める領域で
ある。説明のため、本発明のカラム凝集方法を、特定の
血液型および適合性操作に関連して記述する。本発明の
マトリックスが加えられているカラム状装置を用い、こ
こに記述したようなカラム凝集装置を利用して、前方血
液型分析を行うことができる。抗血清を含有している単
クローン抗体または多クローン抗体を、生理学的に適合
し得る緩衝剤中に分散させた後、それらを含浸させるた
めのミクロ粒子から成るマトリックスに加え、そしてそ
のマトリックスから入り口に向かって広がり、初期反応
ゾーンを生じる。一般的にこれらの抗体の抗原親和性お
よび特異性に応じて、本分野の技術者は常規通り、上記
抗原の適切な量を最適に決定し得る。抗体の活性を増強
する助けを与えそして非特異的結合を防止するための本
分野で公知の適切な添加剤、例えば高分子量ポリマー類
などを含有していてもよい緩衝剤中に該抗体を分散させ
る。これらの例には、ポリビニル類、デキストラン、ゼ
ラチン、およびポリエチレングリコールが含まれる。こ
の溶液の密度を上昇させるため、低分子量のポリマーも
また添加され得る。
【００２９】この初期反応ゾーンに、患者の赤色血液細
胞の食塩水懸濁液を加える。本分野の技術者は、細胞の
適切な懸濁液が約２〜６％、好適には約２〜３％である
ことを容易に確かめることができるであろう。この懸濁
液が希釈され過ぎている場合、いかなる得られる凝集反
応も読み取ることが困難になる。この懸濁液があまりに
も濃い場合、この系は過負荷となり、そして凝集が区別
できなくなる。この結合反応を生じさせた後、これらの
反応体を該マトリックスに向かわせた後、それを通して
移動させる。この動きは、一般に、上述した如き力を与
えることによって行われる。特定の好適な具体例におい
て、遠心分離力、負の圧力、もしくは静水圧力が与えら
れる。
胞の食塩水懸濁液を加える。本分野の技術者は、細胞の
適切な懸濁液が約２〜６％、好適には約２〜３％である
ことを容易に確かめることができるであろう。この懸濁
液が希釈され過ぎている場合、いかなる得られる凝集反
応も読み取ることが困難になる。この懸濁液があまりに
も濃い場合、この系は過負荷となり、そして凝集が区別
できなくなる。この結合反応を生じさせた後、これらの
反応体を該マトリックスに向かわせた後、それを通して
移動させる。この動きは、一般に、上述した如き力を与
えることによって行われる。特定の好適な具体例におい
て、遠心分離力、負の圧力、もしくは静水圧力が与えら
れる。
【００３０】該マトリックス上或はそれを通して反応混
合物を動かす目的でその上に力を与えるために用いられ
る技術が遠心力である場合、本分野の技術者は、遠心分
離の時間および速度が最適な結果を大きく変化させるこ
とを理解するであろう。好適な具体例において、もしあ
れば、このマトリックスカラムの上部近くで凝集物の集
塊もしくは帯を生じさせるに適切な速度および時間で遠
心分離を行うべきであり、それによって、明確に観察で
きる陽性の読み取りを可能にさせる一方、凝集していな
い陰性の細胞がこの装置の底に向かって移動してボタン
状物を形成する。もし長すぎる時間、もしくは高すぎる
速度でこの装置を回転させた場合、これらの凝集物はそ
の管の底に押し出される。このマトリックス部分のいく
らか中心部を通って反応体が移動し、そしてこの装置の
側面上に存在させないようにするため、頭が揺れている
遠心分離器を用いるのも好適である。
合物を動かす目的でその上に力を与えるために用いられ
る技術が遠心力である場合、本分野の技術者は、遠心分
離の時間および速度が最適な結果を大きく変化させるこ
とを理解するであろう。好適な具体例において、もしあ
れば、このマトリックスカラムの上部近くで凝集物の集
塊もしくは帯を生じさせるに適切な速度および時間で遠
心分離を行うべきであり、それによって、明確に観察で
きる陽性の読み取りを可能にさせる一方、凝集していな
い陰性の細胞がこの装置の底に向かって移動してボタン
状物を形成する。もし長すぎる時間、もしくは高すぎる
速度でこの装置を回転させた場合、これらの凝集物はそ
の管の底に押し出される。このマトリックス部分のいく
らか中心部を通って反応体が移動し、そしてこの装置の
側面上に存在させないようにするため、頭が揺れている
遠心分離器を用いるのも好適である。
【００３１】この説明中、もしＢ型血球に対する抗体を
加えた場合、この患者のサンプル中に含まれているＢ型
血球はこの抗体と結合して、該マトリックスの上部近く
で捕捉された凝集細胞から成る１つの線を形成する。Ａ
型血球は凝集せず、この装置の底に遠心分離される。し
ばしば、患者の細胞は弱い反応性を示す異形物を含んで
いる可能性がある。中間的反応は、このカラムマトリッ
クスを通して分散されたより細かい凝集物によって示さ
れ、一方、陰性の場合、このマトリックスカラムの底に
ボタン状物が形成される。図１は、本発明の方法および
装置を用いたとき観察され得る反応終点の例を示してい
る。左端の管は、凝集の明確な帯（液相とマトリックス
相との境界付近に黒く塗りつぶされている）を有する強
陽性反応を示している。左端から２番目の管は、前のも
のよりもいくらか弱い陽性反応を示している、と言うの
は、凝集した帯がより細かい凝集物に分裂しているから
である。左端から３番目の管は、このマトリックスの中
間部分全体に渡って分散しているより細かい凝集物を有
するところの、より中間的な陽性反応を示しており、左
端から４番目の管中と同様、ある程度底に沈澱してい
る。左端から５番目の管は非常に弱い陽性反応を表して
おり、ここでは大部分の細胞がその底に集積している。
左端から６番目すなわち右端の管は明らかな陰性を示し
ており、細胞のボタン状物がこの管の底に存在してお
り、そしてこのマトリックス内にはいかなる凝集物も分
散していない。
加えた場合、この患者のサンプル中に含まれているＢ型
血球はこの抗体と結合して、該マトリックスの上部近く
で捕捉された凝集細胞から成る１つの線を形成する。Ａ
型血球は凝集せず、この装置の底に遠心分離される。し
ばしば、患者の細胞は弱い反応性を示す異形物を含んで
いる可能性がある。中間的反応は、このカラムマトリッ
クスを通して分散されたより細かい凝集物によって示さ
れ、一方、陰性の場合、このマトリックスカラムの底に
ボタン状物が形成される。図１は、本発明の方法および
装置を用いたとき観察され得る反応終点の例を示してい
る。左端の管は、凝集の明確な帯（液相とマトリックス
相との境界付近に黒く塗りつぶされている）を有する強
陽性反応を示している。左端から２番目の管は、前のも
のよりもいくらか弱い陽性反応を示している、と言うの
は、凝集した帯がより細かい凝集物に分裂しているから
である。左端から３番目の管は、このマトリックスの中
間部分全体に渡って分散しているより細かい凝集物を有
するところの、より中間的な陽性反応を示しており、左
端から４番目の管中と同様、ある程度底に沈澱してい
る。左端から５番目の管は非常に弱い陽性反応を表して
おり、ここでは大部分の細胞がその底に集積している。
左端から６番目すなわち右端の管は明らかな陰性を示し
ており、細胞のボタン状物がこの管の底に存在してお
り、そしてこのマトリックス内にはいかなる凝集物も分
散していない。
【００３２】本発明の装置および方法は、白血球、血小
板、赤血球などを含む数多くの異なる血球の検出に対し
て、上述した種類の直接的凝集試験において利用されて
もよい。凝集物の可視的観察が望まれている場合、いか
なる無色の細胞、或は細胞に粘着している無色の粒子に
対しても、最初に、可視的に感知できる凝集反応を行う
に適切な染料で染色するのが好適である。赤血球中のヘ
モグロビンは、染色無しで天然に上記適切な色を与え
る。ＡＢＯ赤血球、並びにＤ、Ｃ、ｃ、Ｅ、ｅ、Ｋ抗原
などを含有している血球に対して、上述したように直接
凝集試験を行うことができる。同様に、血清に関して、
特別な抗原もしくは抗原を含有している細胞に対する抗
体の存在を試験する必要があるとき、それらを公知の抗
原と混合する。もし未知の血清が、提供された公知の抗
原に対する抗体を含有している場合、これらの反応体は
凝集して、それらが該マトリックス上もしくはそこを通
過して下降するとき捕捉される一方、陰性の血清は反応
を起こさず、そして凝集物は捕捉されない。遠心分離、
或は他の適当な手段によって混合物を該マトリックス上
もしくはそれを通して移動させるに先立って、公知の抗
原もしくは抗原を含有している細胞を患者の血清と一緒
に保温するための、２つの部分から成るチャンバ構成
を、最後に述べた分析の実施で利用するのが好適であ
る。
板、赤血球などを含む数多くの異なる血球の検出に対し
て、上述した種類の直接的凝集試験において利用されて
もよい。凝集物の可視的観察が望まれている場合、いか
なる無色の細胞、或は細胞に粘着している無色の粒子に
対しても、最初に、可視的に感知できる凝集反応を行う
に適切な染料で染色するのが好適である。赤血球中のヘ
モグロビンは、染色無しで天然に上記適切な色を与え
る。ＡＢＯ赤血球、並びにＤ、Ｃ、ｃ、Ｅ、ｅ、Ｋ抗原
などを含有している血球に対して、上述したように直接
凝集試験を行うことができる。同様に、血清に関して、
特別な抗原もしくは抗原を含有している細胞に対する抗
体の存在を試験する必要があるとき、それらを公知の抗
原と混合する。もし未知の血清が、提供された公知の抗
原に対する抗体を含有している場合、これらの反応体は
凝集して、それらが該マトリックス上もしくはそこを通
過して下降するとき捕捉される一方、陰性の血清は反応
を起こさず、そして凝集物は捕捉されない。遠心分離、
或は他の適当な手段によって混合物を該マトリックス上
もしくはそれを通して移動させるに先立って、公知の抗
原もしくは抗原を含有している細胞を患者の血清と一緒
に保温するための、２つの部分から成るチャンバ構成
を、最後に述べた分析の実施で利用するのが好適であ
る。
【００３３】本発明の装置および方法の免疫血液学的用
途に関連して、Kell、 DuffyおよびKiddの抗原の如き予
期されない抗体に対して、上述した方法により患者の血
清をスクリーニングすることも可能である。クーム試験
の如き抗グロブリン試験もまた行われ得る。クーム試験
において、これらの細胞は、未結合の抗体を含有してい
る血清を含有していてはならない。ここに記述したシス
テムを用いて、濃密な細胞を該カラム中に遠心分離す
る。濃密でない血清は、米国特許番号４,４３５,２９３
中に記述されている方法と同様なカラムの上部に残存す
る。このマトリックス内に分散された抗ＩｇＧは、抗原
と結合しているＩｇＧ抗体を有する細胞を凝集させ、そ
してこれらの凝集物は該マトリックスの上部もしくはそ
の中に捕捉される。結合しているＩｇＧを全く含んでい
ない細胞は、このカラムを通過してこの管の底に移動す
る。
途に関連して、Kell、 DuffyおよびKiddの抗原の如き予
期されない抗体に対して、上述した方法により患者の血
清をスクリーニングすることも可能である。クーム試験
の如き抗グロブリン試験もまた行われ得る。クーム試験
において、これらの細胞は、未結合の抗体を含有してい
る血清を含有していてはならない。ここに記述したシス
テムを用いて、濃密な細胞を該カラム中に遠心分離す
る。濃密でない血清は、米国特許番号４,４３５,２９３
中に記述されている方法と同様なカラムの上部に残存す
る。このマトリックス内に分散された抗ＩｇＧは、抗原
と結合しているＩｇＧ抗体を有する細胞を凝集させ、そ
してこれらの凝集物は該マトリックスの上部もしくはそ
の中に捕捉される。結合しているＩｇＧを全く含んでい
ない細胞は、このカラムを通過してこの管の底に移動す
る。
【００３４】本発明の装置および方法を、血液血清学に
関連した使用に関して詳しい説明を行ってきた。しかし
ながら、リガンド類のそれらの結合相手との結合の結果
として粒子が凝集するような粒子と会合している結合リ
ガンドのいずれかを伴う結合分析を行うことは、本発明
の範囲内であることを理解すべきである。例えば、赤血
球（抗原を有する）の代わりとなる粒子もしくは他の担
体に付着できるいかなる結合リガンドも適切である。こ
れらの粒子は、抗原を「有している」赤血球と全く同
様、これらのリガンドのための担体として働く。他のリ
ガンドの例には、Schuurs他の再発行特許番号３１,００
６（その結合リガンドに関する開示に関しては、ここで
は参照にいれられる）中に記述されている特定の結合蛋
白質が含まれる。このような粒子は、米国特許番号４,
１４０,６６２（これはここでは参照にいれられる）中
に記述されているが如き不活性な担体である。適切な担
体の粒子サイズおよび組成は、検出しようとする結合リ
ガンドに従って変化し、これらの例は引用文献中に開示
されている。適切なマトリックスのミクロ粒子サイズお
よび組成もまた、選択された担体粒子および結合リガン
ドに従って変化する。本明細書の実施例項は、適切な粒
子サイズおよび組成を決定するに有益な技術に関する案
内を提供している。赤血球の凝集システムを説明したも
のであるが、本分野の技術者はこの方法で他のシステム
を最適化し得るものであることを理解するであろう。い
くつかの具体例において、可視的に着色している赤血球
に関して得られる効果と同様に、粒子の凝集した集塊も
しくは帯を可視的に観察できるように、これらの粒子を
着色するのも好適である。
関連した使用に関して詳しい説明を行ってきた。しかし
ながら、リガンド類のそれらの結合相手との結合の結果
として粒子が凝集するような粒子と会合している結合リ
ガンドのいずれかを伴う結合分析を行うことは、本発明
の範囲内であることを理解すべきである。例えば、赤血
球（抗原を有する）の代わりとなる粒子もしくは他の担
体に付着できるいかなる結合リガンドも適切である。こ
れらの粒子は、抗原を「有している」赤血球と全く同
様、これらのリガンドのための担体として働く。他のリ
ガンドの例には、Schuurs他の再発行特許番号３１,００
６（その結合リガンドに関する開示に関しては、ここで
は参照にいれられる）中に記述されている特定の結合蛋
白質が含まれる。このような粒子は、米国特許番号４,
１４０,６６２（これはここでは参照にいれられる）中
に記述されているが如き不活性な担体である。適切な担
体の粒子サイズおよび組成は、検出しようとする結合リ
ガンドに従って変化し、これらの例は引用文献中に開示
されている。適切なマトリックスのミクロ粒子サイズお
よび組成もまた、選択された担体粒子および結合リガン
ドに従って変化する。本明細書の実施例項は、適切な粒
子サイズおよび組成を決定するに有益な技術に関する案
内を提供している。赤血球の凝集システムを説明したも
のであるが、本分野の技術者はこの方法で他のシステム
を最適化し得るものであることを理解するであろう。い
くつかの具体例において、可視的に着色している赤血球
に関して得られる効果と同様に、粒子の凝集した集塊も
しくは帯を可視的に観察できるように、これらの粒子を
着色するのも好適である。
【００３５】特許を請求する装置および方法は、本質的
に非圧縮性のミクロ粒子から成るマトリックスを利用し
た分析システムを提供することにより、凝集分析に関す
る本分野で公知の装置および方法に関連した欠点を回避
するものである。このシステムの使用前、そして加える
べき試薬量の計算前に、上記粒子を「膨潤」させる必要
がない。これらの粒子は、本分野で公知の他のマトリッ
クスに比べて無孔性であり、従って、加えるべきいかな
る試薬の量も大きく吸収することなく、これにより、こ
の試薬の多くを反応に利用できるようにさせる。また、
粒子サイズの変化が最小限であるため、多くの細かい破
損が生じない。驚くべきことに、遠心分離を用いて該マ
トリックスを通してそれらの反応体を移動させるとき、
本発明の分析システムは遠心分離時間を短縮させる。
に非圧縮性のミクロ粒子から成るマトリックスを利用し
た分析システムを提供することにより、凝集分析に関す
る本分野で公知の装置および方法に関連した欠点を回避
するものである。このシステムの使用前、そして加える
べき試薬量の計算前に、上記粒子を「膨潤」させる必要
がない。これらの粒子は、本分野で公知の他のマトリッ
クスに比べて無孔性であり、従って、加えるべきいかな
る試薬の量も大きく吸収することなく、これにより、こ
の試薬の多くを反応に利用できるようにさせる。また、
粒子サイズの変化が最小限であるため、多くの細かい破
損が生じない。驚くべきことに、遠心分離を用いて該マ
トリックスを通してそれらの反応体を移動させるとき、
本発明の分析システムは遠心分離時間を短縮させる。
【００３６】とりわけこれらの因子は、より少ない量の
試薬を必要とさせ、従って極めてコスト効果の高い分析
システムをもたらす。更に、このシステムは、より長期
の貯蔵安定性および輸送容量に関する追加的利点を与え
る。例えば、輸送もしくは貯蔵段階でこの装置が転倒し
たとしても、このマトリックスは、軽くたたくことで、
容易にその支持部材内の正確な位置に戻すことができ
る。また、本発明のマトリックスの入っているこれらの
装置は、安定性の問題を生じさせることなく、冷凍状
態、１５℃、もしくは室温で保存できる。
試薬を必要とさせ、従って極めてコスト効果の高い分析
システムをもたらす。更に、このシステムは、より長期
の貯蔵安定性および輸送容量に関する追加的利点を与え
る。例えば、輸送もしくは貯蔵段階でこの装置が転倒し
たとしても、このマトリックスは、軽くたたくことで、
容易にその支持部材内の正確な位置に戻すことができ
る。また、本発明のマトリックスの入っているこれらの
装置は、安定性の問題を生じさせることなく、冷凍状
態、１５℃、もしくは室温で保存できる。
【００３７】以下に示す特定の実施例は本発明を例示す
るものであり、それによって制限することを意図したも
のではない。
るものであり、それによって制限することを意図したも
のではない。
【００３８】
【実施例】Ｉ． ミクロ粒子選択 以下に示す実験は、遠心分離したとき、凝集されていな
い赤血球がカラムを通って通過する一方、凝集した赤血
球がそのカラムの上部もしくはその中に捕捉される物質
の選択を示すものである。次の実験を行うための一般的
方法は下記の通りである： １． 試験管の如き容器に粒子を入れる； ２． 抗体を含んでいる試薬と一緒に試験下の赤血球を
混合した後、粒子から成るマトリックス上に堆積させ
る； ３． 水平に容器を回転させることができる遠心分離器
中でこれらの管を遠心する； ４． 凝集／非凝集に関してこれらの管を観察する。
い赤血球がカラムを通って通過する一方、凝集した赤血
球がそのカラムの上部もしくはその中に捕捉される物質
の選択を示すものである。次の実験を行うための一般的
方法は下記の通りである： １． 試験管の如き容器に粒子を入れる； ２． 抗体を含んでいる試薬と一緒に試験下の赤血球を
混合した後、粒子から成るマトリックス上に堆積させ
る； ３． 水平に容器を回転させることができる遠心分離器
中でこれらの管を遠心する； ４． 凝集／非凝集に関してこれらの管を観察する。
【００３９】Ａ． 種々の粒子の試験 約１／２ｍＬのミクロセルロース（Whatman Microsellu
lose ＤＥ３２、ＤＥ５２、ＱＡ５２、ＳＥ５２（接頭
語は異なる充填を示している））を用いて、小型のプラ
スチック製管を製造した。（容積は充填された容積であ
り、燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で製造したスラリー
から得られた） 結果： ＤＥ３２／細胞は通過せず ＤＥ５２／いくつかの細胞は管の上１／２中にあり、他
のものは底に通過。
lose ＤＥ３２、ＤＥ５２、ＱＡ５２、ＳＥ５２（接頭
語は異なる充填を示している））を用いて、小型のプラ
スチック製管を製造した。（容積は充填された容積であ
り、燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で製造したスラリー
から得られた） 結果： ＤＥ３２／細胞は通過せず ＤＥ５２／いくつかの細胞は管の上１／２中にあり、他
のものは底に通過。
【００４０】抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）中に再懸濁し
た後、ＩｇＧコートした細胞（Ortho Coombs Control C
ellTM、例えばOCC）を加えた。
た後、ＩｇＧコートした細胞（Ortho Coombs Control C
ellTM、例えばOCC）を加えた。
【００４１】対照および陰性細胞（SelectogenTM）。
【００４２】ＤＥ５２ ＱＡ５２ 全ての陰性細胞は底に通過した。
【００４３】ＳＥ５２ 試験したAerosil＝直径が約７４０ｎｍの二酸化ケイ素
粒子、およびDowの０.８μポリスチレンラテックス粒
子。
粒子、およびDowの０.８μポリスチレンラテックス粒
子。
【００４４】強い回転後も、細胞はこれらの懸濁液を通
過しなかった。
過しなかった。
【００４５】考察：ヒトの赤血球（直径７ｕ）は、１０
０〜１５０ｕの粒子床を通して遠心分離できる。
０〜１５０ｕの粒子床を通して遠心分離できる。
【００４６】Ｂ． 試験管カートリッジ中で試験した追
加的粒子： セルロースの粒子サイズは赤血球（７.０μ）よりもず
っと大きい（〜１００〜１５０μ）。
加的粒子： セルロースの粒子サイズは赤血球（７.０μ）よりもず
っと大きい（〜１００〜１５０μ）。
【００４７】 １． セルロースWhatman C F11 − 繊維状セルロース粉末 ２． セルロースWhatman C F31 − ミクロ顆粒 ３． 酸洗浄ガラス製ビード − １５０μ未満 − １５０−２１２μ − ４２５−６００μ 操作 （１） Ortho Bioclone 抗ＡTMロット番号ＢＡＡ １１
００中に粒子を懸濁する。
００中に粒子を懸濁する。
【００４８】（２） 懸濁液を装置の上部に充填する。
【００４９】（３） 軽く遠心分離 − セルロースが
上部に粘着。
上部に粘着。
【００５０】プローブで詰まりを壊した後、充填された
セルロースを再び底に遠心分離する。
セルロースを再び底に遠心分離する。
【００５１】ガラス製のビードを乾燥したまま充填した
後、液体を加える。
後、液体を加える。
【００５２】（４） １０ｍＬのAffirmagenTM Ａ血球
もしくはＢ血球を加える。
もしくはＢ血球を加える。
【００５３】（５） 卓上の頭が揺れる遠心分離器（So
rvall GLC-1のミクロタイタープレート担体）中で遠心
分離し、短期間９００ＲＰＭで、Ｂ血球が底に到達する
時間を測定する。
rvall GLC-1のミクロタイタープレート担体）中で遠心
分離し、短期間９００ＲＰＭで、Ｂ血球が底に到達する
時間を測定する。
【００５４】
【表１】 ３０′ プラス１分 プラス１分 プラス５分 − ＋ − ＋ − ＋ − ＋ − セルロース １ Ｔ Ｔ 1/2 Ｔ 1/2 Ｔ 1/2 Ｔ セルロース ２ Ｔ Ｔ Ｔ Ｔ Ｔ Ｔ 1/10 Ｔ ビード(Ｓ) ３ 部分 Ｔ Ｂ Ｔ Ｂ Ｔ Ｂ Ｔ ビード(Ｍ) ４ 部分 Ｔ Ｂ Ｔ Ｂ Ｔ Ｂ Ｔ ビード(Ｍ) ５ 部分 Ｔ Ｂ Ｔ Ｂ Ｔ Ｂ Ｔ Ｔ＝上部の血球 Ｂ＝底部の血球 部もしくは画分は底部の血球を表す。
【００５５】試験した全ての大きさのガラス製ビード
は、約３０〜９０秒間の、Ａ型血球の回転時間に関して
うまく働いた。
は、約３０〜９０秒間の、Ａ型血球の回転時間に関して
うまく働いた。
【００５６】強くコートされた細胞（Ortho Coombs Con
trol CellTM (OCC)）およびコートとされていない細胞
（AffirmagenTMＡ細胞）を用いて、市販の抗ＩｇＧ中で
大型のビードを試みた（４２５〜６００μ）。
trol CellTM (OCC)）およびコートとされていない細胞
（AffirmagenTMＡ細胞）を用いて、市販の抗ＩｇＧ中で
大型のビードを試みた（４２５〜６００μ）。
【００５７】２５μＬのＡＢ血清；１０μＬの細胞懸濁
液；９００ｒｐｍで１分間回転。血清からの血球の分離
は、抗グロブリンが血球を凝集させるのを可能にした。
凝集物は、ビードから成るカラム中に捕捉された。
液；９００ｒｐｍで１分間回転。血清からの血球の分離
は、抗グロブリンが血球を凝集させるのを可能にした。
凝集物は、ビードから成るカラム中に捕捉された。
【００５８】考察：上記項Ｂの試験は、凝集されていな
い血球を遠心分離に通過させる一方、凝集された血球を
捕捉することを可能にする粒子の選択の継続である。２
つのセルロース粉末と３つのガラス製ビードの大きさを
試験した。これらの各々を、市販の血液型血清の抗Ａ中
に懸濁させた。血液群ＡまたはＢの赤血球を加えた後、
試験すべき粒子から成るカラムを通して注意深く遠心分
離した。
い血球を遠心分離に通過させる一方、凝集された血球を
捕捉することを可能にする粒子の選択の継続である。２
つのセルロース粉末と３つのガラス製ビードの大きさを
試験した。これらの各々を、市販の血液型血清の抗Ａ中
に懸濁させた。血液群ＡまたはＢの赤血球を加えた後、
試験すべき粒子から成るカラムを通して注意深く遠心分
離した。
【００５９】ヒト血清中のＩｇＧ抗体に関する試験は、
好適には、この試験血清により分離された指示血球を用
いて行われる、と言うのは、この血清が比較的多量のＩ
ｇＧ（これは試薬である抗ＩｇＧを中和する）を含有し
ているからである。ＩｇＧ抗体がコートしてあることが
知られている血球を、これらの血球に対する抗体が含有
されていないことが知られているＡＢ型の血清と混合し
た。抗体がコートされていないことが知られている血球
を対照として試験した。これらの混合物を、市販の抗Ｉ
ｇＧ試薬中のガラス製ビードから成るカラムの上部に加
えた後、遠心分離した。
好適には、この試験血清により分離された指示血球を用
いて行われる、と言うのは、この血清が比較的多量のＩ
ｇＧ（これは試薬である抗ＩｇＧを中和する）を含有し
ているからである。ＩｇＧ抗体がコートしてあることが
知られている血球を、これらの血球に対する抗体が含有
されていないことが知られているＡＢ型の血清と混合し
た。抗体がコートされていないことが知られている血球
を対照として試験した。これらの混合物を、市販の抗Ｉ
ｇＧ試薬中のガラス製ビードから成るカラムの上部に加
えた後、遠心分離した。
【００６０】結果 これらの陰性を示す血球の全てではないがいくらかが、
該セルロース粒子を通って遠心分離された。凝集した血
球は該カラムの上部に残存していた。その陰性を示す血
球の全てが該ガラス製ビードのカラムの底部に存在して
おり、そしてその陽性を示す血球の全てがその上部に残
存していた。
該セルロース粒子を通って遠心分離された。凝集した血
球は該カラムの上部に残存していた。その陰性を示す血
球の全てが該ガラス製ビードのカラムの底部に存在して
おり、そしてその陽性を示す血球の全てがその上部に残
存していた。
【００６１】ＩｇＧ抗体がコートされている血球は、ビ
ードから成るカラム中に捕捉された抗ＩｇＧにより凝集
させられた。ＩｇＧ抗体がコートされていない血球は凝
集せず、そして該カラムの底部に存在していた。抗Ｉｇ
Ｇを使用したとき、陽性および陰性を示す実施例との間
に著しい差が見られた。
ードから成るカラム中に捕捉された抗ＩｇＧにより凝集
させられた。ＩｇＧ抗体がコートされていない血球は凝
集せず、そして該カラムの底部に存在していた。抗Ｉｇ
Ｇを使用したとき、陽性および陰性を示す実施例との間
に著しい差が見られた。
【００６２】これらの実験で用いた試験血清および血球
は、強い反応を与えるものとして選択された。該ガラス
製ビードは、凝集したＡ血球のための支持体を与え、そ
して凝集していないＢ血球は該カラムを通って容易に遠
心分離された。この抗体がコートされている血球は該血
清から分離され、ここで、それらは強い反応を検出させ
るに充分な程少なくとも良く懸濁された。血清は該カラ
ムの上部に残存しており、そしてその抗ＩｇＧを中和し
ない。
は、強い反応を与えるものとして選択された。該ガラス
製ビードは、凝集したＡ血球のための支持体を与え、そ
して凝集していないＢ血球は該カラムを通って容易に遠
心分離された。この抗体がコートされている血球は該血
清から分離され、ここで、それらは強い反応を検出させ
るに充分な程少なくとも良く懸濁された。血清は該カラ
ムの上部に残存しており、そしてその抗ＩｇＧを中和し
ない。
【００６３】Ｃ． 追加的粒子： 鉄製金属くず； Fisher１５７〜５００から得られる〜
４０メッシュのもの。 洗浄した海砂； Fisher-Ｓ２５-５００から得られるロ
ット番号９０１２２３のもの。
４０メッシュのもの。 洗浄した海砂； Fisher-Ｓ２５-５００から得られるロ
ット番号９０１２２３のもの。
【００６４】洗浄した海砂； Mallinkrodt ７０６２か
ら得られる乾燥したロット番号７０６２ ＫＥＤ２のも
の。
ら得られる乾燥したロット番号７０６２ ＫＥＤ２のも
の。
【００６５】１． 試験管カセット中の２つのカラムの
各々に、試験下の５〜７ｍｍの粒子を加える。
各々に、試験下の５〜７ｍｍの粒子を加える。
【００６６】２． 各々のカラムにOrtho Bioclone 抗
ＡTM、 ロット番号ＢＡＡ１１０Ｄを加えた後、混合し
て、含まれている空気を除く。撹拌のために用いる針が
そのくずを通して壁に当たらないように、鉄くずを充填
する。ある程度の空気泡がこの管の底部に残存してい
る。
ＡTM、 ロット番号ＢＡＡ１１０Ｄを加えた後、混合し
て、含まれている空気を除く。撹拌のために用いる針が
そのくずを通して壁に当たらないように、鉄くずを充填
する。ある程度の空気泡がこの管の底部に残存してい
る。
【００６７】３． 各々に１０μＬの血球を加える（Or
tho Affirmagen抗ＡTM、ロット番号Ａ８４４）。抗Ａに
対して、Ａ血球は陽性であり、そしてＢ血球は陰性であ
る。 ４． 卓上の、頭が振れる遠心分離器中〜８分間遠心分
離する。
tho Affirmagen抗ＡTM、ロット番号Ａ８４４）。抗Ａに
対して、Ａ血球は陽性であり、そしてＢ血球は陰性であ
る。 ４． 卓上の、頭が振れる遠心分離器中〜８分間遠心分
離する。
【００６８】結果：鉄のくずは黒色になり、赤血球を見
ることができない。試験下の試験粒子（即ち赤血球）の
色に対する背景の色として、より適切なくずを使用する
必要がある。Fisherの砂およびMallinkrodtの砂の両方
共、凝集物をその上に保持し、そして両方の砂共、陰性
の血球をその底に通過させた。
ることができない。試験下の試験粒子（即ち赤血球）の
色に対する背景の色として、より適切なくずを使用する
必要がある。Fisherの砂およびMallinkrodtの砂の両方
共、凝集物をその上に保持し、そして両方の砂共、陰性
の血球をその底に通過させた。
【００６９】Mallinkrodtの砂はより白色であり、陰性
の反応を評価するためには優れた背景色を提供してい
た。
の反応を評価するためには優れた背景色を提供してい
た。
【００７０】考察：上記項Ｃの試験において、代替の支
持媒体を見つけ出すため、追加的固体状粒子をスクリー
ニングした。鉄の金属くずおよび２つの給源からの海砂
に関して、血液型血清抗Ａと共にＡおよびＢ血球を用い
て試験した。砂に関しては間接的抗グロブリン試験で試
験した。敏感性を測定するため、抗Ｄの２倍希釈液を用
いて試験した。
持媒体を見つけ出すため、追加的固体状粒子をスクリー
ニングした。鉄の金属くずおよび２つの給源からの海砂
に関して、血液型血清抗Ａと共にＡおよびＢ血球を用い
て試験した。砂に関しては間接的抗グロブリン試験で試
験した。敏感性を測定するため、抗Ｄの２倍希釈液を用
いて試験した。
【００７１】暗色の色が赤血球を不明瞭にしたため、鉄
くずは試験から除いた。２つの砂の両方共、明らかに、
抗Ａが入っているカラム上でＡ血球を捕捉し、そしてＢ
血球を通過させた。遠心分離およびカラムの長さを調節
した後、この抗グロブリン試験の敏感性は標準的マニュ
アル試験結果に匹敵していることが見いだされた。
くずは試験から除いた。２つの砂の両方共、明らかに、
抗Ａが入っているカラム上でＡ血球を捕捉し、そしてＢ
血球を通過させた。遠心分離およびカラムの長さを調節
した後、この抗グロブリン試験の敏感性は標準的マニュ
アル試験結果に匹敵していることが見いだされた。
【００７２】前記試験で用いた砂サンプルを、酸（二ク
ロム酸塩）洗浄した溶液中に一晩浸漬した。これらの砂
を水道水で濯いだ後、蒸留水で濯ぎ、そしてオーブンに
入れて乾燥した。その後、これらの粒子を解剖顕微鏡に
より検査した。
ロム酸塩）洗浄した溶液中に一晩浸漬した。これらの砂
を水道水で濯いだ後、蒸留水で濯ぎ、そしてオーブンに
入れて乾燥した。その後、これらの粒子を解剖顕微鏡に
より検査した。
【００７３】鉄くず − 全てのものはぎざぎざした端
を有する粗いものであった。粒子サイズは約２ｍｍ〜約
２００ｍｍで大きく変化していた。
を有する粗いものであった。粒子サイズは約２ｍｍ〜約
２００ｍｍで大きく変化していた。
【００７４】Fisherの砂 − ボトルから粒子を充填
し、そしてさじで残りを取り除いた。外観： 平均サイ
ズ１００〜１５０ミクロン（中にはより小さいものがあ
る）；透明な石英。
し、そしてさじで残りを取り除いた。外観： 平均サイ
ズ１００〜１５０ミクロン（中にはより小さいものがあ
る）；透明な石英。
【００７５】Mallinkrodtの砂 − Fisherの標本より
も丸い；半透明の表面；恐らくは砂浜で転がったもの。
も丸い；半透明の表面；恐らくは砂浜で転がったもの。
【００７６】Fisherの酸洗浄した砂は、暗色の斑点を有
する黄褐色である。Mallinkrodtは、より少ない量の斑
点を有すると共により白色である。
する黄褐色である。Mallinkrodtは、より少ない量の斑
点を有すると共により白色である。
【００７７】Bioclone抗ＡTMを用いて、ボトルからの砂
（両方共「洗浄した」と表示されている）に対して、酸
洗浄した砂を試験し、そして抗ヒト血清を用いた予備試
験を行った。この酸洗浄したものはより奇麗に見え（他
に特記すべき差はない）、そしていかなる血球も砂と結
合していないように見えた。
（両方共「洗浄した」と表示されている）に対して、酸
洗浄した砂を試験し、そして抗ヒト血清を用いた予備試
験を行った。この酸洗浄したものはより奇麗に見え（他
に特記すべき差はない）、そしていかなる血球も砂と結
合していないように見えた。
【００７８】Ｄ． 高密度溶液の添加 クームス・テスト ： 抗ＩｇＧ ０．５％ＰＥＧ、２％デキストラン８７００
０ＭＷ。
０ＭＷ。
【００７９】試験したＡＢ血清ロット１２４Ｂ４０ −
４０μＬ Ortho抗体増強溶液TM（低イオン性）ロットＡＥＳ ２０
４−１４０− ４０μＬ １０μＬ クーム対照血球TM Ｋ４３０。
４０μＬ Ortho抗体増強溶液TM（低イオン性）ロットＡＥＳ ２０
４−１４０− ４０μＬ １０μＬ クーム対照血球TM Ｋ４３０。
【００８０】抗ヒトグロブリン血球は砂に粘着したよう
に見える。底部の血球ボタン状物は、該ＯＣＣ中よりも
Ａ血球に関していくらか大きい。
に見える。底部の血球ボタン状物は、該ＯＣＣ中よりも
Ａ血球に関していくらか大きい。
【００８１】試験管カートリッジ中、AffirmagenTMＡ血
球およびＯＣＣ血球（ＩｇＧコートした）を用いて、正
常なラビットの血清（ＮＲＳ）プールおよび正常なラビ
ット血清のＰＢＳ希釈液中のビードに関して試験した。
球およびＯＣＣ血球（ＩｇＧコートした）を用いて、正
常なラビットの血清（ＮＲＳ）プールおよび正常なラビ
ット血清のＰＢＳ希釈液中のビードに関して試験した。
【００８２】これらを、卓上の水平遠心分離器中９分間
遠心分離した後、Sorvall GLC ９００ RPM中５分間遠
心分離した。このマトリックスはピンク色に染色された
ように見える。これは、非特異的粘着によるものであろ
う。
遠心分離した後、Sorvall GLC ９００ RPM中５分間遠
心分離した。このマトリックスはピンク色に染色された
ように見える。これは、非特異的粘着によるものであろ
う。
【００８３】希釈していないＮＲＳを用いたMallinkrod
tの海砂が最良に見えた、と言うのは、より少ない量の
血球がこの砂に粘着していたからである。しかしなが
ら、この希釈していないＮＲＳ中の抗体により、血球が
凝集する。
tの海砂が最良に見えた、と言うのは、より少ない量の
血球がこの砂に粘着していたからである。しかしなが
ら、この希釈していないＮＲＳ中の抗体により、血球が
凝集する。
【００８４】５％ＰＥＧ Ｋ２０ ２.５％デキストラン、〜２０Ｋ ＭＷ ＰＢＳ中０.１％ゼラチン、 中で試験したMallinkrodt砂抗ＩｇＧ ４０μＬ血清 対照 血清ＯＡＥＳ ４０μＬのＯＡＥＳ １０μＬ血球ＯＡＥＳ ５μＬ血球 − ＋ 血清なし 細胞 ＯＣＣ ＋ − ＋ − ＯＣＣ 細胞 ＯＣＣ 細胞 明確な差が＋と−との間に観察された。２番目の２組
を、Sorvall GLC中１０００ＲＰＭで５分間遠心分離し
た。
を、Sorvall GLC中１０００ＲＰＭで５分間遠心分離し
た。
【００８５】Mallinkrodt砂の繰り返し試験。この２番
目の２つは次のようにセットした： １０ｍｍのカラム ＧＬＣ２０００ＲＰＭで５分間回転 前と同じく抗ＩｇＧ、血球ＯＣＣ（＋）およびＡ（−） 番号１対照 番号２試験 ４０μＬ血清 １０μＬ血球 ４０μＬのＯＡＥＳ １０μＬ血球 結果：陽性は凝集され、そして陰性は遠心分離された。
このことは、このシステムから血清が分離でき、そして
陽性の反応が得られることを示している。
目の２つは次のようにセットした： １０ｍｍのカラム ＧＬＣ２０００ＲＰＭで５分間回転 前と同じく抗ＩｇＧ、血球ＯＣＣ（＋）およびＡ（−） 番号１対照 番号２試験 ４０μＬ血清 １０μＬ血球 ４０μＬのＯＡＥＳ １０μＬ血球 結果：陽性は凝集され、そして陰性は遠心分離された。
このことは、このシステムから血清が分離でき、そして
陽性の反応が得られることを示している。
【００８６】血清中の希釈した試験抗Ｄ − 上述した
ように、下記の如き希釈： １／１００ １／１００ １／１０００ １／２０００ １／４０００ ０ 試験結果は、通常の抗ヒトグロブリンマニュアル試験
（間接クーム）に匹敵している。１／１０００は明確な
陽性反応であり；１／２０００はこの管の底部に凝集が
生じているように見え；１／４０００は若干凝集してお
り；そして陰性は、この管の底部に丸くなったボタン状
物の血球を有する。
ように、下記の如き希釈： １／１００ １／１００ １／１０００ １／２０００ １／４０００ ０ 試験結果は、通常の抗ヒトグロブリンマニュアル試験
（間接クーム）に匹敵している。１／１０００は明確な
陽性反応であり；１／２０００はこの管の底部に凝集が
生じているように見え；１／４０００は若干凝集してお
り；そして陰性は、この管の底部に丸くなったボタン状
物の血球を有する。
【００８７】この実験の目的は、Simwash血清／血球分
離SystemR中で用いられているデキストランアルブミン
溶液の如き高密度溶液が、該カラム凝集抗グロブリン試
験を改良するか否かを決定することであった。抗ＩｇＧ
は、添加したSimwashR溶液およびアルブミン中で希釈さ
れた。ＩｇＧがコートされている血球を加え、そしてコ
ートされていない血球を対照として用いた。
離SystemR中で用いられているデキストランアルブミン
溶液の如き高密度溶液が、該カラム凝集抗グロブリン試
験を改良するか否かを決定することであった。抗ＩｇＧ
は、添加したSimwashR溶液およびアルブミン中で希釈さ
れた。ＩｇＧがコートされている血球を加え、そしてコ
ートされていない血球を対照として用いた。
【００８８】結果 コートされている血球は凝集して、該ビードにより捕捉
された。コートされていない血球のいくつかがそのガラ
ス製ビードと結合している。
された。コートされていない血球のいくつかがそのガラ
ス製ビードと結合している。
【００８９】考察 より高い密度の媒体を使用したとき、血清と血球とのよ
り良好な分離を与え、特にクームス・テストを実施する
に有益である。
り良好な分離を与え、特にクームス・テストを実施する
に有益である。
【００９０】本発明の主なる特徴および態様は以下の通
りである。
りである。
【００９１】１．本質的に非圧縮性のミクロ粒子から成
るマトリックス（このマトリックスは、凝集していない
反応体の移動を可能にするが、凝集している反応体の有
意な移動は可能にしない）から成り、上記マトリックス
が、上記凝集体の観察を可能にするに充分な配置および
量で装置内に配置されている、凝集体を捕捉するための
装置。
るマトリックス（このマトリックスは、凝集していない
反応体の移動を可能にするが、凝集している反応体の有
意な移動は可能にしない）から成り、上記マトリックス
が、上記凝集体の観察を可能にするに充分な配置および
量で装置内に配置されている、凝集体を捕捉するための
装置。
【００９２】２．ａ） 入り口を有する本質的に透明な
中空支持部材； ｂ） 上記入り口に対してサンプルを受け取る関係にあ
る、上記支持部材内に配置された第一結合反応ゾーン； ｃ） マトリックスが、凝集していない反応体の移動を
可能にするが、凝集している反応体の有意な移動は可能
にしないところの、本質的に非圧縮性のミクロ粒子のマ
トリックスから成る、上記第一ゾーンに対してサンプル
を受け取る関係にある第二凝集検出ゾーン； から成る、抗体もしくは抗原の存在を検出するための装
置。
中空支持部材； ｂ） 上記入り口に対してサンプルを受け取る関係にあ
る、上記支持部材内に配置された第一結合反応ゾーン； ｃ） マトリックスが、凝集していない反応体の移動を
可能にするが、凝集している反応体の有意な移動は可能
にしないところの、本質的に非圧縮性のミクロ粒子のマ
トリックスから成る、上記第一ゾーンに対してサンプル
を受け取る関係にある第二凝集検出ゾーン； から成る、抗体もしくは抗原の存在を検出するための装
置。
【００９３】３．上記中空支持部材の形状が円錐形であ
る前記２項の装置。
る前記２項の装置。
【００９４】４．上記入り口と上記第一結合反応ゾーン
との間に位置している初期サンプル受け取りゾーンを更
に含む前記２項の装置。
との間に位置している初期サンプル受け取りゾーンを更
に含む前記２項の装置。
【００９５】５．上記凝集体検出ゾーンを取り巻いてい
る上記中空支持部材の形が円錐形であり、そしてそれ
が、上記初期サンプル受け取りゾーンを取り巻いている
上記中空支持部材の一部と連結している前記４項の装
置。
る上記中空支持部材の形が円錐形であり、そしてそれ
が、上記初期サンプル受け取りゾーンを取り巻いている
上記中空支持部材の一部と連結している前記４項の装
置。
【００９６】６．上記凝集体検出ゾーンを取り巻いてい
る上記中空支持部材と、上記初期サンプル受け取りゾー
ンを取り巻いている中空支持部材と、の連結部が、上記
入り口で限定されている開口よりも小さい開口を限定し
ている前記５項の装置。
る上記中空支持部材と、上記初期サンプル受け取りゾー
ンを取り巻いている中空支持部材と、の連結部が、上記
入り口で限定されている開口よりも小さい開口を限定し
ている前記５項の装置。
【００９７】７．上記ミクロ粒子の直径が約５０〜約１
５０ミクロメートルの範囲にある前記１項の装置。
５０ミクロメートルの範囲にある前記１項の装置。
【００９８】８．上記ミクロ粒子がガラス製ビード、ポ
リスチレン製ビード、二酸化ケイ素の粒子、およびセル
ロースの粒子から本質的に成る群から選択される前記７
項の装置。
リスチレン製ビード、二酸化ケイ素の粒子、およびセル
ロースの粒子から本質的に成る群から選択される前記７
項の装置。
【００９９】９．上記ミクロ粒子がガラス製ビードであ
る前記８項の装置。
る前記８項の装置。
【０１００】１０．上記ミクロ粒子がポリスチレン製ビ
ードである前記８項の装置。
ードである前記８項の装置。
【０１０１】１１．上記ミクロ粒子が二酸化ケイ素の粒
子である前記８項の装置。
子である前記８項の装置。
【０１０２】１２．上記二酸化ケイ素粒子が海砂である
前記１１項の装置。
前記１１項の装置。
【０１０３】１３．上記ミクロ粒子がセルロースの粒子
である前記８項の装置。
である前記８項の装置。
【０１０４】１４．上記マトリックスが試薬に埋め込ま
れている前記１項の装置。
れている前記１項の装置。
【０１０５】１５．上記試薬が抗体を含有している前記
１４項の装置。
１４項の装置。
【０１０６】１６．上記試薬が抗ＩｇＧ抗体から成る前
記１５項の装置。
記１５項の装置。
【０１０７】１７．高密度のデキストランアルブミン溶
液を更に含む前記１６項の装置。
液を更に含む前記１６項の装置。
【０１０８】１８．（ａ） 結合リガンドが入っている
可能性のあるサンプルを、上記結合リガンドのための相
当する結合相手を含有している試薬と接触させ； （ｂ） マトリックスが、凝集していない反応体の移動
を可能にするが、凝集している反応体の有意な移動は可
能にしない、本質的に非圧縮性のミクロ粒子のマトリッ
クスから成る装置に、上記サンプルを加え；そして （ｃ） このマトリックスの上部もしくはその中で、凝
集物の存在の有無を検出する； の段階から成る、リガンドの結合を検出する方法。
可能性のあるサンプルを、上記結合リガンドのための相
当する結合相手を含有している試薬と接触させ； （ｂ） マトリックスが、凝集していない反応体の移動
を可能にするが、凝集している反応体の有意な移動は可
能にしない、本質的に非圧縮性のミクロ粒子のマトリッ
クスから成る装置に、上記サンプルを加え；そして （ｃ） このマトリックスの上部もしくはその中で、凝
集物の存在の有無を検出する； の段階から成る、リガンドの結合を検出する方法。
【０１０９】１９．ａ） 本質的に非圧縮性のミクロ粒
子から成るマトリックス（このマトリックスは、凝集し
ていない反応体の移動を可能にするが、凝集している反
応体の有意な移動は可能にしない、そして上記マトリッ
クスが、非凝集もしくは凝集した反応体の観察を可能に
するに充分な配置および量で配置されている）に、抗体
もしくは抗原検出用試薬、そして抗体もしくは抗原が入
っている可能性のある液状サンプルを加え； ｂ） 上記マトリックスに力を加えて、それを通して上
記検出用試薬および上記サンプルを移動させ；そして ｃ） 上記マトリックスの上部もしくはその中で、凝集
した反応体の存在の有無を検出する； の段階から成る、抗体もしくは抗原の存在を検出する方
法。
子から成るマトリックス（このマトリックスは、凝集し
ていない反応体の移動を可能にするが、凝集している反
応体の有意な移動は可能にしない、そして上記マトリッ
クスが、非凝集もしくは凝集した反応体の観察を可能に
するに充分な配置および量で配置されている）に、抗体
もしくは抗原検出用試薬、そして抗体もしくは抗原が入
っている可能性のある液状サンプルを加え； ｂ） 上記マトリックスに力を加えて、それを通して上
記検出用試薬および上記サンプルを移動させ；そして ｃ） 上記マトリックスの上部もしくはその中で、凝集
した反応体の存在の有無を検出する； の段階から成る、抗体もしくは抗原の存在を検出する方
法。
【０１１０】２０．上記抗体もしくは抗原が血液型抗原
もしくはそれに対する抗体である前記１９項の方法。
もしくはそれに対する抗体である前記１９項の方法。
【０１１１】２１．ａ） 本質的に透明な中空支持部材
｛この部材の中には、第一結合反応ゾーン、およびそれ
に対して液体を受け取る関係にある第二凝集検出ゾーン
［この第二ゾーンは、本質的に非圧縮性のミクロ粒子か
ら成るマトリックス（マトリックスは、凝集していない
赤色血液細胞の移動を可能にするが、凝集している赤色
液体細胞の有意な移動は可能にしない）を含有してい
る］が配置されている｝の入り口に、抗体もしくは抗原
を検出するための試薬、そして抗体もしくは抗原が入っ
ている可能性がある液状サンプルを加え； ｂ） 上記部材を遠心分離し；そして ｃ） 上記マトリックスの上部もしくはその中で、凝集
した赤色血液細胞の存在の有無を検出する； の段階から成る、血液型の抗体もしくは抗原の存在を検
出するための方法。
｛この部材の中には、第一結合反応ゾーン、およびそれ
に対して液体を受け取る関係にある第二凝集検出ゾーン
［この第二ゾーンは、本質的に非圧縮性のミクロ粒子か
ら成るマトリックス（マトリックスは、凝集していない
赤色血液細胞の移動を可能にするが、凝集している赤色
液体細胞の有意な移動は可能にしない）を含有してい
る］が配置されている｝の入り口に、抗体もしくは抗原
を検出するための試薬、そして抗体もしくは抗原が入っ
ている可能性がある液状サンプルを加え； ｂ） 上記部材を遠心分離し；そして ｃ） 上記マトリックスの上部もしくはその中で、凝集
した赤色血液細胞の存在の有無を検出する； の段階から成る、血液型の抗体もしくは抗原の存在を検
出するための方法。
【０１１２】２２．凝集した細胞の存在が、該結合反応
ゾーンに近い該凝集検出ゾーンの領域にある上記マトリ
ックス内に帯が形成されることによって示される前記２
１項の方法。
ゾーンに近い該凝集検出ゾーンの領域にある上記マトリ
ックス内に帯が形成されることによって示される前記２
１項の方法。
【図１】本発明の分析装置の縦断面図である。
【図２】本発明の分析装置の縦断面図である。
【図３】本発明の分析装置の縦断面図である。
【図４】本発明の分析装置の縦断面図である。
フロントページの続き (72)発明者 ローズマリー・ケイ・チヤコウスキー アメリカ合衆国ニユージヤージイ州 08835マンビル・ノースフイフスアベニ ユー119 (72)発明者 トーマス・セツトキヤベツジ アメリカ合衆国ニユージヤージイ州 08848ミルフオード・フエアビユウアベ ニユー111 (56)参考文献 特開 平１−163662（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−19832（ＪＰ，Ａ) 特開 昭51−73116（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/543 581 G01N 33/53
Claims (10)
- 【請求項１】 入り口部を有する本質的に透明な中空支
持部材と、 該支持部材に含まれる本質的に非圧縮性の酸で洗浄され
た無孔性ガラスミクロ粒子から成るマトリックスとを備
えた凝集体を捕捉するための装置であって、 該マトリックスが、それを通して、凝集していない反応
体の移動を可能にするが、しかし、凝集した反応体の有
意な移動は可能にせず；そして該マトリックスは、凝集
していない反応体からの凝集した反応体の分離を可視化
するのに十分な量で該支持部材中に存在していることを
特徴とする装置。 - 【請求項２】 該マトリックスが試薬を含有する溶液に
より処理されている請求項１記載の装置。 - 【請求項３】 該溶液がその密度を上昇させるためのポ
リマーを含む請求項２記載の装置。 - 【請求項４】 該溶液が抗体を含有する請求項２または
３記載の装置。 - 【請求項５】 該抗体がＩｇＧ抗体である請求項４記載
の装置。 - 【請求項６】 該ミクロ粒子が直径５０〜１５０μｍの
範囲内にある請求項１〜５のいずれかに記載の装置。 - 【請求項７】 （ａ） 該試薬が結合リガンドに対応す
る結合相手を包含する請求項２〜６のいずれかに記載の
装置に対して、結合リガンドが入っている可能性のある
サンプルを適用する工程、 （ｂ） 該サンプルに力を加えることにより該サンプル
と試薬を含有する溶液とを混合させてサンプル中に存在
する結合リガンドを対応する結合相手に結合させ、こう
して凝集体を形成し、そして凝集していない反応体は該
マトリックスを通過させるが、凝集した反応体は該マト
リックス上もしくはその中に捕捉する工程、および （ｃ） 該マトリックスの上部もしくはその中で、凝集
体の存在の有無を検出する工程、 を含んでなるリガンドの結合を検出する方法。 - 【請求項８】 該力が遠心によって加えられる請求項７
記載の方法。 - 【請求項９】 単一容器内で可能性のある凝集反応を促
進させ、そして凝集していない細胞から凝集した細胞を
分離する方法であって、 該容器が、凝集していない細胞から凝集した細胞を分離
するための本質的に非圧縮性の酸で洗浄された無孔性ガ
ラスミクロ粒子から成るマトリックスを備える分離領
域、並びに該分離領域への移入を伴うことなく細胞と該
細胞に対する抗体とをインキュベートできる保温領域を
備えており、かつ、 ｉ） 該保温領域に細胞と抗体を置き、 ｉｉ） 細胞の該分離領域への移入を伴うことなく細胞
と抗体との接触を促進する第一の力で第一の期間遠心
し、そして ｉｉｉ） 凝集していない細胞がマトリックスを通して
移動するような第二の力で第二の期間遠心して、凝集し
た細胞から凝集していない細胞を分離すること、 を含んでなる方法。 - 【請求項１０】 凝集していない細胞から凝集した細胞
を分離するための本質的に非圧縮性の酸で洗浄された無
孔性ガラスミクロ粒子から成るマトリックスを備える分
離領域と保温領域を含む反応容器であって、該分離領域
の横断面が一つの軸線に沿って長くそしてそれに垂直な
軸線に沿って短くなっていることで、分離領域の溶液能
を低減することなく短い軸線に沿った可視性が向上して
いることを特徴とする反応容器。
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| US5552064A (en) * | 1993-02-26 | 1996-09-03 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Column agglutination assay and device using biphasic centrifugation |
| US5491067A (en) * | 1993-07-15 | 1996-02-13 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Agglutination reaction and separation vessel |
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