JP2007519938A - 凝集反応の可視化と分離により分析物を検出するための装置と方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.血液型の判定
a)両方の反応パートナーをピペットで反応容器に入れる
5μlのリン酸緩衝液をピペットで担持エレメントの試薬アプリケーションチャネルに入れる。この緩衝液をID遠心分離装置(ダイア-メド社)の中で遠心処理する(10分間、85×g)。血液型A細胞の懸濁液(リバースサイトA1(ReverseCyte A1)、メディオン・ディアグノスティック社)を0.8%に希釈したもの25μlをピペットで反応チャンバーに入れた後、5μlの抗A(BIRMA-1、セロロジカルズ社)を入れる。カードを再びID遠心分離装置の中で遠心処理する。結果:赤血球凝集体が毛管系に保持される。陰性反応容器は細胞なしのままである。リバースサイトA1細胞の代わりにリバースサイトB細胞を用いるのであれば、遠心処理後に陰性反応容器の下方領域に細胞が回収されるのが見える。
5μlの抗A(BIRMA-1、セロロジカルズ社)をピペットで担持エレメントの試薬アプリケーションチャネルに入れる。カードをID遠心分離装置の中で遠心処理する(10分間、85×g)。血液型A細胞の懸濁液(リバースサイトA1、メディオン・ディアグノスティック社)を0.8%に希釈したもの25μlをピペットで反応チャンバーに入れる。カードを再びID遠心分離装置の中で遠心処理する。結果:赤血球凝集体が毛管系に保持される。陰性反応容器は細胞なしのままである。リバースサイトA1細胞の代わりにリバースサイトB細胞を用いるのであれば、遠心処理後に陰性反応容器の下方領域に細胞が回収されるのが見える。
5μlの抗A(BIRMA-1、セロロジカルズ社)をピペットで担持エレメントの試薬アプリケーションチャネルに入れる。カードをID遠心分離装置の中で遠心処理する(10分間、85×g)。血液型Aの一人の人の抗凝固処理した全血の懸濁液50μlをブロメリン試薬(希釈液1、ダイアメド社)500μlと混合し、室温で10分間放置する。その後、この懸濁液10μlをピペットで反応チャンバーに入れる。ただちにカードをID遠心分離装置の中で遠心処理する。結果:赤血球凝集体が毛管系に保持される。陰性反応容器は細胞なしのままである。血液型A細胞の代わりに血液型B細胞を用いるのであれば、遠心処理後に陰性反応容器の下方領域に細胞が回収されるのが見える。
5μlの抗A(BIRMA-1、セロロジカルズ社)をピペットで担持エレメントの試薬アプリケーションチャネルに入れる。血液型Aの一人の人の抗凝固処理した全血の懸濁液50μlをブロメリン試薬(希釈液1、ダイアメド社)500μlと混合し、室温で10分間放置する。その後、この懸濁液10μlをピペットで反応チャンバーに入れる。ただちにカードをID遠心分離装置の中で遠心処理する。結果:赤血球凝集体が毛管系に保持される。陰性反応容器は細胞なしのままである。血液型A細胞の代わりに血液型B細胞を用いるのであれば、遠心処理後に陰性反応容器の下方領域に細胞が回収されるのが見える。
10%グリセリンを含むPBS(pH7.4)に入れた抗IgG 5μlをピペットで担持エレメントの試薬アプリケーションチャネルに入れる。カードをID遠心分離装置の中で遠心処理する(10分間、85×g)。弱い血液型D(Dweak)である一人の人の抗凝固処理した全血の懸濁液50μlを希釈溶液(希釈液2、ダイアメド社)500μlと混合する。この懸濁液から25μlをピペットで採取して反応チャンバーに入れた後、市販のIgG抗D製品(ESD-1、ダイアメド社)25μlを入れる。37℃にて15分間にわたってインキュベート(すなわち定温放置)した後、ID遠心分離装置の中で遠心処理する。結果:赤血球が凝集し、赤血球凝集体が毛管系に保持される。陰性反応容器は細胞なしのままである。血液型D陽性細胞の代わりに血液型D陰性細胞を用いるのであれば、遠心処理後に陰性反応容器の下方領域に細胞が回収されるのが見える。
5μlの低イオン緩衝液(ダイアメド社、希釈液2)をピペットで担持エレメントの試薬アプリケーションチャネルに入れる。その後、A1試験細胞、A2試験細胞、B試験細胞、O試験細胞(ダイアメド社、ID-DiaCell ABO)の各懸濁液10μlをピペットで採取して担持エレメントの4つの異なる反応チャンバーに入れた後、血液型Aの一人の被験者の血漿10μlもピペットで採取してその反応チャンバーに入れ、得られた混合物を室温(18〜25℃)にて10分間にわたってインキュベートする。カードをID遠心分離装置の中で遠心処理する。結果:B試験細胞が反応をして陽性を示し、赤血球凝集体が毛管系に保持される。この反応装置の陰性反応容器は細胞なしのままである。使用した血漿中のイソアグルチニンと反応しない他の3種類の細胞(A1、A2、O)は、遠心処理後に陰性反応容器の下方領域に回収されるのが見える。
a)間接的な抗ヒトグロブリン試験(間接クームス試験)
抗IgGと抗C3d(メディオン・ディアグノスティックス社)の混合物を10%グリセリン(w/v)によって密度を大きくしたもの5μlをピペットで担持エレメントの試薬アプリケーションチャネルに入れる。カードをID遠心分離装置の中で遠心処理する(10分間、85×g)。抗体探索試験のための血液型O試験細胞(スクリーンサイト0.8% I、II、III、メディオン・ディアグノスティック社)25μlをピペットで反応チャンバーに入れた後、患者の血清25μlを入れる。37℃にて15分間にわたってインキュベートした後、ID遠心分離装置の中で遠心処理する。結果:細胞のうちの1つに存在している抗原に対する変則的な抗体が患者の血清に含まれている場合には、対応する試験細胞の赤血球が凝集し、赤血球凝集体が毛管系に保持される。細胞のうちの1つに存在している抗原に対する変則的な抗体が患者の血清に含まれていない場合には、赤血球は凝集しない。それらは遠心処理後に陰性反応容器の下方領域に赤く見える“ボタン”として回収される。
i)一相試験
5μlのリン酸緩衝液(pH7.4)をピペットで採取して担持エレメントの試薬アプリケーションチャネルに入れる。カードをID遠心分離装置の中で遠心処理する(10分間、85×g)。抗体探索試験のための血液型O試験細胞(スクリーンサイトI、II、III)25μlをピペットで反応チャンバーに入れた後、酵素試薬(希釈液1、ダイアメド社)25μlと患者の血清25μlを入れる。37℃にて15分間にわたってインキュベートした後、ID遠心分離装置の中で遠心処理する。結果:細胞のうちの1つに存在している抗原に対する変則的な抗体が患者の血清に含まれている場合には、対応する試験細胞の赤血球が凝集し、赤血球凝集体が毛管系に保持される。細胞のうちの1つに存在している抗原に対する変則的な抗体が患者の血清に含まれていない場合には、赤血球は凝集しない。それらは遠心処理後に陰性反応容器の下方領域に赤く見える“ボタン”として回収される。
5μlのリン酸緩衝液(pH7.4)をピペットで採取して担持エレメントの試薬アプリケーションチャネルに入れる。カードをID遠心分離装置の中で遠心処理する(10分間、85×g)。抗体探索試験のためのパパイン化した血液型O試験細胞(ID-DiaCell IP、IIP、IIIP、ダイアメド社)25μlをピペットで反応チャンバーに入れた後、患者の血清25μlを入れる。37℃にて15分間にわたってインキュベートした後、ID遠心分離装置の中で遠心処理する。結果:細胞のうちの1つに存在している抗原に対する変則的な抗体が患者の血清に含まれている場合には、対応する試験細胞の赤血球が凝集し、赤血球凝集体が毛管系に保持される。細胞のうちの1つに存在している抗原に対する変則的な抗体が患者の血清に含まれていない場合には、赤血球は凝集しない。それらは遠心処理後に陰性反応容器の下方領域に赤く見える“ボタン”として回収される。
抗IgGと抗C3d(メディオン・ディアグノスティックス社)の混合物を10%グリセリン(w/v)によって密度を大きくしたもの5μlをピペットで担持エレメントの試薬アプリケーションチャネルに入れる。カードをID遠心分離装置の中で遠心処理する(10分間、85×g)。保管しておいた1単位の血液の希釈を、10μlの細胞沈殿物を1mlの希釈溶液(希釈液2、ダイアメド社)と混合することによって行なう。その後、その保管血液の希釈液25μlをピペットで反応チャンバーに入れた後、患者の血清25μlを入れる。37℃にて15分間にわたってインキュベートした後、ID遠心分離装置の中で遠心処理する。結果:保管血液の赤血球の抗原に対する抗体が患者の血清に含まれている場合には、その血液が凝集し、赤血球凝集体が毛管系に保持される(ドナーとレシピエントが不適合)。不適合な抗体が患者の血清に含まれていない場合には、遠心処理後に赤血球が陰性反応容器の下方領域に赤く見える“ボタン”として回収される。
抗IgGと抗C3d(メディオン・ディアグノスティックス社)の混合物を10%グリセリン(w/v)によって密度を大きくしたもの5μlをピペットで担持エレメントの試薬アプリケーションチャネルに入れる。カードをID遠心分離装置の中で遠心処理する(10分間、85×g)。IgGを添加したクームスコントロール細胞(クームスコントロール、メディオン・ディアグノスティックス社)10μlをピペットで反応チャンバーに入れる。ただちにID遠心分離装置の中で遠心処理する。結果:クームスコントロール細胞にはIgGが添加されているため赤血球が凝集し、赤血球凝集体が毛管系に保持される。IgGが添加されていない細胞は、遠心処理後に陰性反応容器の下方領域に赤く見える“ボタン”として回収される。
抗ヒトIgG(メディオン・ディアグノスティックス社)を10%グリセリン(w/v)を用いて密度を大きくしたもの5μlをピペットで担持エレメントの試薬アプリケーションチャネルに入れる。カードをID遠心分離装置の中で遠心処理する(10分間、85×g)。組み換えの梅毒トレポネーマ抗原(TpN15、TpN17、TpN47)でコーティングした粒子試薬(ダイアメド社、梅毒ポリマー粒子)を最高設定にして5秒間撹拌する。その後、患者の血清5μlと粒子試薬25μlをピペットで反応チャンバーに入れる。室温にて5分間にわたってインキュベートした後、ID遠心分離装置の中で遠心処理する。結果:粒子上の1つ以上の梅毒抗原に対する抗体を含んでいる患者の血清は粒子を凝集させるため、それらが赤血球と同様に毛管系に保持される。感染していない人の血清は粒子を凝集させない。すると遠心処理中に自由粒子が、陰性反応容器の下方領域に茶色っぽく見える“ボタン”として沈澱する。
抗ヒトIgG(メディオン・ディアグノスティックス社)を10%グリセリン(w/v)を用いて密度を大きくしたもの5μlをピペットで担持エレメントの試薬アプリケーションチャネルに入れる。カードをID遠心分離装置の中で遠心処理する(10分間、85×g)。組み換え梅毒トレポネーマ抗原(TpN15、TpN17、TpN47)でコーティングした常磁性粒子(エスタポア・マイクロスフィア、フランス国)を最高設定にして5秒間撹拌する。その後、患者の血清5μlと粒子試薬25μlをピペットで反応チャンバーに入れる。室温にて5分間にわたってインキュベートした後、磁石(ライフセップ1.5S磁性分離ユニット、デクスター・マグネティック・テクノロジーズ社、アメリカ合衆国)を陰性反応容器の底部に取り付ける。結果:粒子上の1つ以上の梅毒抗原に対する抗体を含んでいる患者の血清は粒子を凝集させるため、それらが赤血球と同様に毛管系に保持される。感染していない人の血清は粒子を凝集させない。すると自由粒子が、陰性反応容器の下方領域に茶色っぽく見える“ボタン”として沈澱する。
5μlのPBS緩衝液(滴定してpH5.8にする)をピペットで担持エレメントの試薬アプリケーションチャネルに入れる。その後、血液型抗原Pを持つパパイン化した試験細胞の懸濁液10μlをピペットで反応チャンバーに入れる。そこで組み換えVP2粒子の溶液10μlをピペットでこの反応チャンバーに入れ、得られた混合物をただちにID遠心分離装置の中で遠心処理する。結果:細胞が凝集し、赤血球凝集体が毛管系に保持される。この反応装置の陰性反応容器は細胞なしのままである。VP2粒子の代わりにウイルスに感染していない人の血清を用いる場合には、赤血球が、遠心処理後に陰性反応容器の下方領域に回収されるのが見える。
Claims (32)
- サンプル中の1つ以上の分析物を検出する装置であって、サンプルを収容するのに適した1つ以上の反応チャンバー(1)と、選択的に1つ以上の試薬アプリケーションチャネル(2)を備え、上記反応チャンバー(1)または上記試薬アプリケーションチャネル(2)の後に続く1つ以上の毛管系(3)と、その毛管系(3)の後に続く1つ以上の陰性反応容器(4)とを含む装置。
- 上記毛管系(3)が、1つの毛管面(3a)内に少なくとも1つの毛管(3b)を備えているか、1つ以上の毛管面(3a)内にあって断面積が小さくなっていく1つ以上の毛管(3b)を備えている、請求項1に記載の装置。
- 上記毛管系(3)が、下に行くほど断面積が小さくなっていく毛管面(3a)を備える、請求項1または2に記載の装置。
- それぞれの毛管面(3a)内に、複数の毛管(3b)が、互いに隣接して、または束になって配置されている、請求項1から3のいずれか1項に記載の装置。
- 1つの毛管面(3a)内の互いに隣接した毛管(3b)または束になった毛管(3b)が、接続ウェブ(8)を備える、請求項1から4のいずれか1項に記載の装置。
- 1つの毛管面(3a)内の互いに隣接した毛管(3b)または束になった毛管(3b)が、同じ内部断面積を持つ、請求項1から5のいずれか1項に記載の装置。
- 上記毛管面(3a)の毛管(3b)の内部断面積が、上記反応チャンバー(1)から離れるほど、より小さくなっている、請求項1から6のいずれか1項に記載の装置。
- 上記毛管系(3)の毛管面(3a)がチャンバーによって互いに接続されており、そのチャンバーの内部断面積は、好ましくは最も広い毛管(3b)の内部断面積と同じである、請求項1から7のいずれか1項に記載の装置。
- 上記試薬アプリケーションチャネル(2)が、上記毛管(3b)と比べて、または上記毛管系(3)に上記陰性反応容器(4)を加えたものと比べて、体積が1.2倍である、請求項1から8のいずれか1項に記載の装置。
- 上記陰性反応容器(4)が、使用する細胞または粒子の圧縮堆積物よりも大きな体積を有する、請求項1から9のいずれか1項に記載の装置。
- 上記陰性反応容器(4)が底部に向かって細くなる形状であり、例えば矢またはU字のように先が尖っている、請求項1から10のいずれか1項に記載の装置。
- 1つまたは複数の換気チャネル(6)が、好ましくは上記陰性反応容器のより幅広の上部から分岐している、請求項1から11のいずれか1項に記載の装置。
- 上記毛管系(3)が、担持エレメント(5)と一体化した構成要素を形成している、請求項1から12のいずれか1項に記載の装置。
- サンプル流体中の1つ以上の分析物を凝集の可視化によって検出する方法であって、
a)サンプル流体を試薬と接触させ、
b)得られた反応混合物に重力または磁気の効果を作用させ、該反応混合物を請求項1から13のいずれか1項に記載の装置の陰性反応容器が後に続く請求項1から13のいずれか1項に記載の装置の毛管系を通過させ、
c)分析物と上記試薬の間の反応を調べることを特徴とする方法。 - 処理ステップb)の間に反応混合物をさらに別の試薬と接触させる、請求項14に記載の方法。
- 特に、重力または磁気を作用させている間だけ上記サンプル流体を試薬と接触させる場合に、ステップa)とステップb)からなる個々の処理ステップの順番を逆転させる、請求項14に記載の方法。
- 上記サンプル流体および/または試薬が1つ以上の粒子を含む、請求項14から16のいずれか1項に記載の方法。
- 上記反応を光学的に調べる、請求項14から17のいずれか1項に記載の方法。
- 上記粒子が天然の色彩を有するか、着色されている、請求項14から18のいずれか1項に記載の方法。
- 上記粒子が、色、放射能、蛍光、酵素のいずれかでコード化されている、請求項14から19のいずれか1項に記載の方法。
- 上記粒子が、赤血球および/または血小板および/または白血球、またはその一部を含む、請求項14から20のいずれか1項に記載の方法。
- 上記粒子をタンパク質分解酵素であらかじめ処理して反応を促進する、請求項14から21のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体、特にペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、ウイルス、細菌、寄生虫、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞のいずれか、またはその一部を粒子と結合させる、請求項14から22のいずれか1項に記載の方法。
- 抗原またはそれ以外のリガンド、例えばペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、ウイルス、細菌、寄生虫、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、アレルゲンのいずれか、またはその一部を粒子と結合させる、請求項14から23のいずれか1項に記載の方法。
- 上記粒子が、特にポリスチレン、ポリブロモスチレン、ゼラチン、メラミン、重合したアガロース、ポリメタクリル酸メチルのいずれかを含む、請求項14から24のいずれか1項に記載の方法。
- 上記粒子が磁性体または常磁性体である、請求項14から25のいずれか1項に記載の方法。
- 上記サンプル混合物に遠心処理によって重力を作用させる、請求項14から26のいずれか1項に記載の方法。
- 上記サンプル混合物に磁気を作用させる、請求項14から27のいずれか1項に記載の方法。
- 上記サンプル流体が、ヒト材料、動物材料、植物材料のいずれか、特に血液または血液成分を含む、請求項14から28のいずれか1項に記載の方法。
- 上記試薬が、特に抗体、試験細胞、合成粒子、緩衝液、ブースター溶液のいずれかを含む、請求項14から29のいずれか1項に記載の方法。
- 溶液の比重を増大すべく、グリセリンまたはそれ以外の分子が試薬に添加される、請求項14から30のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1から13のいずれか1項に記載の装置を利用して特に血液型の血清学的診断を行ない、好ましくは、血液型と、血液型の特徴に対する抗体と、保管されている血液とレシピエントの間の適合性を明らかにする、および/または血小板の特徴と、血小板に対する抗体を明らかにする、および/または白血球の特徴と、白血球に対する抗体を明らかにする、および/または赤血球を凝集させるウイルスを検出する、および/またはタンパク質、ウイルス、細菌、寄生虫に対する抗体を検出する、および/またはウイルス、細菌、寄生虫のいずれか、またはそれ以外の抗原を検出する、および/または自己抗体と、アレルゲンに対する抗体を検出する方法。
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