JP3172184B2 - 支持媒体 - Google Patents

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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
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    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/805—Test papers

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は支持媒体にかかり、詳しくは、血液分析試
薬のための支持媒体に関せん。
発明の背景 一般的にグルコースや他の物質の存在を確認する血液
検査又は血液分析は、一又はそれ以上の物質と反応する
指示色を呈する試薬混合物が保持されたテスト片に血液
を滴下することにより行われる。
このテスト片は一般的には白色のプラスチック片の片
側に試薬を含んだゼラチン或いは他の不活性樹脂或いは
ゲルマトリックスを取り付けることによって形成されて
いる。しかしながら、この方法は空気輸送時や他の物質
による汚染の問題や或いは同時に多量のテストを実施す
るオペレーターによる試験片上の相互汚染の危険性にさ
らされている。
また、過剰な血液検体を試薬パッドの色変化の観察が
可能とすべく取り除く必要性があり、この行為によって
試薬パッドの破壊やなすりつけを導く。また、テストが
完全に終わった後、血液が付着した試験片の廃棄問題も
ある。
米国特許第4935346号において、孔の中に反応試薬混
合物を設けた半透明多孔性膜の片側に血液検体を滴下す
るという方法が提案されている。それは血液中の血漿が
孔の中を流れ、試薬と反応して色変化を呈し、その色変
化を膜の他の側からの観察を可能にしたものである。こ
の技術は以下、バックリーディングテクニックとして記
載する。
しかしながら、我々は次の事を発見した。もし、簡便
な製造技術で容易に調製できる程度の大きさの孔を設け
れば、各孔の通路の入口において、表面張力効果が血液
細胞壁、特に膜の表面と接触している血液細胞膜を破壊
するほど大きくなる。
その結果、破壊された赤色細胞壁の破片が孔の中に嵌
入し、膜の他面から色の観察が歪められてしまう。この
ゆがみを補正する為には過剰の指示薬を必要とし、その
結果、装置のコスト上昇と製造工程を複雑にするという
欠点をもたらす。
膜材料との結合特性を持つ細胞プロテインを増加させ
るために膜の表面は勿論孔の内壁もコーティングを施す
技術が提案された。しかし、この処理は上記した細胞壁
の破壊問題や或いは細胞壁の破片のその問題を克服する
方法ではなく、また細胞壁破片が通過して呈色観察に影
響を及ぼした。
我々は今、この問題を解決し、バックリーディングテ
クニックを好適にする膜付き装置を完成するに到った。
我々の発明において、膜に存在する孔は当初、閉塞も
しくは盲となっている。
それは、当初孔に如何なる液体も自由に流れ込まず、
テスト検体の物質の細胞成分が膜から離されてテスト検
体の液体分のみをテストに提供するためである。
この膜が血液がテストの為に導入されるチャンバーの
他端壁として設けられている。血液検体はチャンバーの
中で密閉状態に保たれ、外部汚染の危険や他の検体との
相互汚染の危険が軽減される。また、チャンバーの中に
検体が閉じ込められるからテスト終了後の検体の廃棄問
題が軽減される。
発明の要約 従って、この発明は膜に適用するテスト物質の一又は
それ以上のテスト試薬の為の支持体として使用する膜を
提供するとともに、特にバックリーディングテクニック
に好適に使用される膜に関する。
この発明に於いて、膜の片面に適用される血液検体中
の血液細胞から血漿が分離され、そして膜の他面から膜
に設けられた試薬との反応の観察が容易となる。
この膜は当初は貫通孔を持つ多孔性材料であるが、膜
を貫通する通路から実質的に細胞壁の破片を妨げるため
に孔の少なくともある部分は盲とされていることが特徴
である。
少なくとも50％、より望ましくは75％の孔の長さが、
あるいは全ての孔の長さが盲とされ、そしてこの閉塞剤
は孔の全横断面すべてを完全に充填するか或いは、膜に
適用される物質の細胞成分の細胞壁の破壊がどのような
顕著な範囲で発生しようとも、その破壊の大きさ以下に
減ずることができる膜の有効な口径を充分満足できるよ
うに充填されることが特徴である。
膜は多孔性のプラスチックシート材料であることが望
ましく、或いは膜の他の形態、例えばチューブ上、或い
は更に要望に応じて応用できうる膜の実施形状の形状形
態を採用すればよい。この様にして膜は適宜の血液テス
ト片に形成されればよい。
しかしながら、上述の如くこの発明はバックリードテ
スト法に主に適応されるものであるから、液体検体のコ
ンテナーの一つの壁を構成する形にすることが望まし
い。というのは、検体はコンテナーの中で保持され、コ
ンテナーの中に一旦供給されれば、環境から隔離される
からである。テストに供される液体中の細胞成分から非
細胞壁を分離する装置に形成され、そして膜は細胞壁の
破壊を防止しながら非細胞液体が孔を閉塞する物質の中
に浸透する。
より詳しくはこの発明の応用の項で後述する。
この膜は膜に適用される液体や細胞成分の特性や大き
さそして、非細胞成分、非細胞液体成分について実施さ
れるテストを勘案して幅広い範囲の素材から形成され
る。特に膜は開口孔を持つ多孔性プラスチックから構成
するのが望ましく、特に初期の開口孔の大きさは液体か
ら分離を要求される細胞壁の細胞の大きさよりも小さい
径であることが望ましい。
しかしながら、この発明に於いては必ずしもこれに限
定されることはない。
というのは、孔の閉塞によって孔の径は軽減されて実
質的に０になるからである。膜の初期の孔の大きさは、
望ましくは0.1から10より望ましくはさらには１μｍ以
下とするのが望ましい。
膜は種々の高分子膜、高分子材料から使用することが
できる。
例えば、セルロース、ニトロセルロース或いは他のセ
ルロース誘導体、例えばセルロースエステル、紡糸され
た或いは織られたポリアミド繊維、ポリビニリディンポ
リマー、ポリカーボネイトポリマー、ポリサルホネイト
ポリマー、ポリアルキレンポリマー、アクリル又はメタ
クリル酸ポリマー又はこれらの共重合体、ポリアミドポ
リマー、ポリテトラフルオロエチレンポリマーあるいは
その他である。
この高分子は一般的にはシート状に形成されるが、繊
維や他の補強材を必要に応じて含有してもよい。或いは
また非常な微細繊維で織物状に形成したものも使用する
ことができる。
このようなシート材は一般的に可撓性をもっており、
使用に際しては支持媒体に装着することができる。しか
しながらこの発明においては固い膜の使用もできる。例
えば、焼結ガラスやセラミックで、これらの素材は内部
に隙間をもっておりこの隙間が内部結合して曲がりくね
った孔を構成するからである。
この孔はこの発明に基づいて閉塞することが可能であ
る。以下、この発明においては便宜的に膜を高分子シー
トのものについて述べる。
この孔は膜を製造する際に、同時に形成することがで
きる。例えば、揮発性の物質や可溶性の塩或いはその他
の物質を合成樹脂シートに予め混入し、例えば圧延工程
の際に、或いは蒸発により、更には析出をすることによ
って樹脂からこれらの物質を除去し、結果、貫通通路や
貫通孔を形成することができる。
一方これらの孔は合成樹脂シートの製造後に形成する
こともできる。例えば、合成樹脂シート形成体を針で穿
孔する、或いは放電加工によって形成できる。
特にこの膜の孔は直径が0.1から10μｍ、望ましくは
0.1から１μｍとすることが望ましくまた、この膜は空
気透過率が、膜の平板に対し10Psigの圧力を負荷した際
に、毎cm2毎分1.5から４であることが望ましい。
この様な膜物質としては市販されている種々の形体の
膜が使用可能であり、また、市販の膜を使用される形に
応用することも充分可能である。
膜は充分な薄さを持つことが望ましい。それは検体が
適用された表面に残存する血液細胞の色が非細胞成分と
反応した試薬で観察される色に悪い影響を与えないよう
にするためである。
特に、膜は50から500μｍの薄さとされる。それは過
剰な量の検体が膜の孔容積内の閉塞物質に向かわないよ
うにするためである。
膜の孔は少なくとも部分的に物質により閉塞される。
それは初期の孔の径を孔の入口の表面張力によって細胞
壁を破壊させない程度にその表面張力を減少させる為
に、及びまたは孔が閉塞物質によって完全に閉鎖される
そのいずれかの手法であるレベルまで減少される。
そのことによって細胞壁の破壊は生じなくなるし、さ
らに細胞壁の破片が重大な量であってもそれを通過させ
ることはなくなるからである。
膜は液体中で閉塞処理をする。その閉塞処理は固形片
が懸濁した、或いは固形片を分散させた、或いは固形片
がコロイド状に分散した液の中に膜を浸漬し、固形片を
膜の孔の中に機械的に連続した孔の詰物として浸入させ
ることによって行う。この方法は、孔に固形片を残して
孔の前処理として施すこともできる。
更には、熱可塑性樹脂或いは熱硬化性樹脂が熔解時に
この充填材料として使われる。これらは孔への充填時に
硬化する。この閉塞試薬は次の様なものとすべきであ
る。孔の中で水分を減少させることにより、あるいは物
質のレオロジカル特性を変化させることにより硬化する
物質、例えば液体ゲルやチキソトロピ材料を再凝固させ
るような物質である。さらに閉塞物質は化学変化により
硬化するものが望ましい。それは例えば、プレポリマー
やモノマーが重合することによって硬化することであ
る。閉塞物質は固まってしまわないように、更に貯蔵や
輸送時に孔からの脱落影響を少なくするように使用前に
除去できるシーリングコート樹脂やワックスを閉塞膜の
表面に施すことが望ましい。
一般的に、孔を閉塞する為に使用する物質は容易に孔
の壁を湿潤するものである。それは膜中の空気の形成を
少なくする為であり、又、検査される液体と試薬が反応
しない物質であり、そして呈色反応が呈した際に、孔を
介して半透明物質状態でその反応をみることができるた
めである。
閉塞物質はしばしばマトリックス中の１又はそれ以上
の反応試薬が物質と反応して生じる生成物を他の成分と
拡散反応させる、他の成分、例えば色素元と反応拡散さ
せるように媒体として行動をする。孔を閉塞する物質は
孔の中でマトリックス体を作る、或いは連続した固体と
なるものを形成するものが望ましい。
分散しやすくするために、微小な間隙の内部結合が部
分的な固体片の詰物であるよりは全体を通じて詰まって
いることが望ましいからである。
これは特に試験に供される液体と酵素試薬の間で行わ
れる反応によって生成物例えば、過酸化水素ができやす
くすることが重要である。
そしてこの生成物が他の成分と反応を生ぜしめる。例
えば、クロモゲンオルトトルイジンである。この反応物
が色を提示し、この提示された色が膜の反対面から観察
することが可能になるのである。特に、好ましい実施例
としては水溶液、ゼラチンのコロイドサスペンジョン、
孔の全長の全てまたはある部分を充足するゲル状の詰物
に使用され、この発明のゼラチンは低分子又は中分子の
ものが望ましく、例えば平均分子量が2000から50000で
ある。
このような形態のゼラチンは通常市販されているもの
が望ましく使用でき、そして市販されている状態で使用
できる。望ましくは市販物は前処理して使用することが
望ましい。例えば、酢洗い、或いは他の適宜な処理をす
ることによって血液の分析や血液の検査に好適に使用す
る物とすることができる。孔の閉塞は全ての孔の全長さ
を閉塞する。しかしながら、必ずしも全長の閉塞が必要
ではなく、閉塞を孔の長さの部分的におこなうことによ
っても充分な結果は得られる。
閉塞試薬の膜に適用する閉塞試薬の量は孔の径、膜の
厚さ、テストする物質、或いは実施するテストの性質に
よって定めるのが望ましい。最も好適な量は単純な試行
錯誤テストで定めればよい。しかしながら、ゼラチン閉
塞物質を使う際には一般的に0.1から0.5mmの厚みの膜に
対し、１から10望ましくは２から6mgのゼラチンを毎平
方メーター毎に使用することが望ましい。
閉塞は望ましくは膜の全平面において行うのが望まし
い。しかしながら、血液や他の物質をテストするための
膜のある部分的な選択された部分にのみ閉塞を及ぼすこ
ともできる。
また、膜は処理膜の所要の部分を円盤状に或いはステ
ィック状にすることもできる。閉塞物質は任意の方法で
膜に提供すればよい。例えば、物質の溶液や懸濁液がス
プレーやローラー塗布或いはパッティングによって膜に
適用される。
そのことによって負荷すべき閉塞物質の望ましい量の
みが負荷できるからである。
膜に作用する全閉塞物質におけるゼラチン濃度は、ゼ
ラチンの平均分子量は2000から3000の場合、水又は他の
キャリア液体に対して400部から6000部の間とすればよ
い。
また、ゼラチンの平均分子量が25000から40000の場合
においてはキャリア液体に対して100から600部とすれば
よい。
この充填物質は孔の中に充填される際に膜の他面から
吸引する及び又は流体静力学的な補助を及ぼすことによ
って達成される。前記の如くこの発明の膜は膜に滴下さ
れる液体に実施される幾つかのテストの為の支持薬を特
に支持するために用いられる。例えば、その膜は反応試
薬の表面コート剤によって支持される。
その支持薬の片側は検体が適用される側の面にむき出
しになっており、検体からの非細胞液は閉塞を浸透して
そして反応試薬層と接触する。
しかしながら、接触試薬は孔の中の閉塞物質中に含有
させておくことがより望ましい。
たとえば、膜に水溶性ゲルを適用し、その中に適当な
反応試薬を含有させることである。非細胞液体は閉塞物
質で呈色反応をして、膜の他面からの観察をより容易な
ものとする。
この発明にかかる膜は、例えば、テストの為に細胞成
分から非細胞成分を分離することができるものであるな
らば、種々の用途に適用が可能である。
たとえば、植物の細胞物質から細胞液を分拡する等の
用途がある。しかし、この発明が最も好適に適用できる
ものは血液や他の体液からその中に含まれるグルコー
ス、尿素、コレステロール含量等を分析することであ
る。
図面の説明 この発明は、添付する図面にこの発明の好適な形態を
図示することによって以下よく示す。
第１図はこの発明に係る膜の断面模式図であり、第２
図はこの発明に掛かる膜をバックリーディングテクニッ
クテスト装置に応用した図面である。
好適な実施例の記載 第１液は室温で300mlの脱イオン水pH7に調整する為の
リン酸ナトリウム0.5モル緩衝液200ml、20％濃度の界面
活性剤ガントレズ（商品名）100mlと分子量が2500から4
000の乾燥粉末のゼラチン300mgを、攪拌して調整した。
第２液は、60℃で１時間、脱イオン水300ml、メトキ
シエタノール300ml、オルトトルイジン塩酸塩15gを攪拌
して調製した。
第２溶液は攪拌中の第１液を、滴下しながら混合し
た。混合液は60℃で１時間放置した。
第３溶液をリン酸ナトリウム塩緩衝液0.1モル液に500
000IUsのグルコースオキシラーゼと300000IUsのパーオ
キシラーゼを混合することによって調製した。
この溶液は他の混合液と攪拌混合し、そして0.1μｍ
孔の濾紙でろ過した。
ろ液はポリサルトネイト樹脂シート１に含浸された。
このポリサルトネイト樹脂シート１（厚さ0.2から0.4m
m、孔径0.2μｍ、10psigの加圧下毎分毎cm2当たり３
の空気透過能力）は、5IUSのグルコースオキシラーゼと
3IUsのパーオキシラーゼと0.2mgのオトトルイジン、1cm
当たり4mgのゼラチンを供給した。この含浸は、溶液中
に膜シートを浸漬すことで行った。
この樹脂は親水性なのでゼラチン溶液が膜の内表面を
湿潤し、そして毛管現象によって孔の中にゼラチン溶液
が容易に浸入した。浸漬は最初膜の上面まで溶液が浸漬
するように、一面から浸漬し、そしてゼラチン溶液が孔
２を実質的に充填するように他面からも行われた。
処理後膜は乾燥されてゼラチンゲルの固形状の詰物３
がその孔の中に充足された。膜は円盤10として裁断さ
れ、そしてテストチャンバー11の他端を構成するように
使用された。このテストチャンバー11は、開口部を持
ち、そしてこの開口部は血液13の滴下が行われる孔12と
なる。血液がチャンバー11に浸入し、そしてテスト装置
14内で保持される。血液13は膜の内面を湿潤し、そして
非細胞血漿がゼラチン詰物３の溶液又は吸着によって孔
２に浸透する。
血液細胞は孔の中に浸入するのをゼラチン詰物によっ
て防止され、そして血液細胞の破壊が全く生じないか、
若しくは非常に微小の量だけ生じることとなる。
血漿は孔を閉塞するゼラチンマトリックス内に拡散す
ることによって試薬と反応して呈色反応を供し、図示す
る矢印の方向、装置の他面から呈色反応を観察すること
ができる。このようにして血液サンプルは、汚染に曝さ
れることなく、また、テスト装置は血液に含まれる病原
菌の感染の危険なしに廃棄することができる。
この発明にかかる膜は血液細胞の破壊を減少し、そし
てこの減少が血液細胞の破片によって生じる呈色反応の
失敗を防ぐことができる。
好ましい観点からこの発明は血液検査の新しい方法を
提供することができる。
それは当初、多孔性膜の最初の表面に血液検体を適用
することによって行い、そしてその膜は血液成分と反応
する少なくとも１つ以上の試薬を含んだマトリックスを
持つゼラチンが設けられ、その膜は膜の中の孔を実質的
に完璧にその検体が適用される範囲を閉塞し、そしてそ
のそこで血液の赤色細胞が最初の面で破壊されることな
く保持され検体の血漿がマトリックスの中を通過し、試
薬と反応して呈色をする。そしてその膜の反対面から色
を観察する。そういう方法である。
この発明はまた、この発明の膜を製造する方法を提供
する。その方法は初期の多孔膜に閉塞物質を含む液体成
分を施し、そしてその液体を膜の孔の中に含浸透させ、
その孔の少なくともある部分に完全に実質的に閉塞する
ようにその孔の中に固形物を形作る方法である。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平２−55952（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−54354（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−192389（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−101757（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】テスト物質を膜に適用する為の１又はそれ
    以上の反応試薬を支持するために好適に使用できる膜で
    あって、当初開口された多孔性膜で、少なくともその膜
    の微小孔のある部分が連続した固体、ゲルあるいはマト
    リックスからなる閉塞物質によって閉塞され、この閉塞
    により膜に施される物質に含まれる細胞壁の破片が膜の
    微小孔に通過することを防止することを特徴とする膜。
  2. 【請求項２】多孔性膜の微小孔の縦横断面が実質的に完
    璧に閉塞物質である連続する固体ゲル又は連続するマト
    リックスによって軸長方向の全てが実質的に充填されて
    いることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の膜。
  3. 【請求項３】テストする物質を含む成分と反応する少な
    くとも１つの試薬を含む物質で多孔性膜の微小孔が閉塞
    されていることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は
    第２項記載の膜。
  4. 【請求項４】閉塞物質がゼラチンであることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項乃至第３項記載の膜。
  5. 【請求項５】膜はポリスルホン樹脂であることを特徴と
    する特許請求の範囲第１項乃至第４項記載の膜。
  6. 【請求項６】特許請求の範囲第１項記載の膜から構成さ
    れる液体テスト装置。
  7. 【請求項７】膜の少なくともある部分がそのチャンバー
    の１の壁を構成して検体を保持しそしてそのチャンバー
    に導入された検体がこの膜と接触する事を特徴とする特
    許請求の範囲第６項記載の装置。
  8. 【請求項８】特許請求の範囲第１項記載の膜の１の面に
    テストする検体を適用し、そしてその膜の他の面から反
    応試薬とその物質の成分との反応を観察することからな
    る検査方法。
  9. 【請求項９】テストされる物質が細胞物質を含み、閉塞
    膜の第１の面に細胞物質が残存することからなる特許請
    求の範囲第８項記載の検査方法。
  10. 【請求項１０】前記テスト検体が血液検体であり、閉塞
    膜の第１の面に検体の赤血球が非破壊状態で残り、そし
    て検体の血漿がマトリックスを通過して反応試薬と反応
    することからなる特許請求の範囲第８項記載の検査方
    法。
  11. 【請求項１１】多孔性膜の微小孔に液体が含漬できる初
    期多孔性膜の閉塞物質を含む液体組成物を施し、孔の微
    小孔の少なくともある長さを完全に閉塞する様にその孔
    の中に連続する固形分、ゲル又はマトリックスを構成す
    る固化剤組成物を形成することからなる特許請求の範囲
    第１項記載の膜を製造する方法。
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