JP3115298B2 - 血小板特異的キメラ免疫グロブリン - Google Patents
血小板特異的キメラ免疫グロブリンInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 血小板凝集は血液凝塊の形成に必須の事象である。普
通の情況下では、血液凝塊は、血管系から血液細胞が逃
げるのを防止する作用をする。しかしながら、或る種の
疾患状態（例えば心筋硬塞）の間、凝塊は血流を制限す
るか又は全く閉塞して、細胞の壊死をもたらす。
通の情況下では、血液凝塊は、血管系から血液細胞が逃
げるのを防止する作用をする。しかしながら、或る種の
疾患状態（例えば心筋硬塞）の間、凝塊は血流を制限す
るか又は全く閉塞して、細胞の壊死をもたらす。
心臓発作の患者は、典型的には、凝塊のフィブリン成
分を溶解する組織プラスミノーゲン活性化因子又はスト
レプトキナーゼのような血栓溶解剤で処理される。フィ
ブリン溶解と関連した主要な合併症は、血小板凝集に基
づく再閉塞であり、これは更に心臓の損傷をもたらす。
糖タンパク質（gp）II b/III a受容体は、血小板凝集の
原因であることが知られているので、これらの受容体を
ブロックする試薬は血栓溶解に続く再硬塞を減少させる
か又は防止しそして血栓溶解の速度を促進すると予想さ
れる。
分を溶解する組織プラスミノーゲン活性化因子又はスト
レプトキナーゼのような血栓溶解剤で処理される。フィ
ブリン溶解と関連した主要な合併症は、血小板凝集に基
づく再閉塞であり、これは更に心臓の損傷をもたらす。
糖タンパク質（gp）II b/III a受容体は、血小板凝集の
原因であることが知られているので、これらの受容体を
ブロックする試薬は血栓溶解に続く再硬塞を減少させる
か又は防止しそして血栓溶解の速度を促進すると予想さ
れる。
血小板凝集を阻止するための１つの方法は、gp II b/
III a受容体に対して特異的なモノクローナル抗体が関
与する。血小板凝集を抑制しそしてヒト血栓症の処置に
有用であると思われる7E3と名付けられたネズミモノク
ローナル抗体は、公開されたヨーロッパ特許出願公開第
205,270号（特開昭62−76463号に対応）及び同第206532
号（特開昭62−30728号に対応）に記載されている。ネ
ズミ抗体は、ヒトの治療に使用する際には厳しい制限が
あることは当業界では知られている。外来タンパク質と
して、ネズミ抗体は、その治療効果を減少又は破壊する
及び／又は患者にアレルギー反応又は過敏症反応を誘発
する免疫反応を引き起こすことがある。血栓塞栓症にお
けるこのような治療モダリティの再投与の必要は、これ
らのタイプの免疫反応の可能性を増加させる。
III a受容体に対して特異的なモノクローナル抗体が関
与する。血小板凝集を抑制しそしてヒト血栓症の処置に
有用であると思われる7E3と名付けられたネズミモノク
ローナル抗体は、公開されたヨーロッパ特許出願公開第
205,270号（特開昭62−76463号に対応）及び同第206532
号（特開昭62−30728号に対応）に記載されている。ネ
ズミ抗体は、ヒトの治療に使用する際には厳しい制限が
あることは当業界では知られている。外来タンパク質と
して、ネズミ抗体は、その治療効果を減少又は破壊する
及び／又は患者にアレルギー反応又は過敏症反応を誘発
する免疫反応を引き起こすことがある。血栓塞栓症にお
けるこのような治療モダリティの再投与の必要は、これ
らのタイプの免疫反応の可能性を増加させる。
ヒト不変領域に結合した非ヒト結合領域から成るキメ
ラ抗体は、ネズミ抗体の免疫反応の問題を阻止する手段
として示唆された。PNAS、81:6851（1984）及びPCT出願
PCT/GB8500392参照。不変領域は抗体分子の免疫反応性
を大きく担っているので、ヒト起源の不変領域を有する
キメラ抗体は、ヒトにおいて抗ネズミ応答を誘発する可
能性がより少ないであろう。しかしながら、所望の特異
性のネズミ結合領域へのヒト不変領域の連結が免疫反応
性を減少させ及び／又は得られるキメラ抗体の結合能力
を変えるかどうかは予想できない。
ラ抗体は、ネズミ抗体の免疫反応の問題を阻止する手段
として示唆された。PNAS、81:6851（1984）及びPCT出願
PCT/GB8500392参照。不変領域は抗体分子の免疫反応性
を大きく担っているので、ヒト起源の不変領域を有する
キメラ抗体は、ヒトにおいて抗ネズミ応答を誘発する可
能性がより少ないであろう。しかしながら、所望の特異
性のネズミ結合領域へのヒト不変領域の連結が免疫反応
性を減少させ及び／又は得られるキメラ抗体の結合能力
を変えるかどうかは予想できない。
本発明の要約 本発明は、特異的な非ヒト起源の可変領域又は抗原結
合領域及びヒト起源の不変領域を含む血小板特異的キメ
ラ免疫グロブリンに関する。キメラ免疫グロブリンは、
gp II b/III a受容体又は他の血小板成分に対して特異
的であることができる。これらの抗体は、血小板に結合
しそして血小板凝集を阻止することができ、かくして抗
血栓症剤として有用でありそして血栓溶解に続く再閉塞
を防止又は減少させるのに有用である。
合領域及びヒト起源の不変領域を含む血小板特異的キメ
ラ免疫グロブリンに関する。キメラ免疫グロブリンは、
gp II b/III a受容体又は他の血小板成分に対して特異
的であることができる。これらの抗体は、血小板に結合
しそして血小板凝集を阻止することができ、かくして抗
血栓症剤として有用でありそして血栓溶解に続く再閉塞
を防止又は減少させるのに有用である。
第１図は、プローブとしてクローン化された可変領域
を使用する7E3モノクローナル抗体のためのＨ鎖及びＬ
鎖mRNA′ｓのノザーン分析を示す。
を使用する7E3モノクローナル抗体のためのＨ鎖及びＬ
鎖mRNA′ｓのノザーン分析を示す。
第２図は、それぞれ、キメラ7E3免疫グロブリンのＬ
鎖及びＨ鎖のキメラ遺伝子構築物を有するプラスミドp7
E3VκhCκ及びp7E3VHhCG4の略図である。
鎖及びＨ鎖のキメラ遺伝子構築物を有するプラスミドp7
E3VκhCκ及びp7E3VHhCG4の略図である。
第３図は、血小板に対するキメラ7E3免疫グロブリン
の結合を示す。
の結合を示す。
第４図は、キメラ7E3免疫グロブリンによる血小板凝
集の抑制を示す。
集の抑制を示す。
本発明の詳細な説明 本発明のキメラ免疫グロブリンは、個々のキメラＨ免
疫グロブリン鎖及びＬ免疫グロブリン鎖を含んで成る。
キメラＨ鎖は、ヒトＨ鎖不変領域に連結されたgp II b/
III a受容体に対して特異的な非ヒト抗体のＨ鎖由来の
抗原結合領域を含んで成る。キメラＬ鎖は、ヒトＬ鎖不
変領域に連結された非ヒト抗体のＬ鎖由来の抗原結合領
域を含んで成る。
疫グロブリン鎖及びＬ免疫グロブリン鎖を含んで成る。
キメラＨ鎖は、ヒトＨ鎖不変領域に連結されたgp II b/
III a受容体に対して特異的な非ヒト抗体のＨ鎖由来の
抗原結合領域を含んで成る。キメラＬ鎖は、ヒトＬ鎖不
変領域に連結された非ヒト抗体のＬ鎖由来の抗原結合領
域を含んで成る。
本発明の免疫グロブリンは、一価、二価又は多価であ
ることができる。一価免疫グロブリンは、ジスルフイド
橋を介してキメラＬ鎖と結合したキメラＨ鎖から形成さ
れた二量体（HL）である。二価免疫グロブリンは、少な
くとも１つのジスルフイド橋を介して結合した２つの二
量体から形成された四量体（H2L2）である。多価免疫グ
ロブリンは、例えば、凝集するＨ鎖不変領域（例えばIg
MH鎖）を使用することにより製造することもできる。Fa
b、Fab′又はＦ（ab′）２のようなキメラ免疫グロブリ
ン断片も製造することができる。
ることができる。一価免疫グロブリンは、ジスルフイド
橋を介してキメラＬ鎖と結合したキメラＨ鎖から形成さ
れた二量体（HL）である。二価免疫グロブリンは、少な
くとも１つのジスルフイド橋を介して結合した２つの二
量体から形成された四量体（H2L2）である。多価免疫グ
ロブリンは、例えば、凝集するＨ鎖不変領域（例えばIg
MH鎖）を使用することにより製造することもできる。Fa
b、Fab′又はＦ（ab′）２のようなキメラ免疫グロブリ
ン断片も製造することができる。
キメラ免疫グロブリンの非ヒト抗原結合領域は、血小
板に対して特異的な免疫グロブリン由来のものである。
好ましい免疫グロブリンは、血小板gp II b/III a受容
体に対して特異的でありそして糖タンパク質gp II b/II
I a受容体複合体に結合するリガンドをブロックする。
適当な抗体の例には7E3及び10E5が含まれる。ヨーロッ
パ特許出願公開第205,270号（特開昭62−76463号に対
応）及び同第206532号（特開昭62−30728号に対応）。
これらの教示は本明細書に加入する。7E3抗体は、gp II
b/III a受容体の複合化形態に対して特異的であるの
で、特に好ましい。II b又はIII a成分のいずれかに対
して特異的な他の抗体も使用することができる。他の血
小板抗原に対して特異的な抗体を使用することができ
る。例えば、血小板と反応性の抗体である、S12抗体
［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem）、259:9799−9804（1984）］のような
顆粒膜タンパク質GMP−140を使用することができる。
板に対して特異的な免疫グロブリン由来のものである。
好ましい免疫グロブリンは、血小板gp II b/III a受容
体に対して特異的でありそして糖タンパク質gp II b/II
I a受容体複合体に結合するリガンドをブロックする。
適当な抗体の例には7E3及び10E5が含まれる。ヨーロッ
パ特許出願公開第205,270号（特開昭62−76463号に対
応）及び同第206532号（特開昭62−30728号に対応）。
これらの教示は本明細書に加入する。7E3抗体は、gp II
b/III a受容体の複合化形態に対して特異的であるの
で、特に好ましい。II b又はIII a成分のいずれかに対
して特異的な他の抗体も使用することができる。他の血
小板抗原に対して特異的な抗体を使用することができ
る。例えば、血小板と反応性の抗体である、S12抗体
［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem）、259:9799−9804（1984）］のような
顆粒膜タンパク質GMP−140を使用することができる。
好ましくは、抗原結合領域はネズミ起源である。その
理由は、血小板に対する、特にgp II b/III a受容体に
対するネズミ抗体は入手可能であるか又はネズミ系で生
産することができるからである。他の動物又は齧歯種は
抗原結合領域の別のソースを提供する。
理由は、血小板に対する、特にgp II b/III a受容体に
対するネズミ抗体は入手可能であるか又はネズミ系で生
産することができるからである。他の動物又は齧歯種は
抗原結合領域の別のソースを提供する。
キメラ抗体の不変領域は、ヒト免疫グロブリン由来の
ものである。Ｈ鎖不変領域は、５つのアイソタイプα、
δ、ε、γ又はmuのいずれかから選ぶことができる。更
に、種々のサブクラスのＨ鎖（Ｈ鎖のIgGサブクラスの
如き）は異なるエフェクター機能を受け持ち、かくして
所望のＨ鎖不変領域を選ぶことにより、所望のエフェク
ター機能を有するキメラ抗体を生産することができる。
好ましい不変領域は、γ１（IgG1）、γ３（IgG3）及び
γ４（IgG4）である。Ｌ鎖不変領域はκ又はλタイプで
あることができる。
ものである。Ｈ鎖不変領域は、５つのアイソタイプα、
δ、ε、γ又はmuのいずれかから選ぶことができる。更
に、種々のサブクラスのＨ鎖（Ｈ鎖のIgGサブクラスの
如き）は異なるエフェクター機能を受け持ち、かくして
所望のＨ鎖不変領域を選ぶことにより、所望のエフェク
ター機能を有するキメラ抗体を生産することができる。
好ましい不変領域は、γ１（IgG1）、γ３（IgG3）及び
γ４（IgG4）である。Ｌ鎖不変領域はκ又はλタイプで
あることができる。
一般に、キメラ抗体は、キメラ免疫グロブリンのＬ鎖
及びＨ鎖成分の各々のために、ヒト不変領域の少なくと
も一部をコード化している第2DNAセグメントに連結され
た非ヒト起源の血小板特異的可変領域の少なくとも機能
的部分（例えば、連結セグメントを伴う機能的に再配列
された可変領域）をコード化している第1DNAセグメント
を含んで成る融合遺伝子を製造することにより生産され
る。各融合した遺伝子は、発現ベクター中に組み込まれ
るか又は挿入される。受容細胞は、遺伝子生産物を発現
することができる受容細胞を、次いで上記遺伝子でトラ
ンスフェクションする。トランスフェクションされた受
容細胞を導入された遺伝子の発現を可能とする条件下に
培養し、そして発現された免疫グロブリンまたは免疫グ
ロブリン鎖を回収する。
及びＨ鎖成分の各々のために、ヒト不変領域の少なくと
も一部をコード化している第2DNAセグメントに連結され
た非ヒト起源の血小板特異的可変領域の少なくとも機能
的部分（例えば、連結セグメントを伴う機能的に再配列
された可変領域）をコード化している第1DNAセグメント
を含んで成る融合遺伝子を製造することにより生産され
る。各融合した遺伝子は、発現ベクター中に組み込まれ
るか又は挿入される。受容細胞は、遺伝子生産物を発現
することができる受容細胞を、次いで上記遺伝子でトラ
ンスフェクションする。トランスフェクションされた受
容細胞を導入された遺伝子の発現を可能とする条件下に
培養し、そして発現された免疫グロブリンまたは免疫グ
ロブリン鎖を回収する。
IgのＬ鎖及びＨ鎖の可変領域をコード化している遺伝
子は、血小板特異的抗体を生産するリンパ球から得るこ
とができる。例えば、gp II b/III a受容体に対する抗
体を生産するハイブリドーマ細胞系は、本発明のキメラ
抗体の免疫グロブリン可変領域のソースを提供する。他
の齧歯動物細胞系が入手可能である。細胞系は、齧歯動
物をヒト血小板又はgp II b/III a受容体含有成分又は
血小板の画分でチャレンジし、抗体生産細胞とミエロー
マ細胞系との融合したハイブリッド細胞を形成し、この
ハイブリッドをクローニングしそして、血小板又は糖タ
ンパク質gp II b/III a受容体に対する抗体を生産する
クローンを選択することにより製造することができる。
子は、血小板特異的抗体を生産するリンパ球から得るこ
とができる。例えば、gp II b/III a受容体に対する抗
体を生産するハイブリドーマ細胞系は、本発明のキメラ
抗体の免疫グロブリン可変領域のソースを提供する。他
の齧歯動物細胞系が入手可能である。細胞系は、齧歯動
物をヒト血小板又はgp II b/III a受容体含有成分又は
血小板の画分でチャレンジし、抗体生産細胞とミエロー
マ細胞系との融合したハイブリッド細胞を形成し、この
ハイブリッドをクローニングしそして、血小板又は糖タ
ンパク質gp II b/III a受容体に対する抗体を生産する
クローンを選択することにより製造することができる。
不変領域は、標準クローン技術によりヒト抗体生産細
胞から得ることができる。別法として、２つのクラスの
Ｌ鎖及び５つのクラスのＨ鎖を表現する遺伝子がクロー
ニングされているので、ヒト起源の不変領域はこれらの
クローンから容易に入手可能である。Ｆ（ab′）２及び
Fab断片のようなキメラ抗体結合断片は、截頭形態（tru
ncated form）にキメラＨ鎖遺伝子をデザインすること
により製造することができる。例えば、Ｆ（ab′）2H鎖
部分をコード化しているキメラ遺伝子は、Ｈ鎖のCH1ド
メイン及びヒンジ領域をコード化しているDNA配列を含
むであろう。
胞から得ることができる。別法として、２つのクラスの
Ｌ鎖及び５つのクラスのＨ鎖を表現する遺伝子がクロー
ニングされているので、ヒト起源の不変領域はこれらの
クローンから容易に入手可能である。Ｆ（ab′）２及び
Fab断片のようなキメラ抗体結合断片は、截頭形態（tru
ncated form）にキメラＨ鎖遺伝子をデザインすること
により製造することができる。例えば、Ｆ（ab′）2H鎖
部分をコード化しているキメラ遺伝子は、Ｈ鎖のCH1ド
メイン及びヒンジ領域をコード化しているDNA配列を含
むであろう。
好ましくは、Ｌ及びＨキメラ鎖（又はその一部）をコ
ード化している融合した遺伝子は、受容細胞をコトラン
スフェクションするのに使用することができる２つの異
なる発現ベクター中に組み込まれる。各ベクターは２つ
の選択可能な遺伝子、一一１つはバクテリア系における
選択のため、１つは真核細胞系における選択のため、一
一を含み、各ベクターは異なる遺伝子の対を有してい
る。これらのベクターはバクテリア系における融合遺伝
子の生産及び増幅、及び真核細胞のその後のコトランス
フェクション及びコトランスフェクションされた細胞の
選択を可能とする。バクテリア系のための選択可能な遺
伝子の例は、アンピシリン耐性を付与する遺伝子及びク
ロラムフェニコール耐性を付与する遺伝子である。真核
細胞トランスフェクタントの選択のための２つの選択可
能な遺伝子、（ｉ）キサンチン−グアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子（gpt）及び（ii）Tn5から
のホスホトランスフェゼ遺伝子（neoと名付ける）、が
好ましい。gptによる選択は、この遺伝子によりコード
化された酵素の、プリンヌクレオチド合成のための基質
としてキサンチンを使用する能力に基づいており、類似
の内在酵素は選択できない。イノシンモノホスフェート
のキサンチンモノホスフェートへの転換を阻止する、キ
サンチン及びマイコフェノール酸を含む培地中で、gpt
遺伝子を発現する細胞のみが生き残ることができる。ne
oの生産物は抗生物質G418及びそのクラスの他の抗生物
質により引き起こされる真核細胞中でのタンパク質合成
の抑制を阻止する。２つの選択方法を同時に又は順次に
使用して、真核細胞中に２つの異なるDNAベクター上に
導入された免疫グロブリン鎖遺伝子の発現について選択
することができる。
ード化している融合した遺伝子は、受容細胞をコトラン
スフェクションするのに使用することができる２つの異
なる発現ベクター中に組み込まれる。各ベクターは２つ
の選択可能な遺伝子、一一１つはバクテリア系における
選択のため、１つは真核細胞系における選択のため、一
一を含み、各ベクターは異なる遺伝子の対を有してい
る。これらのベクターはバクテリア系における融合遺伝
子の生産及び増幅、及び真核細胞のその後のコトランス
フェクション及びコトランスフェクションされた細胞の
選択を可能とする。バクテリア系のための選択可能な遺
伝子の例は、アンピシリン耐性を付与する遺伝子及びク
ロラムフェニコール耐性を付与する遺伝子である。真核
細胞トランスフェクタントの選択のための２つの選択可
能な遺伝子、（ｉ）キサンチン−グアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子（gpt）及び（ii）Tn5から
のホスホトランスフェゼ遺伝子（neoと名付ける）、が
好ましい。gptによる選択は、この遺伝子によりコード
化された酵素の、プリンヌクレオチド合成のための基質
としてキサンチンを使用する能力に基づいており、類似
の内在酵素は選択できない。イノシンモノホスフェート
のキサンチンモノホスフェートへの転換を阻止する、キ
サンチン及びマイコフェノール酸を含む培地中で、gpt
遺伝子を発現する細胞のみが生き残ることができる。ne
oの生産物は抗生物質G418及びそのクラスの他の抗生物
質により引き起こされる真核細胞中でのタンパク質合成
の抑制を阻止する。２つの選択方法を同時に又は順次に
使用して、真核細胞中に２つの異なるDNAベクター上に
導入された免疫グロブリン鎖遺伝子の発現について選択
することができる。
好ましい受容細胞系はミエローマ細胞である。ミエロ
ーマ細胞は、トランスフェクションされたIg遺伝子によ
りコード化された免疫グロブリンを、合成し、組立てそ
して分泌することができる。更に、それらは免疫グロブ
リンのグリコシル化の機構を有する。特に好ましい受容
細胞はIg非生産性ミエローマ細胞Sp2/0である。この細
胞は、トランスフェクションされた免疫グロブリン遺伝
子によりコード化された免疫グロブリンのみを生産す
る。ミエローマ細胞は培養物中で又はマウスの腹膜内で
増殖することができ、そこで分泌された免疫グロブリン
を腹水から得ることができる。Ｂリンパ球又はハイブリ
ドーマ細胞の如き他のリンパ球は、適当な受容細胞とし
て働くことができる。
ーマ細胞は、トランスフェクションされたIg遺伝子によ
りコード化された免疫グロブリンを、合成し、組立てそ
して分泌することができる。更に、それらは免疫グロブ
リンのグリコシル化の機構を有する。特に好ましい受容
細胞はIg非生産性ミエローマ細胞Sp2/0である。この細
胞は、トランスフェクションされた免疫グロブリン遺伝
子によりコード化された免疫グロブリンのみを生産す
る。ミエローマ細胞は培養物中で又はマウスの腹膜内で
増殖することができ、そこで分泌された免疫グロブリン
を腹水から得ることができる。Ｂリンパ球又はハイブリ
ドーマ細胞の如き他のリンパ球は、適当な受容細胞とし
て働くことができる。
免疫グロブリンコード化遺伝子を含むベクターでリン
パ球をトランスフェクションするいくつかの方法があ
る。リンパ球にDNAを導入する好ましい方法は、エレク
トロポレーシヨンによる。この方法では、受容細胞は、
導入されるべきDNAの存在下に電気パルスにさらされ
る。例えば、ポッター等、PNAS 81:7161（1984）参
照。DNAを導入する他の方法は原形質体（protoplast）
融合による。この方法では、リゾチームを使用して、キ
メラIg遺伝子を含む組換えプラスミドを収容するバクテ
リアから細胞壁をはがす。得られる原形質体をポリエチ
レングリコールによりミエローマ細胞と融合させる。原
形質体融合の後、トランスフェクタントを選びそして単
離する。多くのタイプの細胞にDNAを導入するのに使用
することができる他の方法はリン酸カルシウム沈でんで
ある。
パ球をトランスフェクションするいくつかの方法があ
る。リンパ球にDNAを導入する好ましい方法は、エレク
トロポレーシヨンによる。この方法では、受容細胞は、
導入されるべきDNAの存在下に電気パルスにさらされ
る。例えば、ポッター等、PNAS 81:7161（1984）参
照。DNAを導入する他の方法は原形質体（protoplast）
融合による。この方法では、リゾチームを使用して、キ
メラIg遺伝子を含む組換えプラスミドを収容するバクテ
リアから細胞壁をはがす。得られる原形質体をポリエチ
レングリコールによりミエローマ細胞と融合させる。原
形質体融合の後、トランスフェクタントを選びそして単
離する。多くのタイプの細胞にDNAを導入するのに使用
することができる他の方法はリン酸カルシウム沈でんで
ある。
キメラ免疫グロブリン遺伝子は、バクテリア又は酵母
のような非リンパ球で発現させることができる。バクテ
リアで発現される場合には、免疫グロブリンＨ鎖及びＬ
鎖は封入体の一部となる。かくして、鎖は、単離され、
精製され、次いで機能化免疫グロブリン分子に組み立て
られなければならない。
のような非リンパ球で発現させることができる。バクテ
リアで発現される場合には、免疫グロブリンＨ鎖及びＬ
鎖は封入体の一部となる。かくして、鎖は、単離され、
精製され、次いで機能化免疫グロブリン分子に組み立て
られなければならない。
本発明のキメラ血小板特異的抗体は、抗血栓症治療剤
として有用である。キメラ抗体（又はその断片）を使用
して、血小板凝集及び血栓形成を抑制することができ
る。この抗体は、血栓形成又は再形成を防止すべきいか
なる情況においても使用することができる。例えば、こ
の抗体は、血管形成後の処理、肺塞栓症、深静脈血栓症
及び冠状バイパス手術における凝塊を防止するするのに
単独で使用することができる。この抗体は、組織プラス
ミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ又はストレプトキ
ナーゼのような血栓溶解剤と共に投与して、血栓溶解後
に起こりうる再閉塞を防止又は減少させそして凝塊溶解
を促進させることができる。抗体又は断片は、再閉塞を
生じうる血小板凝集を防止するのに十分な量で、血栓溶
解剤の投与の前、投与と共に又は投与の後に投与するこ
とができる。抗体は、無菌食塩水の如き製薬学的に許容
しうるビヒクル中で、非経口的に、好ましくは静脈内に
与えられる。抗体は、多数回投与するか又は制御された
放出機構（例えばポリマー又はパッチ投与系により）に
より与えることができる。
として有用である。キメラ抗体（又はその断片）を使用
して、血小板凝集及び血栓形成を抑制することができ
る。この抗体は、血栓形成又は再形成を防止すべきいか
なる情況においても使用することができる。例えば、こ
の抗体は、血管形成後の処理、肺塞栓症、深静脈血栓症
及び冠状バイパス手術における凝塊を防止するするのに
単独で使用することができる。この抗体は、組織プラス
ミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ又はストレプトキ
ナーゼのような血栓溶解剤と共に投与して、血栓溶解後
に起こりうる再閉塞を防止又は減少させそして凝塊溶解
を促進させることができる。抗体又は断片は、再閉塞を
生じうる血小板凝集を防止するのに十分な量で、血栓溶
解剤の投与の前、投与と共に又は投与の後に投与するこ
とができる。抗体は、無菌食塩水の如き製薬学的に許容
しうるビヒクル中で、非経口的に、好ましくは静脈内に
与えられる。抗体は、多数回投与するか又は制御された
放出機構（例えばポリマー又はパッチ投与系により）に
より与えることができる。
抗血小板抗体による繰り返し治療中に、薬剤誘発の血
小板血症が起こることがあり、これは、身体が、抗体被
覆血小板を、それらに対して抗体を生じる外来タンパク
質として認識し、次いでそれらを普通よりは迅速に除去
する結果であるかも知れない。キメラ抗血小板（例えば
gp II b/III a）抗体の使用は、この問題を回避するこ
とができる。キメラ抗体のネズミ成分の大部分は血小板
（例えばgp II b/III a受容体）に結合され、かくし
て、キメラ抗体を、同じエピトープ指向性ヒト抗体から
機能的に識別可能とする免疫系に受け入れられず、故に
非免疫原性であると予想される。
小板血症が起こることがあり、これは、身体が、抗体被
覆血小板を、それらに対して抗体を生じる外来タンパク
質として認識し、次いでそれらを普通よりは迅速に除去
する結果であるかも知れない。キメラ抗血小板（例えば
gp II b/III a）抗体の使用は、この問題を回避するこ
とができる。キメラ抗体のネズミ成分の大部分は血小板
（例えばgp II b/III a受容体）に結合され、かくし
て、キメラ抗体を、同じエピトープ指向性ヒト抗体から
機能的に識別可能とする免疫系に受け入れられず、故に
非免疫原性であると予想される。
本発明の血小板特異的キメラ免疫原性グロブリンは、
血栓像形成にも有用である。この目的で、抗体断片が一
般に好ましい。上記のように、キメラＨ鎖遺伝子は、ト
ランケーテッド形態でデザインされて、免疫原性シンチ
グラフィーの像形成のためのキメラ免疫原性グロブリン
断片（例えばFab、Fab′又はＦ（ab′）２）を生成する
ことができる。これらの分子は、直接又はDTPAの如きカ
ップリングしたキレート化剤を介して、131ヨウ素、125
ヨウ素、99mテクネチウム又は111インジウムのような放
射性同位元素により標識して、放射免疫原性シンチグラ
フィー剤を生成することができる。別法として、放射金
属結合（キレート化）ドメインを、キレート化抗体部位
中に工学的につくって標識部位を得ることができる。か
くして、キレート化免疫原性グロブリンは、非ヒト血小
板特異的可変領域、ヒト不変領域（好ましくはトランケ
ーションされた）及びメタロチオニンの如き金属結合タ
ンパク質由来の金属結合ドメインを有するタンパク質と
してデザインすることができる。
血栓像形成にも有用である。この目的で、抗体断片が一
般に好ましい。上記のように、キメラＨ鎖遺伝子は、ト
ランケーテッド形態でデザインされて、免疫原性シンチ
グラフィーの像形成のためのキメラ免疫原性グロブリン
断片（例えばFab、Fab′又はＦ（ab′）２）を生成する
ことができる。これらの分子は、直接又はDTPAの如きカ
ップリングしたキレート化剤を介して、131ヨウ素、125
ヨウ素、99mテクネチウム又は111インジウムのような放
射性同位元素により標識して、放射免疫原性シンチグラ
フィー剤を生成することができる。別法として、放射金
属結合（キレート化）ドメインを、キレート化抗体部位
中に工学的につくって標識部位を得ることができる。か
くして、キレート化免疫原性グロブリンは、非ヒト血小
板特異的可変領域、ヒト不変領域（好ましくはトランケ
ーションされた）及びメタロチオニンの如き金属結合タ
ンパク質由来の金属結合ドメインを有するタンパク質と
してデザインすることができる。
血小板特異的キレート化免疫原性グロブリンは、血栓
を有する疑いのある患者に投与される。標識された免疫
原性グロブリンを血栓部位に局在させるのに十分な時間
の後、標識により発生した信号をγカメラの如きフォト
スキャン装置により検出される。検出された信号は、次
いで血栓の像に転換される。この像は、生体内で血栓を
突き止めそして適当な治療方法を案出することととを可
能とする。
を有する疑いのある患者に投与される。標識された免疫
原性グロブリンを血栓部位に局在させるのに十分な時間
の後、標識により発生した信号をγカメラの如きフォト
スキャン装置により検出される。検出された信号は、次
いで血栓の像に転換される。この像は、生体内で血栓を
突き止めそして適当な治療方法を案出することととを可
能とする。
本発明を、更に下記の実施例により説明する。特記し
ない限り、すべての部及び百分率は重量によるものであ
り、度は摂氏である。
ない限り、すべての部及び百分率は重量によるものであ
り、度は摂氏である。
説明 実施例１ キメラ血小板特異的IgG4の生産 Ａ・一般的方法 7E3ハイブリドーマからのＨ鎖及びＬ鎖遺伝子のため
の可変領域をクローニングする方法は、機能的に配列さ
れた（そして発現された）Ig遺伝子のための可変領域と
対応するＪ（連結）領域とのゲノムにおける連結に基づ
いた。Ｊ領域DNAプローブを使用してゲノムライブラリ
ーをスクリーニングして、Ｊ領域に連結されたDNAを単
離することができる。生殖系列配置（germline configu
ration）（再配列されていない）中のDNAも又Ｊプロー
ブにハイブリダイゼーションするが、可変領域配列には
連結されず、そして単離されたクローンの制限酵素分析
により同定することができる。
の可変領域をクローニングする方法は、機能的に配列さ
れた（そして発現された）Ig遺伝子のための可変領域と
対応するＪ（連結）領域とのゲノムにおける連結に基づ
いた。Ｊ領域DNAプローブを使用してゲノムライブラリ
ーをスクリーニングして、Ｊ領域に連結されたDNAを単
離することができる。生殖系列配置（germline configu
ration）（再配列されていない）中のDNAも又Ｊプロー
ブにハイブリダイゼーションするが、可変領域配列には
連結されず、そして単離されたクローンの制限酵素分析
により同定することができる。
故に、このクローニング方法は、JH及びJKプローブを
使用して再配列されたＨ鎖及びＬ鎖遺伝子から可変領域
を単離することであった。これらのクローンを、それら
の配列が7E3ハイブリドーマ中で発現されたかどうかを
決定するためにノザーン分析により試験した。発現され
た配列を含んだこれらのクローンは、ヒト不変領域を含
む発現ベクターに入れそしてマウスミエローマ細胞にト
ランスフェクションして、抗体が生産されたかどうかを
決定した。次いで生産性細胞からの抗体を7E3ネズミ抗
体と比較して、結合特異性及び機能性について試験し
た。
使用して再配列されたＨ鎖及びＬ鎖遺伝子から可変領域
を単離することであった。これらのクローンを、それら
の配列が7E3ハイブリドーマ中で発現されたかどうかを
決定するためにノザーン分析により試験した。発現され
た配列を含んだこれらのクローンは、ヒト不変領域を含
む発現ベクターに入れそしてマウスミエローマ細胞にト
ランスフェクションして、抗体が生産されたかどうかを
決定した。次いで生産性細胞からの抗体を7E3ネズミ抗
体と比較して、結合特異性及び機能性について試験し
た。
Ｂ・材料及び方法 Ｈ鎖ゲノムライブラリー構築 7E3ハイブリドーマからＨ鎖可変領域遺伝子を単離す
るために、ファージλベクターgt10を使用してサイズ選
択ゲノムライブラリーを構築した。JHプローブを使用す
るEcoR I消化7E3DNAのサザーン分析は、再配列されたＨ
鎖位置に相当する単一3.5kbバンドを示した。この断片
は、7E3H鎖可変領域遺伝子を含んでいるようであった。
高分子量DNAを7E3ハイブリドーマ細胞から単離し、そし
て制限エンドヌクレアーゼEcoR Iで完全に消化した。次
いでDNAを0.7％アガロースゲルで分別し、３−4kbのサ
イズ範囲のDNAをゲルから直接単離した。フェノール／
クロロホルム抽出及びセファデックスＧ−50ゲル過の
後、３−4kb断片をλGT10アーム（プロメガ・バイオテ
ック・インコーポレーテッド）と連結しそしてプロメガ
・バイオテックからのパッケージェネを使用して生体外
でファージ粒子中にパッケージした。このライブラリー
を、32P標識JHプローブを使用して約30,000プラーク/15
0mmペトリ皿の密度で直接スクリーニングした。プラー
クハイブリダイゼーシヨンは、５×SSC、50％ホルムア
ミド、２×デンハートの試薬、200μg/ml変性サケ精子D
NA中で42℃で18−20時間行った。最終洗浄は、0.5×SS
C、0.1％SDS中で65℃で行った。正のクローンをオート
ラジオグラフィーの後同定した。
るために、ファージλベクターgt10を使用してサイズ選
択ゲノムライブラリーを構築した。JHプローブを使用す
るEcoR I消化7E3DNAのサザーン分析は、再配列されたＨ
鎖位置に相当する単一3.5kbバンドを示した。この断片
は、7E3H鎖可変領域遺伝子を含んでいるようであった。
高分子量DNAを7E3ハイブリドーマ細胞から単離し、そし
て制限エンドヌクレアーゼEcoR Iで完全に消化した。次
いでDNAを0.7％アガロースゲルで分別し、３−4kbのサ
イズ範囲のDNAをゲルから直接単離した。フェノール／
クロロホルム抽出及びセファデックスＧ−50ゲル過の
後、３−4kb断片をλGT10アーム（プロメガ・バイオテ
ック・インコーポレーテッド）と連結しそしてプロメガ
・バイオテックからのパッケージェネを使用して生体外
でファージ粒子中にパッケージした。このライブラリー
を、32P標識JHプローブを使用して約30,000プラーク/15
0mmペトリ皿の密度で直接スクリーニングした。プラー
クハイブリダイゼーシヨンは、５×SSC、50％ホルムア
ミド、２×デンハートの試薬、200μg/ml変性サケ精子D
NA中で42℃で18−20時間行った。最終洗浄は、0.5×SS
C、0.1％SDS中で65℃で行った。正のクローンをオート
ラジオグラフィーの後同定した。
Ｌ鎖ゲノムライブラリー構築 7E3L鎖の可変領域遺伝子を単離するために、ゲノムラ
イブラリーをλベクターEMBL−３中に構築した。高分子
量DNAを制限エンドヌクレアーゼSau3Aで部分的に消化し
そして10−40％スクロース密度勾配でサイズ分別した。
18−23kbのDNA断片をEMBL−３アームと連結しそしてパ
ッケージェネを使用して生体外でファージ粒子中にパッ
ケージした。このライブラリーを、Ｊκプローブを使用
して30,000プラーク/150mmプレートの密度でスクリーニ
ングした。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件はＨ鎖
ライブラリーで使用したのと同じであった。
イブラリーをλベクターEMBL−３中に構築した。高分子
量DNAを制限エンドヌクレアーゼSau3Aで部分的に消化し
そして10−40％スクロース密度勾配でサイズ分別した。
18−23kbのDNA断片をEMBL−３アームと連結しそしてパ
ッケージェネを使用して生体外でファージ粒子中にパッ
ケージした。このライブラリーを、Ｊκプローブを使用
して30,000プラーク/150mmプレートの密度でスクリーニ
ングした。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件はＨ鎖
ライブラリーで使用したのと同じであった。
DNAプローブ マウスＨ鎖JHプローブは、J3及びJ4セグメントの両方
を含む2kbのBamH I/EcoR I断片である。マウスＬ鎖Ｊκ
プローブは、すべての５つのＪκセグメントを含む2.7k
bのHind III断片である。32P標識プローブは、アマーシ
ャム社から得られるキットを使用してニックトランスレ
ーションにより製造した。遊離ヌクレオチドはセファデ
ックスＧ−50カラムを通して遠心分離により除去され
た。プローブの特異的活性は約109cpm/μｇであった。
を含む2kbのBamH I/EcoR I断片である。マウスＬ鎖Ｊκ
プローブは、すべての５つのＪκセグメントを含む2.7k
bのHind III断片である。32P標識プローブは、アマーシ
ャム社から得られるキットを使用してニックトランスレ
ーションにより製造した。遊離ヌクレオチドはセファデ
ックスＧ−50カラムを通して遠心分離により除去され
た。プローブの特異的活性は約109cpm/μｇであった。
ノザーン分析 15μｇの全細胞DNAを、１％アガロース／ホルムアル
デヒドゲル（マニアチス等、モレキュラー・クローニン
グ）での電気泳動に付しそしてニトロセルロースに移し
た。ブロットを、50％ホルムアミド、２×デンハートの
試薬、５×SSC及び200μg/ml変性サケ精子DNA中でニッ
クトランスレーシヨンされたDNAプローブと、42℃で10
時間ハイブリダイゼーションした。最終洗浄条件は、65
℃で0.5×SSC0.1％SDSであった。
デヒドゲル（マニアチス等、モレキュラー・クローニン
グ）での電気泳動に付しそしてニトロセルロースに移し
た。ブロットを、50％ホルムアミド、２×デンハートの
試薬、５×SSC及び200μg/ml変性サケ精子DNA中でニッ
クトランスレーシヨンされたDNAプローブと、42℃で10
時間ハイブリダイゼーションした。最終洗浄条件は、65
℃で0.5×SSC0.1％SDSであった。
エレクトロポレーションを使用するDNAトランスフェク
ション トランスフェクションされるべきプラスミドDNAを、
エチジウムブロミド／塩化セシウム勾配中で平衡まで２
回遠心分離することにより精製した。10−50μｇのプラ
スミドDNAを氷上のPBS中の８×106SP2/0細胞に加え、そ
して混合物をバイオラドのエレクトロポレーション装置
に入れた。エレクトロポレーションは、200ボルトであ
りそして細胞を96ウエルのマイクロタイタープレートに
付着させた（plate out）。適当な薬剤選択を48時間後
に適用しそして薬剤耐性コロニーを１−２週間後に同定
した。
ション トランスフェクションされるべきプラスミドDNAを、
エチジウムブロミド／塩化セシウム勾配中で平衡まで２
回遠心分離することにより精製した。10−50μｇのプラ
スミドDNAを氷上のPBS中の８×106SP2/0細胞に加え、そ
して混合物をバイオラドのエレクトロポレーション装置
に入れた。エレクトロポレーションは、200ボルトであ
りそして細胞を96ウエルのマイクロタイタープレートに
付着させた（plate out）。適当な薬剤選択を48時間後
に適用しそして薬剤耐性コロニーを１−２週間後に同定
した。
抗体生産の定量 精製したIgGで得られた標準曲線を使用して、粒子濃
度蛍光イムノアッセイ（ジョリー・エム・イー等、ジャ
ーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ、67:21）に
より、組織培養上澄液のIgGタンパク質含有率を分析し
た。ヒト不変領域を有するキメラ7E3抗体の濃度を、ヤ
ギ抗ヒトIgGFc抗体被覆ポリスチレンビーズ及びフルオ
レセイン結合ヤギ抗ヒトIgGFc抗体を使用して決定し
た。このアッセイは、自動化装置（パンデックス・ラボ
ラトリーズ社）で行った。
度蛍光イムノアッセイ（ジョリー・エム・イー等、ジャ
ーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ、67:21）に
より、組織培養上澄液のIgGタンパク質含有率を分析し
た。ヒト不変領域を有するキメラ7E3抗体の濃度を、ヤ
ギ抗ヒトIgGFc抗体被覆ポリスチレンビーズ及びフルオ
レセイン結合ヤギ抗ヒトIgGFc抗体を使用して決定し
た。このアッセイは、自動化装置（パンデックス・ラボ
ラトリーズ社）で行った。
血小板特異的キメラIgG4抗体の精製 ダイアフロYM100限外過膜（アミコン）により組織
培養上澄液を濃縮し、そしてプロテインＡ−セファロー
スカラムに加えた。pH6.5からpH3.5までのクエン酸ナト
リウムpH勾配によりキメラ抗体をプロテインＡカラムか
ら溶離した。精製した抗体をダイアフロYM100限外過
膜を使用して濃縮した。抗体濃度は280nmでの吸光度を
決定することにより測定した。
培養上澄液を濃縮し、そしてプロテインＡ−セファロー
スカラムに加えた。pH6.5からpH3.5までのクエン酸ナト
リウムpH勾配によりキメラ抗体をプロテインＡカラムか
ら溶離した。精製した抗体をダイアフロYM100限外過
膜を使用して濃縮した。抗体濃度は280nmでの吸光度を
決定することにより測定した。
結合抑制アッセイ 精製した抗体（ネズミ7E3又はキメラ7E3）を使用し
て、ヒト血小板に対する結合について放射ヨウ素化7E3
抗体と競合させた。血小板に富んだ血漿（PRP）を、187
5rpmで3.5分クエン酸塩処理全ヒト血液を遠心分離する
ことにより製造した。125I標識7E3抗体（150,000cpm）
を精製した試験抗体の適当な希釈物に加えそして反応を
150μl PRPの添加により開始した。室温でインキユベー
ションを１−２時間行いそして結合した抗体を有する血
小板を、遊離抗体から、0.4mlマイクロヒュージ管中で1
2,000gで４分間30％スクロースを通して遠心分離するこ
とにより分離した。血小板／抗体ペレットを含む管先端
を切り取り、そしてγ計数管で計数した。ヨウ素化7E3
とキメラ7E3の血小板に対する結合の競争を、ヨウ素化7
E3と非標識7E3IgGの競争に対して比較した。
て、ヒト血小板に対する結合について放射ヨウ素化7E3
抗体と競合させた。血小板に富んだ血漿（PRP）を、187
5rpmで3.5分クエン酸塩処理全ヒト血液を遠心分離する
ことにより製造した。125I標識7E3抗体（150,000cpm）
を精製した試験抗体の適当な希釈物に加えそして反応を
150μl PRPの添加により開始した。室温でインキユベー
ションを１−２時間行いそして結合した抗体を有する血
小板を、遊離抗体から、0.4mlマイクロヒュージ管中で1
2,000gで４分間30％スクロースを通して遠心分離するこ
とにより分離した。血小板／抗体ペレットを含む管先端
を切り取り、そしてγ計数管で計数した。ヨウ素化7E3
とキメラ7E3の血小板に対する結合の競争を、ヨウ素化7
E3と非標識7E3IgGの競争に対して比較した。
血小板凝集の抑制 精製した7E3又はキメラ7E3抗体をクエン酸塩処理全ヒ
ト血液に加え、そして37℃で10分間インキユベーション
した。血小板凝集の速度を、全血液凝集検出計（クロノ
ログ社）を使用してコラーゲン又はADPによる活性化の
後測定した。
ト血液に加え、そして37℃で10分間インキユベーション
した。血小板凝集の速度を、全血液凝集検出計（クロノ
ログ社）を使用してコラーゲン又はADPによる活性化の
後測定した。
c.結果 血小板特異的可変遺伝子領域のクローニング それぞれ、JH及びＪκプローブを使用して約100万の
プラークをスクリーニングした後Ｈ鎖及びＬ鎖ライブラ
リーからいくつかの正のクローンを単離した。少なくと
も３ラウンドのプラーク精製の後、各正のクローンにつ
いてバクテリオファージDNAを単離し、EcoR I（Ｈ鎖ク
ローン）又はHind III（Ｌ鎖クローン）で消化しそして
１％アガロースゲルで分別した。DNAをニトロセルロー
スに移しそしてブロットをJH（Ｈ鎖）又はＪκ 32P標識D
NAプローブとハイブリダイゼーションさせた。JHプロー
ブにハイブリダイゼーションした3.5kb EcoR I DNA断片
を含んでいる２つのクローンが得られた。3.0及び6.0kb
の２つのサイズクラスのHind III断片がＪκプローブに
より同定された。
プラークをスクリーニングした後Ｈ鎖及びＬ鎖ライブラ
リーからいくつかの正のクローンを単離した。少なくと
も３ラウンドのプラーク精製の後、各正のクローンにつ
いてバクテリオファージDNAを単離し、EcoR I（Ｈ鎖ク
ローン）又はHind III（Ｌ鎖クローン）で消化しそして
１％アガロースゲルで分別した。DNAをニトロセルロー
スに移しそしてブロットをJH（Ｈ鎖）又はＪκ 32P標識D
NAプローブとハイブリダイゼーションさせた。JHプロー
ブにハイブリダイゼーションした3.5kb EcoR I DNA断片
を含んでいる２つのクローンが得られた。3.0及び6.0kb
の２つのサイズクラスのHind III断片がＪκプローブに
より同定された。
7E3ハイブリドーマからの真性のＨ及びＬ鎖可変領域
に対応するクローニングされたDNAは、ハイブリドーマ
から単離したmRNAにハイブリダイゼーションするはずで
ある。Ｈ又はＬ鎖位置における非機能的DNA再配列は発
現されないはずである。第１図は、3.5kb EcoR I推定Ｈ
鎖断片及び6.0kb Hind III推定Ｌ鎖断片は各々7E3ハイ
ブリドーマからの適当なサイズのmRNAにハイブリダイゼ
ーションすることを示すノザーン分析を示す。サブクロ
ーニングされた断片をニックトランスレーシヨンにより
32Pで標識し、そしてSP2/07（7E3ハイブリドーマの融合
相手）又は7E3由来の全RNAを含むノザーンブロットにハ
イブリダイゼーションさせた。3.5kb EcoR I H鎖断片は
7E3 RNAの2kb mRNAとハイブリダイゼーションするが、S
P2/0RNAにおいてはしない。同様に、6.0kb L鎖Hind III
断片は、7E3 RNA中の1250bp mRNAとハイブリダイゼーシ
ョンするが、SP2/0RNAにおいてはしない。これらは、そ
れぞれＨ鎖及びＬ鎖mRNAの正確なサイズである。クロー
ニングされたDNA断片は7E3ハイブリドーマにおいて発現
された配列を含んでいるので、これらのデータは、これ
らが7E3ハイブリドーマからの正確な可変領域配列であ
ることを示唆する。しかしながら、最終機能試験は、こ
れらの配列は、適当な不変領域配列と組み合わせられる
とき、ネズミ7E3抗体の特異性及びアフィニテイと同様
な特異性及びアフィニテイを有する抗体の合成を指向す
ることができるという証明である。
に対応するクローニングされたDNAは、ハイブリドーマ
から単離したmRNAにハイブリダイゼーションするはずで
ある。Ｈ又はＬ鎖位置における非機能的DNA再配列は発
現されないはずである。第１図は、3.5kb EcoR I推定Ｈ
鎖断片及び6.0kb Hind III推定Ｌ鎖断片は各々7E3ハイ
ブリドーマからの適当なサイズのmRNAにハイブリダイゼ
ーションすることを示すノザーン分析を示す。サブクロ
ーニングされた断片をニックトランスレーシヨンにより
32Pで標識し、そしてSP2/07（7E3ハイブリドーマの融合
相手）又は7E3由来の全RNAを含むノザーンブロットにハ
イブリダイゼーションさせた。3.5kb EcoR I H鎖断片は
7E3 RNAの2kb mRNAとハイブリダイゼーションするが、S
P2/0RNAにおいてはしない。同様に、6.0kb L鎖Hind III
断片は、7E3 RNA中の1250bp mRNAとハイブリダイゼーシ
ョンするが、SP2/0RNAにおいてはしない。これらは、そ
れぞれＨ鎖及びＬ鎖mRNAの正確なサイズである。クロー
ニングされたDNA断片は7E3ハイブリドーマにおいて発現
された配列を含んでいるので、これらのデータは、これ
らが7E3ハイブリドーマからの正確な可変領域配列であ
ることを示唆する。しかしながら、最終機能試験は、こ
れらの配列は、適当な不変領域配列と組み合わせられる
とき、ネズミ7E3抗体の特異性及びアフィニテイと同様
な特異性及びアフィニテイを有する抗体の合成を指向す
ることができるという証明である。
ベクター及び発現系 7E3ハイブリドーマからクローニングされた推定Ｌ及
びＨ鎖Ｖ遺伝子を、前記した（サン・エル等、PNAS 8
4、214−218頁（1987））発現ベクターにおいてヒトκ
及びG4不変領域遺伝子に連結させた。pSV184△Hneo17−
1AVκhCκの17−1AVκHind III断片を、7E3からの推定
Ｌ鎖可変領域遺伝子に相当する6.0kb Hind III断片で置
き換えた。同様に、pSV2△Hgpt17−1AVH−hCG4の17−1A
VHEcoR I断片を、7E3からの推定Ｈ鎖Ｖ領域遺伝子に相
当する3.5kb EcoR I断片で置き換えた。p7E3VκhCH κ及
びp7E3VHhCG4と名付けられた得られるプラスミドの構造
を第２図に示す。
びＨ鎖Ｖ遺伝子を、前記した（サン・エル等、PNAS 8
4、214−218頁（1987））発現ベクターにおいてヒトκ
及びG4不変領域遺伝子に連結させた。pSV184△Hneo17−
1AVκhCκの17−1AVκHind III断片を、7E3からの推定
Ｌ鎖可変領域遺伝子に相当する6.0kb Hind III断片で置
き換えた。同様に、pSV2△Hgpt17−1AVH−hCG4の17−1A
VHEcoR I断片を、7E3からの推定Ｈ鎖Ｖ領域遺伝子に相
当する3.5kb EcoR I断片で置き換えた。p7E3VκhCH κ及
びp7E3VHhCG4と名付けられた得られるプラスミドの構造
を第２図に示す。
キメラＨ及びＬ鎖遺伝子を発現させるために、２つの
プラスミドを、非生産性マウスミエローマ細胞系SP2/0
にコトランスフェクションした。Ｌ鎖プラスミドは、G4
18に対する耐性を与えそしてＨ鎖プラスミドはマイコフ
ェノール酸に対する耐性を与え、かくして、各プラスミ
ドからの遺伝子を有しそして発現するクローンを得るの
に２重選択を使用することを可能とする。G418及びマイ
コフェノール酸にたいして耐性のコロニーを安定な細胞
系に拡大し、両薬剤の存在下に保持した。これらの細胞
系からの組織培養上澄液を、ヤギ抗ヒトIgGFc抗体及び
フルオレセインで標識された同じ抗体で被覆されたポリ
スチレンビーズによる粒子濃度蛍光イムノアッセイを使
用して抗体について試験した。チェックした最初の10系
統から、約２μg/mlを生産した１つ（ｃ−7E3F6と名付
ける）を更なる検討のために選んだ。
プラスミドを、非生産性マウスミエローマ細胞系SP2/0
にコトランスフェクションした。Ｌ鎖プラスミドは、G4
18に対する耐性を与えそしてＨ鎖プラスミドはマイコフ
ェノール酸に対する耐性を与え、かくして、各プラスミ
ドからの遺伝子を有しそして発現するクローンを得るの
に２重選択を使用することを可能とする。G418及びマイ
コフェノール酸にたいして耐性のコロニーを安定な細胞
系に拡大し、両薬剤の存在下に保持した。これらの細胞
系からの組織培養上澄液を、ヤギ抗ヒトIgGFc抗体及び
フルオレセインで標識された同じ抗体で被覆されたポリ
スチレンビーズによる粒子濃度蛍光イムノアッセイを使
用して抗体について試験した。チェックした最初の10系
統から、約２μg/mlを生産した１つ（ｃ−7E3F6と名付
ける）を更なる検討のために選んだ。
血小板結合活性アッセイ プロテインＡ−セファロースカラムを使用してｃ−7E
3F6抗体の精製の後、抗体を濃縮し、そして血小板結合
活性アッセイにおいてネズミ7E3IgGと比較した。第３図
は、ネズミ7E3及びｃ−7E3F6（推定キメラ抗体）が血小
板結合について同じ程度に放射標識7E3と競争すること
を示す。結合曲線は重なることができ、これはネズミ及
びキメラ7E3の結合特性が同じであることを示してい
る。
3F6抗体の精製の後、抗体を濃縮し、そして血小板結合
活性アッセイにおいてネズミ7E3IgGと比較した。第３図
は、ネズミ7E3及びｃ−7E3F6（推定キメラ抗体）が血小
板結合について同じ程度に放射標識7E3と競争すること
を示す。結合曲線は重なることができ、これはネズミ及
びキメラ7E3の結合特性が同じであることを示してい
る。
ｃ−7E3F6による血小板凝集の抑制 精製したｃ−7E3F6を、試験抗体のヒト血小板の凝集
を抑制する能力を測定する機能アッセイにおいてネズミ
7E3と比較した。第４図に示された結果は、両抗体は同
じ抗体濃度で同じ程度にコラーゲン誘発血小板凝集を抑
制することを示す。ｃ−7E3F6は、同様な程度にADP誘発
血小板凝集も抑制する。
を抑制する能力を測定する機能アッセイにおいてネズミ
7E3と比較した。第４図に示された結果は、両抗体は同
じ抗体濃度で同じ程度にコラーゲン誘発血小板凝集を抑
制することを示す。ｃ−7E3F6は、同様な程度にADP誘発
血小板凝集も抑制する。
血小板結合アッセイ及び血小板凝集の抑制アッセイの
結果は、1.）正確な可変領域遺伝子が実際に7E3ハイブ
リドーマからクローニングされること、２）マウス不変
領域をヒト不変領域で替えることは、これらのアッセイ
により測定して7E3可変領域の結合又は機能的特性に対
して影響しないことを示す。
結果は、1.）正確な可変領域遺伝子が実際に7E3ハイブ
リドーマからクローニングされること、２）マウス不変
領域をヒト不変領域で替えることは、これらのアッセイ
により測定して7E3可変領域の結合又は機能的特性に対
して影響しないことを示す。
フィブロゲン被覆ビーズアッセイ キメラｃ−7E3F6抗体は、抗体の血小板及びフィブリ
ノーゲン被覆ビーズ間の凝集を抑制する能力を測定する
定性的、機能アッセイにおいて正であることが見出され
た。カラー・ビー等、（1983）ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・インベスティゲーション（J.Clin.Invest）、7
3:325−338。
ノーゲン被覆ビーズ間の凝集を抑制する能力を測定する
定性的、機能アッセイにおいて正であることが見出され
た。カラー・ビー等、（1983）ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・インベスティゲーション（J.Clin.Invest）、7
3:325−338。
実施例２・キメラIgG1及びIgG3の製造 ネズミ7E3抗体からのＨ鎖の可変領域をコード化して
いるDNAセグメントを、17−1A可変領域断片を7E3可変領
域断片で置き換えることにより、発現ベクターpSV2△Hg
pt17−1AVH−hCG1及びpSV2△Hgpt17−1AVH−hCG3（サン
等、PNAS 84、214−218頁、1987）上に存在するヒト１
及び３不変領域に連結した。得られるキメラＨ鎖遺伝子
を、キメラＬ鎖遺伝子と共にSP2/0細胞中にコトランス
フェクションして、γ１、Ｋ、及びγ３、Ｋ抗体を分泌
する安定な細胞系を発生させた。
いるDNAセグメントを、17−1A可変領域断片を7E3可変領
域断片で置き換えることにより、発現ベクターpSV2△Hg
pt17−1AVH−hCG1及びpSV2△Hgpt17−1AVH−hCG3（サン
等、PNAS 84、214−218頁、1987）上に存在するヒト１
及び３不変領域に連結した。得られるキメラＨ鎖遺伝子
を、キメラＬ鎖遺伝子と共にSP2/0細胞中にコトランス
フェクションして、γ１、Ｋ、及びγ３、Ｋ抗体を分泌
する安定な細胞系を発生させた。
均等物 当業者は、本明細書に記載の本発明の態様に対する均
等物を、ルーチンな実験をするだけで認識し又は確認す
るであろう。このような均等物は下記の請求の範囲に包
含されることを意図する。
等物を、ルーチンな実験をするだけで認識し又は確認す
るであろう。このような均等物は下記の請求の範囲に包
含されることを意図する。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 Ａ６１Ｐ 7/02 51/00 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｋ Ａ６１Ｐ 7/02 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 33/577 Ａ６１Ｋ 49/02 Ａ (72)発明者 コラー，バリイ・エス アメリカ合衆国ニユーヨーク州11746 デイクスヒルズ・ダラムドライブ２ (72)発明者 ナイト，デビツト・エム アメリカ合衆国ペンシルベニア州19301 パオリ・フエザントランドライブ208 (56)参考文献 特開 昭62−29995（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−30728（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−47500（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ 84（1987）ｐ．214−218 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (25)
- 【請求項１】糖タンパク質II b/III aに対する特異性を
有する7E3モノクローナル抗体の可変領域と、ヒト起源
の不変領域が結合しており、そして糖タンパク質II b/I
II aに対する特異性を有するキメラ免疫グロブリン又は
そのキメラ免疫グロブリン断片。 - 【請求項２】請求項１記載のキメラ免疫グロブリン断
片。 - 【請求項３】断片がFab、Fab′又はＦ（ab′）２断片で
ある請求項２記載のキメラ免疫グロブリン断片。 - 【請求項４】キメラ免疫グロブリン断片がFab断片であ
る請求項３記載のキメラ免疫グロブリン断片。 - 【請求項５】免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片が
IgG1クラスのものである請求項１記載のキメラ免疫グロ
ブリン又はキメラ免疫グロブリン断片。 - 【請求項６】ａ） ヒト重鎖不変領域の少なくとも一部
に連結された糖タンパク質II b/III aに対して特異性を
有する7E3モノクローナル抗体の重鎖の可変領域を含ん
で成る少なくとも１つのキメラ重鎖を含んで成り、 該重鎖は、 ｂ） ヒト軽鎖不変領域の少なくとも一部に連結された
糖タンパク質II b/III aに対する特異性を有する7E3モ
ノクローナル抗体の軽鎖の可変領域を含んで成る少なく
とも１つのキメラ軽鎖と会合している、 糖タンパク質II b/III aに対する特異性を有するキメラ
免疫グロブリン又はキメラ免疫グロブリン断片。 - 【請求項７】請求項６記載のキメラ免疫グロブリン断
片。 - 【請求項８】断片がFab、Fab′又はＦ（ab′）２断片で
ある請求項７記載のキメラ免疫グロブリン断片。 - 【請求項９】キメラ免疫グロブリン断片がFab断片であ
る請求項８記載のキメラ免疫グロブリン断片。 - 【請求項１０】免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片
がIgG1クラスのものである請求項６記載のキメラ免疫グ
ロブリン又はキメラ免疫グロブリン断片。 - 【請求項１１】7E3モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖
可変領域とヒト軽鎖不変領域及びヒト重鎖不変領域の一
部とが結合しており、そして糖タンパク質II b/III aに
対する特異性を有するキメラ免疫グロブリンFab、Fab′
又はＦ（ab′）２断片。 - 【請求項１２】断片がIgG1クラスのものである請求項11
記載のキメラ免疫グロブリン断片。 - 【請求項１３】断片がFab断片である請求項11記載のキ
メラ免疫グロブリン断片。 - 【請求項１４】Fab断片がIgG1クラスのものである請求
項13記載のキメラ免疫グロブリン断片。 - 【請求項１５】放射標識されている請求項11記載のキメ
ラ免疫グロブリン断片。 - 【請求項１６】放射標識が99mTc又は111Inである請求項
15記載のキメラ免疫グロブリン断片。 - 【請求項１７】請求項１記載のキメラ免疫グロブリン又
はそのキメラ免疫グロブリン断片を生産するための遺伝
子であって、 ａ） 7E3モノクローナル抗体の免疫グロブリン軽鎖又
は重鎖可変領域をコードしている第１のDNA配列、及び ｂ） ヒト起源の免疫グロブリンの不変領域をコードし
ている第２のDNA配列、 を含んで成るキメラ免疫グロブリン軽鎖又は重鎖をコー
ドする融合遺伝子。 - 【請求項１８】請求項17記載の融合遺伝子を含んで成る
発現ベクター。 - 【請求項１９】請求項17記載の融合遺伝子を含んで成る
宿主細胞。 - 【請求項２０】請求項18記載の発現ベクターを含んで成
る宿主細胞。 - 【請求項２１】請求項１記載のキメラ免疫グロブリン又
はそのキメラ免疫グロブリン断片を生産するための細胞
であって、キメラ免疫グロブリン軽鎖をコードしている
融合遺伝子とキメラ免疫グロブリン重鎖をコードしてい
る融合遺伝子を含んで成り、該融合遺伝子の各々が ａ） 7E3モノクローナル抗体の免疫グロブリン軽鎖又
は重鎖可変領域をコードしている第１のDNA配列；及び ｂ） ヒト起源の免疫グロブリンの不変領域をコードし
ている第２のDNA配列 を含んで成る宿主細胞。 - 【請求項２２】請求項１記載のキメラ免疫グロブリン又
はそのキメラ免疫グロブリン断片を生産するための遺伝
子であって、 ａ） 7E3モノクローナル抗体の免疫グロブリン重鎖可
変領域をコードしている第１のDNA配列；及び ｂ） ヒト起源の免疫グロブリンの重鎖不変領域をコー
ドしている第２のDNA領域 を含んで成り、第1DNA配列及び第2DNA配列がFab、Fab′
又はＦ（ab′）２断片の重鎖をコードしているキメラ免
疫グロブリン重鎖断片をコードする融合遺伝子。 - 【請求項２３】請求項22記載の融合遺伝子を含んで成る
宿主細胞。 - 【請求項２４】請求項22記載の融合遺伝子を含んで成る
発現ベクター。 - 【請求項２５】請求項24記載の発現ベクターを含んで成
る宿主細胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US19572088A | 1988-05-18 | 1988-05-18 | |
| US195,720 | 1988-05-18 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10242601A Division JPH11180894A (ja) | 1988-05-18 | 1998-08-14 | 抗血栓治療又は予防のための薬剤 |
| JP11206314A Division JP2000060555A (ja) | 1988-05-18 | 1999-07-21 | 血小板特異的キメラ免疫グロブリン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04501503A JPH04501503A (ja) | 1992-03-19 |
| JP3115298B2 true JP3115298B2 (ja) | 2000-12-04 |
Family
ID=22722511
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP01506806A Expired - Fee Related JP3115298B2 (ja) | 1988-05-18 | 1989-05-16 | 血小板特異的キメラ免疫グロブリン |
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