JP3012216B2 - κ−カラゲーナーゼの製造方法 - Google Patents

κ−カラゲーナーゼの製造方法

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JP3012216B2
JP3012216B2 JP9199214A JP19921497A JP3012216B2 JP 3012216 B2 JP3012216 B2 JP 3012216B2 JP 9199214 A JP9199214 A JP 9199214A JP 19921497 A JP19921497 A JP 19921497A JP 3012216 B2 JP3012216 B2 JP 3012216B2
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01083—Kappa-carrageenase (3.2.1.83)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はκ−カラゲーナーゼ
（carraghenase) の微生物学的製造方法に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】κ−カラゲーナーゼは紅藻類(algues ro
uges) の壁を構成するサルフート化多糖類、κ−カラゲ
ーナン（carraghenanes)の加水分解酵素である。一般
に、κ−カラゲーナーゼは海洋細菌、例えばシュードモ
ナスカラゲーノボラ(Pseudomonas carrageenovora)によ
って生産される〔ウェイグル（WEIGLE J.)とヤーヘ(YAP
HE W) のCanadian Journal of Microbiology,12 巻、93
9-947 頁、1966年と、リーン(Mc LEAN M.W.)とウイリア
ムソン(WILLIAMSON F.B.) の Eur.J. Biochem. 93巻、
553-558頁、1979年) 。
【０００３】この酵素は細胞外にあり、特殊なβ-1, 4
結合をしているので、サルフート化オリゴ糖、特にネオ
カラビビオース-4−Ｏ−サルフェート(neocarrabiose-4
-O-sulfate)を得ることができる。これはκ−カラゲー
ナンの酸処理では製造できないものであい（サルフェー
ト基の損失）。
【０００４】オストガード (φSTGAARD K.) 達（Enzyme
Miocrob.Technol.,15巻、326-333頁、1993年) は培養
装置で細菌培養することでκ−カラゲーナーゼが製造で
きるということを示した。しかし、この方法で得られた
ものの酵素力はミリリットル当たりガラクトース単位が
約５（ガルU/ml) と低く、酵素を多量に必要とする場合
には醗酵回数を増やすしかない。また、バイオマスが再
生産可能であるとしても、酵素力が広範囲に変化する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、細菌が同
化可能な窒素含有塩基を用いて培養物のｐＨを調節する
ことによって、再生産可能な状態で、κ−カラゲーナー
ゼの生産性を実質的に向上させることができるというこ
とを発見した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は細菌が同化可能
な窒素を含む塩基を用いて培養物のｐＨを調節すること
を特徴とするシュードモナスカラゲーノボラ(Pseudemon
as carrageenovora)、アルテロモナス(Alteromonas) ま
たはキトファガ(Cytophaga) の存在下でκ−カラゲーナ
ンからκ−カラゲーナーゼを製造する微生物学的製法を
提供する。本発明方法では 20 ガルU/ml以上、有利には
40〜60ガルU/mlの酵素力を得ることができる。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明方法は一般に従来のバッチ
式培養装置を用いて実施することができる。この培養装
置には溶存酸素計、攪拌装置、温度およびｐＨ調節装置
が備えられている。培養装置の全容量は重要でなく、広
範囲に変えることができ、例えば２〜100 リットル、ま
たはそれ以上にすることができる。培養条件下で培養装
置に入れた培地に細菌の予備培養物を接種する。
【０００８】一般に細菌はシュードモナスカラゲーノボ
ラ(Pseudemonas carrageenovora)、アルテロモナス(Alt
eromonas) およびキトファガ(Cytophaga) からなる群の
中から選択される。シュードモナスカラゲーノボラ ATC
C 43555 またはNCMB 302を使用するのが好ましい。一般
に、細菌の予備培養物はW.Y 培地またはφSTGAARD K.達
（Enzyme Microb.Technol.,15 巻、326-333 頁、1993
年) に記載の新しい標準型培地に上記細菌を接種して得
られる。一般に、この予備培養は振盪フラスコ内で20〜
30℃、好ましくは24〜26℃の温度で、24時間以下、好ま
しくは10〜20時間実施する。600 nmで測定した予備培養
物の光学濃度は一般に 0.5〜2.5 、好ましくは１〜２の
間にある。一般に、培養装置での予備培養の接種量は１
〜10％、好ましくは４〜６％である。
【０００９】一般に、培養装置内の培地は W. Y 培地お
よび上記の新しい標準培地から選択され、新しい標準培
地を使用するのが好ましい。一般に、培地のｐＨは窒素
含有塩基を用いて７±１、好ましくは７±0.5 に維持す
る。一般に、培養物の温度は予備培養用で説明した上記
範囲内の温度にする。
【００１０】一般に、窒素含有塩基は窒素を含み、細菌
が同化できる塩基性化合物であり、例としてはアンモニ
ア水、脂肪族アミン、例えばメチルアミンおよびエチル
アミン、芳香族アミン、例えばピリジンおよびベンジル
アミン、水酸化アミン、例えばヒドロキシルアミンから
選択される。アンモニア水を用いるのが好ましい。培養
時間は25〜120 時間で変えることができる。その後、培
養物を遠心分離すると、上澄みは20ガルU/ml以上のκ−
カラゲーナーゼを含む。酵素は必要に応じてさらに精製
することができる。精製方法としては一般的な方法、例
えば透析、イオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモ
ニウム沈澱分離または限外濾過を用いることができる。
【００１１】
【実施例】以下、本発明の実施例を説明する。実施例で
は下記測定方法を用いた。培養物の光学濃度は 600 nm
（ＯＤ600 ）で測定した。培地のラクトース濃度（g/L)
は G.Iミラー(MILLER)（Anal.Chem.31巻、426 〜428
頁、1959年）に記載のジニトロサリチル酸法で測定し
た。κ−カラゲーナーゼ活性はラクトース濃度を求める
上記方法で測定した。結果は培養物ミリリットル当たり
のガラクトース単位（ガルU/ml) で表した。１ガラクト
ース単位は１分間に１ミクロモル減少する糖（ガラクト
ース当量）の遊離を触媒する酵素の量に相当する。
【００１２】実施例１ (a) 接種剤の製造方法 シュードモナスカラゲーノボラ ATCC 43555 を、下記組
成（g/l)のφSTGAARDの新しい標準培地を入れた振盪フ
ラスコ内で25℃で培養した： イースト抽出物 0.5 ラクトース 20 (NH 4 ) 2 SO4 13 MgSO4 ・ 7 H2 O 0.5 CaCl2 ・ 2 H2 O 0.2 KCl 0.6 NaCl 20 κ−カラゲーナン 1.5 Na2 HPO 4 ・ 2 H2 O 2.0 FeSO4 ・ 7 H2 O 0.001 24時間接種後、ＯＤ600 が約２の細菌培養物が得られ
た。
【００１３】(b) 培養装置での培養 溶存酸素計、攪拌装置、ｐＨ調節手段およびサーモスタ
ット付きジャケットを備えた 2.5リットル容の培養装置
に 1.5リットルの上記の新しい標準培地（培養装置内で
予め滅菌）と、75mlの (a)段階で得られた予備培養物と
を導入した。培養装置の温度は25℃に維持し、ｐＨは14
重量％のアンモニア溶液を用いて７±１に調節した。攪
拌は 650 rpmにした。結果は〔表１〕に示してある。
【００１４】
【表１】
【００１５】実施例２ 実施例１の条件下で操作したが、シュードモナスカラゲ
ーノボラ NCMB 302 を使用した。結果は〔表２〕に示し
てある。
【００１６】
【表２】
【００１７】実施例３ 実施例１の条件下で操作したが、ｐＨを 6N-水酸化ナト
リウム溶液を用いて調節した。結果は〔表３〕に示して
ある。
【００１８】
【表３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ルネ−マルク ウィルモ フランス国 31450 ポンペルツザ レ ジダンスカステルトロンペット ３ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 シュードモナスカラゲーノボラ (Pseude
    monas carrageenovora) 、アルテロモナス(Alteromona
    s) またはキトファガ(Cytophaga) の存在下でκ−カラ
    ゲーナーゼを微生物学的に製造する方法において、 アンモニア水を用いて培養物のｐＨを調節することを特
    徴とする方法 。
  2. 【請求項２】 シュードモナスカラゲーノボラ ATCC 43
    555 またはNCMB 302を使用する請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 得られたκ−カラゲーナーゼの酵素力が
    20ガルU/ml以上である請求項１または２に記載の方法。
JP9199214A 1996-07-09 1997-07-09 κ−カラゲーナーゼの製造方法 Expired - Lifetime JP3012216B2 (ja)

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FR9608530A FR2750998B1 (fr) 1996-07-09 1996-07-09 Procede de preparation de k-carraghenase
FR9608530 1996-07-09

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JPH1066567A JPH1066567A (ja) 1998-03-10
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JPH1066567A (ja) 1998-03-10
FR2750998B1 (fr) 1998-09-18
EP0818531A2 (fr) 1998-01-14
CA2209527A1 (fr) 1998-01-09
FR2750998A1 (fr) 1998-01-16

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