JP3000033B2 - 牛の小型ピロプラズマ病原虫感染の予防に有効なペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、牛の感染症対策に有用
なペプチドに関する。さらに詳しくは、牛の小型ピロプ
ラズマ病原虫すなわちタイレリア・セルゲンティー（Ｔ
heileria sergenti）による感染症予防に有用なペプチ
ド、このペプチドからなるワクチンおよび該感染症の診
断測定法に関する。

【０００２】

【従来技術】牛の小型ピロプラズマ病はマダニが媒介す
る原虫病であり、貧血と削痩をその主な症状とする。本
疾患は、世界各地の放牧場で発生しており、死亡率が高
いため放牧経営における最大の障害となっている。その
対策としては、殺原虫剤の牛体投与および媒介となるダ
ニの殺滅を目的とした牛体および牧野への殺ダニ剤散布
が主として行われているが、殺原虫剤投与による治療効
果、乳肉への薬物残留および殺ダニ剤の使用による環境
汚染が問題となっている。

【０００３】予防手段として、これまでに小型ピロプラ
ズマ原虫感染血液を接種する方法が試みられてきたが、
牛の血液を直接投与するため、牛白血病をはじめとする
様々の伝染病を広める危険性があることから、この方法
は現在では禁止されるに至っている。また、最近、小型
ピロプラズマ原虫に感染した媒介ダニのだ液腺から小型
ピロプラズマ原虫のスポロゾイトを分離精製し、精製分
離したスポロゾイトの一定量を放牧前の牛に接種するこ
とにより、放牧後の小型ピロプラズマ病の発症が軽減さ
れることが報告されている［神尾ら：第１１３回 日本
獣医学会講演要旨集、１５６頁（１９９２）］。しかし
ながら、これも実用化されるまでには至っていない。

【０００４】最近の研究により、小型ピロプラズマ原虫
のピロプラズム（牛の赤血球に寄生する発育期のピロプ
ラズマ原虫）の主要タンパク質の分子量は、３２〜３３
ｋｄ（キロダルトン）で、この主要蛋白質は宿主である
牛の液性免疫の主要な標的抗原となっていることも明ら
かにされている［河津ら：第１１１回日本獣医学会講演
要旨集、１３５頁（１９９１）、および杉本ら：第１１
５回日本獣医学会講演要旨集、１４３頁（１９９
３）］。また、本発明者らによる、小型ピロプラズマ原
虫の１種であるタイレリア・セルゲンティーのピロプラ
ズムの主要タンパク質をコードする遺伝子の単離精製お
よびその遺伝子の解析結果から、その塩基配列が明らか
にされた［河津ら：第１１３回日本獣医学会講演要旨
集、１５５頁（１９９２）］。一方、小型ピロプラズマ
原虫と同じ住血原虫であるマラリア原虫では、マラリア
原虫の表面抗原は数個のアミノ酸からなる繰り返し配列
が存在し、赤血球ステージのマラリア原虫の表面抗原タ
ンパク質は、リジン−グルタミン酸（ＫＥ）の荷電アミ
ノ酸ペアを分子内に数ケ所有しており、このうちのリジ
ン−グルタミン酸−リジン（ＫＥＫ）、リジン−グルタ
ミン酸−バリン（ＫＥＶ）あるいは、リジン−グルタミ
ン酸−ロイシン（ＫＥＬ）のアミノ酸配列領域がヒト赤
血球レセプターとの結合に機能することが明らかにさ
れ、ＫＥＫおよびＫＥ配列を含む合成ペプチドによるマ
ラリアの予防が研究されている［Ｐarasite Ｉmmunolog
y、１４、Ｐ１１１〜１２４（１９９２）］。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これま
でに牛の小型ピロプラズマ病を予防できる有効なワクチ
ンは開発されておらず、現状の対策方法には上述したよ
うな種々の問題点が存在することから、牛の小型ピロプ
ラズマ原虫感染予防に有用な新しい対策方法の開発が求
められている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記のように、本発明者
らにより小型ピロプラズマ原虫の１種であるタイレリア
・セルゲンティーの主要タンパク質のアミノ酸配列が明
らかにされたことに伴い、このアミノ酸配列中に上述し
たマラリア原虫にみられるようなＫＥＫ配列が存在する
ことが判明した。本発明者らは、この事実に着目し、こ
の配列を含むペプチドにて牛の免疫試験を行った結果、
この配列を有するペプチドが牛のタイレリア・セルゲン
ティーの主要タンパク質である３３ｋｄペプチドに係わ
る免疫原性を有し、タイレリア・セルゲンティーを含む
牛の小型ピロプラズマ感染予防に極めて有効であること
を見いだし本発明を完成するに至った。すなわち、本発
明に従えば、タイレリア・セルゲンティー感染による小
型ピロプラズマ病を予防できる新規ペプチドが提供され
る。

【０００７】このように本発明によって提供されるペプ
チドは、タイレリア・セルゲンティーの主要タンパク質
である３３ｋｄペプチドに係わる免疫原性を有するペプ
チドであり、公知の固相ペプチド合成法により合成する
ことができる。本発明のペプチドは、そのアミノ酸配列
中にリジン−グルタミン酸−リジン（ＫＥＫ）配列を有
する、タイレリア・セルゲンティーの３３ｋｄペプチド
のアミノ酸配列の部分的なアミノ酸配列からなるペプチ
ドである。このようなリジン−グルタミン酸−リジン
（ＫＥＫ）配列は、配列表：配列番号２のアミノ酸配列
中で１３９番目から１４１番目のアミノ酸配列にあた
り、本発明のペプチドとは、この領域を含むタイレリア
・セルゲンティーの３３ｋｄペプチドの部分的なアミノ
酸を含むペプチドをいう。本発明のペプチドは、リジン
−グルタミン酸−リジン（ＫＥＫ）の最小単位の３アミ
ノ酸からなるペプチドであっても担体との結合等を工夫
することにより牛の小型ピロプラズマ病に対して免疫原
性を有するペプチド化合物として調製することができる
ので、牛の小型ピロプラズマ病の予防に用いることがで
きる。さらに、本発明の好ましい形態のペプチドとして
は、充分な免疫原性という観点から、さらにこのペプチ
ドをＮ末端、Ｃ末端の両端に延長したペプチドを調製す
ることにより、より高い効果を有する本発明のペプチド
を調製することができる。ペプチドの長さとしては、Ｋ
ＥＫ配列を含む３０アミノ酸以下のペプチド、好ましく
はＫＥＫ配列を含む２０アミノ酸以下のペプチドとする
のが望ましい。そのような好ましい形態のペプチドの一
例としては、下記のアミノ酸配列（Ａ）からなるペプチ
ドを挙げることができる。 (Ａ) Ｇlu−Ｖal−Ｖal−Ｔrp−Ｌys−Ｇlu−Ｌys−Ｌy
s−Ｇlu−Ｖal−Ｌys−Ａsp−Ｌeu−Ａsp−Ａla

【０００８】本発明のペプチドを調製するに際しては、
上記アミノ酸配列(Ａ)の範囲をひとつの指標として、Ｌ
ys−Ｇlu−Ｌys（ＫＥＫ）を有する適当な長さのペプチ
ドを調製することができる。また、上記(Ａ)のペプチド
よりさらに長いペプチドを調製することもできるが、そ
の場合には、本発明者らが先に見いだしたタイレリア・
セルゲンティーの３３ｋｄ主要タンパク質のアミノ酸配
列（配列表：配列番号２）に従い、該３３ｋｄタンパク
質本来のアミノ酸配列を有するように、上記ペプチド
(Ａ)の領域をＮ末側およびＣ末側に延長させたペプチド
を調製することができる（上記ペプチド(Ａ)は、配列
表：配列番号２のアミノ酸配列中で１３４番目から１４
８番目のアミノ酸配列にあたる）。

【０００９】さらに、本配列のペプチドとキャリアタン
パク質支持体との結合を容易にするために、付加的に本
発明のペプチドのＮ末端またはＣ末端に１ないし２個の
アミノ酸を付加することも可能である。このような目的
のために有用なアミノ酸としては、チロシン、リジン、
グルタミン酸、アスパラギン酸、システインおよびこれ
らの誘導体が挙げられる。さらに、通常のタンパク質修
飾法、たとえば、アミノ末端のアセチル化やカルボキシ
末端のアシド化などにより、本発明のペプチドまたはキ
ャリアタンパク質支持体の結合を容易にすることも可能
である。また、β−アラニンにリジンを結合させ、その
αとεのアミノ基の両方にさらにリジンを結合すること
を繰り返して作成したＭＡＰ（multiple antigen pepti
de）骨格のアミノ基に本発明のペプチドを結合させるこ
とも可能である。

【００１０】このようにして調製した本発明のペプチド
は、適当なアジュバント、たとえばアルミニウムゲル、
オイルアジュバント等を添加した後、免疫原として使用
することができる。これらの免疫原は、牛に注射するこ
とによって本発明のペプチドに対する抗体を牛体内に産
生させ、タイレリア・セルゲンティーに感染したダニの
吸血による感染を受けても、小型ピロプラズマ病の発症
を抑える効果、またはその症状を著しく軽減する効果を
得ることが可能となる。

【００１１】また、本発明のペプチドが、上述したよう
に牛の小型ピロプラズマ病の予防に関して重要な役割を
奏することから、牛体内における本発明のペプチドに対
する抗体を測定することで、牛の小型ピロプラズマ病に
対する免疫状態を調べることが可能となる。すなわち、
本発明のペプチドを測定用抗原として用いることによ
り、牛の血清中に存在する、このペプチドに特異的な抗
体を調べることで牛の免疫状態を調べることが可能とな
る。このような抗体測定系の構築に際しては、公知の手
法を用いて種々の抗体測定系を構築することが可能であ
るが、その一例としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａ）を利用した測定法が簡便な測定法として挙げられ
る。

【００１２】

【実施例】つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳
細に説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。実施例１ 本発明に特徴的なＫＥＫ配列（リジン−グルタミン酸−
リジン）を有する、下記のアミノ酸配列のペプチド（以
下、「ＫＥＫペプチド」という）を固相ペプチド合成法
に従い合成した。 Ｇlu−Ｖal−Ｖal−Ｔrp−Ｌys−Ｇlu−Ｌys−Ｌys−Ｇ
lu−Ｖal−Ｌys−Ａsp−Ｌeu−Ａsp−Ａla このようにして調製した上記ＫＥＫペプチドを用い、リ
ジンを介して５個のＫＥＫペプチドが１分子として結合
するような上記ＭＡＰの形態のペプチドを調製した。こ
のようにして調製したペプチドに、フロイントの完全ア
ジュバントを添加し、ペプチドの投与量が１ｍｇ／頭・
回となるように、約４ケ月齢のホルスタイン種４頭の臀
部筋肉内に４週間隔で３回注射した。３回目注射後、３
週目に小型ピロプラズム感染成ダニの吸血による攻撃を
行った。また、非接種対照牛として４頭用いた。攻撃後
６０日間、臨床観察、体温測定、血液検査（赤血球数、
ヘマトクリット値）およびパラシテミアについて検査を
行った。血液検査については、日本電工株式会社製のセ
ルタックを用いて測定し、寄生率については、赤血球１
０００個当りに寄生している寄生赤血球の割合により求
めた。

【００１３】その結果、ＫＥＫペプチドを免疫原として
牛に注射することによって、ＫＥＫペプチドに対する牛
生体内の抗体は上昇し、攻撃時において、ＫＥＫ抗体を
測定するＥＬＩＳＡでは、測定価（吸光度）が２.００
以上を示した。一方、対照群では同様のＥＬＩＳＡ価に
おいて０.１以下を示した。さらに、同様にＫＥＫペプ
チドに対する抗体測定のための寒天ゲル内沈降（以下、
「ＡＧＰ」という）では、本発明のペプチド投与群で
は、抗体価は４〜８倍を示した。一方、対照群における
ＡＧＰ抗体は陰性であった。

【００１４】攻撃後の感染様相は、下記の表１に示す通
りであった。攻撃後のピロプラズマ原虫は、吸血開始後
９〜１５日目にかけて認められるようになり、本発明の
ペプチド免疫群では４頭中１頭において最高寄生率が９
％まで上昇したが、残りの３頭の最高寄生率は、３.６
〜６.９％であった。一方、対照群では４頭中３頭にお
いて１０.４〜１４.２％の最高寄生率を示し、免疫群で
の寄生率は対照群のものよりも明らかに低率であった。

【００１５】

【表１】

【００１６】本発明のペプチド免疫群における赤血球数
は、寄生率の上昇にともなって減少し、最低の赤血球数
は、４０９、４６０、４６４および２３６万個／ｍｍ³
を示したが、すぐに回復傾向を示し、観察終了時には６
００〜８００万個／ｍｍ³までに回復していた。一方、
対照群では最低の赤血球数は１８９〜３８８万個／ｍｍ
³を示し、終了時には３５０〜６００万個／ｍｍ³に回復
したが、この赤血球の回復は免疫群の方が対照群よりも
早い傾向が認められた。

【００１７】また、免疫群におけるヘマトクリット値
は、赤血球数の推移と同様に推移し、対照群よりも軽度
であることが確認された。以上の結果から、本発明のＫ
ＥＫペプチドによる牛の免疫は、小型ピロプラズマ病の
感染に対して症状を軽減することが確認された。

【００１８】実施例２ 野外での小型ピロプラズマ原虫感染耐過牛における、本
発明のＫＥＫペプチドに対する抗体反応性について、実
験感染牛血清と比較検討した。反応性については、本発
明のＫＥＫペプチドを測定用抗原として用いたＥＬＩＳ
Ａ法により行った。供試した野外感染耐過血清は、放牧
後２年以上経過している血清１１検体を、実験感染血清
は、感染後３〜４ケ月目の血清１８検体を用いた。その
結果を表２に示す。野外感染牛血清の本発明のＫＥＫペ
プチドに対するＥＬＩＳＡ抗体価は、低い値ではあった
が１１頭中８頭において認められ、その吸光度は、０.
１５〜０.３２であった。一方、実験感染牛血清では全
例が、０.１以下を示した。以上のことから、本発明の
ＫＥＫペプチドに対する抗体は、野外感染耐過血清中に
存在することが確認された。

【００１９】

【表２】

【００２０】本発明のＫＥＫペプチドで免疫した血清を
用いて、小型ピロプラズマ原虫であるタイレリア・セル
ゲンティ・イケダ（Ｔheileria sergenti Ｉkeda）（以
下、「ＴＳＩ」と称する）、タイレリア・ブッフェリー
・ワルウイック（Ｔheileriabufferi Ｗarwick）（以
下、「ＴＢＷ」と称する）、およびタイレリア・オリエ
ンタリス・エセックス（Ｔheileria orientalis Ｅsse
x）（以下、「ＴＯＥ」と称する）から精製したピロプ
ラズムとのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動お
よびウエスタンブロッティング法による解析を行った。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエス
タンブロッティング法は、それぞれラムリーの方法［Ｌ
eammliら、Ｎature、２２７、p６８０−６８５、（１９
７０）］およびダンの方法［Ｄunn、Ａnal.Ｂiochem.１
５７、p１４４−１５３（１９８６）］に従って行っ
た。その結果を図１に示す。本発明のＫＥＫペプチド免
疫牛血清は、ＴＳＩの主要タンパク質を強く認識してい
たが、ＴＢＷおよびＴＯＥの主要タンパク質とは反応せ
ず、本発明のＫＥＫペプチドは、ＴＳＩに特異的である
ことが確認された。図１中、１、２および３はＴＳＩ感
染牛血清、４、５および６は抗ペプチド牛血清を示し、
１および４はＴＳＩ、２および５はＴＢＷ、３および６
はＴＯＥを意味する。

【００２１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu-Val-Val-Trp-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Lys-Asp-Leu-Asp-Ala 1 5 10 15

【００２２】配列番号：２ 配列の長さ：８５２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 起源 生物名：タイレリア・セルゲンティー（Ｔheileria ser
genti） 配列 ATG TTG TCC AAG AGA ACG TTC AAC GTA CTT TGC CTA GGA TAC TTC CTT 48 Met Leu Ser Lys Arg Thr Phe Asn Val Leu Cys Leu Gly Tyr Phe Leu 1 5 10 15 ATC GTC TCT GCT ACC GCC GCA GAG GAA AAA AAA GAT GCA AAG GCT GAA 96 Ile Val Ser Ala Thr Ala Ala Glu Glu Lys Lys Asp Ala Lys Ala Glu 20 25 30 GAG AAG AAG GAC TTA ACT CTC GAA GTT AAC GCC ACC GCA GCC GAA CAT 144 Glu Lys Lys Asp Leu Thr Leu Glu Val Asn Ala Thr Ala Ala Glu His 35 40 45 TTT AAA GTC GAC GCC TCA AAC GCC AAC GAC GTC GTT TTT ACT GCC GAA 192 Phe Lys Val Asp Ala Ser Asn Ala Asn Asp Val Val Phe Thr Ala Glu 50 55 60 GAG GGA TAC CGC ATC AAG ACA CTC AAG GTC GGA GAT AAG AAC CTG TAT 240 Glu Gly Tyr Arg Ile Lys Thr Leu Lys Val Gly Asp Lys Asn Leu Tyr 65 70 75 80 ACC GTA GAT ACT TCC AAG TTC ACC CCA ACT GTC GCC CAC AGA CTG AAG 288 Thr Val Asp Thr Ser Lys Phe Thr Pro Thr Val Ala His Arg Leu Lys 85 90 95 CAT GCT GAC GAC CTG TTC TTC AAG CTC AAC CTG TCC CAC GCA AAG CCA 336 His Ala Asp Asp Leu Phe Phe Lys Leu Asn Leu Ser His Ala Lys Pro 100 105 110 TTG CTG TTC AAG AAG AAG ACT GAC AAG GAT TGG GTT CAA TTC AGC TTC 384 Leu Leu Phe Lys Lys Lys Thr Asp Lys Asp Trp Val Gln Phe Ser Phe 115 120 125 GCC CAG TAC CTC GAT GAA GTT GTA TGG AAG GAG AAG AAG GAA GTA AAA 432 Ala Gln Tyr Leu Asp Glu Val Val Trp Lys Glu Lys Lys Glu Val Lys 130 135 140 GAC CTC GAC GCA TCC AAG TTC GCA GAC GCA GGT CTT TTC GCC GCT GAG 480 Asp Leu Asp Ala Ser Lys Phe Ala Asp Ala Gly Leu Phe Ala Ala Glu 145 150 155 160 GCT TTC GGT ACC GGA AAG CTG TAC AAC TTC ATT GGA AAC TTC AAG GTC 528 Ala Phe Gly Thr Gly Lys Leu Tyr Asn Phe Ile Gly Asn Phe Lys Val 165 170 175 AAG AAG GTC ATG TTC GAG GAG AAG GAC GTT GGA GAT TCA AAC AAG GCC 576 Lys Lys Val Met Phe Glu Glu Lys Asp Val Gly Asp Ser Asn Lys Ala 180 185 190 AAA TAC ACC GCT GTC AAA GTT TAC GTC GGT TCC GAT GAG AAG AAA GTC 624 Lys Tyr Thr Ala Val Lys Val Tyr Val Gly Ser Asp Glu Lys Lys Val 195 200 205 GTA AGA CTC GAC TAC TTC TAC ACT GGT GAT GAG AGA TTC AAG GAG GTT 672 Val Arg Leu Asp Tyr Phe Tyr Thr Gly Asp Glu Arg Phe Lys Glu Val 210 215 220 TAC TTC AAA TTG GTA GAC GGA AAA TGG AAG AAG GTT GAG CAG AGC GAG 720 Tyr Phe Lys Leu Val Asp Gly Lys Trp Lys Lys Val Glu Gln Ser Glu 225 230 235 240 GCA AAC AAG GAT TTG CAC GCC ATG AAC AGT GCT TGG CCT TCG GAC TAC 768 Ala Asn Lys Asp Leu His Ala Met Asn Ser Ala Trp Pro Ser Asp Tyr 245 250 255 AAG CCT CTT GTC GAC AAG TTC TCA CCA CTT GCC GTT CTC AGC GCG GTT 816 Lys Pro Leu Val Asp Lys Phe Ser Pro Leu Ala Val Leu Ser Ala Val 260 265 270 CTC ATC GCC TCC CTC GCA GTA TTC TAT TAT CTC TAG 852 Leu Ile Ala Ser Leu Ala Val Phe Tyr Tyr Leu 275 280

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例２のウエスタンブロッティングによる
解析における、本発明のＫＥＫペプチドで免疫した血清
と各種ピロプラズムとの反応を示す電気泳動の結果を示
す写真。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ａ６１Ｋ 39/295 39:002 39:12） (Ａ６１Ｋ 39/295 39:002 39:155） (Ａ６１Ｋ 39/295 39:002 39:235） (Ａ６１Ｋ 39/295 39:002 39:102） (Ａ６１Ｋ 39/295 39:002 39:08） (72)発明者 神尾 次彦 茨城県つくば市竹園３−106−201 (72)発明者 種子野 章 熊本県熊本市下硯川町1360−２ (72)発明者 野中 富士男 熊本県熊本市花園７−1752−47 (72)発明者 宮原 徳治 熊本県菊池郡菊陽町津久礼3566−22−13 −５ (72)発明者 山田 進二 熊本県熊本市練兵町49−３ (72)発明者 酒井 英史 熊本県熊本市高平２−12−17 (56)参考文献 Ｍｃｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓ ｉｔｏｌ．，Ｖｏｌ．56（１），ｐ. 169−175（1992) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 39/002 A61K 39/295 C07K 7/08 C07K 14/44 G01N 33/569 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記のアミノ酸配列： Ｇlu−Ｖal−Ｖal−Ｔrp−Ｌys−Ｇlu−Ｌys−Ｌys−Ｇlu−Ｖal−Ｌys−Ａsp− Ｌeu−Ａsp−Ａla からなるペプチドとアジュバント活性を有する物質とか
   らなる牛の小型ピロプラズマ病原虫感染予防用ワクチ
   ン。
2. 【請求項２】 前記ペプチドが、β−アラニンにリジン
   を結合させ、そのαとεのアミノ基の両方にさらにリジ
   ンを結合することを繰り返して作製されたＭＡＰ（Mult
   iple Antigen Peptide）骨格のアミノ基に前記ペプチド
   を結合させることにより、リジンを介して複数個のペプ
   チドが１分子として結合された構造をとることを特徴と
   する請求項１に記載のワクチン。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載のワクチンと下
   記の中から選択されるひとつまたは２つ以上のワクチン
   とからなる牛用混合ワクチン。 牛伝染性鼻気管炎ワクチン、 粘膜型牛伝染性下痢症ワクチン、 牛パラインフルエンザワクチン、 牛アデノウイルスワクチン、 ヘモフィルスワクチン、 クロストリジウムワクチン