KR100263575B1 - 소의 소형 피로플라즈마 병원충 감염의 예방용 펩티드 - Google Patents

Abstract

소의 소형 피로플라즈마 병원층 유래의 33kd 펩티드의 아미노산 서열의 부분적인 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 있어서, Lys-Glu-Lys의 아미노산 서열을 함유하는 소의 소형 피로플라즈마 병원충 감염 예방에 효과적인 펩티드; 펩티드 및 보조 활성을 갖는 물질을 포함하는 소의 소형 피로플라즈마 병원충 감염 예방용 백신; 측정 항원으로서 상기 펩티드를 사용하는 것을 특징으로하는 소의 소형 피로플라즈마 병원충에 대한 항체 측정 방법.

Description

소의 소형 피로플라즈마 병원충 감염의 예방용 펩티드

제1도는 본 발명의 KEK 펩티드로 면역시킨 혈청과 각종 피로플라즈마간의 반응을 나타내는, 실시예 2로 수행되는 웨스턴 블로팅 분석의 전기 영동 결과를 나타내는 사진이다.

본 발명은 소의 감염병 예방 및 치료에 유용한 펩티드에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 소의 소형 피로플라즈마 병원충 즉, 테일러리아 세르젠티 (Theileria sergenti)에 의해 발생하는 감염병의 예방에 유용한 펩티드, 상기 펩티드를 포함하는 백신 및 상기 질병의 진단법에 관한 것이다.

소의 소형 피로플라즈마 질병은 진드기가 매개하는 원충병이고 주요 중상으로서 빈혈 및 쇠약증이 있다. 본 질병은 세계 각지의 방목장에서 발생하는데 높은 치사율을 나타내어 목장 경영에 실질적인 장애물이 되고 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 소 체내에 살원충제를 투여하고, 이 병을 매개하는 진드기를 제거하기 위하여 소와 목장에 진드기약을 살포하여 왔다. 그러나 살원충제의 투여는 그 치료 효과가 의심스럽고 우유 및 우육에 약제성분이 잔류하는 문제점을 가지고 있고 또한 살원충제의 살포는 환경 오염의 심각한 문제를 불러일으킨다.

이러한 질병을 예방하기 위해서, 소의 소형 피로플라즈마 병원충에 감염된 혈액율 접종하는 방법을 사용하여 왔다. 그러나 이 방법은 소 혈액에 직접 투여하기 때문에, 소의 백혈병을 포함하는 각종 전염병을 살포할 위험이 있어서 오늘날에는 금지되어 있다. 최근에는, 또한 소형 피로플라즈마 병원충에 감염된 매개 진드기의 타액선으로부터 소형 피로플라즈마 병원충의 스포로조이트(sporozoite)를 분리 정제하고, 분리 정제한 스포로조이트의 일정량을 방목전의 소에 접종하여 방목후의 소형 피로플라즈마 병의 발병을 감소시키는 것이 보고되었다.[Kamio et al.: 113th Japan Veterinary Association excerpt, page 156 (1992)]. 그러나, 이 방법은 아직 실용화 되지 않고 있다.

최근의 연구에서는 소형 피로플라즈마 병원충(소의 적혈구에 기생하는 발육기의 피로플라즈마 병원충)의 피로플라즈마의 주요 단백질의 분자량이 32∼33kd 이고, 주요 단백질이 숙주 소의 체액 면역에서 중요한 표적 항원인 것을 발견하였다 [Kawazu et al.: 111th Japan Veterinary Association excerpt, page 135 (1991); and Sugimoto et al.: 115th Japan Veterinary Association excerpt, page 143 (1993)]. 본 발명자들은 소형 피로플라즈마 병원충의 하나인 테일러리아 세르젠티 (Theileria sergenti)의 피로플라즈마의 주요한 단백질을 코드하는 유전자를 분리 정제하여, 상기 유전자를 분석하고 그의 뉴클레오티드 서열을 측정하였다[Kawazu et al.: 113th Japan Veterinary Association excerpt, page 155 (1992)].

한편, 소형 피로플라즈마 병원충과 동일한 주혈충인 말라리아 병원충의 경우에는, 말라리아 병원충의 표면 항원이 수개의 아미노산 반복 단위의 아미노산 서열을 가지며, 적혈구 단계에서 말라리아 병원충의 표면 항원 단백질은 분자내 여러 부분에서 리신-글루탐산(KE)의 하전된 아미노산 쌍을 가지고, 그들 중의 리신-글루탐산-리신(KEK), 리신-글루탐산-발린(KEV) 또는 리신-글루탐산 류신(KEL)의 아미노산 서열이 인간 적혈구 수용체와의 결합에 관계 있는 것을 알게 되었고, KEK 또는 KE 서열을 포함하는 합성 펩티드를의 사용하여 말라리아를 예방하는 것을 연구하게 되었다[Parasite Immunology,14, page 111-124 (1992)].

그러나, 소의 소형 피로플라즈마 질병의 예방에 효과적인 백신은 아직 개발되지 않았고, 통상적인 방법에 관련된 각종 문제점 때문에 소의 소형 플라즈마 병원충 감염 예방에 유용한 방법을 개발할 필요성이 있었다.

상기에서 언급한 것처럼, 본 발명자들에 의해 소형 피로플라즈마 병원충의 1 종인 테일러리아 세르젠티(Theileria sergenti)의 주요 단백질의 아미노산 서열이 밝혀졌고, 이와함께 그의 아미노산 서열중에 상기 말라리아 병원충의 경우와 같은 KEK 서열을 포함하는 아미노산 서열이 존재하는 것이 발견되었다.

본 발명자들은 이러한 사실을 고려하여 이러한 서열을 함유하는 펩티드를 가진 면역 소의 면역 시험을 한 결과, 상기 서열을 함유하는 펩티드가 소의 테일러리아 세르젠티(Theileria sergenti)의 중요 단백질에 있는 33kd 펩티드의 면역 원성을 나타내고, 테일러리아 세르젠티(Theileria sergenti)를 함유하는 소의 소형 피로플라즈마 병원충의 감염 예방에 극히 효과적이라는 것을 발견하였다.

본 발명의 목적은 소의 소형 피로플라즈마 병원충 유래의 33kd 펩티드의 아미노산 서열의 부분적인 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 있어서, Lys-Glu-Lys의 아미노산 서열을 함유하는 소의 소형 피로플라즈마 병원충 감염 예방에 효과적인 펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 하기의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드를 제공하는 것이다.

Glu-Val-Val-Trp-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Lys-Asp-Leu-Asp-Ala.

본 발명의 또 다른 목적은 하기의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드를 제공하는 것이다 :

Glu-Val-Val-Trp-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Lys-Asp-Leu-Asp-Ala.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 펩티드 및 보조 활성을 가지는 물질을 포함하는 소의 소형 피로플라즈마 병원충 감염 예방용 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 백신 및 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 이상의 백신을 포함하는 소의 혼합 백신을 제공하는 것이다 :

소전염성비기관염 백신

점막형소전염성설사병 백신

소의 파라인플루엔자 비루스백신

소의 아데노비루스 백신

헤모필러스 백신

클로스트리듐 백신

본 발명의 또 다른 목적은 측정 항원으로서 본 발명의 펩티드를 사용하는 것을 포함하는 소의 소형 피로플라즈마 병원충에 대한 항체의 측정법을 제공하는 것이다.

이와같은 목적 및 그의 장점들은 하기의 설명으로부터 당 기술 분야에 숙련된 자들에게 명백해질 것이다.

본 발명의 펩티드는 테일러리아 세르겐티(Theileria sergenti)의 중요한 단백질에 있는 33kd 펩티드의 면역 원성을 나타내고, 펩티드를 제조하는 통상적인 고상법으로 합성될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 그의 아미노산 배열중에 리신-클루탐산-리신(KEK)을 포함하는 테일러리아 세르젠티(Theileria sergenti)의 33kd 펩티드의 아미노산 서열 일부를 가지며, 상기 KEK 서열은 서열표: 서열번호 2의 아미노산 서열중에서 138번 내지 140번의 아미노산 서열에 상응한다.

본 발명의 펩티드는, 비록 리신-글루탐산-리신(KEK)의 세 아미노산만의 최소 단위로 구성될지라도, 담체와의 결합등을 고안함으로써 소의 소형 피로플라즈마병에 대한 면역 원성을 가지는 펩티드 화합물로 제형할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예는, 충분한 면역 원성의 관점으로부터, N-말단 및 C-말단에서 모두 상기의 최소 펩티드를 연장하여 긴 펩티드를 제조할 수 있다. 본 발명 펩티드의 크기는 KEK 서열을 포함하여 30 아미노산 이하이고, 바람직하게는 KEK 서열을 포함하여 20 아미노산 이하이다. 이러한 바람직한 펩티드의 1 예로는 하기 아미노산 서열(A)의 펩티드를 포함할 수 있다 :

(A) Glu-Va1-Va1-Trp-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Va1-Lys-Asp-Leu-Asp-Ala

상기의 아미노산 서열(A)를 지표로서 언급할 경우, Lys-Glu-Lys (KEK) 서열을 포함하는 특정 크기의 펩티드를 적당히 제조할 수 있다. 필요하다면, 상기 서열(A)보다 긴 펩티드도 또한 제조할 수 있다. 이러한 경우에는, 본 발명자들이 미리 측정한 테일러리아 세르젠티(Theileria sergenti)의 33kd 주요 단백질 본래의 아미노산 서열(서열표 : 서열번호 2)은 연장된 N-말단 및 C-말단에서 서열이 본래의 아미노산 서열에서 상응하도록 제조될 수 있다(상기 펩티드(A)는 서열표 : 서열번호 2의 아미노산 서열중에서 l34번 내지 l48번의 아미노산 서열에 상응한다).

또한, 본 발명의 펩티드의 N-말단 및 C-말단에서 1 또는 2개의 아미노산을 첨가하여 본 발명의 펩티드와 담체 단백질 지지체와의 결합을 용이하게 할 수 있다. 이러한 목적에 유용한 단백질은, 예를들어, 티로신, 리신, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인 뿐만 아니라 그의 유도체를 들 수 있다.

또한 아미노 말단의 아세틸화 및 카르복실 말단의 아미드화와 같은 단백질 수식의 통상적인 방법을 본 발명 펩티드와 담체 단백질 지지체와의 결합을 용이하게 하기 위하여 사용될 수 있다. 또한 본 발명 펩티드와 MAP(multiple antigen peptide)의 아미노기의 결합이 가능하고, 상기 MAP는-알라닌에 리신을 결합한 후, 리신--알라닌의및아미노기 모두에 리신을 결합하는 것을 반복함으로써 수득될 수 있다.

상기에서 수득한 본 발명의 펩티드는 알루미늄 겔 또는 오일 보조제같은 적당한 보조제와 병합하여 면역원으로서 사용할 수 있다. 그리고나서, 면역원을 소에 투여하여 소에서 본 발명의 펩티드에 대한 항체를 생산할 수 있고, 이것으로 소형 피로플라즈마 질병의 발명을 예방할 수 있거나, 또는 소가 테일러리아 세르젠티 (Theileria sergenti)에 감염된 진드기에 흡혈되어 감염될지라도 최소한 질병의 증상을 극도로 감소시킬 수 있다.

본 발명의 펩티드가 소의 소형 피로플라즈마 질병의 예방에 중요한 역할을 하는 것을 고려해 볼 때, 소형 피로플라즈마 질병에 대한 소의 면역 상태는 본 발명의 펩티드에 대한 항체 측정으로써 평가될 수 있다.

즉, 소의 면역 상태는 측정 항원으로서 펩티드를 사용함으로써 소의 혈청에 존재하는 본 발명의 펩티드에 특이적인 항체를 측정함으로써 평가할 수 있다. 항체를 측정하는 측정계는 공지된 방법을 사용하여 실행할 수 있다. 대표적인 예가 단순하고 용이하게 조작할 수 있는 효소 면역측정법(ELISA)을 사용한 측정계이다.

본 발명은 하기의 실시예로 보다 상세히 설명되나 이것으로 본 발명을 제한하지 않는다.

[실시예 1]

본 발명(이후로는 "KEK 펩티드"로 언급한다)에 따른 KEK(리신-글루탐산-리신) 서열을 포함하는 하기 아미노산 서열의 펩티드는 고상법으로 합성된다.

Glu-Val-Va1-Trp-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Va1-Lys-Asp-Leu-Asp-A1a

이렇게 수득틴 KEK 펩티드를 사용하여서, 리신을 매개로 하여 5개의 KEK 펩티드가 서로 결합되어 1 분자를 형성하는 상기 언급된 MAP 형태의 펩티드를 제조한다. 이렇게 수득된 펩티드를 프룬드(Freund)의 완전 보조제와 함께 각 주사의 펩티드 양이 1mg/마리가 되도록하여 약 4달된 4 마리의 홀스타인 종 소의 둔부 근육내에 4주 간격으로 3회 주사한다. 3회 주사 후, 소가 3주안에 소형 피로플라즘에 감염돤 성충 진드기에 흡혈 공격을 당하도록 한다. 또한 4마리의 대조군 홀스타인은 접종없이 사용한다. 공격 후 60일 동안 임상 관찰, 체온 측정, 혈액 검사(적혈구수, 헤모크리트치) 및 기생에 대한 시험을 실행한다. 혈액 검사는 Nippon Denko K.K의 Hematology Analyzer(PS-510V)를 사용하여 실행하고 기생율은 적혈구 1000개 당 기생된 적혈구의 비율을 사용하여 수득한다.

그 결과로, KEK 펩티드를 면역원으로 소에 주사함으로써, KEK 펩티드에 대한 소 체내의 항체는 증가한다. 공격시에, KEK 항체를 측정한 ELISA는 2.0 이상의 흡광도를 나타낸다. 한편, 대조군에서의 동일한 ELISA 값은 0.1 이하를 나타낸다. 또한 KEK 펩티드에 대한 항체를 측정하기 위한 겔아가 침전(이하 "AGP"라 한다) 시험은 본 발명의 KEK 펩티드로 면역된 군에서 4 내지 8배 높은 항체가를 나타낸다. 한편, 대조군에서 AGP 항체는 음성이다.

공격후의 감염 상태는 하기 표 1 및 2에 나타낸다. 공격후, 피로플라즈마 병원충은 흡혈 개시후로부터 9 내지 15일 경에 나타난다. 본 발명의 펩티드로 면역된 군에서 최고 기생율은 4마리의 소 중 1마리에서 9%까지 상승하지만 나머지 3마리에서는 3.6 내지 6.9%로 낮다. 한편, 대조군은 4마리의 소 중에 3마리에서 10.4 내지 14.2%의 높은 최대 기생율을 나타낸다. 이러한 결과는 면역군에서의 기생율이 대조군의 기생율 보다 현저히 낮은 것을 나타낸다.

[표 1]

(면역군)

[표 2]

(대조군)

(주 *) 대조군의 소 제5번 보다 더 높은 최고 기생율을 나타낸 일 수

본 발명의 펩티드로 면역된 군의 적혈구 수는 기생율이 최소 적혈구 수 409, 460, 464 및 236×10⁴/mm³으로 증가함에 따라 감소한다. 그러나, 상기 면역군은 즉시 회복 경향을 나타내고 관찰 종료시에는 적혈구 수가 600 내지 800×10⁴/mm³으로 회복된다. 한편, 대조군은 최소 적혈구 수가 189 내지 388×10⁴/mm³를 나타내고, 종료시에는 350 내지 600×l0⁴/mm³로 회복된다. 이러한 결과로서, 적혈구 수의 회복은 대조군에서 보다 면역군에서 보다 신속하게 발견된다.

헤마토크리트 값은 적혈구 수의 변화와 동일하고, 대조군 보다 낮은 정도로 감소된다.

이상의 결과로서, 본 발명의 KEK 펩티드에 의한 소의 면역은 소형 피로플라즈마 병의 감염에 대한 증상을 감소시키는 것이 확인된다.

[실시예 2]

야외에서 소형 피로플라즈마 병원충 감염 내성이 있는 소와 실험용 감염 소의 혈청간의 본 발명의 KEK 펩티드에 대한 항체 반응성을 비교한다. 측정 항원으로서 본 발명의 KEK 펩티드를 사용한 ELISA로 반응성을 평가한다.

측정된 야외 감염 내성이 있는 혈청은 방목후 2년 이상 경과된 혈청 11 검체이고, 실험용 감염 혈청은 감염후 3 내지 4달이 경과된 혈청 l8 검체이다. 결과는 표 3에 나타낸다. 본 발명의 KEK 펩티드에 대한 ELISA 항체가는 흡광도가 0.15 내지 0.32의 낮은 수준일지라도, 야외 감염 혈청의 11마리중 8마리에서 확인된다.

한편, 실험용 감염된 소의 혈청 모두는 0.1 이하의 흡광도를 나타낸다.

이것은 본 발명의 KEK 펩티드에 대한 항체가 야외 감염 내성 혈청에서 발견될 수 있다는 것을 확인한다.

[표 3]

본 발명의 KEK 펩티드로 면역된 혈청을 사용할 경우, 각종 소형 피로플라즈라즈마 병원충, 테일러리아 세르겐티 이께다(Theileria sergenti Ikeda 하기에 "TSI"로 표기), 테일러리아 버퍼리 와아윅(Theileria bufferi Warwick 하기에 "TBW"로 표기) 및 테일러리아 오리엔탈리스 에섹스(Theileria Orientalis Essex 하기에 "TOE"로 표기)로부터 정제된 피로플라즘을 갖는 반응성은, Laemmli et al. [Laemmli et al., Nature, 227, page 680~685(1970)] 및 Dunn [Dunn, Anal. Biochem., 157, page 144-153(1986)] 각각에 기재된 대로 실행한 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 및 웨스턴 블로팅으로 측정할 수 있다. 결과는 제1도에 나타낸다.

본 발명의 KEK 펩티드로 면역된 소의 혈청은 TSI의 중요단백질을 강하게 인지하지만 TBW 또는 TOE의 중요 단백질과는 반응하지 않아 본 발명의 KEK 펩티드가 TSI에 대해 특이적은 것이 확인되었다.

제1도에서 1, 2 및 3은 TSI 감염 소의 혈청이고, 4, 5 및 6은 소의 항 펩티드 혈청을 나타내고 1 및 4는 TSl, 2 및 5는 TBW, 3 및 6은 TOE이다.

[서열표]

Claims (6)

1. 소의 소형 피로플라즈마 병원충 테일러리아 세르젠티(Theileria sergenti) 유래의, 서열표 서열 번호 : 2의 아미노산 서열을 갖는 33kd 펩티드의 아미노산 서열의 부분적인 아미노산 서열을 갖는 펩티드로서 Lys-Glu-Lys의 아미노산 서열을 함유하는, 소의 소형 피로플라즈마 병원충 테일러리아 세르젠티(Theileria sergenti) 감염 예방에 효과적인 펩티드.
2. 제1항에 있어서, 하기의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드:

   Glu-Va1-Va1-Trp-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Va1-Lys-Asp-Leu-Asp-Ala.
3. 제2항에 있어서, 하기의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드:

   Glu-Va1-Va1-Trp-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Va1-Lys-Asp-Leu-Asp-Ala.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드 및 보조 활성을 갖는 물질을 포함하는 소의 소형 피로플라즈마 병원충 감염 예방용 백신.
5. 제4항의 백신 및 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 백신을 포함하는 소의 혼합 백신:

   소전염성비기관염 백신

   점막형소전염성설사병 백신

   소의 파라인플루엔자 비루스 백신

   소의 아데노비루스 백신

   헤모필러스 백신

   클로스트리듐 백신
6. 측정 항원으로서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 하는 소의 소형 피로플라즈마 병원충 테일러리아 세르젠티(Theileria sergenti)에 대한 항체 측정 방법.