JP2965699B2 - 胎児細胞回収法 - Google Patents
胎児細胞回収法Info
- Publication number
- JP2965699B2 JP2965699B2 JP3505625A JP50562591A JP2965699B2 JP 2965699 B2 JP2965699 B2 JP 2965699B2 JP 3505625 A JP3505625 A JP 3505625A JP 50562591 A JP50562591 A JP 50562591A JP 2965699 B2 JP2965699 B2 JP 2965699B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- antibody
- maternal
- fetal
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 title claims abstract description 152
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 148
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 545
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 claims abstract description 133
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 131
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 131
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 131
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 116
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 61
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 60
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 58
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 51
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 18
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 claims description 8
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 abstract description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 74
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 50
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 47
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 30
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 17
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 16
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 16
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 16
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 16
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 12
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 11
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 9
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 9
- 230000008775 paternal effect Effects 0.000 description 8
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 238000002669 amniocentesis Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 2
- 210000004252 chorionic villi Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 238000011527 multiparameter analysis Methods 0.000 description 2
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 2
- UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N (2-chloroethyl)phosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CCCl UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XYJODUBPWNZLML-UHFFFAOYSA-N 5-ethyl-6-phenyl-6h-phenanthridine-3,8-diamine Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2N(CC)C1C1=CC=CC=C1 XYJODUBPWNZLML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 1
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010044495 Fetal Hemoglobin Proteins 0.000 description 1
- 208000022471 Fetal disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 101150035751 GSP2 gene Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- NEAPKZHDYMQZCB-UHFFFAOYSA-N N-[2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethyl]-2-oxo-3H-1,3-benzoxazole-6-carboxamide Chemical compound C1CN(CCN1CCNC(=O)C2=CC3=C(C=C2)NC(=O)O3)C4=CN=C(N=C4)NC5CC6=CC=CC=C6C5 NEAPKZHDYMQZCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011252 Phenylketonuria Diseases 0.000 description 1
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 101000980463 Treponema pallidum (strain Nichols) Chaperonin GroEL Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003322 aneuploid effect Effects 0.000 description 1
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- IQPQWNKOIGAROB-UHFFFAOYSA-N isocyanate group Chemical group [N-]=C=O IQPQWNKOIGAROB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 229960000901 mepacrine Drugs 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- GPKJTRJOBQGKQK-UHFFFAOYSA-N quinacrine Chemical compound C1=C(OC)C=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=C(C=CC(Cl)=C3)C3=NC2=C1 GPKJTRJOBQGKQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine chloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56977—HLA or MHC typing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
- G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/824—Immunological separation techniques
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、多型遺伝子座に対する母性細胞表面抗原を
１個持つ胎児細胞を両方の母性細胞表面抗原を持つ母性
細胞と区別する抗体を用いた、母親の血液から胎児細胞
の回収法に関する。
１個持つ胎児細胞を両方の母性細胞表面抗原を持つ母性
細胞と区別する抗体を用いた、母親の血液から胎児細胞
の回収法に関する。
発明の背景 胎児の病気及び遺伝的異常の早期検出のための胎児細
胞の検査が、約30人中一人の妊婦につき行われている。
主な指標は、母親の年令である（35才以上）。試験は、
DNA遺伝子タイピング又は、より普通には染色体核タイ
ピングのための生存胎児細胞の利用により行うことがで
きる。
胞の検査が、約30人中一人の妊婦につき行われている。
主な指標は、母親の年令である（35才以上）。試験は、
DNA遺伝子タイピング又は、より普通には染色体核タイ
ピングのための生存胎児細胞の利用により行うことがで
きる。
通常胎児細胞は、羊水穿刺、すなわち羊膜嚢又は胎盤
内の羊膜腔からの羊水の取り出しにより得る。この方法
には、特に妊娠３カ月後は胎児を傷付ける危険がある。
胎児への危険ならびに方法に高い経費がかかることによ
り、異常の早期検出のための胎児細胞の検査を、妊娠中
の慣例的手順として確立することが妨げられてきた。
内の羊膜腔からの羊水の取り出しにより得る。この方法
には、特に妊娠３カ月後は胎児を傷付ける危険がある。
胎児への危険ならびに方法に高い経費がかかることによ
り、異常の早期検出のための胎児細胞の検査を、妊娠中
の慣例的手順として確立することが妨げられてきた。
1970年代の後期及び1980年代の初期に、Herzenberg及
び彼の同僚達は、妊婦15週という早い時期に、胎児細胞
が母親の血液中に存在することを記録した。著者らは、
父親のHLA抗原を区別するために母親の血液を染色する
ことにより、細胞自動解析分離装置（FACS）を用いて母
親の細胞と胎児の細胞を分離した。著者らは、胎児細胞
が母親の循環系に入り込み、FACS−濃縮法により単離す
ることができるということの立証は、羊水穿刺を行わず
に核タイピングを可能にするという点で実際に重要であ
ると述べている。著者らは、15週における細胞の単離の
成功頻度が十分高く、細胞に分裂を誘起することができ
たら（中期に入る）、これが可能であろうと述べてい
る。さらに母親の細胞と胎児の細胞の区別のために、高
価なHLAタイピング剤又は他の細胞表面試薬を開発する
必要がある。今日まで、核タイピング又は胎児DNA分析
のための臨床的技術として使用するために方法を応用し
ても成功しなかった。
び彼の同僚達は、妊婦15週という早い時期に、胎児細胞
が母親の血液中に存在することを記録した。著者らは、
父親のHLA抗原を区別するために母親の血液を染色する
ことにより、細胞自動解析分離装置（FACS）を用いて母
親の細胞と胎児の細胞を分離した。著者らは、胎児細胞
が母親の循環系に入り込み、FACS−濃縮法により単離す
ることができるということの立証は、羊水穿刺を行わず
に核タイピングを可能にするという点で実際に重要であ
ると述べている。著者らは、15週における細胞の単離の
成功頻度が十分高く、細胞に分裂を誘起することができ
たら（中期に入る）、これが可能であろうと述べてい
る。さらに母親の細胞と胎児の細胞の区別のために、高
価なHLAタイピング剤又は他の細胞表面試薬を開発する
必要がある。今日まで、核タイピング又は胎児DNA分析
のための臨床的技術として使用するために方法を応用し
ても成功しなかった。
最近、胎児中に存在する遺伝子の分析を行うために、
母親の血液中に存在する胎児細胞が用いられた。ある方
法の場合、母親の細胞と胎児の細胞を分離せず、混合細
胞からのDNAをＹ染色体特異的プライマーで増幅して胎
児が雄であるかどうかを決定した。DNA増幅法をこの方
法で行って、病気を伴う遺伝子配列を検出することもで
きることが示唆された。もちろんこの方法は、母親が形
質のキャリヤーである場合は使用できない。
母親の血液中に存在する胎児細胞が用いられた。ある方
法の場合、母親の細胞と胎児の細胞を分離せず、混合細
胞からのDNAをＹ染色体特異的プライマーで増幅して胎
児が雄であるかどうかを決定した。DNA増幅法をこの方
法で行って、病気を伴う遺伝子配列を検出することもで
きることが示唆された。もちろんこの方法は、母親が形
質のキャリヤーである場合は使用できない。
今日まで、羊水又は絨毛性絨毛試験切除が、核タイピ
ングのために十分な数の生存細胞を与える母体内細胞の
唯一の源であった。さらに、DNA分析法は、母親の細胞
と胎児の細胞の特定の差、例えば胎児中のＹ染色体の存
在、又は母親の細胞にはない胎児上のHLA−A2の存在な
どに依存する比較的限られた状況下でのみ可能であっ
た。
ングのために十分な数の生存細胞を与える母体内細胞の
唯一の源であった。さらに、DNA分析法は、母親の細胞
と胎児の細胞の特定の差、例えば胎児中のＹ染色体の存
在、又は母親の細胞にはない胎児上のHLA−A2の存在な
どに依存する比較的限られた状況下でのみ可能であっ
た。
先行技術の説明 Herzenberg及び彼の同僚達は、細胞自動解析分離装置
（FACS）を用いた母親の血液中の母性細胞と胎児細胞の
分離法を記載した。Herzenberg等,Proc.Natl.Acad.Soi.
USA76:1453−1455（1979）では、妊娠15週のHLA A2−
陰性婦人からの血液試料中の細胞をHLA A2抗原に関し
て染色した。染色細胞をFACSにより分離し、集めて胎児
細胞集団を濃縮した。この方法は、母親の血液中の雄の
HLA A2−陽性細胞を有効に同定することが示された
が、現在まで一般に応用して成功していなかった。Iver
spn等,Prenat.Diag.1:61−73（1981）では、15週、又は
21−25週の妊婦からの抹消血リンパ球（PBL）を調べ
た。婦人がHLA A2−陰性の場合は彼女の細胞を抗−HLA
A2−試薬で染色し、FACSにより（HLA A2−陽性の胎
児に関して）顕微鏡のスライド上に分離し、キナクリン
で染色して顕微鏡によりＹ染色体−陽性細胞を調べた。
著者らは、胎児細胞が妊娠15週という早い時期に母親の
循環系に入り込むことを報告している。
（FACS）を用いた母親の血液中の母性細胞と胎児細胞の
分離法を記載した。Herzenberg等,Proc.Natl.Acad.Soi.
USA76:1453−1455（1979）では、妊娠15週のHLA A2−
陰性婦人からの血液試料中の細胞をHLA A2抗原に関し
て染色した。染色細胞をFACSにより分離し、集めて胎児
細胞集団を濃縮した。この方法は、母親の血液中の雄の
HLA A2−陽性細胞を有効に同定することが示された
が、現在まで一般に応用して成功していなかった。Iver
spn等,Prenat.Diag.1:61−73（1981）では、15週、又は
21−25週の妊婦からの抹消血リンパ球（PBL）を調べ
た。婦人がHLA A2−陰性の場合は彼女の細胞を抗−HLA
A2−試薬で染色し、FACSにより（HLA A2−陽性の胎
児に関して）顕微鏡のスライド上に分離し、キナクリン
で染色して顕微鏡によりＹ染色体−陽性細胞を調べた。
著者らは、胎児細胞が妊娠15週という早い時期に母親の
循環系に入り込むことを報告している。
Bianchi等,Cytometry 8:197−202（1987）は、細胞
のDNAを直接ハイブリッド形成させ、それをニトロセル
ロースフィルター上にフローソートする、DNAの単離段
階の必要がない方法を報告している。この方法は、ヒト
臍帯血に関して行った。著者らは、母親の血液から回収
した胎児細胞の場合のように、分析に用いることができ
るDNAの量が限られている場合にこの方法が有用である
と述べている。
のDNAを直接ハイブリッド形成させ、それをニトロセル
ロースフィルター上にフローソートする、DNAの単離段
階の必要がない方法を報告している。この方法は、ヒト
臍帯血に関して行った。著者らは、母親の血液から回収
した胎児細胞の場合のように、分析に用いることができ
るDNAの量が限られている場合にこの方法が有用である
と述べている。
（1987年６月23日に発行されたCalenoffの）U.S.特許
4,675,286は、子宮腔及び羊膜嚢の外表面からの剥離細
胞を、胎児細胞又は母親の細胞のどちらかに選択的に結
合する分離抗体と共にインキュベートすることによる、
診断のために胎児細胞を得る方法を記載している。抗体
は、不溶性担体に結合させて、又は蛍光標識と複合さ
せ、セルソーターで取り出して分離することができる。
4,675,286は、子宮腔及び羊膜嚢の外表面からの剥離細
胞を、胎児細胞又は母親の細胞のどちらかに選択的に結
合する分離抗体と共にインキュベートすることによる、
診断のために胎児細胞を得る方法を記載している。抗体
は、不溶性担体に結合させて、又は蛍光標識と複合さ
せ、セルソーターで取り出して分離することができる。
Truneh等、Cytometry 8:562−567（1987）は、流動
細胞計測法による、細胞上の非常に少数のレセプター数
の検出法を記載している。この方法は、何千もの蛍光発
色分子を含む小胞で細胞を染色し、その小胞を所望の特
異性を持つ抗体と複合させることによる。
細胞計測法による、細胞上の非常に少数のレセプター数
の検出法を記載している。この方法は、何千もの蛍光発
色分子を含む小胞で細胞を染色し、その小胞を所望の特
異性を持つ抗体と複合させることによる。
Albright等、Cytometry 7:536−543（1986）は、流
動細胞計測法の代わりとして喀たん試料中の細胞の遠心
分離を用いることにつき記載している。
動細胞計測法の代わりとして喀たん試料中の細胞の遠心
分離を用いることにつき記載している。
Society for Clinical Cytology 1988 Abstract
s p.6は、異数体及び転座の検出のための非放射活性プ
ローブを用いた、構造的及び数的異常の検出のための、
その場ハイブリッド形成につき記載している（Pinkel
等,No.13）。単クローン性抗体及び流動細胞計測法を用
いた多重パラメーター分析による抹消血Ｔ細胞サブセッ
トのソーティングにより、癌患者の免疫潜在力を研究し
た（Nonura等,No.14）。
s p.6は、異数体及び転座の検出のための非放射活性プ
ローブを用いた、構造的及び数的異常の検出のための、
その場ハイブリッド形成につき記載している（Pinkel
等,No.13）。単クローン性抗体及び流動細胞計測法を用
いた多重パラメーター分析による抹消血Ｔ細胞サブセッ
トのソーティングにより、癌患者の免疫潜在力を研究し
た（Nonura等,No.14）。
Howard M.Shapiro、Alan R.LissによるPractical
Flow Cytometry（第２版）,Inc.1988は、流動細胞計測
法についての高範囲の研究である。この本は、流動細胞
計測器の組み立て、購入及び使用法、ならびに分析の計
画法及び得られたデータの分析法を記載している。
Flow Cytometry（第２版）,Inc.1988は、流動細胞計測
法についての高範囲の研究である。この本は、流動細胞
計測器の組み立て、購入及び使用法、ならびに分析の計
画法及び得られたデータの分析法を記載している。
上記の参照文献及びその中の引用文献のそれぞれをそ
のまま、ここに参照として挿入する。
のまま、ここに参照として挿入する。
発明の概略 本発明は、母親の血液試料から胎児細胞を選択的に回
収する方法を提供する。この方法は、多型遺伝子座の第
１対立遺伝子及び多型遺伝子座の第２対立遺伝子により
発現する、異なる第１及び第２細胞表面抗原を持つ妊婦
からの血液試料につき行う。本方法は、多型細胞表面抗
原、特にHLA抗原に特異的な抗体に対する細胞の異なる
活性に基づいて母性細胞と胎児細胞を分離する。特に伝
達されない母親の対立遺伝子によりコードされる細胞表
面抗原に関して特異的な抗体に対する胎児細胞の非−反
応性に基づいて胎児細胞及び母親の細胞を分離する。
収する方法を提供する。この方法は、多型遺伝子座の第
１対立遺伝子及び多型遺伝子座の第２対立遺伝子により
発現する、異なる第１及び第２細胞表面抗原を持つ妊婦
からの血液試料につき行う。本方法は、多型細胞表面抗
原、特にHLA抗原に特異的な抗体に対する細胞の異なる
活性に基づいて母性細胞と胎児細胞を分離する。特に伝
達されない母親の対立遺伝子によりコードされる細胞表
面抗原に関して特異的な抗体に対する胎児細胞の非−反
応性に基づいて胎児細胞及び母親の細胞を分離する。
方法は、以下の段階を含む。多形遺伝子座の第１対立
遺伝子によりコードされる第１細胞表面抗原及び多形遺
伝子座の第２対立遺伝子によりコードされる第２の異な
る細胞表面抗原を持つ妊婦の血液試料からの細胞を第１
細胞表面抗原に関して特異的な抗体と、抗体が結合する
のに十分な時間、合わせておく。抗体に結合した細胞を
抗体に結合しない細胞から分離し、結合しない分離細胞
を回収する。50％の確率で、抗原をコードする対立遺伝
子は伝達されず、抗体に結合した母性細胞を非結合胎児
細胞から分離することができる。
遺伝子によりコードされる第１細胞表面抗原及び多形遺
伝子座の第２対立遺伝子によりコードされる第２の異な
る細胞表面抗原を持つ妊婦の血液試料からの細胞を第１
細胞表面抗原に関して特異的な抗体と、抗体が結合する
のに十分な時間、合わせておく。抗体に結合した細胞を
抗体に結合しない細胞から分離し、結合しない分離細胞
を回収する。50％の確率で、抗原をコードする対立遺伝
子は伝達されず、抗体に結合した母性細胞を非結合胎児
細胞から分離することができる。
好ましい具体化の場合、細胞を第２細胞表面抗原に関
して特異的な第２抗体とも接触させる。母性細胞は、両
方の抗体と反応する。胎児が母親の対立遺伝子の両方を
受け継いでいる場合を除いて、胎児は最高でも抗体のひ
とつとしか反応しない。最も好ましい具体化の場合、対
立遺伝子は１個の遺伝子座、好ましくはHLA遺伝子座に
関する対立遺伝子である。胎児が父親から非伝達対立遺
伝子を受け継いでいない場合、２個の母親の対立遺伝子
中のひとつしか受け継いでいない胎児細胞は、このよう
にして２個の抗体のひとつとしか反応しない。胎児がこ
れらの対立遺伝子に関して母親と同一のHLA型の場合
（すなわち胎児が父親から母親の非−伝達対立遺伝子を
受け継いでいる場合）、胎児細胞及び母性細胞の抗体と
の反応性に差がないであろう。試料中の細胞が抗体のひ
とつと反応しなくなるようになるまで、母親の他のHLA
抗原に関して特異的な抗体を使用することができる。
して特異的な第２抗体とも接触させる。母性細胞は、両
方の抗体と反応する。胎児が母親の対立遺伝子の両方を
受け継いでいる場合を除いて、胎児は最高でも抗体のひ
とつとしか反応しない。最も好ましい具体化の場合、対
立遺伝子は１個の遺伝子座、好ましくはHLA遺伝子座に
関する対立遺伝子である。胎児が父親から非伝達対立遺
伝子を受け継いでいない場合、２個の母親の対立遺伝子
中のひとつしか受け継いでいない胎児細胞は、このよう
にして２個の抗体のひとつとしか反応しない。胎児がこ
れらの対立遺伝子に関して母親と同一のHLA型の場合
（すなわち胎児が父親から母親の非−伝達対立遺伝子を
受け継いでいる場合）、胎児細胞及び母性細胞の抗体と
の反応性に差がないであろう。試料中の細胞が抗体のひ
とつと反応しなくなるようになるまで、母親の他のHLA
抗原に関して特異的な抗体を使用することができる。
胎児細胞及び母性細胞の抗体反応性の差を用い、抗体
の固相への固定、あるいは蛍光発色−標識抗体を用いた
FACSに基づく２通りの一般的方法で細胞を分離すること
ができる。固相分離の場合、選んだ各母性抗原に関して
別々に細胞を固相−固定抗体（例えば磁気ビーズ−固定
抗体）と接触させる。母性細胞は、それぞれの抗体と結
合する。胎児細胞は、非伝達抗原に関する抗体と反応せ
ず、固相に結合せず、回収される。FACSに基づく分離の
場合、抗体を蛍光発色団で標識し、非標識胎児細胞が標
識された母性細胞から分離される。好ましい具体化にお
いては、２つの母親の対立遺伝子に関する抗体を異なる
蛍光発色団で標識し、二重標識母性細胞を非標識及び一
重標識胎児細胞から分離する。
の固相への固定、あるいは蛍光発色−標識抗体を用いた
FACSに基づく２通りの一般的方法で細胞を分離すること
ができる。固相分離の場合、選んだ各母性抗原に関して
別々に細胞を固相−固定抗体（例えば磁気ビーズ−固定
抗体）と接触させる。母性細胞は、それぞれの抗体と結
合する。胎児細胞は、非伝達抗原に関する抗体と反応せ
ず、固相に結合せず、回収される。FACSに基づく分離の
場合、抗体を蛍光発色団で標識し、非標識胎児細胞が標
識された母性細胞から分離される。好ましい具体化にお
いては、２つの母親の対立遺伝子に関する抗体を異なる
蛍光発色団で標識し、二重標識母性細胞を非標識及び一
重標識胎児細胞から分離する。
分離した胎児細胞は、多様な方法で使用することがで
きる。回収胎児細胞のDNAを用いて、特にDNA増幅法を用
いた多様な遺伝形質の決定を行うことができる。好まし
い具体化の場合、胎児細胞を培養し、培養物を核タイピ
グに使用する。古典的に核タイピング及びその場ハイブ
リッド形成により明らかにされてきた細胞遺伝的異常
を、ゲル電気泳動により明らかにすることも目的として
いる。
きる。回収胎児細胞のDNAを用いて、特にDNA増幅法を用
いた多様な遺伝形質の決定を行うことができる。好まし
い具体化の場合、胎児細胞を培養し、培養物を核タイピ
グに使用する。古典的に核タイピング及びその場ハイブ
リッド形成により明らかにされてきた細胞遺伝的異常
を、ゲル電気泳動により明らかにすることも目的として
いる。
発明の詳細な説明 本発明は、母親の血液試料中の胎児細胞を選択的に回
収する方法を提供する。方法は、細胞の多型表面抗原、
特にHLA抗原に特異的な抗体への、細胞の反応性の差に
より母性細胞及び胎児細胞を分離することに基づく。HL
A遺伝子座（又は他の多型遺伝子座）に関して、胎児は
ひとつの対立遺伝子を母親から受け継いでいる。非伝達
対立遺伝子により発現する抗原に関して特異的な抗体と
の、胎児細胞の非−反応性を利用して胎児細胞と母親の
細胞を分離することができる。
収する方法を提供する。方法は、細胞の多型表面抗原、
特にHLA抗原に特異的な抗体への、細胞の反応性の差に
より母性細胞及び胎児細胞を分離することに基づく。HL
A遺伝子座（又は他の多型遺伝子座）に関して、胎児は
ひとつの対立遺伝子を母親から受け継いでいる。非伝達
対立遺伝子により発現する抗原に関して特異的な抗体と
の、胎児細胞の非−反応性を利用して胎児細胞と母親の
細胞を分離することができる。
特に、選ばれた母親の抗原を固相に固定することがで
きる。母親の細胞は、抗体との反応により固相に固定さ
れる。抗原が非伝達対立遺伝子によりコードされる（及
び胎児が父親から母親の非伝達対立遺伝子を受け継いで
いない）場合、胎児細胞は抗体と結合せず、回収されな
い。別法として、抗体を蛍光発色団で標識し、標識した
母性細胞を、非標識胎児細胞から分離することができ
る。
きる。母親の細胞は、抗体との反応により固相に固定さ
れる。抗原が非伝達対立遺伝子によりコードされる（及
び胎児が父親から母親の非伝達対立遺伝子を受け継いで
いない）場合、胎児細胞は抗体と結合せず、回収されな
い。別法として、抗体を蛍光発色団で標識し、標識した
母性細胞を、非標識胎児細胞から分離することができ
る。
２種類の母性細胞表面抗原に特異的な抗体を使用する
のが好ましい。２種類の選ばれた母親の対立遺伝子が異
なる多型遺伝子座のものである場合、胎児が両方の対立
遺伝子を受け継いでいる確率は４分の１である。すなわ
ち４分の３の確率で胎児は２種類の母親の対立遺伝子の
ひとつを母親から受け継ぐか又は全く受け継がない。従
って母親の血液試料を、これらのHLA遺伝子座の選ばれ
た各対立遺伝子に関する抗体と合わせると、（胎児が父
親から母親の非伝達対立遺伝子を受け継いでいない場
合）母性細胞が両方の抗体と反応し、胎児細胞が抗体の
ひとつ（確率４分の２）と反応するか、又はどちらの抗
体とも反応しない（確率４分の１）。
のが好ましい。２種類の選ばれた母親の対立遺伝子が異
なる多型遺伝子座のものである場合、胎児が両方の対立
遺伝子を受け継いでいる確率は４分の１である。すなわ
ち４分の３の確率で胎児は２種類の母親の対立遺伝子の
ひとつを母親から受け継ぐか又は全く受け継がない。従
って母親の血液試料を、これらのHLA遺伝子座の選ばれ
た各対立遺伝子に関する抗体と合わせると、（胎児が父
親から母親の非伝達対立遺伝子を受け継いでいない場
合）母性細胞が両方の抗体と反応し、胎児細胞が抗体の
ひとつ（確率４分の２）と反応するか、又はどちらの抗
体とも反応しない（確率４分の１）。
母親がHLA遺伝子座に関してヘテロ接合体の場合（及
び胎児が父親から母親の非伝達対立遺伝子を受け継いで
いない場合）、母親及び胎児がHLA遺伝子座に関して異
なる対立遺伝子を持つ。従って母親の血液試料を抗体と
合わせると母性細胞が両方の抗体と反応し、胎児細胞が
抗体のひとつだけと反応する。
び胎児が父親から母親の非伝達対立遺伝子を受け継いで
いない場合）、母親及び胎児がHLA遺伝子座に関して異
なる対立遺伝子を持つ。従って母親の血液試料を抗体と
合わせると母性細胞が両方の抗体と反応し、胎児細胞が
抗体のひとつだけと反応する。
母親の２種類の抗原に関する抗体を異なる蛍光発色団
で標識すると、一重標識又は非標識胎児細胞が、細胞自
動解析分離装置（FACS）を用いて二重標識された母性細
胞から容易に分離され、胎児細胞の分離及び回収ができ
る。同様に母親の非伝達対立遺伝子によりコードされる
細胞表面抗原に関する抗体を固相に結合した場合、母性
細胞のみが固相に結合する。非結合胎児細胞は、結合し
た母性細胞から容易に分離し、回収することができる。
で標識すると、一重標識又は非標識胎児細胞が、細胞自
動解析分離装置（FACS）を用いて二重標識された母性細
胞から容易に分離され、胎児細胞の分離及び回収ができ
る。同様に母親の非伝達対立遺伝子によりコードされる
細胞表面抗原に関する抗体を固相に結合した場合、母性
細胞のみが固相に結合する。非結合胎児細胞は、結合し
た母性細胞から容易に分離し、回収することができる。
回収した胎児細胞は、いろいろな分析に使用すること
ができる。回収した胎児細胞中のDNAは、多様な遺伝形
質の決定に使用することができる。好ましい具体化の場
合、胎児細胞を培養し、培養物を核タイピングに使用す
る。古典的に核タイピング及びその場ハイブリッド形成
により明らかにされてきた細胞遺伝的異常を、ゲル電気
泳動により明らかにすることも計画されている。
ができる。回収した胎児細胞中のDNAは、多様な遺伝形
質の決定に使用することができる。好ましい具体化の場
合、胎児細胞を培養し、培養物を核タイピングに使用す
る。古典的に核タイピング及びその場ハイブリッド形成
により明らかにされてきた細胞遺伝的異常を、ゲル電気
泳動により明らかにすることも計画されている。
本発明の胎児細胞回収法は、先行技術の方法で達成す
ることができなかった利点を与える。先行技術との最も
重要な差は、父親の寄与に関する情報が不必要なことで
ある。母親のHLA対立遺伝子の同定のみが必要である。
識別可能な自然の父親の対立遺伝子の同定が不必要なだ
けでなく、胎児が父親から母親の対立遺伝子を受け継い
でいなければ、母性細胞と胎児細胞を区別するパターン
を見いだすために調べなければならない抗原の数が限ら
れる。
ることができなかった利点を与える。先行技術との最も
重要な差は、父親の寄与に関する情報が不必要なことで
ある。母親のHLA対立遺伝子の同定のみが必要である。
識別可能な自然の父親の対立遺伝子の同定が不必要なだ
けでなく、胎児が父親から母親の対立遺伝子を受け継い
でいなければ、母性細胞と胎児細胞を区別するパターン
を見いだすために調べなければならない抗原の数が限ら
れる。
選ばれた遺伝子座に関する非−母親対立遺伝子−コー
ド抗原すべてに特異的な抗体の混合物の使用の必要もな
い。方法は、子供が受け継いでいるかも知れない識別で
きる父親の対立遺伝子を用いた胎児細胞の同定の試みを
当てにしていない。さらに本方法は、胎児細胞中に母親
の抗原がないことに基づいて胎児細胞と母親の細胞を分
離するので、前以て父親の抗原と出会っていなくても胎
児細胞を有効に分離することができる。母性細胞上に存
在する抗原が一度同定されると、どのような非伝達抗原
も分離の基礎となることができる。さらに抗体のひとつ
と反応しない細胞が試料中に存在することは、胎児細胞
が抗体反応の差に基づいて区別されたことを示す。それ
以上の評価をする必要はない。
ド抗原すべてに特異的な抗体の混合物の使用の必要もな
い。方法は、子供が受け継いでいるかも知れない識別で
きる父親の対立遺伝子を用いた胎児細胞の同定の試みを
当てにしていない。さらに本方法は、胎児細胞中に母親
の抗原がないことに基づいて胎児細胞と母親の細胞を分
離するので、前以て父親の抗原と出会っていなくても胎
児細胞を有効に分離することができる。母性細胞上に存
在する抗原が一度同定されると、どのような非伝達抗原
も分離の基礎となることができる。さらに抗体のひとつ
と反応しない細胞が試料中に存在することは、胎児細胞
が抗体反応の差に基づいて区別されたことを示す。それ
以上の評価をする必要はない。
本方法は、“胎児”抗原、例えば母性細胞のあるもの
も発現する場合がある胎児ヘモグロビンなどに基づいて
胎児細胞を区別しようとしていない。本方法の場合、母
性細胞のあるものにも存在する胎児抗原（悪性胎児抗
原）を選択するのではなく、胎児細胞には存在しない母
性抗原を利用する。試料中の細胞のいくらかと反応しな
い抗体が一度同定されたら、抗体と反応しない細胞はす
べて胎児細胞である。さらに、HLA抗原を発現するすべ
ての核化胎児細胞は、HLA抗原が胎児に伝達されないの
で、抗体と反応しない。反応性の欠如は、発生の特定の
胎児段階又は特定の胎児細胞型に関連してはいない。従
ってすべての非反応性細胞は、胎児細胞である。
も発現する場合がある胎児ヘモグロビンなどに基づいて
胎児細胞を区別しようとしていない。本方法の場合、母
性細胞のあるものにも存在する胎児抗原（悪性胎児抗
原）を選択するのではなく、胎児細胞には存在しない母
性抗原を利用する。試料中の細胞のいくらかと反応しな
い抗体が一度同定されたら、抗体と反応しない細胞はす
べて胎児細胞である。さらに、HLA抗原を発現するすべ
ての核化胎児細胞は、HLA抗原が胎児に伝達されないの
で、抗体と反応しない。反応性の欠如は、発生の特定の
胎児段階又は特定の胎児細胞型に関連してはいない。従
ってすべての非反応性細胞は、胎児細胞である。
多型遺伝子座−コード抗原の選択 胎児は、その染色体の半分を母親から、及び半分を父
親から受け継ぐ。HLA遺伝子座などのそれぞれの多型遺
伝子座に関して胎児は、対立遺伝子のひとつを母親か
ら、ひとつを父親から受け継ぐ。従って母親と胎児は常
に各多型遺伝子座に関して少なくともひとつの対立遺伝
子を共通に持つ。胎児が受け継がない母親の対立遺伝子
は、胎児が父親から非伝達対立遺伝子を受け継いだ場合
を除いて母性細胞に独特である。
親から受け継ぐ。HLA遺伝子座などのそれぞれの多型遺
伝子座に関して胎児は、対立遺伝子のひとつを母親か
ら、ひとつを父親から受け継ぐ。従って母親と胎児は常
に各多型遺伝子座に関して少なくともひとつの対立遺伝
子を共通に持つ。胎児が受け継がない母親の対立遺伝子
は、胎児が父親から非伝達対立遺伝子を受け継いだ場合
を除いて母性細胞に独特である。
どのような多型遺伝子座に関しても、胎児は多くても
母親の対立遺伝子のひとつを受け継ぐであろう。母親が
遺伝子座に関してヘテロ接合体の場合、胎児が父親から
非伝達対立遺伝子を受け継いだ場合のみに母親と胎児が
同一の対立遺伝子を持つ。そのような現象の起こる確率
は、集団における非伝達対立遺伝子の頻度に依存する。
遺伝子座は、下記のように、選択した抗原に関する対立
遺伝子を胎児が父親から受け継いでいる確率を最小にす
るように選択するのが好ましい。
母親の対立遺伝子のひとつを受け継ぐであろう。母親が
遺伝子座に関してヘテロ接合体の場合、胎児が父親から
非伝達対立遺伝子を受け継いだ場合のみに母親と胎児が
同一の対立遺伝子を持つ。そのような現象の起こる確率
は、集団における非伝達対立遺伝子の頻度に依存する。
遺伝子座は、下記のように、選択した抗原に関する対立
遺伝子を胎児が父親から受け継いでいる確率を最小にす
るように選択するのが好ましい。
多数の多型遺伝子座が周知であり、遺伝子座により発
現する細胞表面抗原の決定により直接又は間接にこれら
の遺伝子座に関する対立遺伝子型を決定する方法も同様
である。選択された遺伝子座は、少なくとも２個の対立
遺伝子を持ち、そのそれぞれがその集団のかなりのパー
センテージを成す。遺伝子座は、集団中でかなりのパー
センテージで存在する多くの対立遺伝子を持つのが好ま
しい。そのような遺伝子座を選択することにより、父親
が母親の非伝達対立遺伝子を胎児に与えていない確率を
最大とすることができる。
現する細胞表面抗原の決定により直接又は間接にこれら
の遺伝子座に関する対立遺伝子型を決定する方法も同様
である。選択された遺伝子座は、少なくとも２個の対立
遺伝子を持ち、そのそれぞれがその集団のかなりのパー
センテージを成す。遺伝子座は、集団中でかなりのパー
センテージで存在する多くの対立遺伝子を持つのが好ま
しい。そのような遺伝子座を選択することにより、父親
が母親の非伝達対立遺伝子を胎児に与えていない確率を
最大とすることができる。
好ましい具体化の場合、選ばれた遺伝子座の対立遺伝
子は、血清法を用いて機械的操作で検出される。このよ
うにして、遺伝子座のタイピングに使用できる抗体試薬
は、本発明の分離法における試薬として使用できる。
子は、血清法を用いて機械的操作で検出される。このよ
うにして、遺伝子座のタイピングに使用できる抗体試薬
は、本発明の分離法における試薬として使用できる。
細胞表面抗原をコードする適した遺伝子座は、分化の
初期から後期を通じて細胞上に存在する。しかし核化胎
児細胞により発現するいずれの表面抗原も使用すること
ができる。例えば適した遺伝子座は、血液型抗原、特に
ABO型、キッド型、ダッフィー型、ルイス型、ｐ型、Ｉ
型などの抗原をコードする。同等の結果を与える多型遺
伝子座は、副組織適合抗原遺伝子座及び胎児細胞及び母
性細胞上に存在する細胞表面抗原をコードする他の多型
遺伝子座に伴うものである。本発明で用いるのに最も好
ましい遺伝子座は、HLA遺伝子座である。抗原は、すべ
ての核化細胞により発現し、発生の初期に胎児細胞上に
存在する。さらに患者のHLA型の決定法は、周知であ
り、HLA抗原に対する多数の抗体が商業的に入手可能で
ある。抗原の選択に関する今後の議論は、HLA抗原を例
として用いる。他の多型遺伝座によりコードされる抗原
の使用の場合も類似の考えを適用ることができる。
初期から後期を通じて細胞上に存在する。しかし核化胎
児細胞により発現するいずれの表面抗原も使用すること
ができる。例えば適した遺伝子座は、血液型抗原、特に
ABO型、キッド型、ダッフィー型、ルイス型、ｐ型、Ｉ
型などの抗原をコードする。同等の結果を与える多型遺
伝子座は、副組織適合抗原遺伝子座及び胎児細胞及び母
性細胞上に存在する細胞表面抗原をコードする他の多型
遺伝子座に伴うものである。本発明で用いるのに最も好
ましい遺伝子座は、HLA遺伝子座である。抗原は、すべ
ての核化細胞により発現し、発生の初期に胎児細胞上に
存在する。さらに患者のHLA型の決定法は、周知であ
り、HLA抗原に対する多数の抗体が商業的に入手可能で
ある。抗原の選択に関する今後の議論は、HLA抗原を例
として用いる。他の多型遺伝座によりコードされる抗原
の使用の場合も類似の考えを適用ることができる。
本方法の場合、母親のHLA型がわかっていると、母親
の２個のHLA抗原に関して入手できるいずれのHLA抗原−
特異的抗体も使用することができる。抗体は、母親がヘ
テロ接合体であるHLA遺伝子座の抗原に特異的であるこ
とが好ましい。
の２個のHLA抗原に関して入手できるいずれのHLA抗原−
特異的抗体も使用することができる。抗体は、母親がヘ
テロ接合体であるHLA遺伝子座の抗原に特異的であるこ
とが好ましい。
母親のHLA型が未知の場合、少なくとも１個のHLA遺伝
子座、好ましくは２個かそれ以上の遺伝子座に関する対
立遺伝子を、好ましくはその遺伝子座の抗原に特異的な
抗体を用いて決定する。遺伝子座の２個の対立遺伝子に
特異的な抗体が母性細胞と反応したら、これらの抗体を
胎児細胞の同定及び分離に使用することができる。この
ようにして、方法に有用な抗体試薬を入手できること
が、分離法の最初に明らかとなる。別の場合、HLA型をD
NA法により決定することができ、対立遺伝子をコードさ
れる抗原に関する抗体の入手性に基づいて選ぶことがで
きる。
子座、好ましくは２個かそれ以上の遺伝子座に関する対
立遺伝子を、好ましくはその遺伝子座の抗原に特異的な
抗体を用いて決定する。遺伝子座の２個の対立遺伝子に
特異的な抗体が母性細胞と反応したら、これらの抗体を
胎児細胞の同定及び分離に使用することができる。この
ようにして、方法に有用な抗体試薬を入手できること
が、分離法の最初に明らかとなる。別の場合、HLA型をD
NA法により決定することができ、対立遺伝子をコードさ
れる抗原に関する抗体の入手性に基づいて選ぶことがで
きる。
遺伝子座は、Ｉ型遺伝子座（A,B及びＣ）及びII型遺
伝子座（DR,DQ及びDP）のいずれか２つであることが好
ましい。これらの遺伝子座は、通常血清法によりタイピ
ングされるので、これらの遺伝子座の多くの対立遺伝子
に関するHLA抗原−特異的抗体を商業的に入手できる。
特にＡ及びDR/DQ抗原に関する多数の単クローン性抗体
がある。
伝子座（DR,DQ及びDP）のいずれか２つであることが好
ましい。これらの遺伝子座は、通常血清法によりタイピ
ングされるので、これらの遺伝子座の多くの対立遺伝子
に関するHLA抗原−特異的抗体を商業的に入手できる。
特にＡ及びDR/DQ抗原に関する多数の単クローン性抗体
がある。
使用するHLA対立遺伝子を選ぶ場合に、最初に考えな
ければならないのは、対立遺伝子により発現する抗原に
関する抗体の入手性である。母親に存在する多数の対立
遺伝子の抗原に関する抗体が入手できる場合、上記の通
り集団中にかなりの数で存在する対立遺伝子を多数持つ
遺伝子座から対立遺伝子を選ぶのが好ましい。
ければならないのは、対立遺伝子により発現する抗原に
関する抗体の入手性である。母親に存在する多数の対立
遺伝子の抗原に関する抗体が入手できる場合、上記の通
り集団中にかなりの数で存在する対立遺伝子を多数持つ
遺伝子座から対立遺伝子を選ぶのが好ましい。
母親のHLA遺伝子座のいずれの対立遺伝子の抗原に特
異的な抗体も、母親の血液試料の細胞の分離に使用する
ために選ぶことができる。抗体は、多クローン性又は単
クローン性であることができ、単クローン性が好まし
い。選んだ対立遺伝子は、２個の異なる遺伝子座のもの
であることができる。
異的な抗体も、母親の血液試料の細胞の分離に使用する
ために選ぶことができる。抗体は、多クローン性又は単
クローン性であることができ、単クローン性が好まし
い。選んだ対立遺伝子は、２個の異なる遺伝子座のもの
であることができる。
２個のHLA遺伝子座に関する対立遺伝子を用いる場
合、対立遺伝子がひとつの染色体上にあり、組み替えが
起こらない場合にのみ胎児は両方の対立遺伝子を受け継
ぐ。この場合は、２個の遺伝子座の使用により１個の遺
伝子座を用いた場合と同様の結果が得られる。すなわち
半分の確率で有効な分離が行われ、半分の確率で胎児が
母親と同一の対立遺伝子を持ち、分離が行われない。２
個の対立遺伝子を用いて分離を確実にするためには、選
ぶ対立遺伝子が異なる染色体からのものでなければなら
ない。すなわち母親の異なるハプロタイプからのもので
なければならない。
合、対立遺伝子がひとつの染色体上にあり、組み替えが
起こらない場合にのみ胎児は両方の対立遺伝子を受け継
ぐ。この場合は、２個の遺伝子座の使用により１個の遺
伝子座を用いた場合と同様の結果が得られる。すなわち
半分の確率で有効な分離が行われ、半分の確率で胎児が
母親と同一の対立遺伝子を持ち、分離が行われない。２
個の対立遺伝子を用いて分離を確実にするためには、選
ぶ対立遺伝子が異なる染色体からのものでなければなら
ない。すなわち母親の異なるハプロタイプからのもので
なければならない。
ほとんどのDNA法及びすべての血清法は、母親のハプ
ロタイプを決定しない。２個の遺伝子座に関して４個の
対立遺伝子が決定されるが、ハプロタイプを構成する対
立遺伝子に関する情報は、決定されない。本方法の場
合、選んだ対立遺伝子が一緒に受け継がれないことを確
認するために、ハプロタイプを決定するのが好ましい。
ハプロタイプの決定法には、単相細胞の分析（例えば精
液中のDNAの分析）及びDNAを希釈して単相とする方法
（Ruano等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,87:6296−6300（1
990））が含まれる。好ましい方法は、8/20/90出願、19
91年２月25日公開のMalcolm J.SimonsによるIntron S
equence Analysis Method for Detection of Adj
acent and Romote Locus Alleles as Haplotypes
の標題のEPO出願番号90.309107.2に記載されている。
ロタイプを決定しない。２個の遺伝子座に関して４個の
対立遺伝子が決定されるが、ハプロタイプを構成する対
立遺伝子に関する情報は、決定されない。本方法の場
合、選んだ対立遺伝子が一緒に受け継がれないことを確
認するために、ハプロタイプを決定するのが好ましい。
ハプロタイプの決定法には、単相細胞の分析（例えば精
液中のDNAの分析）及びDNAを希釈して単相とする方法
（Ruano等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,87:6296−6300（1
990））が含まれる。好ましい方法は、8/20/90出願、19
91年２月25日公開のMalcolm J.SimonsによるIntron S
equence Analysis Method for Detection of Adj
acent and Romote Locus Alleles as Haplotypes
の標題のEPO出願番号90.309107.2に記載されている。
別の場合、１個の遺伝子座に関する母親の両方の対立
遺伝子が決定されたら、対立遺伝子は必然的に異なる染
色体上にあり、胎児は、母親から対立遺伝子の１個を受
け継ぐ。従って適した試薬が得られれば常に１個の遺伝
子座の対立遺伝子によりコードされる２個の抗原に特異
的な抗体は、選ぶことができる。
遺伝子が決定されたら、対立遺伝子は必然的に異なる染
色体上にあり、胎児は、母親から対立遺伝子の１個を受
け継ぐ。従って適した試薬が得られれば常に１個の遺伝
子座の対立遺伝子によりコードされる２個の抗原に特異
的な抗体は、選ぶことができる。
前に述べた通り、抗体は１個のHLA遺伝子座の対立遺
伝子により発現する２個の抗原に特異的であることが好
ましい。他の好ましい具体化の場合、抗体は、１個以上
のHLA遺伝子座の対立遺伝子により発現する両方の抗原
に特異的である。胎児が母親の非伝達対立遺伝子を父親
から受け継いだ場合、別のHLA遺伝子座の対立遺伝子に
より生産された抗原に対する抗体を選んで分離法を繰り
返す。他の多型遺伝子座によりコードされる抗原の選択
に関しても、同様の考えを適用する。
伝子により発現する２個の抗原に特異的であることが好
ましい。他の好ましい具体化の場合、抗体は、１個以上
のHLA遺伝子座の対立遺伝子により発現する両方の抗原
に特異的である。胎児が母親の非伝達対立遺伝子を父親
から受け継いだ場合、別のHLA遺伝子座の対立遺伝子に
より生産された抗原に対する抗体を選んで分離法を繰り
返す。他の多型遺伝子座によりコードされる抗原の選択
に関しても、同様の考えを適用する。
特定の試料の場合に使用する抗体を選んだら、分離法
の種類に依存して抗体を固相に結合するか又は細胞の標
識に用いる。それぞれの方法は、下記に一般的に記載す
る。さらにそれぞれの種類の分離法に関する好ましい方
法の例を実施例にて詳細に説明する。
の種類に依存して抗体を固相に結合するか又は細胞の標
識に用いる。それぞれの方法は、下記に一般的に記載す
る。さらにそれぞれの種類の分離法に関する好ましい方
法の例を実施例にて詳細に説明する。
細胞の供給源及び精製 本方法は、母親の血液試料、特に静脈血試料中に存在
する胎児細胞の回収のために計画する。妊婦は、妊娠の
最初の３カ月であることが好ましい。試料は、ヘパリン
を含む試料又は好ましくはACD溶液などの、凝固を予防
したどのような血液試料であることもできる。試料は、
使用まで０−４℃に保存して死亡細胞、細胞破片及び細
胞塊の数を最小にするのが好ましい。試料中の胎児細胞
の数は、胎児の月令、胎児／母親の数、各エピソード中
の血液の量及び最後の出血からの時間などの因子に依存
して変化する。典型的に７−20mlの母親の血液が、母性
細胞からの分離に十分な胎児細胞を与える。試料を追加
することなく十分な細胞を確実に得るために、30ml又は
それ以上の血液を採取するのが好ましい。第２の分離が
必要な場合、細胞を37℃にて約２時間インキュベート
し、その後洗浄して前に使用した抗体を除去する。血液
試料の追加は、必要でない。
する胎児細胞の回収のために計画する。妊婦は、妊娠の
最初の３カ月であることが好ましい。試料は、ヘパリン
を含む試料又は好ましくはACD溶液などの、凝固を予防
したどのような血液試料であることもできる。試料は、
使用まで０−４℃に保存して死亡細胞、細胞破片及び細
胞塊の数を最小にするのが好ましい。試料中の胎児細胞
の数は、胎児の月令、胎児／母親の数、各エピソード中
の血液の量及び最後の出血からの時間などの因子に依存
して変化する。典型的に７−20mlの母親の血液が、母性
細胞からの分離に十分な胎児細胞を与える。試料を追加
することなく十分な細胞を確実に得るために、30ml又は
それ以上の血液を採取するのが好ましい。第２の分離が
必要な場合、細胞を37℃にて約２時間インキュベート
し、その後洗浄して前に使用した抗体を除去する。血液
試料の追加は、必要でない。
母親の血液は、少なくとも３つの主要な型の核化胎児
細胞：核化赤芽球、合胞体栄養細胞及びリンパ球を含
む。血液試料は、精製して赤血球（RBC）を除去する。
精製試料中に３つの主要な型の核化胎児細胞を 保つのが好ましい。RBCは、低張溶液、例えば0.037％の
EDTAを含む0.87％塩化アンモニウム中で細胞をインキュ
ベートすることにより除去することができる。この方法
は、Ficollなどの濃度勾配材料は糖で細胞を被覆し、そ
れが分離法と低触するので、固相に基づく分離の場合に
特に好ましい。
細胞：核化赤芽球、合胞体栄養細胞及びリンパ球を含
む。血液試料は、精製して赤血球（RBC）を除去する。
精製試料中に３つの主要な型の核化胎児細胞を 保つのが好ましい。RBCは、低張溶液、例えば0.037％の
EDTAを含む0.87％塩化アンモニウム中で細胞をインキュ
ベートすることにより除去することができる。この方法
は、Ficollなどの濃度勾配材料は糖で細胞を被覆し、そ
れが分離法と低触するので、固相に基づく分離の場合に
特に好ましい。
別の場合、濃度勾配分離により得た抹消血リンパ球
（PBL）を用いることができる。PBLは、多数の核化胎児
細胞を含む。簡便にPBLを精製するために、RBCとPBLの
濃度の中間の濃度を持つ濃度勾配媒地、例えばFicoll−
Hypaque及びPercoll（両方ともPharmacia,Piscataway,N
J）を用いてPBLを得る。PBLの層を取り出し、懸濁媒地
に懸濁する。細胞を洗浄し、ペレットを分離法に適した
濃度で懸濁媒地に再懸濁する。同様に核化赤芽球及び合
胞体栄養細胞の濃度勾配分離のための特異的バンド形成
材料を使用することができる。
（PBL）を用いることができる。PBLは、多数の核化胎児
細胞を含む。簡便にPBLを精製するために、RBCとPBLの
濃度の中間の濃度を持つ濃度勾配媒地、例えばFicoll−
Hypaque及びPercoll（両方ともPharmacia,Piscataway,N
J）を用いてPBLを得る。PBLの層を取り出し、懸濁媒地
に懸濁する。細胞を洗浄し、ペレットを分離法に適した
濃度で懸濁媒地に再懸濁する。同様に核化赤芽球及び合
胞体栄養細胞の濃度勾配分離のための特異的バンド形成
材料を使用することができる。
固層分離法を下記で議論し、その後FACS分離につき議
論する。固相に基づく、及びFACSに基づく分離法の懸濁
媒地及び適した細胞濃度をこれらの議論中で記載する。
論する。固相に基づく、及びFACSに基づく分離法の懸濁
媒地及び適した細胞濃度をこれらの議論中で記載する。
固相分離 前記の通り、母親の非伝達細胞表面抗原に特異的な抗
体との反応性が胎児細胞に欠如していることに基づい
て、血液中の母性細胞から胎児細胞を分離することがで
きる。簡単に言うと母性抗原−特異的抗体は、直接又は
抗原特異的抗体と結合する固相−固定架橋の使用によ
り、固相に結合することができる。母性細胞は、架橋と
結合し、固相に固定される。抗原−特異的抗体が非伝達
対立遺伝子の抗原に関するものである場合、胎児細胞は
固相に結合せず、分離され、回収することができる。分
離法を下記に記載する。
体との反応性が胎児細胞に欠如していることに基づい
て、血液中の母性細胞から胎児細胞を分離することがで
きる。簡単に言うと母性抗原−特異的抗体は、直接又は
抗原特異的抗体と結合する固相−固定架橋の使用によ
り、固相に結合することができる。母性細胞は、架橋と
結合し、固相に固定される。抗原−特異的抗体が非伝達
対立遺伝子の抗原に関するものである場合、胎児細胞は
固相に結合せず、分離され、回収することができる。分
離法を下記に記載する。
分離のための固相の選択及び調製 胎児細胞の分離のための固相は、抗体に基づく細胞分
離に従来用いられている、例えばプラスチックプレー
ト、皿、フラスコ及び管；ビーズ、例えばポリアクリル
アミド、セファデックス、アガロース−ポリアクロレイ
ン、トリサクリル及びラテックス；ナイロン円板、なら
びに牛赤血球であることができる。固相は、細胞を接触
させる皿、フラスコ又は管の形態であることができ、容
器中の、又はカラムに充填したビーズ又は円板として存
在することができ（例えばビーズ及び赤血球）、細胞を
そこに通過させる。管又は他の容器中の磁気ビーズの使
用が最も好ましい。細胞の単離のためのアフィニティー
クロマトグラフィー法は、周知であり、Affinity Chro
matograhpy;A Practical Approach,ed.P.D.G.Dean,IR
L Press（1985）及びそこに引用されている文献に記載
されており、そのそれぞれをここに参照として挿入す
る。
離に従来用いられている、例えばプラスチックプレー
ト、皿、フラスコ及び管；ビーズ、例えばポリアクリル
アミド、セファデックス、アガロース−ポリアクロレイ
ン、トリサクリル及びラテックス；ナイロン円板、なら
びに牛赤血球であることができる。固相は、細胞を接触
させる皿、フラスコ又は管の形態であることができ、容
器中の、又はカラムに充填したビーズ又は円板として存
在することができ（例えばビーズ及び赤血球）、細胞を
そこに通過させる。管又は他の容器中の磁気ビーズの使
用が最も好ましい。細胞の単離のためのアフィニティー
クロマトグラフィー法は、周知であり、Affinity Chro
matograhpy;A Practical Approach,ed.P.D.G.Dean,IR
L Press（1985）及びそこに引用されている文献に記載
されており、そのそれぞれをここに参照として挿入す
る。
抗体は、吸着、イオン結合、ファン デル ワールス
吸着、静電結合又は他の非−共有又は共有結合を含む固
相材料のための従来の方法で選んだ固相に結合すること
ができる。非−共有結合の方法は、U.S.特許4,528,267
に記載されている。抗体を個体担体に共有結合する方法
は、IMMOBILIZED ENNZYMES.Halsted Press:New York
（1978）でIchiro chibataにより、及びA.Cuatrecasa
s,J.Bil.Chem.245:3059（1970）により記載されてお
り、その内容全体をここに参照として挿入する。
吸着、静電結合又は他の非−共有又は共有結合を含む固
相材料のための従来の方法で選んだ固相に結合すること
ができる。非−共有結合の方法は、U.S.特許4,528,267
に記載されている。抗体を個体担体に共有結合する方法
は、IMMOBILIZED ENNZYMES.Halsted Press:New York
（1978）でIchiro chibataにより、及びA.Cuatrecasa
s,J.Bil.Chem.245:3059（1970）により記載されてお
り、その内容全体をここに参照として挿入する。
抗体は、直接又は抗体を結合させる表面層を使用して
間接的に固相に結合させることができる。例えば表面を
蛋白質で被覆し、カップリング剤（例えばグルタルアル
デヒド）を用いて蛋白質を抗体とカップリングさせる。
水溶液中の抗体を、遊離のイソシアナート基（例えばポ
リエーテルイソシアナート）を持つ層で被覆した表面に
適用することにより、抗体を結合させることができる。
さらにシアノーゲンブロミドを用いて抗体をヒドロキシ
ル化材料にカップリングすることができる。
間接的に固相に結合させることができる。例えば表面を
蛋白質で被覆し、カップリング剤（例えばグルタルアル
デヒド）を用いて蛋白質を抗体とカップリングさせる。
水溶液中の抗体を、遊離のイソシアナート基（例えばポ
リエーテルイソシアナート）を持つ層で被覆した表面に
適用することにより、抗体を結合させることができる。
さらにシアノーゲンブロミドを用いて抗体をヒドロキシ
ル化材料にカップリングすることができる。
別の場合、抗体“架橋”を固相に結合し、分離法の前
に、又はその間に抗−母性抗原抗体を間接的に結合する
のに使用することができる。架橋には、抗−母性抗原抗
体の種の免疫グロブリンに特異的な抗体で、第２抗体と
も呼ばれる抗体が含まれる。マウス単クローン性抗体の
場合、架橋抗体の例は、羊抗−マウス免疫グロブリン、
羊抗−マウスIgG及び羊抗−マウスIgMである。他の架橋
には、プロテインＡ（SPA）（免疫グロブリンのFc領域
と結合する）の利用、又はビオチン化抗体と結合するア
ビジンの利用が含まれる。適用できる場合は、特定の種
類の固相に抗体を結合させる特定の方法を下記に記載す
る。固相に基づく分離の多くは、一般に特定の抗体を細
胞と反応させ、その後細胞を固相に固定した第２抗体又
は他の架橋と反応させることにより行う。
に、又はその間に抗−母性抗原抗体を間接的に結合する
のに使用することができる。架橋には、抗−母性抗原抗
体の種の免疫グロブリンに特異的な抗体で、第２抗体と
も呼ばれる抗体が含まれる。マウス単クローン性抗体の
場合、架橋抗体の例は、羊抗−マウス免疫グロブリン、
羊抗−マウスIgG及び羊抗−マウスIgMである。他の架橋
には、プロテインＡ（SPA）（免疫グロブリンのFc領域
と結合する）の利用、又はビオチン化抗体と結合するア
ビジンの利用が含まれる。適用できる場合は、特定の種
類の固相に抗体を結合させる特定の方法を下記に記載す
る。固相に基づく分離の多くは、一般に特定の抗体を細
胞と反応させ、その後細胞を固相に固定した第２抗体又
は他の架橋と反応させることにより行う。
抗体の結合に続いて固相を適用する場合、アルブミ
ン、カゼイン及び無脂乳を含む水溶性の非免疫動物蛋白
質の利用などにより、固相を“遮蔽”して非特異的結合
を減少させることができる。
ン、カゼイン及び無脂乳を含む水溶性の非免疫動物蛋白
質の利用などにより、固相を“遮蔽”して非特異的結合
を減少させることができる。
好ましい固相分離法の場合、抗体を金属又は有機ビー
ズに固定し、管又は他の容器中で細胞と合わせる。結合
の後、固相−固定母性細胞を、磁石を利用して細胞懸濁
媒地から除去する。磁石により引き付けられるビーズ
は、商業的に入手できる。好ましいビーズは、DYNABEAD
の名前でDYNAL ASにより販売されている（Robbins Sc
ientific of Mountain View,CAから入手可能）。抗
体は、製造者の指示に従ってビーズに結合させることが
できる。さらに、羊抗−マウスIgG抗体を表面に結合さ
せたビーズを入手することができる。マウス単クローン
性IgG抗体は、生理学的溶液中でビーズと共にインキュ
ベートすることによりビーズに容易に結合させることが
できる。DYNABEADビーズを引き付ける磁石を含むチュー
ブホルダーもDynal ASから入手できる。
ズに固定し、管又は他の容器中で細胞と合わせる。結合
の後、固相−固定母性細胞を、磁石を利用して細胞懸濁
媒地から除去する。磁石により引き付けられるビーズ
は、商業的に入手できる。好ましいビーズは、DYNABEAD
の名前でDYNAL ASにより販売されている（Robbins Sc
ientific of Mountain View,CAから入手可能）。抗
体は、製造者の指示に従ってビーズに結合させることが
できる。さらに、羊抗−マウスIgG抗体を表面に結合さ
せたビーズを入手することができる。マウス単クローン
性IgG抗体は、生理学的溶液中でビーズと共にインキュ
ベートすることによりビーズに容易に結合させることが
できる。DYNABEADビーズを引き付ける磁石を含むチュー
ブホルダーもDynal ASから入手できる。
カラム分離の場合、カルム充填材料は適当な空間を持
ち、母性細胞がカラム材料に固定された抗体と反応する
ことができ、抗原を持たない胎児細胞がカラムを通過で
きなければならない。細胞の分離に使用するのに適した
カラム材料には、種々の種類のビーズ及び羊赤血球が含
まれる。
ち、母性細胞がカラム材料に固定された抗体と反応する
ことができ、抗原を持たない胎児細胞がカラムを通過で
きなければならない。細胞の分離に使用するのに適した
カラム材料には、種々の種類のビーズ及び羊赤血球が含
まれる。
同様に、選ばれた母親の抗原に関する抗体は、ミクロ
タイタープレート、培養皿、試験管、遠心管、又は類似
の適した細胞容器などの固相に固定することができる。
非結合胎児細胞は、固相の表面を穏やかに洗浄すること
により母性細胞から分離し、除去することができる。細
胞のアフィニティー分離に適した固相材料は、周知であ
り、商業的に入手できる。
タイタープレート、培養皿、試験管、遠心管、又は類似
の適した細胞容器などの固相に固定することができる。
非結合胎児細胞は、固相の表面を穏やかに洗浄すること
により母性細胞から分離し、除去することができる。細
胞のアフィニティー分離に適した固相材料は、周知であ
り、商業的に入手できる。
上記の通り、それぞれの種類の固相の場合に抗体を固
相に固定するか、又は固相−固定架橋との反応により固
相に結合させることができる。同様の結果を与えるさら
に別の具体化は、同業者が容易に計画することができ
る。
相に固定するか、又は固相−固定架橋との反応により固
相に結合させることができる。同様の結果を与えるさら
に別の具体化は、同業者が容易に計画することができ
る。
細胞の調製 固相をベースとする分離法の懸濁媒地及び適した細胞
濃度は、固相−固定抗体−ベース細胞分離に従来用いら
れてきたものであることができる。懸濁媒地は、抗体の
機能及び胎児ならびに母性細胞の保護に適合するいずれ
かの生理学的媒地、例えば生理食塩水、リン酸塩緩衝食
塩水などのイムノアッセイ法に用いられる溶液であるこ
とができる。懸濁媒地は、回収細胞を培養する能力を最
適にする組織培養媒地であることもできる。適した組織
培養媒地は、FACS分離法のための懸濁媒地についての記
載中で述べる。懸濁媒地は、さらに抗生物質及び組織培
養媒地中に通常存在する類似添加剤を含むことができ
る。懸濁媒地は、その後の分離細胞の使用と低触する試
薬を含まないものでなければならない。例えば分離の後
に細胞を培養する場合、防腐剤は、使用しないのが好ま
しい。
濃度は、固相−固定抗体−ベース細胞分離に従来用いら
れてきたものであることができる。懸濁媒地は、抗体の
機能及び胎児ならびに母性細胞の保護に適合するいずれ
かの生理学的媒地、例えば生理食塩水、リン酸塩緩衝食
塩水などのイムノアッセイ法に用いられる溶液であるこ
とができる。懸濁媒地は、回収細胞を培養する能力を最
適にする組織培養媒地であることもできる。適した組織
培養媒地は、FACS分離法のための懸濁媒地についての記
載中で述べる。懸濁媒地は、さらに抗生物質及び組織培
養媒地中に通常存在する類似添加剤を含むことができ
る。懸濁媒地は、その後の分離細胞の使用と低触する試
薬を含まないものでなければならない。例えば分離の後
に細胞を培養する場合、防腐剤は、使用しないのが好ま
しい。
ビーズ−固定抗体を用いた分離の場合懸濁媒地は、単
球の活性を最小にして分離法の間に単球がビーズを飲み
込む傾向を減少させるために、カルシウム−及びマグネ
シウム−非含有であることが好ましい。さらに媒地は、
ヘパリン又はACDなどの抗凝血物質を含むことができ
る。
球の活性を最小にして分離法の間に単球がビーズを飲み
込む傾向を減少させるために、カルシウム−及びマグネ
シウム−非含有であることが好ましい。さらに媒地は、
ヘパリン又はACDなどの抗凝血物質を含むことができ
る。
固相分離法は、用いるPBSが分離法を通じて細胞の生
存率を保つのに十分であるように、比較的短時間で行
う。しかし細胞の培養を含む利用のために、細胞は分離
後、組織培養媒地中に再懸濁するのが好ましい。
存率を保つのに十分であるように、比較的短時間で行
う。しかし細胞の培養を含む利用のために、細胞は分離
後、組織培養媒地中に再懸濁するのが好ましい。
血液試料の精製後、細胞を洗浄し、選んだ懸濁媒地中
に固相分離に適した濃度でペレットを再度懸濁する。一
般に濃度は、約105−約108細胞/ml、好ましくは約106−
約107細胞/mlの範囲である。
に固相分離に適した濃度でペレットを再度懸濁する。一
般に濃度は、約105−約108細胞/ml、好ましくは約106−
約107細胞/mlの範囲である。
細胞懸濁液を、後文で述べるように、固相−固定抗体
と接触させる。
と接触させる。
固相分離法 分離を行うために、試料の細胞を、選んだ母親の抗原
のひとつに特異的な固相−固定抗体と、抗体の結合に十
分な時間だけ合わせる。時間は、温度に依存して変化
し、周知である。室温では１分という短時間のインキュ
ベーションが適当である。４℃では、より長時間が必要
となる。細胞表面抗原が固相−個体抗体と接触するのに
十分な時間があることがより重要である。通常約10−約
60分が十分である。
のひとつに特異的な固相−固定抗体と、抗体の結合に十
分な時間だけ合わせる。時間は、温度に依存して変化
し、周知である。室温では１分という短時間のインキュ
ベーションが適当である。４℃では、より長時間が必要
となる。細胞表面抗原が固相−個体抗体と接触するのに
十分な時間があることがより重要である。通常約10−約
60分が十分である。
母親の抗原に特異的な抗体により（従って固相に）結
合した細胞は、固相に結合しない細胞から分離される。
選ばれた抗体により結合しない細胞が試料中にある場
合、そのような細胞を回収する。試料中の細胞のすべて
が第１の抗体により結合した場合、選んだ第２の母性細
胞表面抗原に関する抗体を用いて方法を繰り返し、非結
合分離細胞を回収する。第１及び第２抗体を用いた分離
は、順番に行うことができる。分離は、試料細胞の異な
るアリコートを用いて別々に、実質的に同時に行うのが
好ましい。
合した細胞は、固相に結合しない細胞から分離される。
選ばれた抗体により結合しない細胞が試料中にある場
合、そのような細胞を回収する。試料中の細胞のすべて
が第１の抗体により結合した場合、選んだ第２の母性細
胞表面抗原に関する抗体を用いて方法を繰り返し、非結
合分離細胞を回収する。第１及び第２抗体を用いた分離
は、順番に行うことができる。分離は、試料細胞の異な
るアリコートを用いて別々に、実質的に同時に行うのが
好ましい。
ビーズ分離の場合、母性細胞は常にビーズに結合す
る。固相−固定抗体が母親の非伝達抗原に関するもので
ある場合に、胎児細胞は結合しない。試料中の細胞を分
割し、細胞のアリコートを、選んだ母親の抗原のそれぞ
れに関して特異的な抗体を含むビーズと別々に、同時に
合わせることができる。非伝達対立遺伝子が父親から受
け継がれていなければ、胎児細胞はビーズの組のひとつ
と結合する。懸濁媒地からビーズを分離することによ
り、固相に固定された母親の細胞を結合しない胎児細胞
から分離する。
る。固相−固定抗体が母親の非伝達抗原に関するもので
ある場合に、胎児細胞は結合しない。試料中の細胞を分
割し、細胞のアリコートを、選んだ母親の抗原のそれぞ
れに関して特異的な抗体を含むビーズと別々に、同時に
合わせることができる。非伝達対立遺伝子が父親から受
け継がれていなければ、胎児細胞はビーズの組のひとつ
と結合する。懸濁媒地からビーズを分離することによ
り、固相に固定された母親の細胞を結合しない胎児細胞
から分離する。
磁気ビーズの場合、細胞をビーズと共に約１時間、好
ましくは４℃にてインキュベートする。単球により飲み
込まれるのを避けるために、インキュベーションは約１
時間以下であることが好ましい。ビーズは、インキュベ
ーション中約106−約７ビーズ/mlで存在する。ビーズに
対する細胞の好ましい比率は、約２ビーズ／細胞であ
る。インキュベーション後、ビーズに固定された母性細
胞をインキュベーションを行った管の横側に磁石を用い
て動かし、穏やかに洗浄することにより非結合胎児細胞
を除去する。最終洗浄媒地は、蛋白質含有量が１％以下
であることが好ましい。
ましくは４℃にてインキュベートする。単球により飲み
込まれるのを避けるために、インキュベーションは約１
時間以下であることが好ましい。ビーズは、インキュベ
ーション中約106−約７ビーズ/mlで存在する。ビーズに
対する細胞の好ましい比率は、約２ビーズ／細胞であ
る。インキュベーション後、ビーズに固定された母性細
胞をインキュベーションを行った管の横側に磁石を用い
て動かし、穏やかに洗浄することにより非結合胎児細胞
を除去する。最終洗浄媒地は、蛋白質含有量が１％以下
であることが好ましい。
カラム−ベース分離の場合、試料のアリコートを抗体
を結合するのに十分な流量でカラムに通過させることに
より方法を行う。固相−固定抗体が母親の非伝達抗原に
関するものである場合、胎児細胞はカラムを通過する。
試料中の細胞を分け、細胞のアリコートを選んだ母親の
抗原のそれぞれに特異的な抗体を含むカラムに同時に通
過させることができる。非伝達対立遺伝子が父親から受
け継がれていなければ胎児細胞は、カラムのひとつから
溶離する。
を結合するのに十分な流量でカラムに通過させることに
より方法を行う。固相−固定抗体が母親の非伝達抗原に
関するものである場合、胎児細胞はカラムを通過する。
試料中の細胞を分け、細胞のアリコートを選んだ母親の
抗原のそれぞれに特異的な抗体を含むカラムに同時に通
過させることができる。非伝達対立遺伝子が父親から受
け継がれていなければ胎児細胞は、カラムのひとつから
溶離する。
別法の場合、細胞をひとつのカラムに通過させ、胎児
細胞が溶離しない場合、細胞をカラムから除去して別の
カラムに通過させるか、又は第２の細胞のアリコートを
母親の第２の抗原に関するカラムに通過させることがで
きる。細胞は、過剰の母親の抗原又は抗体の結合部位に
対する競争的阻害剤を用いた機械的破壊により（例えば
ピペッティング）、あるいは牛赤血球の場合赤血球の細
胞溶解により、カラム材料から又は他の固相表面から分
離することができる。特定の表面に固定された細胞の除
去のための他の方法は周知であり、抗体の固相への結合
に用いられた特定の結合の分裂、例えばチオールを用い
たジスルフィド結合の分裂が含まれる。細胞の別々のア
リコートを使用し、選んだ母親の抗原を持つ胎児細胞を
固相から分離する必要がないことが好ましい。
細胞が溶離しない場合、細胞をカラムから除去して別の
カラムに通過させるか、又は第２の細胞のアリコートを
母親の第２の抗原に関するカラムに通過させることがで
きる。細胞は、過剰の母親の抗原又は抗体の結合部位に
対する競争的阻害剤を用いた機械的破壊により（例えば
ピペッティング）、あるいは牛赤血球の場合赤血球の細
胞溶解により、カラム材料から又は他の固相表面から分
離することができる。特定の表面に固定された細胞の除
去のための他の方法は周知であり、抗体の固相への結合
に用いられた特定の結合の分裂、例えばチオールを用い
たジスルフィド結合の分裂が含まれる。細胞の別々のア
リコートを使用し、選んだ母親の抗原を持つ胎児細胞を
固相から分離する必要がないことが好ましい。
プレート又は管などの容器を用いた分離の場合、細胞
を固相−固定抗体と共に、抗体の結合に十分な時間だけ
インキュベートするのが好ましい。インキュベーション
後、非結合細胞を表面から穏やかに洗浄して回収する。
を固相−固定抗体と共に、抗体の結合に十分な時間だけ
インキュベートするのが好ましい。インキュベーション
後、非結合細胞を表面から穏やかに洗浄して回収する。
FACS分離 胎児細胞は、細胞の異なる標識及びFACSを用いた標識
細胞の分離に基づいて血液中の母性細胞から分離するこ
とができる。簡単に言うと前に述べた通り、母性細胞は
選んだ母親の抗原に関する抗体で標識することができ
る。その場合50％の確率で、試料は非標識胎児細胞を含
む。母性細胞を二重標識するのが好ましい。選んだ母親
の抗原が、異なる遺伝子座の対立遺伝子によりコードさ
れる場合、胎児が母親の対立遺伝子のひとつを受け継い
でいるか、又は受け継いでいないかに因り、胎児細胞は
４分の３の確率で非標識であるか又は一重標識される。
選んだ母親の抗原が、同一の遺伝子座の対立遺伝子によ
りコードされる場合胎児細胞は、一重標識される。二重
標識母性細胞を例として分離法を下記に説明する。
細胞の分離に基づいて血液中の母性細胞から分離するこ
とができる。簡単に言うと前に述べた通り、母性細胞は
選んだ母親の抗原に関する抗体で標識することができ
る。その場合50％の確率で、試料は非標識胎児細胞を含
む。母性細胞を二重標識するのが好ましい。選んだ母親
の抗原が、異なる遺伝子座の対立遺伝子によりコードさ
れる場合、胎児が母親の対立遺伝子のひとつを受け継い
でいるか、又は受け継いでいないかに因り、胎児細胞は
４分の３の確率で非標識であるか又は一重標識される。
選んだ母親の抗原が、同一の遺伝子座の対立遺伝子によ
りコードされる場合胎児細胞は、一重標識される。二重
標識母性細胞を例として分離法を下記に説明する。
細胞の調製 FACS−ベース分離法の懸濁媒地及び適した細胞濃度
は、従来用いられてきたものである。精製の後、細胞を
洗浄し、ソーティングに適した濃度でペレットを懸濁媒
地中に再懸濁する。濃度は、希薄すぎではならない。し
かし比較的濃厚な又は比較的希薄な試料を用いて適した
細胞流量を与えるように流動細胞計測器を調節すること
ができる。細胞濃度は、約106−約5x108細胞/mlが好ま
しく、約5x106−約1x107細胞/mlがより好ましい。
は、従来用いられてきたものである。精製の後、細胞を
洗浄し、ソーティングに適した濃度でペレットを懸濁媒
地中に再懸濁する。濃度は、希薄すぎではならない。し
かし比較的濃厚な又は比較的希薄な試料を用いて適した
細胞流量を与えるように流動細胞計測器を調節すること
ができる。細胞濃度は、約106−約5x108細胞/mlが好ま
しく、約5x106−約1x107細胞/mlがより好ましい。
懸濁媒地は、細胞の本来の姿を保つために生理学的溶
液、例えば生理学的緩衝液である。ほとんどの生理学的
緩衝液、例えばトリス緩衝液、リン酸塩緩衝液（PB）、
クンエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝食塩水（PBS）が適
している。アール平衡塩類溶液（EBSS）、ハンク平衡塩
類溶液（HBSS）及びゲイ平衡塩類溶液（GBSS）などの平
衡塩類溶液を適している。懸濁媒地は、組織培養媒地
（例えばイーグルの基礎媒地及びダルベッコの修正イー
グル媒地）が好ましく、リンパ球培養の場合に用いるの
に適した濃縮組織培養媒地、例えばRPMI 1640がより好
ましい。組織培養媒地、特に試料である細胞の型の成長
に合わせた媒地の利用により、細胞の安定性を最大にす
る環境を与えることができる。
液、例えば生理学的緩衝液である。ほとんどの生理学的
緩衝液、例えばトリス緩衝液、リン酸塩緩衝液（PB）、
クンエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝食塩水（PBS）が適
している。アール平衡塩類溶液（EBSS）、ハンク平衡塩
類溶液（HBSS）及びゲイ平衡塩類溶液（GBSS）などの平
衡塩類溶液を適している。懸濁媒地は、組織培養媒地
（例えばイーグルの基礎媒地及びダルベッコの修正イー
グル媒地）が好ましく、リンパ球培養の場合に用いるの
に適した濃縮組織培養媒地、例えばRPMI 1640がより好
ましい。組織培養媒地、特に試料である細胞の型の成長
に合わせた媒地の利用により、細胞の安定性を最大にす
る環境を与えることができる。
懸濁媒地は、さらに比較的高濃度の蛋白質源を補足す
ることができる。蛋白質源は、約５−約10％の濃度範囲
の牛血清アルブミン（BSA）、又は好ましくはヒト血清
アルブミン（HSA）などのアルブミンであることができ
る。別の場合蛋白質源は、約５−約10％の濃度の牛胎児
血清又はヒト血清などの血清であることができる。リン
パ球は、外部から抗原の存在により刺激されるので、蛋
白質源はヒトのものであることが好ましい。最も好まし
いのは、約５％のオートロガス結血漿の使用であり、そ
れは精製血液試料から得ることができ、非免疫原性であ
る。
ることができる。蛋白質源は、約５−約10％の濃度範囲
の牛血清アルブミン（BSA）、又は好ましくはヒト血清
アルブミン（HSA）などのアルブミンであることができ
る。別の場合蛋白質源は、約５−約10％の濃度の牛胎児
血清又はヒト血清などの血清であることができる。リン
パ球は、外部から抗原の存在により刺激されるので、蛋
白質源はヒトのものであることが好ましい。最も好まし
いのは、約５％のオートロガス結血漿の使用であり、そ
れは精製血液試料から得ることができ、非免疫原性であ
る。
別の場合、細胞の容器への落下の衝撃を和らげて細胞
の安定性を増すために、懸濁媒地中ではなく流動細胞計
測器収集容器中に蛋白質源を加える。
の安定性を増すために、懸濁媒地中ではなく流動細胞計
測器収集容器中に蛋白質源を加える。
細胞の標識 血液試料の細胞、好ましくは精製細胞を、前記のよう
にして選んだ少なくともひとつの母親の多型遺伝子座に
よりコードされる抗原に特異的な蛍光抗体で標識する。
抗体は、多クローン性又は単クローン性であることがで
き、単クローン性が好ましい。問題の抗原に関する多ク
ローン性及び単クローン性抗体の調製は、周知である。
にして選んだ少なくともひとつの母親の多型遺伝子座に
よりコードされる抗原に特異的な蛍光抗体で標識する。
抗体は、多クローン性又は単クローン性であることがで
き、単クローン性が好ましい。問題の抗原に関する多ク
ローン性及び単クローン性抗体の調製は、周知である。
前記の通りHLA抗原の場合、HLA抗原−特異的抗体は、
商業的に入手できる。典型的にHLA Ｉ型遺伝子座（A,B
及びＣ）及びII型DR及びDQ遺伝子座は、血清法により決
定することができる。従ってこれらの抗原に特異的な抗
体は、容易に入手できる。HLA抗原−特異的抗体の供給
源には、Genetic Systems（Seattle,WA）及びC6 Diag
nostics（Mequon,WI）が含まれる。血液型抗原も血清法
により決定され、抗体を商業的に得ることができる。
商業的に入手できる。典型的にHLA Ｉ型遺伝子座（A,B
及びＣ）及びII型DR及びDQ遺伝子座は、血清法により決
定することができる。従ってこれらの抗原に特異的な抗
体は、容易に入手できる。HLA抗原−特異的抗体の供給
源には、Genetic Systems（Seattle,WA）及びC6 Diag
nostics（Mequon,WI）が含まれる。血液型抗原も血清法
により決定され、抗体を商業的に得ることができる。
抗体は、セルソーティングを容易にする染料、特に蛍
光発色化合物により標識する。FACS分析及び／又は分離
に適した染料は、周知である。そのような染料は、Howr
d M.ShapiroによるPractical Flow Cytometry（第２
版）同上、115−198頁に記載されている。好ましい染料
は、フルオレセイン（例えばフルオレセインイソチオシ
アナート−FITC）、ローダミン（例えばテトラメチロー
ダミンイソチオシアナート−TRITC）、フィコエリトリ
ン（PE）、アロフィコシアニン（APC）及びデキサスレ
ッド（Molecular Probes,Eugene,OR）を含む蛍光発色
化合物である。標識に用いた蛍光発色化合物の組み合わ
せは、区別できる波長の光を発光するように選ぶ。好ま
しい組み合わせは、緑光を発する蛍光発色化合物と赤又
はオレンジの光を発する蛍光発色化合物の組み合わせ、
例えばFIFCとPE又はテキサスレッドである。
光発色化合物により標識する。FACS分析及び／又は分離
に適した染料は、周知である。そのような染料は、Howr
d M.ShapiroによるPractical Flow Cytometry（第２
版）同上、115−198頁に記載されている。好ましい染料
は、フルオレセイン（例えばフルオレセインイソチオシ
アナート−FITC）、ローダミン（例えばテトラメチロー
ダミンイソチオシアナート−TRITC）、フィコエリトリ
ン（PE）、アロフィコシアニン（APC）及びデキサスレ
ッド（Molecular Probes,Eugene,OR）を含む蛍光発色
化合物である。標識に用いた蛍光発色化合物の組み合わ
せは、区別できる波長の光を発光するように選ぶ。好ま
しい組み合わせは、緑光を発する蛍光発色化合物と赤又
はオレンジの光を発する蛍光発色化合物の組み合わせ、
例えばFIFCとPE又はテキサスレッドである。
４色ソーティングを行うことができるこれらの流動細
胞計測器の場合、４個の対立遺伝子により発現する抗原
に関する抗体で細胞を標識することができる。その場合
抗体は、母親の２個のHLA遺伝子座の対立遺伝子により
発現する両方の抗原に特異的であることが好ましい。母
性細胞を４個の蛍光発色化合物全部で標識する。母親の
非伝達対立遺伝子をひとつも父親から受け継いでいない
場合は、４個の蛍光発色化合物の中の２個で胎児細胞を
染色する。２個の遺伝子座から対立遺伝子に４個の蛍光
発色化合物を用いることにより、胎児が母親の非伝達対
立遺伝子のひとつを父親から受け継いでいる時でさえ胎
児細胞を母性細胞から区別することができる。胎児が母
親の非伝達対立遺伝子の両方を父親から受け継いでいる
場合のみに第２の染色が必要である。抗体が母親の３個
又は４個の遺伝子座により発現する抗原に関するもので
ある場合、染料を追加して用いることにより、胎児が母
親の対立遺伝子のそれぞれを受け継いでいない確率が増
加する。
胞計測器の場合、４個の対立遺伝子により発現する抗原
に関する抗体で細胞を標識することができる。その場合
抗体は、母親の２個のHLA遺伝子座の対立遺伝子により
発現する両方の抗原に特異的であることが好ましい。母
性細胞を４個の蛍光発色化合物全部で標識する。母親の
非伝達対立遺伝子をひとつも父親から受け継いでいない
場合は、４個の蛍光発色化合物の中の２個で胎児細胞を
染色する。２個の遺伝子座から対立遺伝子に４個の蛍光
発色化合物を用いることにより、胎児が母親の非伝達対
立遺伝子のひとつを父親から受け継いでいる時でさえ胎
児細胞を母性細胞から区別することができる。胎児が母
親の非伝達対立遺伝子の両方を父親から受け継いでいる
場合のみに第２の染色が必要である。抗体が母親の３個
又は４個の遺伝子座により発現する抗原に関するもので
ある場合、染料を追加して用いることにより、胎児が母
親の対立遺伝子のそれぞれを受け継いでいない確率が増
加する。
退治細胞を本発明の方法によって母性細胞から区別で
きないのは、胎児が母親の６個の非伝達対立遺伝子すべ
てを父親から受け継いでいる場合だけである。
きないのは、胎児が母親の６個の非伝達対立遺伝子すべ
てを父親から受け継いでいる場合だけである。
抗体は、周知の方法で直接又は間接的に蛍光発色化合
物で標識することができる。一般に抗体の標識を結合さ
せる複合法をこれらの目的に用いることができる。FITC
などの染料の場合の直接標識法は、Catty等，“Antiser
a in Immunoassays woth Special Reference to
Monoclonal Antibodies to Human Immunoglobuli
ns",IMMUNOASSAYS FOR THE 80's,同上,pp133−154及
びTHE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY第４
版，第１巻:Immunocytochemistry,ed.D.M.Weir,Blackwe
ll Scientific Publications及びこれらの参照文献に
引用されている出版物に記載されている。これらの参照
文献のそれぞれの内容全体をここに参照として挿入す
る。
物で標識することができる。一般に抗体の標識を結合さ
せる複合法をこれらの目的に用いることができる。FITC
などの染料の場合の直接標識法は、Catty等，“Antiser
a in Immunoassays woth Special Reference to
Monoclonal Antibodies to Human Immunoglobuli
ns",IMMUNOASSAYS FOR THE 80's,同上,pp133−154及
びTHE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY第４
版，第１巻:Immunocytochemistry,ed.D.M.Weir,Blackwe
ll Scientific Publications及びこれらの参照文献に
引用されている出版物に記載されている。これらの参照
文献のそれぞれの内容全体をここに参照として挿入す
る。
標識した抗体は、使用前に精製して非結合標識を除去
するのが好ましい。用いる方法は、抗体組成物も精製し
て免疫グロブリンを与えるのが好ましく、多クローン性
抗体の場合はIgG留分、あるいは単クローン性抗体の場
合は抗体のイソタイプに依存してIgG又はIgM留分を与え
るのがより好ましい。抗体からの抗体留分の単離法に
は、IgGの場合に組み替え蛋白質Ｇの利用、及びIgMの場
合に免疫沈降の利用が含まれる。非結合蛍光発色化合物
をさらに分離する方法は周知であり、DEAE Ｇ 35 Se
phadex（Pharmacia）カラムの利用が含まれる。精製法
の例は、実施例に詳細に記載する。
するのが好ましい。用いる方法は、抗体組成物も精製し
て免疫グロブリンを与えるのが好ましく、多クローン性
抗体の場合はIgG留分、あるいは単クローン性抗体の場
合は抗体のイソタイプに依存してIgG又はIgM留分を与え
るのがより好ましい。抗体からの抗体留分の単離法に
は、IgGの場合に組み替え蛋白質Ｇの利用、及びIgMの場
合に免疫沈降の利用が含まれる。非結合蛍光発色化合物
をさらに分離する方法は周知であり、DEAE Ｇ 35 Se
phadex（Pharmacia）カラムの利用が含まれる。精製法
の例は、実施例に詳細に記載する。
抗体の活性を維持しながら結合するのが比較的困難な
PEなどの染料の場合、抗体をビオチンで標識することが
できる。抗体細胞のインキュベーションと同時に又は好
ましくは後に、ビオチン化した抗体をPE−アビジン又は
PE−ストレパビジン（商業的に入手可能）と共にインキ
ュベーションすることにより染料を結合することができ
る。ビオチンを抗体に複合させる方法は、METHOD IN
ENZYMOLOGY Vol.62（1979）のEdward A.Bayer等，“T
he Avidin−Biotin （Comlex in Affinity Cytoch
emistry"に記載されている。この文献全体をここに参照
として挿入する。
PEなどの染料の場合、抗体をビオチンで標識することが
できる。抗体細胞のインキュベーションと同時に又は好
ましくは後に、ビオチン化した抗体をPE−アビジン又は
PE−ストレパビジン（商業的に入手可能）と共にインキ
ュベーションすることにより染料を結合することができ
る。ビオチンを抗体に複合させる方法は、METHOD IN
ENZYMOLOGY Vol.62（1979）のEdward A.Bayer等，“T
he Avidin−Biotin （Comlex in Affinity Cytoch
emistry"に記載されている。この文献全体をここに参照
として挿入する。
FITCの場合の好ましい直接標識法の例を実施例に詳細
に記載する。抗体のビオチン化及びPE−ストレパビジン
の結合の場合の好ましい間接標識法も記載する。
に記載する。抗体のビオチン化及びPE−ストレパビジン
の結合の場合の好ましい間接標識法も記載する。
標識したHLA抗原特異的抗体を用いて細胞を標識する
ために、細胞を抗体と共に、使用条件下で抗体が実質的
に完全に結合するのに十分な時間だけインキュベートす
る。過剰量の抗体を使用するのが好ましい。104個の細
胞に対して約２μｇの濃度が望ましい。しかし約40μg/
μｌの濃度で50μｌの精製抗体を使用して十分であっ
た。
ために、細胞を抗体と共に、使用条件下で抗体が実質的
に完全に結合するのに十分な時間だけインキュベートす
る。過剰量の抗体を使用するのが好ましい。104個の細
胞に対して約２μｇの濃度が望ましい。しかし約40μg/
μｌの濃度で50μｌの精製抗体を使用して十分であっ
た。
細胞は、細胞の本来の姿を保つために約４℃でインキ
ュベートするのが好ましい。通常４℃にて約30分インキ
ュベートするのが、実質的に完全な抗体の結合に十分で
ある。試料は、インキュベーションの間、血液学的血液
振動装置を用いて混合し、抗体と細胞の接触を確実にす
るのが好ましい。蛍光発色化合物標識を用いる場合、イ
ンキュベーションは、暗所で行うのが好ましい。第２反
応（例えば蛍光発色化合物−標識アビジンとビオチン−
標識細胞のインキュベーション）は、同様の方法で行
う。
ュベートするのが好ましい。通常４℃にて約30分インキ
ュベートするのが、実質的に完全な抗体の結合に十分で
ある。試料は、インキュベーションの間、血液学的血液
振動装置を用いて混合し、抗体と細胞の接触を確実にす
るのが好ましい。蛍光発色化合物標識を用いる場合、イ
ンキュベーションは、暗所で行うのが好ましい。第２反
応（例えば蛍光発色化合物−標識アビジンとビオチン−
標識細胞のインキュベーション）は、同様の方法で行
う。
直接及び間接標識の場合の好ましい細胞標識法の例
を、実施例にて詳細に記載する。
を、実施例にて詳細に記載する。
標識細胞のソーティング 流動細胞計測法は、細胞又は粒子が通常個々に流体と
して測定装置を通過する間に物理的及び／又は化学的性
質の測定を行う方法である。生物学的粒子、通常細胞に
つき、音響、核放射線、電子及び光学センサーを用いて
流動細胞計測分析を行ってきた。光学的測定が最も高範
囲の用途で用いられる。
して測定装置を通過する間に物理的及び／又は化学的性
質の測定を行う方法である。生物学的粒子、通常細胞に
つき、音響、核放射線、電子及び光学センサーを用いて
流動細胞計測分析を行ってきた。光学的測定が最も高範
囲の用途で用いられる。
流動細胞計測器の現在の用途のほとんどは、不均一細
胞集団の限定及び定量を行う装置の能力から生まれてい
る。流動細胞計測により測定することができる細胞の物
理的及び化学的性質又はパラメーターには、細胞の大き
さ、細胞の形、顔料含有量、蛋白質含有量、DNA含有量
及びDNA塩基比が含まれる。さらに細胞を１個又はそれ
以上の蛍光発色化合物で標識し、色の差に基づいて特性
化することができる。流動細胞計測の最も需要の多い用
途では、細胞のサブ集団の同定及びそれに続く特性化が
必要である。この目的に、フローソーティング及び多重
パラメーター分析の両方を用いる。
胞集団の限定及び定量を行う装置の能力から生まれてい
る。流動細胞計測により測定することができる細胞の物
理的及び化学的性質又はパラメーターには、細胞の大き
さ、細胞の形、顔料含有量、蛋白質含有量、DNA含有量
及びDNA塩基比が含まれる。さらに細胞を１個又はそれ
以上の蛍光発色化合物で標識し、色の差に基づいて特性
化することができる。流動細胞計測の最も需要の多い用
途では、細胞のサブ集団の同定及びそれに続く特性化が
必要である。この目的に、フローソーティング及び多重
パラメーター分析の両方を用いる。
フローソーティングは、電気的及び／又は機械的手段
を用いてあらかじめ選んだ性質を持つ細胞を主流からそ
らし、他の方法により得る場合より均一な性質を持つ生
存細胞の純粋な集団を単離するのに使用することができ
る。フローソーティングは、選ばれた細胞をさらに特性
化するために、培養中での短期又は長期の保存、あるい
は流動細胞計測により行うことができない分析法が必要
である場合に特に有用である。
を用いてあらかじめ選んだ性質を持つ細胞を主流からそ
らし、他の方法により得る場合より均一な性質を持つ生
存細胞の純粋な集団を単離するのに使用することができ
る。フローソーティングは、選ばれた細胞をさらに特性
化するために、培養中での短期又は長期の保存、あるい
は流動細胞計測により行うことができない分析法が必要
である場合に特に有用である。
細胞のソーティングに使用することができるパラメー
ターは、２つの異なる角度（通常前方散乱と言われる２
゜以下、及び約90゜）における入射レーザービームから
の細胞による散乱光の測定値を含む。光散乱測定を挿入
した多重パラメーター流動細胞計測の蛍光測定の能力を
用いて、細胞の個々のサブ手段の他の特性を決定するこ
とができる。
ターは、２つの異なる角度（通常前方散乱と言われる２
゜以下、及び約90゜）における入射レーザービームから
の細胞による散乱光の測定値を含む。光散乱測定を挿入
した多重パラメーター流動細胞計測の蛍光測定の能力を
用いて、細胞の個々のサブ手段の他の特性を決定するこ
とができる。
実質的に多数の胎児細胞を含む試料の場合、固相−固
定抗母性HLA抗原抗体に細胞を結合することにより一又
は二段階分離法により細胞を選ぶことができる。例えば
母性細胞及び胎児細胞を、カラム又は（組織培養皿表面
又は磁気ビーズなどの）他の固相に、共有する母性抗原
抗体を用いて結合する。母性細胞のみが胎児が受け継が
なかった抗原に対する抗体を持つカラム（又は他の固
相）に結合する。この方法で、胎児が受け継がなかった
抗原に対する抗体と共にインキュベートすると、胎児細
胞が母性細胞から分離される。
定抗母性HLA抗原抗体に細胞を結合することにより一又
は二段階分離法により細胞を選ぶことができる。例えば
母性細胞及び胎児細胞を、カラム又は（組織培養皿表面
又は磁気ビーズなどの）他の固相に、共有する母性抗原
抗体を用いて結合する。母性細胞のみが胎児が受け継が
なかった抗原に対する抗体を持つカラム（又は他の固
相）に結合する。この方法で、胎児が受け継がなかった
抗原に対する抗体と共にインキュベートすると、胎児細
胞が母性細胞から分離される。
本発明の目的の場合、２つの蛍光発色化合物を用いて
異なる染色をすることにより得た４種類の色のパターン
を選択基準として用いて細胞をソーティングする。赤及
び緑の蛍光発色化合物を用いると、４種類のパターン
は、（１）非染色、（２）赤のみ、。（３）緑のみ、及
び（４）赤及び緑である。
異なる染色をすることにより得た４種類の色のパターン
を選択基準として用いて細胞をソーティングする。赤及
び緑の蛍光発色化合物を用いると、４種類のパターン
は、（１）非染色、（２）赤のみ、。（３）緑のみ、及
び（４）赤及び緑である。
２個の母親の対立遺伝子のそれぞれに関して赤及び緑
の蛍光発色化合物を用いて細胞を染色又は標識した後、
母性細胞は、赤及び緑である。胎児細胞は、胎児が受け
継いだ対立遺伝子に依存して赤又は緑のいずれかであ
る。赤又は緑の蛍光を示すが両方は示さない細胞を選ぶ
ことにより、胎児細胞を単離することができる。
の蛍光発色化合物を用いて細胞を染色又は標識した後、
母性細胞は、赤及び緑である。胎児細胞は、胎児が受け
継いだ対立遺伝子に依存して赤又は緑のいずれかであ
る。赤又は緑の蛍光を示すが両方は示さない細胞を選ぶ
ことにより、胎児細胞を単離することができる。
ほとんどの流動細胞計測器は、３つのパラメーターに
つきソーティングできるので、もうひとつの選択基準を
細胞の大きさとするとができる。この基準により死亡細
胞、破片及び細胞塊を除去する。しかし試料を注意深く
扱い、冷蔵保存すると、死亡細胞は問題とならないよう
である。
つきソーティングできるので、もうひとつの選択基準を
細胞の大きさとするとができる。この基準により死亡細
胞、破片及び細胞塊を除去する。しかし試料を注意深く
扱い、冷蔵保存すると、死亡細胞は問題とならないよう
である。
好ましい具体化の場合、もうひとつの選択基準はDNA
含有量である。Hoechst染料、DAPI（４′−６−ジアミ
ジノ−２−フェニルインドール）、ヒドロエチジン及び
７−アミノアクチノマイシン Ｄ（7AMD）などの多くの
生体内染色蛍光発色化合物を用いて2C DNA含有量以上
の胎児細胞を決定することができる。使用する蛍光発色
化合物は、胎児細胞の選択に使用する標識に依存する。
Hoechst及びDAPI染料を励起するUV光を発することがで
きる第２のレーザーが必要である。上記の染料のそれぞ
れは、FITC及びPEと共に用いることができる。
含有量である。Hoechst染料、DAPI（４′−６−ジアミ
ジノ−２−フェニルインドール）、ヒドロエチジン及び
７−アミノアクチノマイシン Ｄ（7AMD）などの多くの
生体内染色蛍光発色化合物を用いて2C DNA含有量以上
の胎児細胞を決定することができる。使用する蛍光発色
化合物は、胎児細胞の選択に使用する標識に依存する。
Hoechst及びDAPI染料を励起するUV光を発することがで
きる第２のレーザーが必要である。上記の染料のそれぞ
れは、FITC及びPEと共に用いることができる。
流動細胞計測器は、１時間当たり約107−108個の細
胞、通常１時間当たり約4x107個の細胞を扱うことがで
きる。典型的に約20mlの母親の血液から調製した試料
は、少なくとも約2x105個の細胞を含み、それは約５時
間でソーティングして分析に十分な胎児細胞を与える。
しかし使用する分析法により実質的にもっと少量の細胞
が必要なこともある。
胞、通常１時間当たり約4x107個の細胞を扱うことがで
きる。典型的に約20mlの母親の血液から調製した試料
は、少なくとも約2x105個の細胞を含み、それは約５時
間でソーティングして分析に十分な胎児細胞を与える。
しかし使用する分析法により実質的にもっと少量の細胞
が必要なこともある。
セルソーターが母性細胞と胎児細胞を分離する能力
は、究極的に試料中の胎児細胞のパーセンテージに依存
する。少なくとも純度が60％の胎児細胞試料（ソーティ
ングした細胞の60％が胎児細胞である）を得るために
は、胎児細胞が母性細胞の約0.001％かそれ以上を構成
していなければならない。ソーティングの後、試料は80
％、より好ましくは90％の胎児細胞を含むのが好まし
い。
は、究極的に試料中の胎児細胞のパーセンテージに依存
する。少なくとも純度が60％の胎児細胞試料（ソーティ
ングした細胞の60％が胎児細胞である）を得るために
は、胎児細胞が母性細胞の約0.001％かそれ以上を構成
していなければならない。ソーティングの後、試料は80
％、より好ましくは90％の胎児細胞を含むのが好まし
い。
100％の純度が必要な場合、ソーティングした細胞を
顕微操作することができる。例えばあらかじめ選んだ体
積の懸濁媒地当たり１個の細胞を含む細胞懸濁液を限界
希釈法により調製することができる。個々の細胞を含む
滴を適した容器（例えば96ウェルプレート）に入れて蛍
光顕微鏡で視覚により調べ、一重標識（又は非標識）細
胞を同定する。そのような細胞を含むウェルに印をつ
け、細胞をプールすることができる。
顕微操作することができる。例えばあらかじめ選んだ体
積の懸濁媒地当たり１個の細胞を含む細胞懸濁液を限界
希釈法により調製することができる。個々の細胞を含む
滴を適した容器（例えば96ウェルプレート）に入れて蛍
光顕微鏡で視覚により調べ、一重標識（又は非標識）細
胞を同定する。そのような細胞を含むウェルに印をつ
け、細胞をプールすることができる。
PCR分析の場合、１個の明確に同定された胎児細胞を
用いて分析を行うことができる。核タイピングの場合、
５個という少数の中期の細胞を用いて分析を行うことが
できる。５個の中期の細胞を得るために必要な細胞数
は、中期を誘導するために用いた方法及び必要な培養期
間の長さに依存して変わる。2C又はそれ以上のDNAを持
つよう選んだ細胞の場合、実質的に短かい培養期間を用
いることができる。
用いて分析を行うことができる。核タイピングの場合、
５個という少数の中期の細胞を用いて分析を行うことが
できる。５個の中期の細胞を得るために必要な細胞数
は、中期を誘導するために用いた方法及び必要な培養期
間の長さに依存して変わる。2C又はそれ以上のDNAを持
つよう選んだ細胞の場合、実質的に短かい培養期間を用
いることができる。
別の場合、10個の細胞中１個という少数の胎児細胞と
いうような最少の胎児細胞を含む混合細胞集団中の一卵
性（一遺伝子性疾病の存在の指標）の同定法を計画する
こともできる。
いうような最少の胎児細胞を含む混合細胞集団中の一卵
性（一遺伝子性疾病の存在の指標）の同定法を計画する
こともできる。
ソーティングの後、分離細胞を生理学的緩衝液中で２
回洗浄し、細胞について行うその後の分析に適した媒地
中に再懸濁する。
回洗浄し、細胞について行うその後の分析に適した媒地
中に再懸濁する。
回収後の加工 本発明の回収法の後、固相に基づいていても又はFACS
分離に基づいていても、羊水穿刺及び絨毛性絨毛試験切
除などの他の方法で得た胎児細胞と同様の方法で、胎児
細胞を使用することができる。細胞は、胎児の対立遺伝
子の分析のためのDNA源として例えばポリメラーゼ鎖増
幅などにより、使用することができる。PCR分析法は、
胎児の性、β−サラセミア、フェニルケトン尿症（PK
U）及びデュシェンヌ型筋ジストロフィーの検出に使用
されてきた。
分離に基づいていても、羊水穿刺及び絨毛性絨毛試験切
除などの他の方法で得た胎児細胞と同様の方法で、胎児
細胞を使用することができる。細胞は、胎児の対立遺伝
子の分析のためのDNA源として例えばポリメラーゼ鎖増
幅などにより、使用することができる。PCR分析法は、
胎児の性、β−サラセミア、フェニルケトン尿症（PK
U）及びデュシェンヌ型筋ジストロフィーの検出に使用
されてきた。
別の場合、細胞を核タイピングのために試験切除材料
と同様の方法で培養することができる。しかし2C又はそ
れ以上のDNA含有量を選択基準として用いると、インキ
ュベーション期間をかなり短くすることができる。
と同様の方法で培養することができる。しかし2C又はそ
れ以上のDNA含有量を選択基準として用いると、インキ
ュベーション期間をかなり短くすることができる。
以下の特定の実施例により本発明をさらに説明する
が、制限するものではない。他に特定しなければ温度
は、度セッ氏で示し、濃度は重量％で示す。構成的に実
行を縮小した方法は、現在形で記載し、実験室で行った
方法は、過去形で示す。
が、制限するものではない。他に特定しなければ温度
は、度セッ氏で示し、濃度は重量％で示す。構成的に実
行を縮小した方法は、現在形で記載し、実験室で行った
方法は、過去形で示す。
実施例１ 標識抗体の調製 ２個のHLA Ａ遺伝子座対立遺伝子の特異的な２個の
単クローン性抗体を標識した。GSP 16.1と呼ばれる抗
体（抗−Ａ 1,9,10及び11;Genetic Systems,Seattle,
WA;10th International Workshop No.2004からのIgM
単クローン性抗体）をFIFCで標識した。GSP 20.1と呼
ばれる抗体（抗−A2,W69;Genetic Systems,Seattle,W
A;10th Interntional Workshop No.2021からのIgG単
クローン性抗体）をビオチンで標識した、ビオチン化抗
体と反応させた細胞をその後PE−標識ストレパビジンと
反応させた。抗体の精製及び標識に使用した試薬を下記
に示す。
単クローン性抗体を標識した。GSP 16.1と呼ばれる抗
体（抗−Ａ 1,9,10及び11;Genetic Systems,Seattle,
WA;10th International Workshop No.2004からのIgM
単クローン性抗体）をFIFCで標識した。GSP 20.1と呼
ばれる抗体（抗−A2,W69;Genetic Systems,Seattle,W
A;10th Interntional Workshop No.2021からのIgG単
クローン性抗体）をビオチンで標識した、ビオチン化抗
体と反応させた細胞をその後PE−標識ストレパビジンと
反応させた。抗体の精製及び標識に使用した試薬を下記
に示す。
ビオチン化緩衝液 0.42グラム Na2CO3 8.06グラム NaHCO3 １リットルとし、pH8.4。
FITC複合緩衝液 3.18グラム Na2CO3 5.86グラム NaHCO3 １リットルとし、pH9.6。
FITC（Sigma Chemical Co.,カタログ番号Ｆ−7250） 保存溶液FITC:1mlのDMSO（ジメチルスルホキシド）に
10mgを溶解 作用溶液FITC:FITC複合緩衝液中で保存溶液を1mg/ml
に希釈。
10mgを溶解 作用溶液FITC:FITC複合緩衝液中で保存溶液を1mg/ml
に希釈。
ビオチン（Molecular Probes,カタログ番号Ｓ−158
2） 保存溶液ビオチン:1mlのDMSOに10mgを溶解。
2） 保存溶液ビオチン:1mlのDMSOに10mgを溶解。
作用溶液ビオチン:DMSO中で保存溶液を1mg/mlに希
釈。
釈。
IgG抗体（GSP20.1）の場合、最初に抗体を、MABTrapG
キット（Pharmacia LKB）を用いてカラムクロマトグラ
フィーにかけて精製し、他の蛋白質、特にアルブミンを
除去した。このキットは、Protein Ｇ Sepharose ４
Fast F;low chromatograph媒地を用いている。（Pr
otein Ｇ Sepharoseを用いても同等である。）抗体含
有溶離液（15ml）をAmicon B125濃縮器で濃縮し、最終
体積を約2.0ml（最初の体積の約４倍）とした。抗体を
濃縮器から12x75mmの試験管に取り出した。ビオチン化
緩衝液を用いて体積を正確に2.5mlに調節した。
キット（Pharmacia LKB）を用いてカラムクロマトグラ
フィーにかけて精製し、他の蛋白質、特にアルブミンを
除去した。このキットは、Protein Ｇ Sepharose ４
Fast F;low chromatograph媒地を用いている。（Pr
otein Ｇ Sepharoseを用いても同等である。）抗体含
有溶離液（15ml）をAmicon B125濃縮器で濃縮し、最終
体積を約2.0ml（最初の体積の約４倍）とした。抗体を
濃縮器から12x75mmの試験管に取り出した。ビオチン化
緩衝液を用いて体積を正確に2.5mlに調節した。
IgM抗体は、予備精製しなかった。0.5mlの抗体試料を
FITC複合緩衝液を用いて2.5mlに希釈した。
FITC複合緩衝液を用いて2.5mlに希釈した。
Pharmacia LKBから入手したPD−10カラムを25mlの適
した複合緩衝液（FITC−標識抗体の場合FITC複合緩衝
液、及びビオチン化抗体の場合ビオチン複合緩衝液）で
洗浄した。2.5mlの各抗体の試料を適したカラムに適用
した。カラムから液体が落ちるのが止んだ後、適した複
合緩衝液の3mlのアリコートを適用した。各抗体−含有
溶離液を集めた。
した複合緩衝液（FITC−標識抗体の場合FITC複合緩衝
液、及びビオチン化抗体の場合ビオチン複合緩衝液）で
洗浄した。2.5mlの各抗体の試料を適したカラムに適用
した。カラムから液体が落ちるのが止んだ後、適した複
合緩衝液の3mlのアリコートを適用した。各抗体−含有
溶離液を集めた。
各溶離液をAmicon B125濃縮器で濃縮し、最終体積1m
lとした。抗体を濃縮器から取り出し、1.5mlの微量遠心
管に入れた。蛋白質定量のBradford法を用いたキット
（Protein Assay Kit ＃2,BioRad,Richmond,CA）を
使用して蛋白質の存在量を評価した。
lとした。抗体を濃縮器から取り出し、1.5mlの微量遠心
管に入れた。蛋白質定量のBradford法を用いたキット
（Protein Assay Kit ＃2,BioRad,Richmond,CA）を
使用して蛋白質の存在量を評価した。
抗体の量（蛋白質の量）を算出した後、FITC及びビオ
チンを以下の要領で加えた。蛋白質1mg当たり100μｌの
FITCの作用溶液のアリコートをIgM抗体を加えた。蛋白
質1mg当たり120μｌのビオチンの作用溶液を、IgG抗体
に加えた。各溶液を混合し、各管をアルミ箔で覆い、血
液学的血液振動器上で、室温にて終夜振動させた。
チンを以下の要領で加えた。蛋白質1mg当たり100μｌの
FITCの作用溶液のアリコートをIgM抗体を加えた。蛋白
質1mg当たり120μｌのビオチンの作用溶液を、IgG抗体
に加えた。各溶液を混合し、各管をアルミ箔で覆い、血
液学的血液振動器上で、室温にて終夜振動させた。
25mlのリン酸塩緩衝食塩水（PBS）、pH7.4（0.01Mの
リン酸塩、0.15MのNaCl）を通すことにより、各抗体に
つき１個のPD−10カラムを準備した。インキュベーショ
ン後、各抗体調剤をPBSで2.5mlに希釈し、カラム上に層
とした。カラムから液体が落ちるのが止んだ後、3mlのP
BSのアリコートを通過させ、溶離液を集めた。
リン酸塩、0.15MのNaCl）を通すことにより、各抗体に
つき１個のPD−10カラムを準備した。インキュベーショ
ン後、各抗体調剤をPBSで2.5mlに希釈し、カラム上に層
とした。カラムから液体が落ちるのが止んだ後、3mlのP
BSのアリコートを通過させ、溶離液を集めた。
Amicon B125で各抗体を再度濃縮し、最終体積1mlと
した。蛋白質含有量を再度定量し、最終濃度を40μg/ml
に調節した。IgM抗体の場合、抗体の存在量は、合計蛋
白質存在量の半分であるとみなし、40μg/mlに希釈し
た。牛血清アルブミン（BSA）を最終濃度10mg/mlまで加
え、ナトリウムアジドを最終濃度0.1％まで加えた。
した。蛋白質含有量を再度定量し、最終濃度を40μg/ml
に調節した。IgM抗体の場合、抗体の存在量は、合計蛋
白質存在量の半分であるとみなし、40μg/mlに希釈し
た。牛血清アルブミン（BSA）を最終濃度10mg/mlまで加
え、ナトリウムアジドを最終濃度0.1％まで加えた。
実施例２ 標識用の細胞の調製 各試料のヘパリンを混合した全血（30ml）を、室温に
て別々の管中のFicoll−Hypaque（Pharmacia−LKB）勾
配材料上に、3mlのフィコールに対して5mlの血液の比率
でのせて層を形成した。管をスイングバケット遠心機中
で、400gにて３分間回転した。それぞれの単核層を別の
管に取り出し、５％の血漿を含むRPMI 1640組織培養媒
地（Mediatech,Inc.,Herndon,VA）で２回洗浄した。そ
の後試料を血球計数器でカウントし、RPMI中で5x107/ml
に調節し、再度カウントした。
て別々の管中のFicoll−Hypaque（Pharmacia−LKB）勾
配材料上に、3mlのフィコールに対して5mlの血液の比率
でのせて層を形成した。管をスイングバケット遠心機中
で、400gにて３分間回転した。それぞれの単核層を別の
管に取り出し、５％の血漿を含むRPMI 1640組織培養媒
地（Mediatech,Inc.,Herndon,VA）で２回洗浄した。そ
の後試料を血球計数器でカウントし、RPMI中で5x107/ml
に調節し、再度カウントした。
実施例３ 血液試料中の細胞の標識 通常標識した抗体は、約２μg/106細胞の濃度で使用
した。この場合、106個の細胞当たり50μｌの抗体を染
色に使用した。細胞は、その量の抗体を用いて有効に染
色し、ソーティングされた。
した。この場合、106個の細胞当たり50μｌの抗体を染
色に使用した。細胞は、その量の抗体を用いて有効に染
色し、ソーティングされた。
実施例２に記載の要領で調製した細胞（RPMI 1640組
織培養媒地及び５％のオートロガス血漿100μｇ中の106
個の細胞）を下記の要領で染色し、標識の抗体への複合
を評価した。
織培養媒地及び５％のオートロガス血漿100μｇ中の106
個の細胞）を下記の要領で染色し、標識の抗体への複合
を評価した。
管＃１−−抗体を加えない（負） 管＃２−−GSP 16.1（抗−A11、IgM単クローン性抗
体）FITC複合;50μｌ 管＃３−−GSP 20.1（抗−A2,IgG単クローン性抗
体）ビオチン複合;50μｌ 管＃４−−GSP 16.1＋GSP 20.1;それぞれ50μｌ管
を混合し、４℃の暗所で30分間インキュベートした。こ
の後、10μｌのTAGO（Burlingame,CA）PE−ストレパビ
ジンを管＃３及び＃４に加えた。この試薬は、ビオチン
と反応し、ビオチン／アビジン−PE複合体を生じ、ビオ
チン−標識細胞を蛍光性とする。細胞をさらに30分イン
キュベートし、その後細胞を氷冷PBSで２回洗浄し、1ml
のPBS中に再懸濁した。
体）FITC複合;50μｌ 管＃３−−GSP 20.1（抗−A2,IgG単クローン性抗
体）ビオチン複合;50μｌ 管＃４−−GSP 16.1＋GSP 20.1;それぞれ50μｌ管
を混合し、４℃の暗所で30分間インキュベートした。こ
の後、10μｌのTAGO（Burlingame,CA）PE−ストレパビ
ジンを管＃３及び＃４に加えた。この試薬は、ビオチン
と反応し、ビオチン／アビジン−PE複合体を生じ、ビオ
チン−標識細胞を蛍光性とする。細胞をさらに30分イン
キュベートし、その後細胞を氷冷PBSで２回洗浄し、1ml
のPBS中に再懸濁した。
実施例４ 標識細胞のソーティング 実施例３に記載の要領で標識した細胞につき、緑の蛍
光（FITC）の対数対赤の蛍光（PE）の対数を用いて流動
細胞計測分析を行った。（細胞は、HLAタイプA2,A11を
持つドナー［ドナーＡ］からのものである。）この結
果、２次元（2D）プロット、カウンタープロット（逆が
描かれたら）、ドットプロット（ドットが細胞の存在量
を示すのに用いられた場合）及びサイトグラムと呼ばれ
るプロットを得る。FITC蛍光を示すＸ軸及びPE蛍光を示
すＹ軸を互いに対してプロットすると、得られるグラフ
は４つの象限に分けられる。左下は、負又は非染色細胞
が分類される。右下は、FITC−標識（緑）細胞が分類さ
れる。左上は、PE−標識（赤）細胞が分類される。右上
は、FITC−及びPE−標識（緑及び赤）細胞が分類され
る。
光（FITC）の対数対赤の蛍光（PE）の対数を用いて流動
細胞計測分析を行った。（細胞は、HLAタイプA2,A11を
持つドナー［ドナーＡ］からのものである。）この結
果、２次元（2D）プロット、カウンタープロット（逆が
描かれたら）、ドットプロット（ドットが細胞の存在量
を示すのに用いられた場合）及びサイトグラムと呼ばれ
るプロットを得る。FITC蛍光を示すＸ軸及びPE蛍光を示
すＹ軸を互いに対してプロットすると、得られるグラフ
は４つの象限に分けられる。左下は、負又は非染色細胞
が分類される。右下は、FITC−標識（緑）細胞が分類さ
れる。左上は、PE−標識（赤）細胞が分類される。右上
は、FITC−及びPE−標識（緑及び赤）細胞が分類され
る。
実施例５ 希少細胞ソーティングのための希釈研究 この研究では、ドナーＡからの血液試料（試料Ａ）か
らの細胞をドナーＢからの血液試料（試料Ｂ）からの細
胞と混合し、流動細胞計測器を用いた希少細胞分析／ソ
ーティングをまねた。流動細胞計測法の、これらの希少
細胞を同定するばかりでなく、単離することができる能
力を評価するためにこれらの一連の実験を行った。これ
らの研究は、１個のＡ遺伝座対立遺伝子を共通に持つ２
人の患者からの血液を希釈することにより行った。この
方法で、各患者からのあらかじめ決められた数の細胞が
試料中に存在することがわかった。
らの細胞をドナーＢからの血液試料（試料Ｂ）からの細
胞と混合し、流動細胞計測器を用いた希少細胞分析／ソ
ーティングをまねた。流動細胞計測法の、これらの希少
細胞を同定するばかりでなく、単離することができる能
力を評価するためにこれらの一連の実験を行った。これ
らの研究は、１個のＡ遺伝座対立遺伝子を共通に持つ２
人の患者からの血液を希釈することにより行った。この
方法で、各患者からのあらかじめ決められた数の細胞が
試料中に存在することがわかった。
GSP 16.1及びGSP 20.1に関する抗原が両方とも試料
Ａ細胞の表面上に見いだされる。これらの細胞は、これ
らの単クローン性抗体と反応させると、表面上に赤及び
緑の両方の蛍光を持った。抗原GSP 20.1は、試料Ｂ細
胞の表面上にも見いだされる。これらの細胞は、この単
クローン性抗体と反応させると表面上に赤い蛍光のみを
持った。従って標識パターンは、妊婦と胎児のパターン
を模倣している。
Ａ細胞の表面上に見いだされる。これらの細胞は、これ
らの単クローン性抗体と反応させると、表面上に赤及び
緑の両方の蛍光を持った。抗原GSP 20.1は、試料Ｂ細
胞の表面上にも見いだされる。これらの細胞は、この単
クローン性抗体と反応させると表面上に赤い蛍光のみを
持った。従って標識パターンは、妊婦と胎児のパターン
を模倣している。
試料Ａを５％、１％、0.1％及び0.001％の比率で試料
Ｂ中に混合した。第２の研究では、試料Ａを１％、0.1
％、0.001％及び0.0001％の比率で試料Ｂ中に混合し
た。Ｂ中へのＡの希釈は、試験管中に少なくとも1000個
のＡ細胞が存在するように計算した。
Ｂ中に混合した。第２の研究では、試料Ａを１％、0.1
％、0.001％及び0.0001％の比率で試料Ｂ中に混合し
た。Ｂ中へのＡの希釈は、試験管中に少なくとも1000個
のＡ細胞が存在するように計算した。
細胞を実施例３の方法に従って標識した。単クローン
性抗体GSP 16.1及びGSP 20.1の両方を、104個の細胞
当たり実施例１に記載の要領で調製した抗体50μｌを用
いて、混合細胞を含む各試験管に加えた。細胞を撹拌
し、管をアルミ箔で覆い、血液学的血液振動装置上に乗
せた浮氷上に置いた。
性抗体GSP 16.1及びGSP 20.1の両方を、104個の細胞
当たり実施例１に記載の要領で調製した抗体50μｌを用
いて、混合細胞を含む各試験管に加えた。細胞を撹拌
し、管をアルミ箔で覆い、血液学的血液振動装置上に乗
せた浮氷上に置いた。
抗体のインキュベーション後、ビオチン−標識細胞の
各管に、106個の細胞当たり10μｌの非希釈PE−ストレ
パビジンを用いてストレパビジン−フィコエリトリン
（TAGO）を加えた。細胞を再度撹拌し、前と同様にさら
に30分間インキュベートした。
各管に、106個の細胞当たり10μｌの非希釈PE−ストレ
パビジンを用いてストレパビジン−フィコエリトリン
（TAGO）を加えた。細胞を再度撹拌し、前と同様にさら
に30分間インキュベートした。
インキュベーション後、試料を1000gで３分間遠心
し、氷冷PBSで２回洗浄し、RPMI中に再懸濁しておおよ
そ最初の体積とし、氷上に置いた。
し、氷冷PBSで２回洗浄し、RPMI中に再懸濁しておおよ
そ最初の体積とし、氷上に置いた。
106個の試料Ａ細胞のみを含む３本の参照標準管の別
の組を、GSP 16.1、GSP 20.1及びGSP 16.1とGSP 2
0.1の組み合わせを用いて上記と同様の方法で反応させ
た。第４の細胞のアリコートを単クローン性抗体で処理
しないままにした。この４本の管の組を用いて研究中の
細胞の抗体標識を評価し、色の補償、対数増幅オフセッ
ト、信号のゲインなどにつき流動細胞計測装置をセット
した。装置の蛍光パラメーターを、細胞を４つの象限に
分離するよう調節した（前記で議論した通り）。
の組を、GSP 16.1、GSP 20.1及びGSP 16.1とGSP 2
0.1の組み合わせを用いて上記と同様の方法で反応させ
た。第４の細胞のアリコートを単クローン性抗体で処理
しないままにした。この４本の管の組を用いて研究中の
細胞の抗体標識を評価し、色の補償、対数増幅オフセッ
ト、信号のゲインなどにつき流動細胞計測装置をセット
した。装置の蛍光パラメーターを、細胞を４つの象限に
分離するよう調節した（前記で議論した通り）。
最初に最低希釈の管を分析／ソーティングした。この
研究における細胞は新しく、穏やかな遠心で処理し、低
温に保ったので、前方散乱に対する90度散乱パラメータ
ーにより評価して細胞の破片及び塊が最少であった。細
胞は、ディスプレー上に密に詰まった濃度の高い群を形
成した。
研究における細胞は新しく、穏やかな遠心で処理し、低
温に保ったので、前方散乱に対する90度散乱パラメータ
ーにより評価して細胞の破片及び塊が最少であった。細
胞は、ディスプレー上に密に詰まった濃度の高い群を形
成した。
唯一の領域（ゲート）を、ソーティングのために定義
した。これは、緑蛍光の対数対赤蛍光の対数パラメータ
ーとするディスプレー上で二重標識試料Ａ細胞が分類さ
れる領域であった。ただひとつの領域を定義することに
より、どの細胞をソートするかに関する評価において、
コンピューターはひとつの決定をしなければならない。
細胞がディスプレーの定義されたゲート領域に分類され
る場合、細胞はソートされる。
した。これは、緑蛍光の対数対赤蛍光の対数パラメータ
ーとするディスプレー上で二重標識試料Ａ細胞が分類さ
れる領域であった。ただひとつの領域を定義することに
より、どの細胞をソートするかに関する評価において、
コンピューターはひとつの決定をしなければならない。
細胞がディスプレーの定義されたゲート領域に分類され
る場合、細胞はソートされる。
装置は、１滴偏向／純度モードでソートするように設
定した。これは、細胞を望ましくない細胞を一緒にソー
トすることなく確信を持ってソートできる場合にのみ、
細胞がソートされることを意味する。細胞が互いに近接
して位置し、望ましくない細胞が望ましい細胞を含む液
の滴に含まれる場合に、望ましくない細胞が含まれてし
まう。この１滴偏向／純度モードにより本方法の識別能
を助け、向上させ、ソートされた選択細胞の純度を高く
する。
定した。これは、細胞を望ましくない細胞を一緒にソー
トすることなく確信を持ってソートできる場合にのみ、
細胞がソートされることを意味する。細胞が互いに近接
して位置し、望ましくない細胞が望ましい細胞を含む液
の滴に含まれる場合に、望ましくない細胞が含まれてし
まう。この１滴偏向／純度モードにより本方法の識別能
を助け、向上させ、ソートされた選択細胞の純度を高く
する。
ソーティングの平均速度は、約10,000細胞／秒であっ
た。細胞が装置を通過する時、統計がとられ、ソートゲ
ート領域に分類される細胞の数、ならびに装置がソート
した細胞の数を算出する。
た。細胞が装置を通過する時、統計がとられ、ソートゲ
ート領域に分類される細胞の数、ならびに装置がソート
した細胞の数を算出する。
ソートされた細胞を収集する装置は、ソート流の直下
に位置する個体支持体中に固定された10mlのビーカーか
ら成る。これらのビーカーには、RPMI中の約50％の血漿
100−200μｌが層を形成して入っている。この層が細胞
が収集容器に入る時の衝撃を和らげる助けをしている。
に位置する個体支持体中に固定された10mlのビーカーか
ら成る。これらのビーカーには、RPMI中の約50％の血漿
100−200μｌが層を形成して入っている。この層が細胞
が収集容器に入る時の衝撃を和らげる助けをしている。
ゲート領域に位置する細胞の少なくとも3,000個をソ
ートした後、ビーカーの内容物を他の試験管に注ぎ、統
計分析のために再度流動細胞計測を行う。装置を用いて
ソートした細胞を分析することによりソート法の効率を
評価するこの方法は、“プレーバック”、“ソートプレ
ーバック”又は単に“セカンドパス”と呼ばれる。この
ソートした細胞の評価から得られる統計は、最初の管か
らの２つの細胞集団のパーセンテージの、ソート法を経
たことによる変化を与える。ソートされた集団の純度又
は濃縮のパーセンテージを算出できるのは、このソート
した細胞の分析からである。
ートした後、ビーカーの内容物を他の試験管に注ぎ、統
計分析のために再度流動細胞計測を行う。装置を用いて
ソートした細胞を分析することによりソート法の効率を
評価するこの方法は、“プレーバック”、“ソートプレ
ーバック”又は単に“セカンドパス”と呼ばれる。この
ソートした細胞の評価から得られる統計は、最初の管か
らの２つの細胞集団のパーセンテージの、ソート法を経
たことによる変化を与える。ソートされた集団の純度又
は濃縮のパーセンテージを算出できるのは、このソート
した細胞の分析からである。
この方法を用いた研究により、試料Ａを0.01％かそれ
以上に希釈した管の場合、流動細胞計測器がもっと希釈
度の低い場合のように明確に二重標識細胞の信号を区別
できないことが示された。細胞は区別された。しかし希
少細胞のみの検出の信頼性は、低下し始める。これは、
細胞塊、破片などによる系の固有のノイズにより起こる
迷走信号が我々の希少細胞に関して示された領域中に計
算されてしまう、装置に関する統計的問題に起因する。
この限界を克服するために、第３の蛍光色、細胞の大き
さなどの別のパラメーターを用いて希少細胞を突き止め
ることができる。
以上に希釈した管の場合、流動細胞計測器がもっと希釈
度の低い場合のように明確に二重標識細胞の信号を区別
できないことが示された。細胞は区別された。しかし希
少細胞のみの検出の信頼性は、低下し始める。これは、
細胞塊、破片などによる系の固有のノイズにより起こる
迷走信号が我々の希少細胞に関して示された領域中に計
算されてしまう、装置に関する統計的問題に起因する。
この限界を克服するために、第３の蛍光色、細胞の大き
さなどの別のパラメーターを用いて希少細胞を突き止め
ることができる。
本研究は、試料Ａを0.01％かそれ以上に希釈した管の
場合、ソートされる細胞の数が3,000以下であることも
示した。プレーバックすると、ノイズの中に非常に少数
の細胞があるため、分析の信頼性は妨げられた。0.01％
希釈管のプレーバックの分析により、この集団の濃縮が
30％であったのを見るとこれが最も良くかる。次に高い
希釈管（0.001％）を、血漿で被覆した顕微鏡スライド
（乾燥）上に直接ソートした。
場合、ソートされる細胞の数が3,000以下であることも
示した。プレーバックすると、ノイズの中に非常に少数
の細胞があるため、分析の信頼性は妨げられた。0.01％
希釈管のプレーバックの分析により、この集団の濃縮が
30％であったのを見るとこれが最も良くかる。次に高い
希釈管（0.001％）を、血漿で被覆した顕微鏡スライド
（乾燥）上に直接ソートした。
このソート集団の湿潤量の、蛍光顕微鏡を用いた評価
により、存在する細胞の60％近くが二重標識されている
ことが明らかになった。視覚で見ると、染料結晶、破片
などのバックグラウンドが現れ、それは、プレーバック
を行うと流動細胞計測器により拾われてカウントされ、
二重標識細胞の全回収率が低く現れるであろう。希釈度
の低い試料は、希釈度の高い試料より純度が高いことが
予想される。従って0.01％希釈は、60％以上の純度であ
ることが予想される。
により、存在する細胞の60％近くが二重標識されている
ことが明らかになった。視覚で見ると、染料結晶、破片
などのバックグラウンドが現れ、それは、プレーバック
を行うと流動細胞計測器により拾われてカウントされ、
二重標識細胞の全回収率が低く現れるであろう。希釈度
の低い試料は、希釈度の高い試料より純度が高いことが
予想される。従って0.01％希釈は、60％以上の純度であ
ることが予想される。
希釈−ソート研究の評価により、本方法が希釈細胞集
団を突き止め、ソートし、その最初の低いパーセンテー
ジからかなり濃縮することを可能にすることが示され
た。まとめとして、FACSを用いて集団を評価することに
より決定した、ソートされた試料Ａ細胞のパーセンテー
ジ及びソートされた細胞のパーセンテージを下記に挙げ
る。上記のスライド上の目視検査による評価も、0.001
％希釈に関して示す。
団を突き止め、ソートし、その最初の低いパーセンテー
ジからかなり濃縮することを可能にすることが示され
た。まとめとして、FACSを用いて集団を評価することに
より決定した、ソートされた試料Ａ細胞のパーセンテー
ジ及びソートされた細胞のパーセンテージを下記に挙げ
る。上記のスライド上の目視検査による評価も、0.001
％希釈に関して示す。
（ソート前） （ソート後） ５％・・・・・・・・・・・75％ １％・・・・・・・・・・・60％ 0.1％ ・・・・・・・・・55％ 0.01％・・・・・・・・・・30％ 0.001％ 60％（目視により決定） この研究により決定した、２種類の蛍光パラメーター
を用いたゲート領域中の細胞の数の識別の限界は、約0.
01％であった。より高希釈度の場合にこの領域に分類さ
れる細胞は、過大評価されるようである。
を用いたゲート領域中の細胞の数の識別の限界は、約0.
01％であった。より高希釈度の場合にこの領域に分類さ
れる細胞は、過大評価されるようである。
実施例６ 希釈研究の繰り返し 単クローン性抗体標識法の繰り返しを含めて実施例５
に記載の研究を繰り返した。第２の研究の場合の識別の
限界も0.01％のレベルであった。これらの研究からの細
胞は、血漿で被覆し、乾燥したスライド上にソートし
た、１％から0.0001％の範囲の希釈液から約100個の細
胞をソートした。
に記載の研究を繰り返した。第２の研究の場合の識別の
限界も0.01％のレベルであった。これらの研究からの細
胞は、血漿で被覆し、乾燥したスライド上にソートし
た、１％から0.0001％の範囲の希釈液から約100個の細
胞をソートした。
実施例７ 一重標識希少細胞を用いた希釈研究 一重標識細胞を希釈して希少細胞とした別の研究を、
実施例６に記載の要領で行った。（抗体標識法は、繰り
返さなかった。）試料Ａを母親の二重標識細胞として、
及び試料Ｂを胎児の一重標識細胞として、0.1、0.01及
び0.001％の希釈で所為した。得られた結果は、上記の
実施例５に記載の結果と類似していた。この研究は、１
個の蛍光標識に基づいて胎児細胞を母性細胞から分離で
きることを示す。これは、母親の細胞を二重に標識する
ことができる母親の抗原を決定することができるので、
本発明をより密接に設模倣している。この研究で示され
た通り、細胞を分離することができるどのような４象限
の組み合わせも（非染色、赤のみ、緑のみ、及び赤プラ
ス緑）問題の細胞の分離／ソーティングに使用すること
ができる。
実施例６に記載の要領で行った。（抗体標識法は、繰り
返さなかった。）試料Ａを母親の二重標識細胞として、
及び試料Ｂを胎児の一重標識細胞として、0.1、0.01及
び0.001％の希釈で所為した。得られた結果は、上記の
実施例５に記載の結果と類似していた。この研究は、１
個の蛍光標識に基づいて胎児細胞を母性細胞から分離で
きることを示す。これは、母親の細胞を二重に標識する
ことができる母親の抗原を決定することができるので、
本発明をより密接に設模倣している。この研究で示され
た通り、細胞を分離することができるどのような４象限
の組み合わせも（非染色、赤のみ、緑のみ、及び赤プラ
ス緑）問題の細胞の分離／ソーティングに使用すること
ができる。
実施例５−７に示した通り、標識細胞が１個のHLA遺
伝子座の１個の対立遺伝子を共有している場合、HLA抗
原に関する抗体で標識した後、蛍光特性に基づいて試料
Ａ細胞及び試料Ｂ細胞の間の識別が行われた。
伝子座の１個の対立遺伝子を共有している場合、HLA抗
原に関する抗体で標識した後、蛍光特性に基づいて試料
Ａ細胞及び試料Ｂ細胞の間の識別が行われた。
実施例８ 母親の血液からの希少細胞のFACS分離 妊婦９週間の婦人から血液を採取した。実施例５−７
に記載の研究の場合と同様に、母親と父親は、Ａ遺伝子
座に関する共通の抗原を共有していた。母親の他のＡ抗
原は、A2であり、それはGSP 20.1抗体と反応する。父
親の異なるＡ抗原は、GSP 16.1抗体と反応する。
に記載の研究の場合と同様に、母親と父親は、Ａ遺伝子
座に関する共通の抗原を共有していた。母親の他のＡ抗
原は、A2であり、それはGSP 20.1抗体と反応する。父
親の異なるＡ抗原は、GSP 16.1抗体と反応する。
この研究の場合、実施例１に記載の要領で、母親のGS
P 20.1抗体をビオチン/PEで標識し、父親のGSP 16.1
抗体をFITCで標識した。血液を精製し、実施例２及び３
に記載の要領で染色した。この研究の場合、母親の細胞
を赤で染色し、父親の細胞を緑で染色した。
P 20.1抗体をビオチン/PEで標識し、父親のGSP 16.1
抗体をFITCで標識した。血液を精製し、実施例２及び３
に記載の要領で染色した。この研究の場合、母親の細胞
を赤で染色し、父親の細胞を緑で染色した。
母親の血液中の細胞は、主に赤で、希少（胎児）細胞
は、赤及び緑で標識された。約5.5x106個のソートした
母親の細胞中、赤及び緑のソート基準により回収された
細胞は、約0.1％の細胞集団を構成していた。これらの
ソートされた細胞の約20％が赤及び緑で標識されてい
た。
は、赤及び緑で標識された。約5.5x106個のソートした
母親の細胞中、赤及び緑のソート基準により回収された
細胞は、約0.1％の細胞集団を構成していた。これらの
ソートされた細胞の約20％が赤及び緑で標識されてい
た。
上記の方法を、妊婦10週及び11週の同一の婦人からの
試料につき繰り返し、同様の結果を得た。
試料につき繰り返し、同様の結果を得た。
この実験は、妊婦の最初の３カ月の婦人の抹消血中
に、９週という早い時期に胎児細胞が存在し、１個のHL
A遺伝子座によりコードされる母親と胎児のHLE抗原を区
別する蛍光染色パターンを用いて母親の血液から回収す
ることができることを示す。
に、９週という早い時期に胎児細胞が存在し、１個のHL
A遺伝子座によりコードされる母親と胎児のHLE抗原を区
別する蛍光染色パターンを用いて母親の血液から回収す
ることができることを示す。
実施例９ 磁気ビーズを用いた希少細胞の分離 実施例８で使用した細胞の別の試料を、DYNABEAD磁気
ビーズ（Robbins Scientific,Mountain View,CA）を
用いて分離した。胎児HLA Ａ抗原が母性細胞上に存在
しないので、GSP 16.1抗体（IgM）を、製造者の指示に
し従って抗体の複合によりビーズに固定した。この抗体
は、入手し易いので用いた。（本発明の場合のように非
伝達抗原のために母性細胞が固相に固定され、胎児細胞
が結合しないのではなく、）この場合は希少な胎児細胞
が固相に固定され、母性細胞が結合しないことを除いて
この抗体分離は、母性細胞の結合に基づく分離と同様に
働く。
ビーズ（Robbins Scientific,Mountain View,CA）を
用いて分離した。胎児HLA Ａ抗原が母性細胞上に存在
しないので、GSP 16.1抗体（IgM）を、製造者の指示に
し従って抗体の複合によりビーズに固定した。この抗体
は、入手し易いので用いた。（本発明の場合のように非
伝達抗原のために母性細胞が固相に固定され、胎児細胞
が結合しないのではなく、）この場合は希少な胎児細胞
が固相に固定され、母性細胞が結合しないことを除いて
この抗体分離は、母性細胞の結合に基づく分離と同様に
働く。
母親の血液を塩化アンモニウム細胞溶解により精製
し、４℃にてPBS中に懸濁した。製造者は、1ml当たり1x
106−1x107個のビーズを細胞１個当たり約５個のビーズ
の比率で用いることを薦めている。しかし相談の結果、
細胞の混合物から選んだ細胞を取り出す場合の用途に
は、細胞１個当たり約１個又はそれ以下のビーズの比率
が示唆された。
し、４℃にてPBS中に懸濁した。製造者は、1ml当たり1x
106−1x107個のビーズを細胞１個当たり約５個のビーズ
の比率で用いることを薦めている。しかし相談の結果、
細胞の混合物から選んだ細胞を取り出す場合の用途に
は、細胞１個当たり約１個又はそれ以下のビーズの比率
が示唆された。
0.05及び0.5ビーズ／細胞を用いた実験を行った。GSP
16.1抗体をビーズに複合させ（“16.1ビーズ”）、非
特異的複合を評価するために、負の参照標準抗体（GSP
56.1,HLA Ｂ 27.1の抗体，抗原は両親のどちらにも
存在しない）を第２組のビーズに複合させた。精製した
血液の細胞をビーズと共に４℃で60分間インキュベート
した。
16.1抗体をビーズに複合させ（“16.1ビーズ”）、非
特異的複合を評価するために、負の参照標準抗体（GSP
56.1,HLA Ｂ 27.1の抗体，抗原は両親のどちらにも
存在しない）を第２組のビーズに複合させた。精製した
血液の細胞をビーズと共に４℃で60分間インキュベート
した。
0.05対１の比率で用いた16.1ビーズは、ビーズが少な
すぎて評価できなかった。0.5対１の比率で用いた16.1
ビーズには、容易に見える細胞のロゼットがあった。5
6.1ビーズは、ビーズ当たり少量の細胞を有し、目立っ
たロゼットはなかった。参照標準ビーズ配合物の細胞遠
心により、ロゼット形式細胞は主に単球であることがわ
かった。
すぎて評価できなかった。0.5対１の比率で用いた16.1
ビーズには、容易に見える細胞のロゼットがあった。5
6.1ビーズは、ビーズ当たり少量の細胞を有し、目立っ
たロゼットはなかった。参照標準ビーズ配合物の細胞遠
心により、ロゼット形式細胞は主に単球であることがわ
かった。
ロゼット形成細胞が胎児由来であることを立証するた
めに、細胞に対するビーズの比率0.5を用いて研究を繰
り返した。ビーズがかなり大きくFITC−標識細胞が結合
できるので、ビーズと共にインキューベートする前に血
液細胞をFITC−標識GSP 16.1抗体で逆標識し、胎児細
胞を緑とした。蛍光標識を用いる場合は常にインキュベ
ーションを暗所で行う以外は上記に記載の要領で細胞を
インキュベートした。インキュベーション後、固相に固
定された胎児細胞を、磁石を用いて母性細胞から分離
し、磁気ビーズから除去した。その後の分析のために、
分離胎児細胞をRPMI 1640媒地中に入れた。
めに、細胞に対するビーズの比率0.5を用いて研究を繰
り返した。ビーズがかなり大きくFITC−標識細胞が結合
できるので、ビーズと共にインキューベートする前に血
液細胞をFITC−標識GSP 16.1抗体で逆標識し、胎児細
胞を緑とした。蛍光標識を用いる場合は常にインキュベ
ーションを暗所で行う以外は上記に記載の要領で細胞を
インキュベートした。インキュベーション後、固相に固
定された胎児細胞を、磁石を用いて母性細胞から分離
し、磁気ビーズから除去した。その後の分析のために、
分離胎児細胞をRPMI 1640媒地中に入れた。
固相−固定細胞の分析により、細胞が緑であることが
示され、細胞が胎児由来のものであることが確認され
た。
示され、細胞が胎児由来のものであることが確認され
た。
その後胎児は、雄であることが決定された。分離細胞
は、以下の方法で胎児細胞であることを立証した。第１
に細胞の蛍光染色により、濃縮“胎児”細胞集団中に父
親のHLA抗原のひとつが存在することが確認された。す
なわち細胞は、非特異的にビーズに結合したなではなか
った。第２に、Kogan,New Engl.J.Med.317:985−990
（1987）に記載の方法に従ってＹ染色体−特異的配列増
幅により、分離“胎児”細胞中にＹ染色体が存在するこ
とが確認された。
は、以下の方法で胎児細胞であることを立証した。第１
に細胞の蛍光染色により、濃縮“胎児”細胞集団中に父
親のHLA抗原のひとつが存在することが確認された。す
なわち細胞は、非特異的にビーズに結合したなではなか
った。第２に、Kogan,New Engl.J.Med.317:985−990
（1987）に記載の方法に従ってＹ染色体−特異的配列増
幅により、分離“胎児”細胞中にＹ染色体が存在するこ
とが確認された。
Ｙ染色体配列の存在及び父親のHLA抗原のひとつの存
在は、細胞が胎児由来であること、及び細胞配合物が遺
伝分析に十分な濃縮をされていることを示す。
在は、細胞が胎児由来であること、及び細胞配合物が遺
伝分析に十分な濃縮をされていることを示す。
なお、本発明の主たる特徴及び態様を示せば以下のと
おりである。
おりである。
1.多型遺伝子座の第１の対立遺伝子によりコードされる
第１の表面抗原及び多型遺伝子座の第２の対立遺伝子に
よりコードされる第２の異なる細胞表面抗原を有する妊
婦の血液試料から胎児細胞を回収する方法であって、 a.該試料の細胞を該第１の細胞表面抗原に特異的な抗体
と、抗体の結合に十分な時間合わせ； b.該抗体に結合した該試料の細胞を該抗体に結合しない
細胞から分離し； c.該非結合、分離細胞を回収する ことを特徴とする方法。
第１の表面抗原及び多型遺伝子座の第２の対立遺伝子に
よりコードされる第２の異なる細胞表面抗原を有する妊
婦の血液試料から胎児細胞を回収する方法であって、 a.該試料の細胞を該第１の細胞表面抗原に特異的な抗体
と、抗体の結合に十分な時間合わせ； b.該抗体に結合した該試料の細胞を該抗体に結合しない
細胞から分離し； c.該非結合、分離細胞を回収する ことを特徴とする方法。
2.該抗体をフルオロクロムで標識し、該抗体に結合した
細胞を、蛍光活性化細胞選別機を用いて該抗体に結合し
ない細胞から分離する、上記１に記載の方法。
細胞を、蛍光活性化細胞選別機を用いて該抗体に結合し
ない細胞から分離する、上記１に記載の方法。
3.a.該細胞を該第２の細胞表面抗原に特異的な第２の異
なるフルオロクロムで標識された第２の抗体と、抗体の
結合に十分な時間接触させて二重標識された母性細胞を
生成せしめ； b.二重標識された細胞を一重標識された又は標識されて
いない細胞から分離する 段階をさらに含む、上記２に記載の方法。
なるフルオロクロムで標識された第２の抗体と、抗体の
結合に十分な時間接触させて二重標識された母性細胞を
生成せしめ； b.二重標識された細胞を一重標識された又は標識されて
いない細胞から分離する 段階をさらに含む、上記２に記載の方法。
4.該抗体を固相に固定する、上記１に記載の方法。
5.a.別に該試料の細胞を、該第２の細胞表面抗原に特異
的な第２の抗体と、抗体の結合に十分な時間合わせ； b.該第２の抗体と結合した該試料中の細胞を該第２の抗
体と結合しない細胞から分離し； c.非結合、分離細胞を回収する 段階をさらに含む、上記４に記載の方法。
的な第２の抗体と、抗体の結合に十分な時間合わせ； b.該第２の抗体と結合した該試料中の細胞を該第２の抗
体と結合しない細胞から分離し； c.非結合、分離細胞を回収する 段階をさらに含む、上記４に記載の方法。
6.該第１の細胞表面抗原に対する該抗体及び該第２の抗
体を該細胞と順次接触させる、上記５に記載の方法。
体を該細胞と順次接触させる、上記５に記載の方法。
7.該血液試料を、該抗体と合わせる前に精製して赤血球
を除去する、上記１に記載の方法。
を除去する、上記１に記載の方法。
8.該精製を、赤血球とリンパ球の中間の密度を有する勾
配材料を用いて行う、上記７に記載の方法。
配材料を用いて行う、上記７に記載の方法。
9.該精製を、低張液を用いて行う、上記７に記載の方
法。
法。
10.該細胞表面抗原が血液群抗原である、上記１の記載
の方法。
の方法。
11.該細胞表面抗原がHLA抗原である、上記１に記載の方
法。
法。
12.該第１及び第２の抗原が同じ多型遺伝子座の異なる
対立遺伝子により発現される、上記１に記載の方法。
対立遺伝子により発現される、上記１に記載の方法。
13.該第１及び第２の抗原が２種の異なる多型遺伝子座
の対立遺伝子により発現される、上記１に記載の方法。
の対立遺伝子により発現される、上記１に記載の方法。
14.多型遺伝子座の第１の対立遺伝子及び多型遺伝子座
の第２の対立遺伝子により発現される異なる第１及び第
２の細胞表面抗原を有する妊婦の血液試料から胎児細胞
を回収する方法であって、 a.該試料の細胞を、固相−固定した該第１の抗原に特異
的な第１の抗体と、抗体の結合に十分な時間合わせ； b.別に該試料の細胞を、該第２の抗原に特異的な固相−
固定した第２の抗体と抗体の結合に十分な時間合わせ； c.該第１の抗体及び該第２の抗体により該固相に結合し
た細胞を、非結合細胞から分離し； d.該非結合、分離細胞を回収する ことを特徴とする方法。
の第２の対立遺伝子により発現される異なる第１及び第
２の細胞表面抗原を有する妊婦の血液試料から胎児細胞
を回収する方法であって、 a.該試料の細胞を、固相−固定した該第１の抗原に特異
的な第１の抗体と、抗体の結合に十分な時間合わせ； b.別に該試料の細胞を、該第２の抗原に特異的な固相−
固定した第２の抗体と抗体の結合に十分な時間合わせ； c.該第１の抗体及び該第２の抗体により該固相に結合し
た細胞を、非結合細胞から分離し； d.該非結合、分離細胞を回収する ことを特徴とする方法。
15.該固相が磁気ビーズであり、該固相−固定された細
胞を磁石を用いて非結合細胞から分離する、上記14に記
載の方法。
胞を磁石を用いて非結合細胞から分離する、上記14に記
載の方法。
16.段階（ａ）及び（ｂ）を順次行う、上記14に記載の
方法。
方法。
17.該第１の抗体を視覚で検出できる第１標識で標識
し、該第２の抗体を視覚で検出できる第２の異なる標識
で標識する、上記14に記載の方法。
し、該第２の抗体を視覚で検出できる第２の異なる標識
で標識する、上記14に記載の方法。
18.HLA遺伝子座の第１及び第２の対立遺伝子により発現
される異なる第１及び第２の抗原を有する妊婦の血液試
料から胎児細胞を分離する方法であって、 a.該試料の細胞を、固相−固定した該第１の抗原に特異
的な第１の抗体と、抗体の結合に十分な時間合わせ； b.別の該試料の細胞を、該第２の抗原に特異的な固相−
固定した第２の抗体と抗体の結合に十分な時間合わせ； c.該第１の抗体及び該第２の抗体により該固相に結合し
た細胞を、非結合細胞から分離し； d.該非結合、分離細胞を回収する ことを特徴とする方法。
される異なる第１及び第２の抗原を有する妊婦の血液試
料から胎児細胞を分離する方法であって、 a.該試料の細胞を、固相−固定した該第１の抗原に特異
的な第１の抗体と、抗体の結合に十分な時間合わせ； b.別の該試料の細胞を、該第２の抗原に特異的な固相−
固定した第２の抗体と抗体の結合に十分な時間合わせ； c.該第１の抗体及び該第２の抗体により該固相に結合し
た細胞を、非結合細胞から分離し； d.該非結合、分離細胞を回収する ことを特徴とする方法。
19.該HLA遺伝子座がA,B及びＣから選ばれる、上記18に
記載の方法。
記載の方法。
20.該HLA遺伝子座がDR,DQ及びDPから選ばれる、上記18
に記載の方法。
に記載の方法。
21.該回収された胎児細胞からDNAを得る段階をさらに含
む、上記18に記載の方法。
む、上記18に記載の方法。
22.該回収された胎児細胞を培養する段階をさらに含
む、上記18に記載の方法。
む、上記18に記載の方法。
23.該妊婦の対立遺伝子を少なくとも２個のHLA遺伝子座
に関して決定する段階をさらに含んでなる、上記18に記
載の方法。
に関して決定する段階をさらに含んでなる、上記18に記
載の方法。
24.該HLA遺伝子座の抗原を血清法を用いて決定する、上
記24に記載の方法。
記24に記載の方法。
25.該HLA遺伝子座の抗原をDNA分析法を用いて決定す
る、上記24に記載の方法。
る、上記24に記載の方法。
26.HLA遺伝子座の第１及び第２の対立遺伝子により発現
される異なる第１及び第２の抗原を有する妊婦の血液試
料から胎児細胞を回収する方法であって、 a.該試料の細胞を、該第１の抗原に特異的な、第１のフ
ルオロクロムで標識した第１の抗体、及び該第２の抗原
に特異的な、第２の異なるフルオロクロムで標識した第
２の抗体と、抗体の結合に十分な時間合わせて、標識さ
れた細胞を含む試料を生成せしめ； b.蛍光活性化細胞選別機を用いて、該試料の二重標識さ
れた細胞を一重標識された細胞から分離して分離、一重
標識細胞を生成せしめ； c.該分離、一重標識細胞を回収する ことを特徴とする方法。
される異なる第１及び第２の抗原を有する妊婦の血液試
料から胎児細胞を回収する方法であって、 a.該試料の細胞を、該第１の抗原に特異的な、第１のフ
ルオロクロムで標識した第１の抗体、及び該第２の抗原
に特異的な、第２の異なるフルオロクロムで標識した第
２の抗体と、抗体の結合に十分な時間合わせて、標識さ
れた細胞を含む試料を生成せしめ； b.蛍光活性化細胞選別機を用いて、該試料の二重標識さ
れた細胞を一重標識された細胞から分離して分離、一重
標識細胞を生成せしめ； c.該分離、一重標識細胞を回収する ことを特徴とする方法。
27.該回収された胎児細胞からDNAを得る段階をさらに含
む、上記26に記載の方法。
む、上記26に記載の方法。
28.該回収された胎児細胞を培養する段階をさらに含
む、上記26に記載の方法。
む、上記26に記載の方法。
Claims (19)
- 【請求項１】多型遺伝子座の第１の対立遺伝子によりコ
ードされる第１の表面抗原及び多型遺伝子座の第２の対
立遺伝子によりコードされる第２の異なる細胞表面抗原
を有する母性血液細胞からなる妊娠個体から得られる血
液試料から胎児細胞を回収する方法であって、該第１及
び第２の対立遺伝子が異なる母性ハプロタイプからのも
のであるか或いは単一の多型遺伝子座の対立遺伝子であ
り、該方法が、 a.該試料の細胞を該第１の細胞表面抗原に特異的な第１
の抗体と、抗体の結合に十分な時間合わせ； b.該第１の抗体に結合した該試料の細胞を該第１の抗体
に結合しない細胞から分離し； c.第１の非結合、分離細胞を回収し； d.段階（ｃ）において非結合、分離細胞が実質的に回収
されない場合には、該試料の細胞を該第２の細胞表面抗
原に特異的な第２の抗原と、抗体の結合に十分な時間合
わせ；そして （ｉ） 該第２の抗体に結合した該試料の細胞を該第２
の抗体に結合しない細胞から分離し； （ii） 第２の非結合、分離細胞を回収する、 ことからなることを特徴とする方法。 - 【請求項２】該血液試料が妊婦からのものである請求の
範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】該第１の抗体をフルオロクロムで標識し、
該第１又は第２の抗体に結合した細胞を、蛍光活性化細
胞選別機を用いて該第１又は第２の抗体に結合しない細
胞から分離する請求の範囲第１項又は第２項に記載の方
法。 - 【請求項４】多型遺伝子座の第１の対立遺伝子により発
現される第１の細胞表面抗原及び多型遺伝子座の第２の
対立遺伝子により発現される第２の異なる細胞表面抗原
を有する母性血液細胞からなる妊娠個体から得られる血
液試料から胎児細胞を回収する方法であって、該第１及
び第２の対立遺伝子が異なる母性ハプロタイプからのも
のであるか或いは単一の多型遺伝子座の対立遺伝子であ
り、該方法が a.該試料の細胞を、該第１の細胞表面抗原に特異的な第
１の抗体及び該第２の細胞表面抗原に特異的な第２の抗
体と、抗体の結合に十分な時間合わせ； b.該第１及び第２の抗体の両方に結合した該試料の細胞
を、該第１及び第２の抗体の両方に結合しない細胞から
分離し、 c.該第１及び第２の抗体の両方に結合しない該分離した
細胞を回収する ことからなることを特徴とする方法。 - 【請求項５】該血液試料が妊婦からのものである請求の
範囲第４項に記載の方法。 - 【請求項６】該第１の抗体をフルオロクロムで標識し、
該第２の抗体を第２の異なるフルオロクロムで標識し、
該第１及び第２の抗体に結合した細胞を、蛍光活性化細
胞選別機を用いて該第１及び第２の抗体に結合しない細
胞から分離する請求の範囲第４項又は第５項に記載の方
法。 - 【請求項７】該第１の細胞表面抗原に特異的な該抗体を
固相に固定する請求の範囲第１項又は第２項に記載の方
法。 - 【請求項８】該第２の抗体を固相−固定し、そして該第
１の細胞表面抗原に対する該抗体により又は該第２の抗
体により該固相に結合された細胞を非結合細胞から分離
する請求の範囲第７項に記載の方法。 - 【請求項９】該固相が磁気ビーズであり、該固相−固定
された細胞を磁石を用いて非結合細胞から分離する請求
の範囲第７項又は第８項に記載の方法。 - 【請求項１０】該第１及び第２の細胞表面抗原の少なく
とも１つが血液群抗原である請求の範囲第１〜３及び７
〜９項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】該第１及び第２の細胞表面抗原の少なく
とも１つがHLA群抗原である請求の範囲第１〜３及び７
〜９項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１２】該第１及び第２の抗原が同じ多型遺伝子
座の異なる対立遺伝子により発現される請求の範囲第１
〜３及び７〜11項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１３】該第１及び第２の抗原が２種の異なる多
型遺伝子座の対立遺伝子により発現される請求の範囲第
１〜３及び７〜11項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１４】多型遺伝子座がHLA遺伝子座である請求
の範囲第12項に記載の方法。 - 【請求項１５】該HLA遺伝子座がA,B及びＣから選ばれる
請求の範囲第14項に記載の方法。 - 【請求項１６】該HLA遺伝子座がDR,DQ及びDPから選ばれ
る請求の範囲第14項に記載の方法。 - 【請求項１７】該回収した胎児細胞からDNAを得る段階
をさらに含む請求の範囲第１〜３及び７〜16項のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項１８】該回収された胎児細胞を培養する段階を
さらに含む請求の範囲第１〜３及び７〜16項のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項１９】該母性血液が由来する個体の対立遺伝子
をHLA遺伝子座に関して決定する段階をさらに含んでな
る請求の範囲第14〜16項のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/499,932 US5153117A (en) | 1990-03-27 | 1990-03-27 | Fetal cell recovery method |
| US499,932 | 1990-03-27 | ||
| PCT/AU1991/000115 WO1991014768A1 (en) | 1990-03-27 | 1991-03-27 | Fetal cell recovery method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05506144A JPH05506144A (ja) | 1993-09-16 |
| JP2965699B2 true JP2965699B2 (ja) | 1999-10-18 |
Family
ID=23987348
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3505625A Expired - Lifetime JP2965699B2 (ja) | 1990-03-27 | 1991-03-27 | 胎児細胞回収法 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5153117A (ja) |
| EP (1) | EP0521909B1 (ja) |
| JP (1) | JP2965699B2 (ja) |
| AT (1) | ATE194166T1 (ja) |
| AU (1) | AU649027B2 (ja) |
| CA (1) | CA2059554C (ja) |
| DE (1) | DE69132269T2 (ja) |
| DK (1) | DK0521909T3 (ja) |
| ES (1) | ES2149760T3 (ja) |
| GR (1) | GR3034487T3 (ja) |
| IE (1) | IE910996A1 (ja) |
| IL (1) | IL97677A (ja) |
| NZ (1) | NZ237589A (ja) |
| SG (1) | SG79188A1 (ja) |
| WO (1) | WO1991014768A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA912317B (ja) |
Cited By (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014502845A (ja) * | 2010-12-22 | 2014-02-06 | ナテラ， インコーポレイテッド | 非侵襲性出生前親子鑑定法 |
| US9334541B2 (en) | 2010-05-18 | 2016-05-10 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US9424392B2 (en) | 2005-11-26 | 2016-08-23 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| US9499870B2 (en) | 2013-09-27 | 2016-11-22 | Natera, Inc. | Cell free DNA diagnostic testing standards |
| US9639657B2 (en) | 2008-08-04 | 2017-05-02 | Natera, Inc. | Methods for allele calling and ploidy calling |
| US9677118B2 (en) | 2014-04-21 | 2017-06-13 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US10011870B2 (en) | 2016-12-07 | 2018-07-03 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
| US10017812B2 (en) | 2010-05-18 | 2018-07-10 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US10061889B2 (en) | 2009-09-30 | 2018-08-28 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US10083273B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US10081839B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US10179937B2 (en) | 2014-04-21 | 2019-01-15 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
| US10262755B2 (en) | 2014-04-21 | 2019-04-16 | Natera, Inc. | Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments |
| US10316362B2 (en) | 2010-05-18 | 2019-06-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US10526658B2 (en) | 2010-05-18 | 2020-01-07 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US10577655B2 (en) | 2013-09-27 | 2020-03-03 | Natera, Inc. | Cell free DNA diagnostic testing standards |
| US20210198733A1 (en) | 2018-07-03 | 2021-07-01 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free dna |
| US11111544B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US11111543B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US11322224B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11326208B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-10 | Natera, Inc. | Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA |
| US11332785B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11332793B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11339429B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11408031B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
| US11479812B2 (en) | 2015-05-11 | 2022-10-25 | Natera, Inc. | Methods and compositions for determining ploidy |
| US11485996B2 (en) | 2016-10-04 | 2022-11-01 | Natera, Inc. | Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing |
| US12305235B2 (en) | 2019-06-06 | 2025-05-20 | Natera, Inc. | Methods for detecting immune cell DNA and monitoring immune system |
| US12385096B2 (en) | 2018-04-14 | 2025-08-12 | Natera, Inc. | Methods for cancer detection and monitoring |
| US12460264B2 (en) | 2016-11-02 | 2025-11-04 | Natera, Inc. | Method of detecting tumour recurrence |
Families Citing this family (88)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05501612A (ja) * | 1989-11-13 | 1993-03-25 | チルドレンズ・メデイカル・センター・コーポレーシヨン | 胎児ｄｎａ単離および検出のための非侵入性方法 |
| US5153117A (en) * | 1990-03-27 | 1992-10-06 | Genetype A.G. | Fetal cell recovery method |
| US5627029A (en) * | 1991-05-03 | 1997-05-06 | Genzyme Corporation | Method for obtaining informative cells |
| CA2117783A1 (en) * | 1992-04-09 | 1993-10-28 | Katherine W. Klinger | Probes for detecting common liveborn chromosomal aneuploidies |
| US5629147A (en) * | 1992-07-17 | 1997-05-13 | Aprogenex, Inc. | Enriching and identifying fetal cells in maternal blood for in situ hybridization |
| BR9306867A (pt) * | 1992-07-17 | 1998-12-08 | Aprogenex Inc | Enriquecimento e identificação de células fetais do sangue materno para a hibridização in situ |
| US5275933A (en) * | 1992-09-25 | 1994-01-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Triple gradient process for recovering nucleated fetal cells from maternal blood |
| EP0690927A4 (en) * | 1993-01-06 | 2002-02-13 | Boehringer Mannheim Corp | Fluorescent detection of nonviable cells |
| US5457024A (en) * | 1993-01-22 | 1995-10-10 | Aprogenex, Inc. | Isolation of fetal erythrocytes |
| AU7921194A (en) * | 1993-09-27 | 1995-04-18 | Oncor, Inc. | Methods for detecting and analyzing individual rare cells in a population |
| US5352613A (en) * | 1993-10-07 | 1994-10-04 | Tafas Triantafillos P | Cytological screening method |
| US6136540A (en) * | 1994-10-03 | 2000-10-24 | Ikonisys Inc. | Automated fluorescence in situ hybridization detection of genetic abnormalities |
| GB9422504D0 (en) * | 1994-11-08 | 1995-01-04 | Robertson Patricia M B | Blood testing |
| US5750339A (en) * | 1994-11-30 | 1998-05-12 | Thomas Jefferson University | Methods for identifying fetal cells |
| US5639669A (en) * | 1995-06-07 | 1997-06-17 | Ledley; Robert | Separation of fetal cells from maternal blood |
| CA2251186A1 (en) * | 1996-04-05 | 1997-10-16 | The Johns Hopkins University | A method of enriching rare cells |
| US6060240A (en) * | 1996-12-13 | 2000-05-09 | Arcaris, Inc. | Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom |
| WO1998034094A1 (en) | 1997-01-31 | 1998-08-06 | The Horticulture & Food Research Institute Of New Zealand Ltd. | Optical apparatus |
| ES2255150T3 (es) | 1997-03-08 | 2006-06-16 | The University Of Dundee | Metodos de diagnostico prenatal in vitro. |
| US6890755B1 (en) * | 1997-12-08 | 2005-05-10 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Recovery of fetal cells from maternal blood using chaotic advection |
| US6071689A (en) | 1997-12-31 | 2000-06-06 | Xy, Inc. | System for improving yield of sexed embryos in mammals |
| US6149867A (en) | 1997-12-31 | 2000-11-21 | Xy, Inc. | Sheath fluids and collection systems for sex-specific cytometer sorting of sperm |
| US6210889B1 (en) * | 1998-01-28 | 2001-04-03 | The Universite Laval | Method for enrichment of fetal cells from maternal blood and use of same in determination of fetal sex and detection of chromosomal abnormalities |
| US6733967B1 (en) | 1998-04-21 | 2004-05-11 | Interleukin Genetics, Inc. | Fetal testing for prediction of low birth weight |
| BR9912539A (pt) | 1998-07-30 | 2001-05-02 | Xy Inc | Sistema equino para inseminação artificial não-cirúrgica |
| AU2686100A (en) * | 1999-02-18 | 2000-09-04 | Bio-View Ltd. | System and method for identifying and analyzing rare cell types in a mixed population of cells |
| AU4745200A (en) * | 1999-05-25 | 2000-12-12 | Britta Christensen | Isolation and culturing of fetal cells |
| US6511806B1 (en) * | 1999-11-03 | 2003-01-28 | Oncotech, Inc. | Methods for cancer prognosis and diagnosis |
| US7208265B1 (en) | 1999-11-24 | 2007-04-24 | Xy, Inc. | Method of cryopreserving selected sperm cells |
| WO2001072392A2 (en) * | 2000-03-14 | 2001-10-04 | Exiqon A/S | New methods for separation and isolation of subpopulations of cells in biological samples |
| JP5071995B2 (ja) | 2000-05-09 | 2012-11-14 | エックスワイ，エルエルシー | 高純度のｘ染色体保有精子集団およびｙ染色体保有精子集団 |
| US7713687B2 (en) | 2000-11-29 | 2010-05-11 | Xy, Inc. | System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations |
| AU2002237689B2 (en) | 2000-11-29 | 2008-01-10 | Xy, Llc. | System to separate frozen-thawed spermatozoa into X-chromosome bearing and Y-chromosome bearing populations |
| AU2002306790B2 (en) * | 2001-03-19 | 2007-05-24 | Ikonisys, Inc. | Epifluorescence microscope with improved image contrast |
| US20040214314A1 (en) * | 2001-11-02 | 2004-10-28 | Friedrich Srienc | High throughput bioreactor |
| EP1451304A4 (en) * | 2001-11-07 | 2006-09-20 | Bioview Ltd | KITS AND METHODS FOR PREPARING CELLULAR SAMPLES OPTIMIZED FOR DUAL COLORING |
| US6977162B2 (en) * | 2002-03-01 | 2005-12-20 | Ravgen, Inc. | Rapid analysis of variations in a genome |
| CA2477761A1 (en) * | 2002-03-01 | 2003-09-12 | Ravgen, Inc. | Methods for detection of genetic disorders |
| US7442506B2 (en) | 2002-05-08 | 2008-10-28 | Ravgen, Inc. | Methods for detection of genetic disorders |
| US20070178478A1 (en) * | 2002-05-08 | 2007-08-02 | Dhallan Ravinder S | Methods for detection of genetic disorders |
| US7727720B2 (en) | 2002-05-08 | 2010-06-01 | Ravgen, Inc. | Methods for detection of genetic disorders |
| US7785898B2 (en) * | 2002-05-31 | 2010-08-31 | Genetic Technologies Limited | Maternal antibodies as fetal cell markers to identify and enrich fetal cells from maternal blood |
| AU2003242106A1 (en) * | 2002-06-07 | 2003-12-22 | Japan Envirochemicals, Ltd. | Detection kit, assay plate to be used therein, detection method, evaluation method, polyclonal antibody of frog vitellogenin and procss for producing the same |
| AU2003243475A1 (en) * | 2002-06-13 | 2003-12-31 | New York University | Early noninvasive prenatal test for aneuploidies and heritable conditions |
| EP2275533B9 (en) | 2002-08-01 | 2016-10-19 | Xy, Llc | Method of assessing sperm cells |
| US8486618B2 (en) | 2002-08-01 | 2013-07-16 | Xy, Llc | Heterogeneous inseminate system |
| MXPA05001654A (es) | 2002-08-15 | 2005-10-18 | Xy Inc | Citometro de flujo de alta resolucion. |
| US7169548B2 (en) | 2002-09-13 | 2007-01-30 | Xy, Inc. | Sperm cell processing and preservation systems |
| ES2375724T3 (es) | 2002-09-27 | 2012-03-05 | The General Hospital Corporation | Dispositivo microflu�?dico para seperación de células y sus usos. |
| EP1413874A1 (en) | 2002-10-16 | 2004-04-28 | Streck Laboratories, Inc. | Method and device for collecting and preserving cells for analysis |
| EP1599608A4 (en) * | 2003-03-05 | 2007-07-18 | Genetic Technologies Ltd | Identification of fetal DNA and fetal cell marker in maternal plasma or serum |
| DE602004024874D1 (de) | 2003-03-28 | 2010-02-11 | Inguran Llc | Eschlechts-sortierten tierspermien |
| US20060263829A1 (en) | 2003-05-15 | 2006-11-23 | Evans Kenneth M | Efficient haploid cell sorting flow cytometer systems |
| EP2801363B1 (en) | 2004-03-29 | 2018-02-21 | Inguran, LLC | Process for storing sorted spermatozoa |
| AR049732A1 (es) | 2004-07-22 | 2006-08-30 | Monsanto Co | Proceso para enriquecer una poblacion de celulas de esperma |
| US7527978B2 (en) * | 2004-10-07 | 2009-05-05 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Flow cytometry based micronucleus assays and kits |
| US7439062B2 (en) * | 2004-12-23 | 2008-10-21 | Biocept, Inc. | Beads for capturing target cells from bodily fluid |
| US20070196820A1 (en) | 2005-04-05 | 2007-08-23 | Ravi Kapur | Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles |
| JP2008538282A (ja) * | 2005-04-05 | 2008-10-23 | セルポイント ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド | 装置および循環腫瘍細胞および他の粒子の濃縮および変更のための方法 |
| GB0509500D0 (en) * | 2005-05-10 | 2005-06-15 | Revealcyte | Method of fetal cell enrichment |
| JP2008543277A (ja) * | 2005-05-11 | 2008-12-04 | ジェネティック テクノロジーズ リミテッド | 胎児細胞を富化する方法 |
| US7618770B2 (en) | 2005-07-29 | 2009-11-17 | Xy, Inc. | Methods and apparatus for reducing protein content in sperm cell extenders |
| US8921102B2 (en) | 2005-07-29 | 2014-12-30 | Gpb Scientific, Llc | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
| CA2632859C (en) * | 2005-12-02 | 2014-07-15 | Simons Haplomics Limited | Methods for gene mapping and haplotyping |
| US8137912B2 (en) | 2006-06-14 | 2012-03-20 | The General Hospital Corporation | Methods for the diagnosis of fetal abnormalities |
| EP2029779A4 (en) | 2006-06-14 | 2010-01-20 | Living Microsystems Inc | HIGHLY PARALLEL SNP GENOTYPING UTILIZATION FOR FETAL DIAGNOSIS |
| US8372584B2 (en) | 2006-06-14 | 2013-02-12 | The General Hospital Corporation | Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags |
| US20080050739A1 (en) | 2006-06-14 | 2008-02-28 | Roland Stoughton | Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats |
| GB0616045D0 (en) * | 2006-08-11 | 2006-09-20 | Univ Bristol | Blood cell separation |
| DE102006062619B4 (de) * | 2006-12-29 | 2012-04-26 | Medion Diagnostics Ag | Verfahren zur Bestimmung von minoren Zellpopulationen in heterogenen Zellpopulationen |
| US20110027795A1 (en) * | 2008-02-18 | 2011-02-03 | Genetic Technologies Limited | Cell processing and/or enrichment methods |
| US20120149587A1 (en) * | 2008-03-12 | 2012-06-14 | University Of Virginia Patent Foundation | Method for detecting nucleated cells |
| AU2009223122B2 (en) | 2008-03-12 | 2014-12-11 | University Of Virginia Patent Foundation | Detection of polymeric analytes |
| SMT201700149T1 (it) | 2008-09-20 | 2017-05-08 | Univ Leland Stanford Junior | Diagnosi non invasiva di aneuploidia fetale mediante sequenziamento |
| WO2010078194A1 (en) * | 2008-12-30 | 2010-07-08 | Streck, Inc. | Method for screening blood using a preservative that may be in a substantially solid state form |
| US11634747B2 (en) * | 2009-01-21 | 2023-04-25 | Streck Llc | Preservation of fetal nucleic acids in maternal plasma |
| DE202010018561U1 (de) | 2009-01-21 | 2017-08-28 | Streck Inc. | Blutsammelröhrchen |
| ES2649572T3 (es) | 2009-02-18 | 2018-01-12 | Streck Inc. | Conservación de ácidos nucleicos fuera de las células |
| EP2421955A4 (en) | 2009-04-21 | 2012-10-10 | Genetic Technologies Ltd | METHODS OF OBTAINING F TAL GENETIC MATERIAL |
| CA2780536C (en) * | 2009-11-09 | 2018-01-02 | Streck, Inc. | Stabilization of rna in and extracting from intact cells within a blood sample |
| US8774488B2 (en) | 2010-03-11 | 2014-07-08 | Cellscape Corporation | Method and device for identification of nucleated red blood cells from a maternal blood sample |
| EP2704740B1 (en) | 2011-05-04 | 2016-10-05 | Streck, Inc. | Inactivated swine flu virus and methods of preparing it |
| CA2917912C (en) | 2013-07-24 | 2019-09-17 | Streck, Inc. | Compositions and methods for stabilizing circulating tumor cells |
| CA2984884A1 (en) * | 2014-05-15 | 2015-11-19 | Kellbenx Incorporated | Preparation of fetal nucleated red blood cells (nrbcs) for diagnostic testing |
| US11168351B2 (en) | 2015-03-05 | 2021-11-09 | Streck, Inc. | Stabilization of nucleic acids in urine |
| US20170145475A1 (en) | 2015-11-20 | 2017-05-25 | Streck, Inc. | Single spin process for blood plasma separation and plasma composition including preservative |
| EP3491381B1 (en) | 2016-07-29 | 2025-09-24 | Streck LLC | Suspension composition for hematology analysis control |
| HUE068517T2 (hu) | 2017-10-19 | 2024-12-28 | Streck Llc | A hemolízis és a véralvadás szabályozására, valamint az extracelluláris vezikulák stabilizálására szolgáló készítmények |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4675286A (en) * | 1985-01-28 | 1987-06-23 | Aspen Diagnostics, Inc. | Fetal cell separation and testing |
| US4835098A (en) * | 1985-09-04 | 1989-05-30 | Regents Of University Of Minnesota | Characterization of HLA alleles with locus-specific DNA probes |
| US4987086A (en) * | 1987-11-30 | 1991-01-22 | Becton, Dickinson And Company | Method for analysis of subpopulations of cells |
| US5503981A (en) * | 1988-12-06 | 1996-04-02 | Flinders Technologies Pty, Ltd. | Isolation of fetal cells from maternal blood to enable prenatal diagnosis |
| US5153117A (en) * | 1990-03-27 | 1992-10-06 | Genetype A.G. | Fetal cell recovery method |
-
1990
- 1990-03-27 US US07/499,932 patent/US5153117A/en not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-03-26 IE IE099691A patent/IE910996A1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-03-26 IL IL9767791A patent/IL97677A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-03-26 NZ NZ237589A patent/NZ237589A/en unknown
- 1991-03-27 JP JP3505625A patent/JP2965699B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-27 US US07/927,313 patent/US5447842A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-27 CA CA002059554A patent/CA2059554C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-27 AT AT91906073T patent/ATE194166T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-03-27 ES ES91906073T patent/ES2149760T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-27 SG SG9607782A patent/SG79188A1/en unknown
- 1991-03-27 WO PCT/AU1991/000115 patent/WO1991014768A1/en not_active Ceased
- 1991-03-27 DK DK91906073T patent/DK0521909T3/da active
- 1991-03-27 DE DE69132269T patent/DE69132269T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-27 AU AU74716/91A patent/AU649027B2/en not_active Expired
- 1991-03-27 ZA ZA912317A patent/ZA912317B/xx unknown
- 1991-03-27 EP EP91906073A patent/EP0521909B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-09-26 GR GR20000402176T patent/GR3034487T3/el not_active IP Right Cessation
Cited By (85)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10083273B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US10392664B2 (en) | 2005-07-29 | 2019-08-27 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US10266893B2 (en) | 2005-07-29 | 2019-04-23 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US10260096B2 (en) | 2005-07-29 | 2019-04-16 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US10227652B2 (en) | 2005-07-29 | 2019-03-12 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| US11111544B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US11111543B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US10081839B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US12509728B2 (en) | 2005-07-29 | 2025-12-30 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US12553087B2 (en) | 2005-07-29 | 2026-02-17 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US12571047B2 (en) | 2005-07-29 | 2026-03-10 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US10597724B2 (en) | 2005-11-26 | 2020-03-24 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| US10711309B2 (en) | 2005-11-26 | 2020-07-14 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| US9695477B2 (en) | 2005-11-26 | 2017-07-04 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| US12571043B2 (en) | 2005-11-26 | 2026-03-10 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| US9424392B2 (en) | 2005-11-26 | 2016-08-23 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| US11306359B2 (en) | 2005-11-26 | 2022-04-19 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| US10240202B2 (en) | 2005-11-26 | 2019-03-26 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| US9430611B2 (en) | 2005-11-26 | 2016-08-30 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| US9639657B2 (en) | 2008-08-04 | 2017-05-02 | Natera, Inc. | Methods for allele calling and ploidy calling |
| US10061890B2 (en) | 2009-09-30 | 2018-08-28 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US10061889B2 (en) | 2009-09-30 | 2018-08-28 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US10216896B2 (en) | 2009-09-30 | 2019-02-26 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US10522242B2 (en) | 2009-09-30 | 2019-12-31 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US10793912B2 (en) | 2010-05-18 | 2020-10-06 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11332785B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US10316362B2 (en) | 2010-05-18 | 2019-06-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US10526658B2 (en) | 2010-05-18 | 2020-01-07 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US9334541B2 (en) | 2010-05-18 | 2016-05-10 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US10538814B2 (en) | 2010-05-18 | 2020-01-21 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US10557172B2 (en) | 2010-05-18 | 2020-02-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US12553083B2 (en) | 2010-05-18 | 2026-02-17 | Natera, Inc. | Methods for enriching and sequencing nucleic acids for non-invasive cancer testing |
| US12553086B2 (en) | 2010-05-18 | 2026-02-17 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US10590482B2 (en) | 2010-05-18 | 2020-03-17 | Natera, Inc. | Amplification of cell-free DNA using nested PCR |
| US12410476B2 (en) | 2010-05-18 | 2025-09-09 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US10597723B2 (en) | 2010-05-18 | 2020-03-24 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11746376B2 (en) | 2010-05-18 | 2023-09-05 | Natera, Inc. | Methods for amplification of cell-free DNA using ligated adaptors and universal and inner target-specific primers for multiplexed nested PCR |
| US11525162B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-12-13 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US10655180B2 (en) | 2010-05-18 | 2020-05-19 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11519035B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-12-06 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US10731220B2 (en) | 2010-05-18 | 2020-08-04 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US10774380B2 (en) | 2010-05-18 | 2020-09-15 | Natera, Inc. | Methods for multiplex PCR amplification of target loci in a nucleic acid sample |
| US11482300B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-10-25 | Natera, Inc. | Methods for preparing a DNA fraction from a biological sample for analyzing genotypes of cell-free DNA |
| US11408031B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
| US11111545B2 (en) | 2010-05-18 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US10174369B2 (en) | 2010-05-18 | 2019-01-08 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US10113196B2 (en) | 2010-05-18 | 2018-10-30 | Natera, Inc. | Prenatal paternity testing using maternal blood, free floating fetal DNA and SNP genotyping |
| US11286530B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-03-29 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US10017812B2 (en) | 2010-05-18 | 2018-07-10 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11306357B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-04-19 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11312996B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-04-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11339429B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11322224B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11332793B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11326208B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-10 | Natera, Inc. | Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA |
| JP2014502845A (ja) * | 2010-12-22 | 2014-02-06 | ナテラ， インコーポレイテッド | 非侵襲性出生前親子鑑定法 |
| US9499870B2 (en) | 2013-09-27 | 2016-11-22 | Natera, Inc. | Cell free DNA diagnostic testing standards |
| US10577655B2 (en) | 2013-09-27 | 2020-03-03 | Natera, Inc. | Cell free DNA diagnostic testing standards |
| US10597708B2 (en) | 2014-04-21 | 2020-03-24 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplifications of target loci |
| US9677118B2 (en) | 2014-04-21 | 2017-06-13 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11408037B2 (en) | 2014-04-21 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
| US11319596B2 (en) | 2014-04-21 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
| US11414709B2 (en) | 2014-04-21 | 2022-08-16 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
| US12305229B2 (en) | 2014-04-21 | 2025-05-20 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11371100B2 (en) | 2014-04-21 | 2022-06-28 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
| US11390916B2 (en) | 2014-04-21 | 2022-07-19 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11486008B2 (en) | 2014-04-21 | 2022-11-01 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
| US11319595B2 (en) | 2014-04-21 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
| US10179937B2 (en) | 2014-04-21 | 2019-01-15 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
| US10351906B2 (en) | 2014-04-21 | 2019-07-16 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11530454B2 (en) | 2014-04-21 | 2022-12-20 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
| US10262755B2 (en) | 2014-04-21 | 2019-04-16 | Natera, Inc. | Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments |
| US10597709B2 (en) | 2014-04-21 | 2020-03-24 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11479812B2 (en) | 2015-05-11 | 2022-10-25 | Natera, Inc. | Methods and compositions for determining ploidy |
| US11485996B2 (en) | 2016-10-04 | 2022-11-01 | Natera, Inc. | Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing |
| US12460264B2 (en) | 2016-11-02 | 2025-11-04 | Natera, Inc. | Method of detecting tumour recurrence |
| US10011870B2 (en) | 2016-12-07 | 2018-07-03 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
| US10577650B2 (en) | 2016-12-07 | 2020-03-03 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
| US11530442B2 (en) | 2016-12-07 | 2022-12-20 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
| US11519028B2 (en) | 2016-12-07 | 2022-12-06 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
| US12571034B2 (en) | 2016-12-07 | 2026-03-10 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
| US10533219B2 (en) | 2016-12-07 | 2020-01-14 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
| US12385096B2 (en) | 2018-04-14 | 2025-08-12 | Natera, Inc. | Methods for cancer detection and monitoring |
| US20210198733A1 (en) | 2018-07-03 | 2021-07-01 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free dna |
| US12305235B2 (en) | 2019-06-06 | 2025-05-20 | Natera, Inc. | Methods for detecting immune cell DNA and monitoring immune system |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1991014768A1 (en) | 1991-10-03 |
| DE69132269T2 (de) | 2001-03-15 |
| IE910996A1 (en) | 1991-10-09 |
| ES2149760T3 (es) | 2000-11-16 |
| IL97677A0 (en) | 1992-06-21 |
| AU7471691A (en) | 1991-10-21 |
| SG79188A1 (en) | 2001-03-20 |
| NZ237589A (en) | 1992-04-28 |
| EP0521909A1 (en) | 1993-01-13 |
| JPH05506144A (ja) | 1993-09-16 |
| EP0521909A4 (en) | 1993-11-18 |
| US5153117A (en) | 1992-10-06 |
| ATE194166T1 (de) | 2000-07-15 |
| DK0521909T3 (da) | 2000-10-30 |
| EP0521909B1 (en) | 2000-06-28 |
| GR3034487T3 (en) | 2000-12-29 |
| AU649027B2 (en) | 1994-05-12 |
| CA2059554A1 (en) | 1991-09-28 |
| DE69132269D1 (de) | 2000-08-03 |
| US5447842A (en) | 1995-09-05 |
| ZA912317B (en) | 1991-12-24 |
| IL97677A (en) | 1996-07-23 |
| CA2059554C (en) | 2004-06-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2965699B2 (ja) | 胎児細胞回収法 | |
| Bianchi et al. | Erythroid‐specific antibodies enhance detection of fetal nucleated erythrocytes in maternal blood | |
| EP0500727B1 (en) | Non-invasive method for isolation and detection of fetal dna | |
| US5437987A (en) | Triple gradient process with antibody panning to recover nucleated fetal cells from maternal blood | |
| KR100523381B1 (ko) | 태아 세포를 동정하는데 사용되는 항배아 헤모글로빈 항체 | |
| US5962234A (en) | Use of anti-embryonic epsilon hemoglobin antibodies to identify fetal cells | |
| WO1995008646A1 (en) | Prenatal diagnosis by isolation of fetal granulocytes from maternal blood | |
| US20090081689A1 (en) | Reagents and methods to enrich rare cells from body fluids | |
| US5270169A (en) | Detection of HLA antigen-containing immune complexes | |
| Schlenke et al. | Evaluation of a novel mononuclear cell isolation procedure for serological HLA typing | |
| PT603107E (pt) | Processo para a quantificacao simultanea numa unica medicao dos principais tipos de linfocitos humanos e dos seus subconjuntos | |
| WO1994025873A1 (en) | Methods for enriching fetal progenitor cells from maternal blood | |
| AU691040B2 (en) | Enrichment of fetal cells from maternal blood | |
| Fauré et al. | A novel rapid method of red blood cell and platelet permeabilization and staining for flow cytometry analysis | |
| AU7735201A (en) | Fetal cell recovery method | |
| FR2682481A1 (fr) | Procede d'obtention de cellules trophoblastiques d'un fóoetus. | |
| NZ208021A (en) | Antibody composition for isolating white blood cell components | |
| AU9718698A (en) | Prenatal diagnosis by isolation of fetal granulocytes from maternal blood | |
| HK1031255B (en) | Use of anti-embryonic hemoglobin antibodies to identify fetal cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070813 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080813 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090813 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090813 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100813 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110813 Year of fee payment: 12 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110813 Year of fee payment: 12 |