ES2255150T3 - Metodos de diagnostico prenatal in vitro. - Google Patents

Metodos de diagnostico prenatal in vitro.

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ES2255150T3 ES98908222T ES98908222T ES2255150T3 ES 2255150 T3 ES2255150 T3 ES 2255150T3 ES 98908222 T ES98908222 T ES 98908222T ES 98908222 T ES98908222 T ES 98908222T ES 2255150 T3 ES2255150 T3 ES 2255150T3
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Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento destinado a identificar eritrocitos embrionarios o fetales en una muestra que contiene glóbulos sanguíneos maternos y eritrocitos embrionarios o fetales o los dos; este permitiendo este procedimiento determinar cual o cuales de las células contienen o expresan un componente del hígado adulto. Esta invención se refiere también a un procedimiento destinado a aislar eritrocitos embrionarios o fetales en una muestra que contienen glóbulos sanguíneos maternos y eritrocitos embrionarios o fetales, o ambos; comprendiendo este procedimiento el aislamiento de las células que contienen o expresan un componente de hígado adulto. Esta invención se refiere también a un procedimiento destinado a detectar una anomalía fetal, procedimiento que comprende la identificación y el aislamiento de las células embrionarias o fetales que se refieren a esta anomalía. Y finalmente, la invención se refiere a la utilización de una técnica que permite determinar si una célula contiene o expresa un componente del hígado adulto para identificar o aislar un eritrocito embrionario o fetal.

Description

Métodos de diagnóstico prenatal in vitro.
La presente invención se refiere a los métodos de diagnóstico, en especial, a los métodos de diagnóstico prenatal y a los reactivos que se utilizarán en dichos métodos.
El diagnóstico prenatal se lleva a cabo de modo generalizado en hospitales de todo el mundo. Existen procedimientos tales como la biopsia coriónica, hepática o fetal para el diagnóstico de trastornos cromosómicos, inclusive el Síndrome de Down, así como los defectos en único gen, incluyendo la fibrosis cística, que son muy invasivos y conllevan un riesgo considerable para el feto y un riesgo menor para la madre.
La amniocentesis, por ejemplo, implica la inserción de una aguja dentro del útero para reunir células del tejido o fluido embrionario. La prueba, que puede detectar el Síndrome de Down, conlleva un riesgo de aborto natural estimado en 1%.
La terapia fetal en sus primeras etapas, así como la posibilidad de realizar pruebas prematuras para una amplia variedad de trastornos, podría indudablemente incrementar el ritmo de investigación en esta área. Las técnicas actuales de cirugía fetal han mejorado, posibilitando así la cirugía fetal para ciertos problemas genéticos como la espina bífida y el paladar hendido. Asimismo, en la actualidad se ha puesto en práctica un tratamiento fetal para otros trastornos que es relativamente simple y efectivo, por ejemplo, el déficit de 21-holocarboxilasa sintetasa (que se trata con biotina), siempre que la detección se realice lo suficientemente temprano.
Por lo tanto, los métodos de diagnóstico prenatal relativamente no invasivos constituyen una alternativa atractiva ante los procedimientos invasivos existentes. Un método basado en la venopunción materna podría permitir que el diagnóstico prematuro esté ampliamente disponible durante el primer trimestre, aumentando las opciones de los padres y obstetras (porque los trastornos genéticos podrían detectarse prematuramente y con menor riesgo), y permitiendo el desarrollo final de una terapia fetal específica.
La posibilidad de recuperar células fetales a partir de la circulación materna ha suscitado un interés general como posible medio, no invasivo para el feto, para el diagnóstico de anomalías fetales (Simpson & Elias (1993) J. Am. Med. Assoc. 270, 2357-2361). Inicialmente, el interés estaba dirigido hacia los sistemas de detección trofoblástica, pero la separación de esas células por medio de la citometría de flujo ha resultado poco fiable ya que los linfocitos maternos parecen absorber las proteínas liberadas por las células trofoblásticas (Mueller et al (1990) Lancet 336, 197-200; Covone et al (1984) Lancet 13 October edition, 841-843). Recientemente, la atención se ha centrado en el desarrollo de métodos para aislar células sanguíneas fetales para el análisis citogenético, en particular, eritrocitos fetales nucleados, ya que su número excede al de los linfocitos fetales en la circulación materna. Se ha descrito la identificación de células rojas sanguíneas fetales a partir de la sangre materna, es decir, en un feto macho, con sondas en el centrómero de Y para identificar células fetales, o desarrollo de secuencias de ADN en el cromosoma Y (Price et al (1991) Am. J. Obstet. Gynecol. 165, 1731-1735; Zheng et al (1993) J. Med. Genet. 30, 1051-1056; Hamada et al (1993) Hum. Genet. 91, 427-432; Cheung et al (1996) Nature Genetics 14, 264-268; y Williamson (1996) Nature Genetics 14, 239-249) o identificación de cariotipo en condiciones trisómicas (por ejemplo, véase Bianchi et al (1992) Hum. Genet. 90, 368-370).
Hume et al (1995) Early Human Development 42, 85-95 demuestra que la enzima microsomal glucosa 6-fosfatasa está presente en las células rojas sanguíneas fetales y embrionarias humanas.
Pazouki et al (1996) Acta histochem. (Jena) 98, 29-37 intenta identificar células rojas sanguíneas nucleadas fetales utilizando la técnica inmunocitoquímica combinada, que emplea un anticuerpo anti-hemoglobina fetal y un método de hibridación in situ usando sondas en cromosomas X e Y.
Hume et al (1996) Blood 87, 762-770 describe un estudio de la expresión de las proteínas del retículo endoplasmático en los precursores de células rojas fetales y embrionarias humanas.
Wachtel et al (1991) Human Reproduction 6, 1466-1469 describe la utilización de la PCR para identificar secuencias de ADN en el cromosoma Y en células maternas aisladas, por medio de la clasificación celular con el anticuerpo receptor de transferrina y el anticuerpo de glicoforina A.
Yeoh et al (1991) Prenatal Diagnosis 11, 117-123 describe la detección de células fetales a partir de la circulación materna por medio del desarrollo enzimático de una única copia de gen que era específicamente fetal.
Holzgreve et al (1992) J. Reprod. Med 37, 410-418 indica que el antígeno receptor de la transferrina por sí solo no resulta suficiente para el enriquecimiento de eritrocitos fetales nucleados, y destaca que la reproducibilidad y fiabilidad de las técnicas aún son limitadas, debido principalmente a la ausencia de marcadores celulares específicos.
Zheng et al (1993) J. Med. Genet. 30, 1051-1056 describe el uso de un separador de células activado por magnetismo (MACS, por sus siglas en inglés) para enriquecer los eritrocitos nucleados fetales mediante la utilización de anticuerpos monoclonales de ratón específicos para CD45 y CD32, con el fin de reducir los leucocitos de la sangre materna. El artículo señala la existencia de una contaminación materna importante, incluso después del enriquecimiento por medio de MACS, impidiendo el análisis exacto de las células fetales a través de la interfase de hibridación in situ fluorescente (FISH).
Tomoda (1964) Nature 202, 910-911 describe la demostración de eritrocitos fetales por medio de la tinción inmunofluorescente.
Las publicaciones internacionales de patentes WO 91/07760 (Children's Medical Center Corp.), WO 91/1468 (Genetype) y WO 96/09409 (Miltenyi Biotech, Inc.) describen, cada una de ellas, los métodos para la recuperación de células fetales obtenidas de una muestra de sangre materna.
Se necesitan métodos mejorados para la identificación de células fetales en la sangre materna a fin de llevar a cabo el diagnóstico prenatal.
Intentamos aislar células rojas sanguíneas nucleadas fetales y embrionarias a partir de la sangre materna con el separador inmuno-magnético, utilizando secuencialmente los anticuerpos anti-CD45 y anti-CD18 para extraer células sanguíneas blancas, y luego, el anticuerpo anti-CD71 (receptor de transferrina) para enriquecer las células rojas nucleadas fetales. Nos sentimos decepcionados al descubrir que el separador inmuno-magnético, con el anticuerpo anti-CD71, no purificaba las células rojas embrionarias de las serie megaloblástica. La ventaja de purificar células megaloblásticas es que éstas constituyen el tipo de células rojas sanguíneas predominante en el embrión y feto prematuro, y que se encuentran nucleadas, mientras que la gran mayoría de las células rojas sanguíneas adultas son normocíticas y anucleadas.
En la inmunohistoquímica convencional posterior, descubrimos que las interacciones del CD71 con los megaloblastos eran muy débiles, lo que explica supuestamente la escasa purificación de las células embrionarias con este anticuerpo. Esto constituye un gran problema en el uso actual de la sangre materna para el diagnóstico prematuro. Hemos demostrado que la serie megaloblástica nucleada predomina en el desarrollo temprano, en comparación con los normoblastos nucleados. Esto significa que con la utilización de anticuerpos convencionales, es decir anti-CD71, es muy difícil obtener células hematopoyéticas nucleadas puras que surjan de la concepción primaria. El anti-CD71 no inmunoreacciona con la mayoría de estas células tempranas, lo que significa que esta técnica debe llevarse a cabo en laboratorios de investigación especializados que cuentan con equipo y personal calificado, y no se practique, por el contrario, en laboratorios de rutina.
El uso del anti-CD71 se describe en Cheung et al (1996) Nature Genetics 14, 264-268 y es analizado por Williamson (1996) Nature Genetics 14, 239-240. El tener que analizar miles de células para encontrar unas pocas células fetales sobre el portaobjetos constituye un problema para este enfoque, ya que los anticuerpos anti-CD71 no son lo suficientemente selectivos para las células fetales y no reaccionan con las células embrionarias.
Un objeto de la presente invención es proveer métodos mejorados para la identificación y obtención de células fetales a partir de la sangre materna. En especial, el objeto de la invención se centra en la provisión de métodos para identificar y aislar células rojas sanguíneas fetales primarias y embrionarias, y analizar las células en vista de anomalías fetales.
Un primer aspecto de la invención proporciona un método para la identificación de células rojas fetales o embrionarias en una muestra que contenga células sanguíneas maternas y células rojas fetales o embrionarias, o ambos; el método consiste en determinar cuáles son las células que contienen o manifiestan un componente de hígado adulto, en qué parte se identifican dichas células rojas fetales o embrionarias, en virtud de la presencia del componente de hígado adulto en la superficie de las células rojas fetales o embrionarias mencionadas.
Un segundo aspecto de la invención proporciona un método para aislar células rojas sanguíneas fetales o embrionarias de una muestra que contenga células sanguíneas maternas y células rojas fetales o embrionarias, o ambas; el método consiste en aislar las células que contienen o manifiestan un componente de hígado adulto, que es un componente expuesto a la superficie celular, además de las etapas que consisten en:
(a) contactar la muestra con un segmento de unión que ligue específicamente el componente de hígado adulto,
(b) permitir que el segmento de unión se ligue con el componente de hígado adulto, y
(c) aislar las citadas células rojas fetales o embrionarias de la muestra por medio de su unión con el segmento de unión.
No se ha propuesto previamente que las células rojas sanguíneas nucleadas fetales o embrionarias funcionan como células de hígado adultas mientras circulan en el torrente sanguíneo.
Sería adecuado que la muestra que contiene las células sanguíneas maternales y las células rojas sanguíneas fetales o embrionarias, o ambas, corresponda a una muestra de sangre de una hembra preñada.
Preferentemente, la célula roja sanguínea fetal es una célula roja fetal primaria.
La hembra preñada puede ser cualquier tipo de mamífero, y en particular, un mamífero de importancia agrícola o comercial, o un mamífero domesticado. Es conveniente que el mamífero sea un caballo, una vaca, una oveja, un cerdo, una cabra, un perro, un gato o similar. El patrón básico de desarrollo hematológico en el embrión y feto es igual en todos los mamíferos.
Preferentemente, la hembra preñada es humana.
Una ventaja especial de la presente invención es que los métodos identifican, así como también pueden aislar las células rojas sanguíneas fetales primarias y embrionarias durante la etapa de gestación primaria. Por lo tanto, es preferible que la muestra de sangre materna se tome de la hembra embarazada durante la primera etapa del embarazo. En el caso de una mujer embarazada, es preferible que la muestra se tome en el primer trimestre.
En general, cuanto menos avanzado esté el embarazo mejor (lo ideal es menos de las 10 semanas de gestación), ya sea por una posible terapia fetal o la opción de interrumpir el embarazo. Una razón más práctica es que el medio para interrumpir un embarazo resulta técnicamente más fácil si se practica durante las primeras etapas de gestación, lo que implica efectos secundarios físicos y psicológicos menores. No existe un límite máximo para el diagnóstico intrauterino de anomalías fetales, e incluso en embarazos avanzados el tratamiento puede seguir siendo beneficioso durante el período intrauterino o el período inmediato al nacimiento. La ontogenia de las células nucleadas fetales y embrionarias indica claramente que el porcentaje de dichas células en el embrión/feto es mayor en el primer trimestre que en el embarazo más avanzado. Sin embargo, el volumen sanguíneo fetal total aumenta con la gestación, y proporcionalmente, los volúmenes de transfusión materna a fetal pueden ser mayores.
La estructura detallada de la concepción humana en desarrollo, suficiente para la datación en días, sólo ha sido descrita en detalle hasta el día 56 de los días postovulatorios, y el término descriptivo embrión será utilizado como la convención para este procedimiento de desarrollo en etapas (O'Rahilly & Muller (1987) Developmental Stages in Human Embryos, Publication 637, Washington:Carnegie Institute of Washington). El término descriptivo feto será utilizado para el resto del desarrollo intrauterino humano (> a las 37 semanas de gestación completas) para nombrar un cálculo estimativo de la edad gestacional de desarrollo del feto (a la semana más cercana) basado en su tamaño, incluyendo la medición de la longitud vértice-talón, vértice-nalga y la longitud del pie (Growth of the External Dimensions of the Human Body in the Fetal Period, Minneapolis: University of Minnesota Press), la historia menstrual y la datación del embarazo por ultrasonido.
Los métodos de la invención resultan especialmente convenientes para identificar, así como para aislar las células rojas sanguíneas fetales y embrionarias de la serie megaloblástica nucleada, que predominan durante el desarrollo primario comparado con los normoblastos nucleados. Sin embargo, los normoblastos nucleados también pueden ser aislados o identificados con el método, obteniendo una ventaja similar. La proporción de megaloblastos es superior durante las primeras etapas del embarazo. La morfología de un megaloblasto primario fetal/embrionario difiere fundamentalmente de los normoblastos fetales/embrionarios y de la pequeña cantidad de normoblastos maternos que podrían estar presentes en la circulación. Los megaloblastos y los megalocitos maternos son sumamente raros, pero sí están presentes en la vitamina B12 y en la deficiencia de folato. Por estos motivos, se prefieren los megaloblastos primarios fetales/embrionarios, pero también podrían utilizarse los normoblastos primarios fetales/embrionarios.
La muestra que contiene las células sanguíneas maternas y las células rojas sanguíneas fetales o embrionarias, o ambas, puede ser una muestra de la que se hayan extraído ciertas células sanguíneas maternas. Por ejemplo, los glóbulos blancos adultos pueden extraerse de la sangre materna mediante el empleo secuencial de los anticuerpos anti-CD45 y anti-CD18, aunque con una eficacia relativamente escasa. El enriquecimiento de la muestra puede lograrse a través de la centrifugación en gradiente de densidad (por ejemplo, el gradiente de Ficoll), pero no separará las células nucleadas adultas y fetales.
La muestra puede ser una muestra que haya sido enriquecida con células fetales. Por ejemplo, puede corresponder a una muestra enriquecida mediante la utilización de un anticuerpo receptor de transferrina, como se describe en Cheung et al (1996) Nature Genetics 14, 264-268.
La muestra (en especial cuando se trate de una muestra en la que se identifican células fetales o embrionarias, en lugar de aislarlas de la misma) puede ser una muestra que haya sido tratada con el propósito de llevar a cabo un análisis hematológico, bioquímico, histoquímico o de biología molecular o similar. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra de sangre o una muestra de una fracción de sangre (como la que ha sido enriquecida con células fetales/reducida de células maternas) que ha sido preparada para el análisis inmunocitoquímico o para el análisis de hibridación in situ fluorescente (por sus siglas en inglés FISH), o simplemente extendida sobre el portaobjetos del microscopio.
La muestra que contiene las células sanguíneas maternas y las células rojas fetales o embrionarias, o ambas, puede ser cualquier tipo de muestra adecuada (incluido un fluido) que contenga dichas células. Por ejemplo, la muestra puede ser de orina de un paciente que padece hematuria, del fluido amniótico o sangre fetal.
Al hablar de "componente de hígado adulto" nos referimos a un componente de una célula de hígado adulta, que está asociada predominantemente al hígado adulto y, si se llegara a encontrar en otros tejidos del adulto, podría encontrarse en niveles inferiores en dicho tejido comparado con el hígado, o bien, que la masa del otro tejido donde se encuentra el componente, comparado con la masa del hígado, sea baja de modo que la cantidad total del componente de hígado adulto resulta mayor en todo el hígado comparado con la cantidad total en todo aquel tejido. Cuando se encuentra el componente de hígado adulto en el otro tejido en niveles bajos, éste es 10 veces más grande en el hígado, preferentemente al menos con un tamaño 100 veces mayor en el hígado, comparado con aquel otro tejido. Cuando se encuentra el componente de hígado adulto en otros tejidos pero en niveles similares a los del hígado, aquel otro tejido tiene el 1/10 del tamaño del hígado, más precisamente el 1/25 de la masa del
hígado.
Aunque el riñón desempeña muchas funciones que no están relacionadas con el hígado, también puede llevar a cabo, en menor medida, algunas funciones del hígado como la gluconeogénesis. En especial, es preferible si en la definición anterior de componente de hígado adulto no se considera al riñón como el "otro tejido".
Por ejemplo, la glucosa 6-fosfatasa es un componente de hígado adulto. Los niveles de glucosa 6-fosfatasa en el hígado son mucho más elevados que los niveles de glucosa 6-fosfatasa en todo el páncreas. Sin embargo, los niveles de glucosa 6-fosfatasa en las células islotes (que son sólo una pequeña proporción de células en el páncreas) pueden ser tan altos como en el hígado. De forma similar, el transportador de glucosa GLUT2 es un componente de hígado adulto que se expresa en las células islotes. Ambas son consideradas en su mayoría proteínas del hígado, ya que la masa total de los islotes en el cuerpo humano es diminuta en comparación con la masa total del hígado.
El nivel de componente de hígado adulto se mide por unidad de fracción de célula, o por unidad de célula o por unidad de tejido.
Por lo tanto, el componente de hígado adulto es, por lo general, selectivo de hígado adulto o hígado adulto específico.
El componente de hígado adulto puede ser cualquiera de los componentes apropiados y puede incluir proteína, ARN, entidades de carbohidratos y metabolitos con la condición de que estos estén asociados en su mayoría al hígado adulto y, si se encontrara en otros tejidos del adulto, se encontraría en aquel otro tejido en niveles bajos comparado con el hígado, o bien, que la masa del otro tejido donde se encuentra el componente, comprado con la masa del hígado, sea baja de modo que la cantidad total del componente de hígado adulto resulta mayor en todo el hígado, comparado con la cantidad total en el otro tejido.
Las células fetales o embrionarias pueden identificarse o aislarse según los métodos de la invención por medio de la detección o enlace de uno o más componentes de hígado adulto, tal como se definió.
En especial, es preferible que el componente de hígado adulto se encuentre considerablemente ausente de las células maternas de la sangre materna. Preferentemente, si se compara con las células rojas sanguíneas fetales o embrionarias, las células maternas de la sangre materna contienen menos del 1% del componente de hígado adulto por unidad de célula; más precisamente, contienen menos del 0.1% por unidad de célula.
Es posible que las células o grupos se diseminen por la corriente sanguínea cuando el hígado se encuentra sumamente dañado a causa de un trauma. Por lo tanto, es preferible que la muestra no sea una muestra de sangre de una hembra cuyo hígado esté dañado como para liberar las células de hígado dentro de la corriente sanguínea. También es preferible que la muestra no se trate de cualquier otra muestra que contenga células de hígado adultas.
El daño del hígado se evalúa por medio de la estimación de plasma en los exámenes de rutina sobre el funcionamiento del hígado, por ejemplo, la actividad de la alanina-aminotransferasa. En términos morfológicos, la aparición de una célula circulante de hígado adulto y de una célula roja nucleada embrionaria resulta lo suficientemente distintiva como para que se discrimine.
Se prefiere que el componente de hígado adulto sea una proteína.
Se prefiere que la proteína de hígado adulto sea una de las enzimas microsomales glucosa 6-fosfatasa, otro componente proteico del sistema glucosa 6-fosfatasa, incluyendo el fosfato o la glucosa o los transportadores de glucosa 6-fosfato, el uridín difosfato glucuronosil transferasa (UDPGT por sus siglas en inglés), la isoenzima citocromo P450 (P450), la nicotinamida adenín dinucleótido fosfato (NADP por sus siglas en inglés), el citocromo P450 reductasa, el transportador de glucosa tipo 2 (GLUT2), la glicoproteína P, la proteína de resistencia multidroga (MDRP - acrónimo inglés de multidrug resistance protein), una MRP (proteína de resistencia multidroga), la gamma glutamil transpeptidasa, el receptor de lipoproteína, la fosfatasa alcalina, el transportador de sal biliar, el transportador de ácido biliar, un receptor de hormona, un transportador de ión orgánico multiespecífico (MOAT por sus siglas en inglés; equivalente a MRP), el transportador de bilirrubina (bilirrubina translocasa) o un transportador (equivalente a MRP) de bilirrubina conjugada (por ejemplo, la bilirrubina glucuronida).
La membrana plasmática del hígado contiene transportadores de una gran variedad de drogas y compuestos xenobióticos y endógenos, que son recogidos por el hígado - su principal sitio de metabolismo. De forma similar, los metabolitos conjugados luego son exportados hacia atrás a través de la membrana plasmática del hígado. Los transportadores, muchos de los cuales son componentes de hígado adulto según se definió, constituyen objetivos apropiados para la práctica de los métodos de la invención. Se observará que se purificarán otros transportadores de este tipo y se clonarán sus ADNc y genes correspondientes. La invención contempla que los otros transportadores, aún siendo desconocidos, serán objetivos adecuados.
En caso de que se encuentren isoenzimas de una proteína particular o clase de proteínas que no sean selectivas de hígado adulto o específicas de hígado adulto, se utilizarán las isoenzimas selectivas de hígado adulto o específicas de hígado adulto. Por ejemplo, ciertas isoenzimas P450 no son selectivas de hígado adulto o específicas de hígado adulto y, por lo tanto, en la práctica de la invención, sólo son relevantes las isoenzimas P450 que afectan selectiva o específicamente el hígado adulto. Por lo general, las enzimas metabolizantes xenobióticas P450 son selectivas de hígado o específicas de hígado.
Es conveniente que, en especial cuando las ya mencionadas células rojas sanguíneas fetales o embrionarias son aisladas de la muestra, el componente de hígado adulto es un componente de superficie celular. Sin embargo, se observará que dichos componentes de superficie celular sirven tanto para los propósitos de aislamiento e identificación, y se prefieren los componentes de superficie celular para los propósitos de aislamiento e identificación.
Preferentemente, el componente de superficie celular es una proteína de membrana plasmática, que se encuentra en su mayoría asociada con la membrana plasmática del hígado adulto y, si se encontrara en otros tejidos del adulto, se encontraría en niveles bajos.
Es conveniente que la proteína de membrana plasmática del hígado adulto sea una de las proteínas GLUT2, una glicoproteína P, una MDRP, una MRP, una gamma glutamil transpeptidasa, un receptor de lipoproteína, una fosfatasa alcalina, un transportador de sal biliar, un transportador de ácido biliar, un receptor de hormona, un MOAT, un transportador de bilirrubina o un transportador de bilirrubina conjugada, como se definieron anteriormente.
Con el propósito de identificar o aislar las células rojas sanguíneas fetales o embrionarias, es preferible que dicha muestra se ponga en contacto con un segmento de unión, que se unirá con el ya mencionado componente de hígado adulto, y se identifica o aísla de la muestra dicha célula fetal o embrionaria en virtud de que se encuentre unida al segmento de unión.
Se observará que las células rojas sanguíneas fetales o embrionarias podrán identificarse de otras formas.
Por ejemplo, muchos de los componentes de hígado adulto son enzimas y, por lo tanto, las células pueden identificarse por medio de la presencia de la enzima. Apropiadamente, se podrán utilizar los tintes histoquímicos para la glucosa 6-fosfatasa. Del mismo modo, resultan útiles los ensayos para el UDP glucuronosil transferasa.
La invención también contempla identificar las células por medio de la detección de componentes de hígado adulto que son ARN mensajeros, utilizando, por ejemplo, la transcripción reversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR, por sus siglas en inglés).
En otra manifestación preferente, el componente de hígado adulto se detecta intracelularmente. Por ejemplo, cuando el componente de hígado es una enzima, es conveniente utilizar un substrato (que entra en la célula, siendo la célula permeable o no según el substrato) y que, cuando se metaboliza con dicha enzima, genera un producto colorido o fluorescente, o bien un producto que puede ser identificado fácilmente. Se observará que en esta manifestación, las células rojas sanguíneas fetales primarias o embrionarias tendrán color o fluorescencia (o estarán marcadas de alguna otra manera) a causa de la presencia de dicho producto generado por la enzima mencionada. Las células fluorescentes pueden ser separadas de las no fluorescentes por medio de la utilización de un separador FAC (fluorescence-activated cell sorting; separador de células activado por fluorescencia). Los substratos para la glucosa 6-fosfatasa que originan un producto colorido son conocidos en este ámbito.
Además de los componentes proteicos de hígado adulto establecidos como posibles fuentes de antígenos para la identificación y/o aislamiento de células fetales y embrionarias, la siguiente propuesta también resulta útil. Otras membranas plasmáticas de hígado humanas y/o mamíferas son aisladas del hígado homogenizado por medio de la centrifugación diferencial (o por medio de otras técnicas conocidas en el ámbito) y pueden ser utilizadas tanto como para a) producir directamente anticuerpos, o b) llevar a cabo el subfraccionamiento de las membranas plasmáticas del hígado previo a la producción de anticuerpos contra componentes específicos. Dichos anticuerpos serán anticuerpos policlonales poliespecíficos, que se unen a la membrana plasmática del hígado adulto y, según la invención, a la membrana plasmática de las células rojas sanguíneas fetales y embrionarias.
Se apreciará que las mezclas de los anticuerpos definidos dirigidos a los componentes de membrana plasmática de hígado adulto también resultan útiles para los métodos de la invención.
Preferentemente, los anticuerpos se unen a porciones de los componentes de membrana plasmática de hígado adulto, que se encuentran expuestas en la superficie de la célula.
Resulta conveniente que dicho segmento de unión sea un anticuerpo o fragmento o derivado del mismo.
Los anticuerpos monoclonales que se unirán a muchos de estos antígenos (ya sea antígenos proteicos o no proteicos) ya son conocidos, pero en caso contrario, con las técnicas actuales en relación con la tecnología de anticuerpos monoclonales, pueden prepararse los anticuerpos para casi todos los antígenos. La porción unión-antígeno puede ser una parte de un anticuerpo (por ejemplo, un fragmento Fab - del inglés fragment binding antigen, región de unión al antígeno) o un fragmento de anticuerpo sintético (por ejemplo, un fragmento de tipo Fv de cadena sencilla [ScFv]). Los anticuerpos monoclonales apropiados para los antígenos seleccionados deben prepararse de acuerdo a las técnicas conocidas, por ejemplo, aquellas reveladas en "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982).
Los anticuerpos híbridos son analizados por Neuberger et al (1988, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799).
Los anticuerpos monoclonales son útiles para los métodos de la invención.
Se prefieren anticuerpos policlonales monoespecíficos. Pueden prepararse anticuerpos policlonales apropiados mediante métodos bien conocidos en este ámbito.
También pueden utilizarse fragmentos de anticuerpos, como los fragmentos Fab y Fab2, al igual que los anticuerpos manipulados genéticamente y fragmentos de anticuerpos.
Los dominios variables de las cadenas pesada (VH) y liviana (VL) del anticuerpo están involucrados en el reconocimiento de antígenos, un hecho que fue previamente reconocido a partir de experimentos de digestión de la proteasa. Fue confirmado aún más por la "humanización" de anticuerpos de roedor. Los dominios variables de origen roedor quizá puedan fusionarse con dominios constantes de origen humano, de modo que el anticuerpo resultante retenga la especificidad antígena del anticuerpo de roedor emparentado (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855).
Dicha especificidad antigénica otorgada por los dominios variables es independiente de los dominios constantes y conocida a partir de experimentos que involucran la expresión bacterial de los fragmentos de anticuerpos, teniendo todos ellos uno o más dominios variables. Estas moléculas incluyen moléculas del tipo Fab (Better et al (1988) Science 240, 1041); moléculas de tipo Fv (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); moléculas de tipo Fv de cadena sencilla (ScFv), en donde las parejas de dominios Vh y Vl están unidos por medio de oligopéptidos flexibles (Bird et al (1988) Science 242, 426; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) y anticuerpos de dominio simple (dAbs) compuestos por dominios aislados V (Ward et al (1989) Nature 341, 544). Un repaso general de las técnicas involucradas en la síntesis de fragmentos de anticuerpos que retienen sus sitios de unión específicos puede encontrarse en Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.
Al hablar de "moléculas ScFv" nos referimos a moléculas en las que las parejas de dominios Vh y Vl están unidas por medio de un oligopéptido flexible.
Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv, ScFv y dAb pueden ser expresados y secretados a partir de E. coli, lo que permite una fácil producción de grandes cantidades de los fragmentos mencionados.
Todos los anticuerpos y los fragmentos F(ab')2 son "bivalentes". Con "bivalente" nos referimos a que dichos anticuerpos y fragmentos F(ab')2 poseen dos sitios de combinación de antígenos. Por el contrario, los fragmentos Fab, Fv, ScFv y dAb son monovalentes, por lo que poseen un sólo sitio de combinación de antígeno.
Se apreciará que cuando el componente de hígado adulto es un receptor, el receptor, y por lo tanto las células rojas fetales o embrionarias, pueden ser identificadas a través de un ligando para el receptor. Por ejemplo, la hormona cognado es un ligando del receptor de hormona.
Por lo general, en el método para la identificación de células rojas fetales o embrionarias, el segmento de unión es marcado de manera perceptible o para que al menos pueda ser detectado. Por ejemplo, el segmento de unión se marca con un átomo radioactivo o una molécula colorida o una molécula fluorescente, que pueda detectarse fácilmente de algún otro modo. El segmento de unión puede ser marcado directamente con un marcador detectable, o bien marcado indirectamente. Por ejemplo, el segmento de unión puede ser un anticuerpo sin marcar, que puede ser detectado por otro anticuerpo que sí se encuentra marcado. Como alternativa, el segundo anticuerpo pudo haberse unido a la biotina, y la unión de la estreptavidina con la biotina es utilizada para marcar indirectamente el primer anticuerpo.
Por lo general, en un método para aislar las células rojas sanguíneas fetales o embrionarias, el segmento de unión es inmovilizado sobre una estructura sólida de modo que las células rojas embrionarias o fetales primarias puedan ser aisladas por afinidad de unión. Convenientemente, la estructura sólida consiste en una de las matrices apropiadas, tales como agarosa, acrilamida, Sefarosa (marca registrada) y Sephadex (marca registrada). La estructura sólida también puede ser un substrato sólido como la placa Microtiter o similar.
Resulta ventajoso que el segmento de unión sea marcado magnéticamente (ya sea directa o indirectamente) de modo que, cuando se unen, las células fetales o embrionarias pueden separarse del resto de la muestra, con la condición de que exista un campo magnético apropiado. Las ultrimicroesferas que se utilizan en el separador de células magnético son denominadas generalmente ultrimicroesferas super paramagnéticas coloidales MACS.
Las células fetales o embrionarias marcadas de esta forma pueden ser separadas por medio del separador de células activado magnéticamente (MACS).
Apropiadamente, el segmento de unión es marcado con una molécula fluorescente (ya sea directa o indirectamente) y las células rojas fetales o embrionarias son aisladas mediante la utilización de un separador de células activado por fluorescencia (FACS).
Por lo tanto, hemos desarrollado herramientas y métodos que identifican y muestran claramente que uno está analizando el tipo de célula correcto (es decir, células rojas fetales o embrionarias).
Un tercer aspecto de la invención propone un método para la determinación de anomalías fetales; dicho método comprende la identificación o aislamiento de células fetales o embrionarias según el método del primer o segundo aspecto de la invención, y el análisis de dichas células fetales o embrionarias en búsqueda de anomalías fetales.
En una manifestación, las células son identificadas por medio de un segmento de unión, o bien, en virtud de la presencia de una enzima, según se describió anteriormente, y el análisis de dicha anomalía fetal se lleva a cabo directamente sobre las células identificadas. Por ejemplo, las células pueden ser identificadas de manera inmunohistoquímica mediante la utilización de un segmento de unión adecuado, o por medio de un sistema de detección de enzimas apropiado, y el análisis de la anomalía fetal se lleva a cabo in situ en la célula identificada, utilizando técnicas tales como la hibridación in situ fluorescente (FISH) para detectar anomalías cromosomales. La reacción en cadena de la polimerasa puede utilizarse in situ. A pesar de que los sistemas de detección fluorescente funcionan bien, también es posible utilizar sondas marcadas y sistemas de detección de enzimas.
En una manifestación particularmente preferente, las células fetales o embrionarias son aisladas según el segundo aspecto de la invención. Las células aisladas siguiendo este procedimiento resultan ser en su mayoría células fetales o embrionarias y, en especial, no se encuentran células maternas.
El análisis de anomalías fetales implica el análisis de dichas células fetales o embrionarias, de acuerdo con el tipo de anomalía posible a investigar.
Si bien el método puede utilizarse de acuerdo con la invención, también es preferible no detectar un defecto familiar en la glucosa 6-fosfatasa, o no diagnosticar trastornos en la expresión proteica del hígado cuando las células son identificadas mediante el uso de un segmento de unión que se une a un componente intracelular de hígado adulto, como la glucosa 6-fosfatasa.
Si bien el método puede utilizarse de acuerdo con la invención, también es preferible no detectar la deficiencia genética de una proteína del retículo endoplasmático cuando las células son identificadas mediante el uso de un segmento de unión que se une a un componente intracelular de hígado adulto.
Es preferible que la anomalía de la célula fetal se determine por medio del análisis del material genético. En especial, el ADN genómico formado por las células fetales aisladas según el método del segundo aspecto de la invención será similar al ADN genético formado por las células somáticas del feto. Se detectan anomalías cromosomales en una manifestación preferente. Al hablar de "anomalía cromosomal" incluimos cualquier anomalía exagerada en un cromosoma o en el número de cromosomas. Esto incluye, por ejemplo, detectar la trisomía del cromosoma 21, indicativo del síndrome de Down, la trisomía 18, la trisomía 13, las anomalías cromosomales sexuales como el síndrome de Klinefelter (47, XXY), XXY o el síndrome de Turner, la supresión y traslocación cromosómica; una pequeña proporción de pacientes con síndrome de Down presentan traslocación y supresión cromosómica, los síndromes incluyen el síndrome Pradar-Willi y el síndrome Angelman, implicando ambos la supresión de parte del cromosoma 15, y detectar asimismo mutaciones (tales como supresión, inserción, transición, transversión y otras mutaciones) en genes individuales. También existen otros tipos de problemas cromosómicos como el síndrome de la X frágil, que puede ser detectado por medio del análisis de ADN. La siguiente tabla indica ciertos genes, cuya mutación conduce a enfermedades genéticas particulares.
Enfermedad Gen defectuoso
Inmunodeficiencia Adenosina deaminasa Purina-nucleósida-fosforilasa
Hipercolesterolemia Receptor LDL (del inglés low-density lipoptrotein;
lipoproteína de baja densidad)
Hemofilia Factor IX
Factor VIII
Enfermedad de Gaucher Glucocerebrosidasa
\beta-glucuronidasa
Mucopolisacaridosis \alpha-1 antitrepsina
Enfisema Regulador transmembrana de la fibrosis cística
Fibrosis cística
(continuación)
Enfermedad Gen defectuoso
Fenilalanina hidroxilasa
Fenilcetonuria Ornitina transcarbanilasa
Hiperamonemia Argininosuccinato sintetasa
Citrulinemia Distrofina
Distrofia muscular \beta-globina
Talasemia \beta-globina
Anemia falciforme CD-18
Deficiencia de Adhesión de leucocitos
También se conocen otros trastornos genéticos que pueden ser detectados por medio del análisis de ADN, tales como el déficit 21-hidroxilasa o deficiencia de la holocarboxilasa sintetasa, la aspartilglucosaminuria, la leucodistrofia metacromática, la enfermedad de Wilson, el déficit de esteroide-sulfatasa, la adrenoleucodistrofia ligada al cromosoma X, la deficiencia de fosforilasa quinasa (enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo VI), y la deficiencia de la enzima desramificante (enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo III). Estas y otras enfermedades genéticas son mencionadas en The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 7th Edition, Volumes I, II y III, Scriver, C.R., Beaudet, A.L., Sly, W.S., and Valle, D. (eds), McGraw Hill, 1995. Claramente, cualquier tipo de enfermedad genética en la que se haya clonado un gen o detectado mutaciones puede ser analizada por medio de esta manifestación del método de la invención.
Los métodos de ensayo genético incluyen las técnicas estándar de análisis de fragmentos de restricción de longitud polimórfica y análisis basados en la PCR - reacción en cadena de la polimerasa, así como también otros métodos que se describen a continuación.
El ensayo puede implicar el uso de cualquier método apropiado para la identificación de mutaciones o polimorfismos, por ejemplo: secuenciación del ADN en una o varias de sus posiciones relevantes; hibridación diferencial de una sonda de oligonucleótidos diseñada para hibridizar en las posiciones relevantes tanto de la secuencia de tipo silvestre como de la mutante; electroforesis en gel desnaturalizante seguida del corte con una enzima de restricción adecuada, seguida preferentemente de la amplificación de las regiones de ADN relevantes; análisis de secuencia de la nucleasa S1; electroforesis en gel no desnaturalizante, seguida preferentemente de la amplificación de las regiones de ADN relevantes; análisis RFLP convencionales (fragmentos de restricción de longitud polimórfica); amplificación selectiva de ADN mediante el empleo de oligonucleótidos, que se emparejan en la secuencia de tipo silvestre y se desemparejan en la secuencia mutante o viceversa; o la introducción selectiva de un sitio de restricción mediante el empleo de un cebador de la PCR (o similar) combinado con el genotipo de tipo silvestre o mutante, seguido de la digestión con enzimas de restricción. Las sondas y cebadores pueden ser fragmentos de ADN aislados de la naturaleza, o bien sintéticos.
Se podría utilizar un gel no desnaturalizante para detectar las longitudes dispares de los fragmentos, que se originan a partir de la digestión con una enzima de restricción apropiada. Por lo general, el ADN se amplifica antes de la digestión, por ejemplo utilizando el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y modificaciones del mismo.
La amplificación del ADN puede lograrse a través del método de la PCR establecido, tal como lo revela Saiki et al (1988) Science 239, 487-491, o por medio de desarrollos o alternativas como la reacción en cadena de la polimerasa, el sistema QB replicasa, y la amplificación de la secuencia de ácidos nucleicos.
Una "enzima de restricción apropiada" es aquella que reconoce y corta la secuencia de tipo silvestre en lugar de la secuencia mutada o viceversa. La secuencia reconocida y cortada por la enzima de restricción (o no, según el caso) puede presentarse como una consecuencia de la mutación, o introducida dentro del alelo normal o mutante utilizando oligonucleótidos desparejos en la reacción de la PCR. Resulta conveniente si la enzima sólo corta el ADN pocas veces, es decir, si reconoce una secuencia que ocurre rara vez.
En otro método, se utilizan un par de cebadores de la PCR, que se emparejan (es decir, se hibridizan) al genotipo de tipo silvestre o al genotipo mutante, pero no a ambos. Sólo si se produce ADN amplificado, indicará entonces el genotipo de tipo silvestre o mutante (y por lo tanto, el fenotipo). Sin embargo, este método depende en parte de un resultado negativo (es decir, la ausencia de ADN amplificado), que puede deberse a una falla técnica. Resulta, entonces, menos fiable y/o requiere experimentos de control adicionales.
Un método preferente utiliza cebadores de la PCR similares pero, además de hibridizarse con sólo una de las secuencias de tipo silvestre o mutante, introducen un sitio de restricción, que no se encuentra en la secuencia de tipo silvestre ni en la mutante.
Con el propósito de facilitar la clonación posterior de secuencias amplificadas, los cebadores deben tener sitios de restricción de enzimas añadidas a sus extremos 5'. Por lo tanto, todos los nucleótidos de los cebadores proceden de la secuencia génica de interés o secuencias adyacentes a dicho gen, excepto los pocos nucleótidos necesarios para la formación del sitio de restricción de enzima. Dichas enzimas y sitios son muy conocidos en el ámbito de estudio. Los cebadores en sí mismos pueden ser sintetizados por medio de técnicas que son muy conocidas en el ámbito de estudio. Por lo general, los cebadores pueden elaborarse a través de máquinas sintetizadoras que están disponibles en el mercado.
Un cuarto aspecto de la invención proporciona un kit de partes para determinar anomalías fetales que comprende en: a) medios para determinar si una célula contiene o expresa un componente de hígado adulto y b) medios para analizar una célula en búsqueda de anomalías.
Los medios para determinar si una célula contiene o expresa un componente de hígado adulto incluyen los segmentos de unión y reactivos (por ejemplo, substratos) ya mencionados para la detección de dichas enzimas, cuando el componente de hígado adulto es una enzima, y reactivos tales como los cebadores de la PCR, deoxinucleótidos, y una ADN polimerasa para detectar dicho ARN mensajero, cuando el componente de hígado adulto es un ARN mensajero. Se prefieren los anticuerpos, o fragmentos o derivados del mismo, a los componentes de hígado adulto. En especial, es preferible que el componente de hígado adulto sea un componente de superficie celular, como se describió anteriormente.
Los medios para analizar si se encuentra una anomalía en la célula incluyen cualquiera de los medios mencionados. En especial, se prefiere que el medio sea un medio para la detección de una anomalía genética. Por lo tanto, dichos medios apropiados incluyen moléculas ácido nucleicas, tales como cebadores y sondas de la PCR, que se hibridizan selectivamente a un gen de interés, es decir, uno en el que se busca una anomalía genética.
Otro aspecto de la invención implica el empleo de un segmento de unión, que se une a un componente de hígado adulto, constituyendo un método para determinar una anomalía fetal consistente en la identificación o aislamiento de células fetales o embrionarias, de acuerdo con el método del primer o segundo aspecto de la invención, y análisis de dichas células fetales o embrionarias en búsqueda de la anomalía fetal.
Preferentemente, el segmento de unión se utiliza en un método donde la anomalía celular fetal es determinada por el análisis del material genético, por ejemplo, por anomalías cromosomales o mutaciones en el ADN.
Otro aspecto más de la invención proporciona el empleo de un medio para determinar si una célula contiene o expresa un componente de hígado adulto, que consiste en la identificación o aislamiento de células rojas fetales o embrionarias.
Los medios para determinar si una célula contiene o expresa un componente de hígado adulto corresponden a los descritos en el cuarto aspecto de la invención.
A continuación, se describirá la invención en más detalle, teniendo como referencia los siguientes Ejemplos y Figura en donde:
La Figura 1 (95corión aGLUT2 1;100X40RH) muestra el villus coriónico humano a los 56 días postovulatorios, que presenta una intensa inmunoreactividad alfa GLUT2 en un megaloblasto (flecha), y ninguna reactividad en un normocito (punta de flecha) dentro del vaso sanguíneo coriónico (bv) fetal. Las capas sincitiotrofoblástica (s) y la citotrofoblástica (c) son mínimamente inmunoreactivas.
Ejemplo 1 Anticuerpos dirigidos contra componentes de hígado adulto
Los anticuerpos dirigidos contra el 4-nitrofenol UDPGT/testosterona purificada en hígado de rata son cultivados en ovejas Suffolk Cross Blackface, por medio de la combinación de inyecciones intradermales y subcutáneas. La IgG se prepara a partir del antisuero, combinando la precipitación con sulfato de amonio y la cromatografía en dietilaminoetil celulosa (Burchell et al (1984) Biochem. Soc. Trans. 12, 50). Por lo general, el anticuerpo antirata de oveja contra la testosterona en hígado/la preparación del anticuerpo 4-nitrofenol UDPGT (RAL 1) inhiben la actividad de la UDPGT contra la bilirrubina, testosterona, 1-naftol, androsterona, estrona, y morfina, y la inmunodetección confirma un amplio espectro de reactividad cruzada para multiplicar isoformos en microsomas de hígado fetales y adultos en humanos y ratas.
Los antisueros policlonales monoespecíficos para la subunidad catalítica del sistema microsomal glucosa 6-fosfato, T2 y T3 son cultivados en ovejas Cheviot, por medio de 3 inyecciones subcutáneas de 80 \mug de proteína purificada y del adyuvante completo de Freund, según se describe (Burchell & Waddell: Genetic deficiencies of the hepatic microsomal glucose-6-phosphatase system, en Randle et al (eds): Genetics and Human Nutrition, London, UK, Libbey, 1990, p93; Waddell et al (1991) Biochem. J. 275, 363; Burchell & Cain (1985) Diabetología 28, 852). El suero preinmune se obtiene de cada oveja antes de la inyección con el antígeno. La enzima glucosa 6-fosfatasa, T2 y T3 utilizadas como antígenos son aisladas de los microsomas hepáticos de rata Wistar sin alimentar. Los antisueros son más purificados a partir del fraccionamiento con (NH_{4})_{2}SO_{4} y la purificación por afinidad, utilizando columnas de proteína G. Las preparaciones del anticuerpo, aunque cultivadas contra proteínas hepáticas de rata, han demostrado muchas veces reacciones cruzadas con las proteínas humanas correspondientes, a juzgar por el análisis de inmunodetección luego de la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio.
Los antisueros son cultivados en conejos contra oximas de metil PGEM (PEM-MOX) acoplados a la albúmina de suero bovino (Kelly et al (1986) Prostaglandins Leukot. Med. 24, 1). En el ensayo radioinmuno, el antisuero PGEM-MOX sólo tiene una reactividad cruzada de 0.05% con PGE2. Las reacciones cruzadas del antisuero PGEM-MOX con otros derivados metil-oxidados de las PGs son, por lo general, menores al 0.02%, excepto por la 15-ceto-PGE2 (12%) y la 15-ceto-PGE2\alpha (0.9%). El porcentaje de reactividad cruzada del antisuero PGEM-MOX con otras PGs es, por lo general, menor al 0.02%, excepto por la 6,15-diceto-13,14-dihidro-PGE2\alpha (0.35%); 13,14-dihidro-PGE2\alpha (2%); y la 15-ceto-PGF2\alpha (4%). La reactividad cruzada de Gemeprost con el antisuero PGEM-MOX es, por lo general, menor a 0.03% y con el antisuero PGMF-MOX, menor a 0.03%. La especificidad del anticuerpo del antisuero PGEM-MOX para la inmunohistoquímica se muestra por medio de la absorción selectiva de inmunotinción del PGEM-MOX (Hume et al (1993) Exp. Lung Res. 19, 361). Los anticuerpos anti-PGHS-1, la fracción de la IgG policlonal de cabra con reactividad cruzada a PGHS-1 de una cantidad de especies mamíferas, pero con reactividad insignificante a PGHS-2, y el anticuerpo monoclonal 15-hidroxiprostaglandina dehidrogenasa son comprados en el Oxford Biomedical Research, Inc (Oxford, MI).
La PGE2 se conjuga con la hemocianina extraída del molusco llamado "lapa californiana" y se inyecta en la oveja de manera intradermal. El antisuero PGEM2 resultante, sobre ensayo radioinmuno, es sumamente grupo-selectivo, con una reactividad cruzada mínima entre las series F y E de las PGs. La reactividad cruzada de Gemeprost con el antisuero PGE2 es, por lo general, menor al 1%. La especificidad de los antisueros para la inmunohistoquímica se prueba por medio de la absorción selectiva de la inmunotinción de la PGE2 en los pulmones fetales humanos (Hume et al (1992) Exp. Lung Res. 18, 259).
Los anticuerpos contra los citocromos P450 purificados son aislados según se describe en Wolf et al (1984) Carcinogenesis 5, 993. Las especificidades de la isoenzima de los antisueros realizados de esta manera han sido demostradas por medio del análisis de inmunodetección, con proteínas humanas recombinantes del citocromo P450 (Forrester et al (1992) Biochem. J. 281, 359). La NADPH-citocromo P450 oxidoreductasa se purifica (Wolf et al (1984) Carcinogenesis 5, 993) y los anticuerpos cultivados en conejos han demostrado una reacción cruzada con la enzima humana en la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (Smith et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8710).
Además de la utilización de anticuerpos hechos con proteínas aisladas como antígenos, los anticuerpos anti-péptidos también resultan útiles.
Los anticuerpos anti-péptidos se sintetizan a partir de información de secuenciación conocida y/o grandes porciones de proteínas que han sido generadas con porciones del ADNc o genes unidos a secuencias apropiadas, que facilitan el aislamiento luego de la sobreexpresión en un sistema adecuado, por ejemplo, la bacteria. Una serie de anticuerpos anti-péptidos contra porciones de la enzima humana glucosa 6-fosfatasa (CSHIHSYNASLKKY (SEC ID No:1); CMNVLHDFGIQSTHY (SEC ID No: 2); CLAQVLGQPHKKSL (SEC ID: No:3); y CLSRIYLAAHFPHQ (SEC ID No: 4) han sido generados de la siguiente manera.
Estos péptidos fueron conjugados con la hemocianina extraída del molusco llamado "lapa californiana" e inyectados en la oveja por vía intradermal y subcutánea. Los antisueros anti-péptidos resultantes han demostrado una reacción cruzada y pueden ser utilizados para la detección inmunohistoquímica de la glucosa-6 fosfatasa, que contienen células tanto fetales como embrionarias.
Ejemplo 2 Análisis inmunocitoquímico y de hibridación fluorescente in situ combinado de una muestra de sangre maternal para detectar la trisomía del cromosoma 21
Muestras de sangre y preparación celular. Las muestras de sangre venosa periférica (EDTA) se obtienen de una mujer embarazada en el primer trimestre. Las alícuotas de cinco ml de sangre son puestas cuidadosamente en capas sobre alícuotas de 3.5 ml de Polymorphoprep (Nycomed, Noruega) en tubos de 15 ml, que luego son centrifugadas a 500 g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células mononucleares en la interfase plasmática/Polymorphoprep (superior a las dos líneas obtenidas) son cultivadas mediante el empleo de una pipeta Pasteur y dispensadas dentro de un tubo limpio. Las células son lavadas tres veces con 5 ml de tampón fosfato salino (PBS) frío, constituido por 0.5% de albúmina de suero bovino (BSA) y 5 mM de ácido etilendiamino tetraacético (EDTA), y luego centrifugadas durante 10 min. a 400g cada vez. Finalmente, los sobrenadantes celulares (pellets) son resuspendidos en PBS/BSA/EDTA a una concentración de 10^{6} células/ml.
Preparación del portaobjetos. Las alícuotas (100 \mul) de células sanguíneas mononucleares son citocentrifugadas sobre el portaobjetos de vidrio (Cytospin, Shandon) y secadas al aire por la noche.
Inmunocitoquímica. Se utilizan en el procedimiento inmunocitoquímico los siguientes anticuerpos mono y policlonales: (a) un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra la enzima glucosa 6-fosfatasa; (b) una anti-IgG de ratón obtenido en conejo (DAKO) a 1:25; y (c) un PAP de ratón (DAKO) a 1:100. Todos los anticuerpos se diluyen en TBS, compuesto por un 20% de suero de conejo normal (Serotec), y las incubaciones del anticuerpo se llevan a cabo en una cámara humedecida a temperatura ambiente.
Las citocentrífugas secas (Cytospin) se fijan en acetona durante 3 min. y se lavan durante 5 min. en dos cambios de Tris tampón salino (TBS). Se modifica la técnica estándar PAP (Sternberger et al, 1960, J. Histochem. Clytochem. 18, 315-333). Brevemente, se bloquea la actividad de la peroxidasa endógena mediante el empleo de 0.3% de peróxido de hidrógeno en TBS durante 30 min., y luego se enjuagan los portaobjetos en dos cambios de TBS durante 5 min. Las citocentrífugas (Cytospin) son incubadas con un 20% de suero de conejo normal en TBS durante 5 min. con el fin de bloquear los sitios de unión no específicos. Luego de remover la mayor parte del suero de conejo normal, las centrífugas son incubadas con el anticuerpo monoclonal anti-G6Pase durante 30 min. Una vez lavados los portaobjetos con TBS como se describió anteriormente, seguido de la incubación con 20% de suero de conejo normal en TBS durante 5 min., las centrífugas se incuban con anti-IgG de ratón obtenido en conejo durante 30 min. Los portaobjetos se lavan tal como se describió, y se incuban con 20% de suero de conejo normal en TBS durante 5 min., seguido de un PAP de ratón durante 30 min. Luego, los portaobjetos se lavan tal como se describió, se agregan de dos a tres gotas del substrato 3,3 diaminobenzidina (DAB) y se incuban a temperatura ambiente durante 7 min. La solución DAB se prepara disolviendo 2.5 mg de DAB (Sigma) en 5 ml de TBS y añadiendo inmediatamente antes del uso 0.1 ml de peróxido de hidrógeno al 1% recién preparado. Los portaobjetos se lavan con agua corriente durante 2 min., se incuban en una solución de sulfato de cobre (0.4 g de sulfato de cobre, 0.72 g de cloruro sódico, 100 ml de agua destilada) durante 5 min., y se enjuagan nuevamente con agua corriente. Con el propósito de verificar la morfología de las células luego de la inmunocitoquímica, se les puede aplicar a los portaobjetos un contra tinte con la hematoxilina de Mayer (Sigma) durante 20 min., deshidratar mediante alcoholes graduados y verificar mediante el empleo de un microscopio liviano Zeiss Axioskop 20.
La inmunohistoquímica sobre secciones de tejido se lleva a cabo mediante el empleo del anticuerpo monoclonal anti-G6Pase y la técnica PAP estándar (Sternberger et al, 1970, J. Histochem. Cytochem. 18, 315-333). Se les aplica a las secciones un leve contra tinte a base de hematoxilina, se las deshidrata mediante un alcohol graduado y limpia con xileno antes de cubrir el portaobjeto con resina sintética.
Hibridación in situ fluorescente (FISH). Luego de la inmunocitoquímica, las centrífugas se fijan en 3:1 (v/) metanol:ácido acético glacial durante 30 minutos a temperatura ambiente. La fijación se repite con una preparación recién hecha del mismo fijador por otros 30 min. y con 70:30 (v/v) ácido acético glacial:agua durante 90 seg. Los portaobjetos se lavan durante 5 min. en dos cambios de PBS, se deshidratan mediante alcohol 70%, 85% y 100%, y se secan al aire a temperatura ambiente. La técnica FISH se lleva a cabo mediante la utilización de sondas específicas humanas para el cromosoma 21 humano, que son directamente marcadas con isotiocianato fluoresceína (FITC). En resumen, el fluido de la hibridación se transfiere mediante una pipeta sobre cada centrífuga, y se ubica un cubreobjetos cubierto de la sonda fluorescente (FITC) sobre la parte superior, para luego sellarla con una solución de goma. En el caso de que se encuentre fluido de hibridación, las sondas fluorescentes son removidas del cubreobjetos, y luego de la desnaturalización de la sonda y el ADN meta, que ocurre por debajo del portaobjetos al calentar el portaobjetos a 70ºC, las sondas pueden hibridizarse con las metas durante 25 min. a 37ºC. Luego de realizar varios lavados post hibridación, se colocan los portaobjetos en una solución antidecolorante que contiene diamidino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI).
Microscopía. Los portaobjetos se analizan con un microscopio Zeiss Axioskop 20 equipado con un iluminador microscópico con lámpara de mercurio de arco corto HBO 50W, y combinaciones apropiadas de filtros Zeiss (02 para DAPI; 09 para FITC). Las células inmunopositivas se localizan utilizando el microscopio en el modo de luz visible, y luego la fuente de luz visible es bloqueada y el microscopio cambia al modo de fluorescencia, y los portaobjetos se analizan utilizando cada uno de los grupos de filtros. Las células se fotografían con una película de color Fujichrome Provia 400 (Fuji Photo Film Co.; Tokio, Japón) tanto en el modo de luz visible como en el de fluorescencia. Finalmente, se realizan negativos blanco y negro e impresiones de la película de color.
Resultados
Tres puntos fluorescentes positivos del cromosoma 21 están presentes en las células fetales o embrionarias obtenidas de un feto afectado. Por el contrario, las células maternas y fetales normales expresan dos puntos fluorescentes positivos para el cromosoma 21. Las células fetales y maternas se distinguen por medio de la inmunoreactividad a la glucosa 6-fosfatasa, es decir, las células rojas fetales son inmunopositivas, y las células rojas maternas, inmunonegativas.
Ejemplo 3 Aislamiento de células fetales y análisis PCR para la anemia falciforme y talasemia
La Figura 1 (95corión Aglut2 1; 100x40RH) muestra el villus coriónico humano a los 56 días postovulatorios, con intensa inmunoreactividad alfa GLUT2 en un megaloblasto (flecha) y reactividad nula en un normocito (punta de flecha) dentro del vaso sanguíneo coriónico fetal (bv). Las capas sincitiotrofoblástica (s) y citotrofoblástica (c) son mínimamente inmunoreactivas.
Las células fetales de la sangre materna extraídas en el primer trimestre son aisladas de la siguiente manera; asimismo, se lleva a cabo un análisis de la PCR para la anemia falciforme y la talasemia.
Muestra de sangre y separación celular. La sangre periférica (16-18 ml) de una mujer embarazada se junta en tubos Vacutainer con EDTA durante el primer trimestre (Becton Dickinson, Rutherford, NJ). Luego se diluye la sangre 1:2 con tampón fosfato salino (PBS), con capas de 15 ml puestas sobre 10 ml de Ficoll-paque plus (densidad 1.077 g/ml, Pharmacia Biotech, Piscatawa, NJ) y se centrifuga a 400 g durante 30 min. a temperatura ambiente. Las células de la interfase son removidas cuidadosamente, lavadas con PBS dos veces y complementadas con 5 mM de EDTA y 0.5% de albúmina de suero bovino (BSA), y finalmente, resuspendidas en 80 \mul de PBS/EDTA/BSA por cada 10^{7} células.
Separador de células activado por magnetismo. Las células rojas fueron enriquecidas a través de MiniMACS (Miltenyi Biotech, Inc., Sunnyvale, CA) según el protocolo del fabricante. El anticuerpo anti-GLUT2 conjugado por ultrimicroesferas MACS se añade a las células resuspendidas a razón de 20 \mul por cada 10^{7} células. La mezcla se incuba en un refrigerador durante 15 min. a 6-12ºC. La suspensión celular marcada por la esfera magnética se transfiere mediante una pipeta a la parte superior de una columna MiniMACS, mientras que a las células no marcadas se las junta haciéndolas salir de la columna mediante un tampón de 1 ml y un desatascador.
Las células aisladas de esta forma son considerablemente células rojas nucleadas fetales primarias o embrionarias.
La PCR se lleva a cabo como se describió (Saiki et al (1998) Science 239, 487-491) en 50 \mul de volumen de reacción, utilizando un termociclador ADN Perkin-Elmer. Cada ciclo de amplificación consiste en 1 min. a 95ºC, 1 min. a 55ºC, 1min. a 72ºC, con una extensión final de 10 min. a 72ºC en el último ciclo. El ADN de las células fetales o embrionarias extraídas de la columna MiniMACS es primero amplificado durante 40 ciclos, y una quinta parte de los productos se examina sobre un gel de acrilamida al 8%. Si no se encuentran productos de la PCR específicos o muy débiles, se amplifica una alícuota de productos de la PCR de la primera vuelta de 10 \mul por otros 20-30 ciclos bajo las mismas condiciones. Los cebadores utilizados para amplificar las secuencias de \beta-globina son biotinizados "pco3" (5'-Biotina-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3' (SEC ID No:5)), biotinizados "\beta110" (5'-Biotina-AAAATAGACCAATAGGCAGA-3' (SEC ID No:6)) y biotinizados "China2" (5'-Biotina-TGCAGCTTGTCACAGTGCAGCTCACT-3' (SEC ID No:7)). El ADN 248-bp amplificado por "pco3" y "\beta110" se utiliza para la detección del gen que causa la anemia falciforme. El ADN 460-bp amplificado por "pco3" y "China2" se utiliza para la detección de \beta-talasemia.
Detección de puntos por hibridación reversa. Las tiras de membrana que contienen varios puntos de sondas de oligonucleótidos inmovilizadas normales y mutantes de las secuencias \beta-globina se preparan tal como se describió (Maggio et al (1993) Blood 81, 239-242; Cai et al (1994) Human Mutation 3, 59-63). Las secuencias de estas sondas de oligonucleótidos para la detección de mutaciones son las siguientes: para detectar el gen de la anemia falciforme, la sonda normal es 5'-TGACTCCTGAGGAGAAGT-3' (SEC ID No:8) y la sonda mutante es 5'-CAGACTTCTCCACAGGA-3' (SEC ID No:9); para detectar la mutación de \beta39, la sonda normal es 5'-CTTGGACCCAGAGGTTCTT-3' (SEC ID No:10) y la secuencia mutante es 5'-AGAACCTCTAGGTCCAAGG-3' (SEC ID No:11); para detectar la mutación de \beta110, la sonda normal es 5'-GAAAATAGACCAATAGGCAGA-3' (SEC ID No:12) y la sonda mutante es 5'-CTGCCTATTAGTCTATTTTC-3' (SEC ID No:13). Los productos de la PCR de las células fetales se añaden a una solución de 0.8 ml que contiene 2x SSC/0.1% SDS. Se añaden las tiras que contienen las sondas de nucleótidos y el ADN se desnaturaliza en un baño de agua hirviendo durante 5 min. La hibridación se lleva a cabo en un baño de agua a 42ºC durante la noche. Luego, las tiras se lavan en 0.5x SSC/0.1% SDS a 42ºC durante 10 min., conjugada con estreptavidina-HRP a temperatura ambiente durante 15 min., y el color se desarrolla con el substrato cromogénico compuesto por una solución de tetrametil benzidina, citrato de sodio y H_{2}O_{2} a temperatura ambiente, hasta que los colores sean visibles, independientemente de que si se puede detectar, por este medio, una célula falciforme o mutación causante de la talasemia en las células fetales.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: University of Dundee (Universidad de Dundee)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Parth Road No 11
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Dundee
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Reino Unido
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: DD1 4HN
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TITULO DE LA INVENCIÓN: Métodos de diagnóstico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NUMERO DE SECUENCIAS: 13
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO MEDIO: Disco floppy
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: Compatible con IBM PC
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ser His Ile His Ser Ile Tyr Asn Ala Ser Leu Lys Lys Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Met Asn Val Leu His Asp Phe Gly Ile Gln Ser Thr His Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Leu Ala Gln Val Leu Gly Gln Pro His Lys Lys Ser Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Leu Ser Arg Ile Tyr Leu Ala Ala His Phe Pro His Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "cebador de la PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACACAACTGT GTTCACTAGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "cebador de la PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAATAGACC AATAGGCAGA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "cebador de la PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCAGCTTGT CACAGTGCAG CTCACT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "sonda"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGACTCCTGA GCAGAAGT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "sonda"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGACTTCTC CACAGGA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "sonda"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTGGACCCA GAGGTTCTT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /des = "sonda"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGAACCTCTA GGTCCAAGG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "sonda"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAAATAGAC CAATAGGCAG A 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "sonda"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13:
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Claims (23)

1. Un método para identificar células rojas sanguíneas fetales o embrionarias en una muestra que contenga células sanguíneas maternas y células rojas fetales o embrionarias, o ambas; método que consiste en determinar cuáles son las células que contienen o expresan un componente de hígado adulto, que es un componente expuesto a la superficie celular, en donde dichas células rojas fetales o embrionarias son identificadas a causa de la presencia de un componente de hígado adulto en la superficie de las células rojas fetales o embrionarias mencionadas.
2. Un método para aislar células rojas sanguíneas fetales o embrionarias de una muestra que contenga células sanguíneas maternas y células rojas fetales o embrionarias, o ambas; método que consiste en aislar las células que contienen o expresan un componente de hígado adulto, que es un componente expuesto a la superficie celular, además de las etapas que consisten en:
(a)
contactar la muestra con un segmento de unión que ligue específicamente el componente de hígado adulto,
(b)
permitir que el segmento de unión se ligue con el componente de hígado adulto, y
(c)
aislar las citadas células rojas fetales o embrionarias de la muestra por medio de su unión con el segmento de unión.
3. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1 o 2 en el que dicha muestra es una muestra de sangre de una hembra preñada.
4. Un método de acuerdo con la Reivindicación 3 en el que la hembra preñada es una hembra humana, y la muestra se toma en el primer trimestre.
5. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1 o 2 en el que la célula roja fetal o embrionaria corresponde a la serie megaloblástica nucleada.
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5 donde el componente es una proteína.
7. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6 donde el componente carece de células maternas de la sangre materna.
8. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones anteriores, donde el componente expuesto a la superficie celular es una proteína de la membrana plasmática del hígado adulto.
9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el componente de hígado adulto es un transportador de glucosa tipo 2, una glicoproteína P, una MDRP, una MRP, una gamma glutamil transpeptidasa, un receptor de lipoproteína, una fosfatasa alcalina, un transportador de sal biliar, un transportador de ácido biliar, un receptor de hormona, un transportador de ión orgánico multiespecífico, un transportador de bilirrubina o un transportador de bilirrubina conjugada.
10. Un método para identificar células rojas fetales o embrionarias en una muestra de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 y 3 a 9, donde dicha muestra se pone en contacto con un segmento de unión, segmento que se une al componente de hígado adulto mencionado; y dicha célula fetal o embrionaria se identifica en la muestra como resultado de su unión al segmento de unión.
11. Un método para identificar células rojas fetales o embrionarias en una muestra de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 y 3 a 9, donde dicha muestra se pone en contacto con el substrato asociado a una enzima, siendo dicha enzima un componente de hígado adulto; y dicha célula fetal o embrionaria se identifica en la muestra en virtud del producto formado por la acción de la enzima sobre el substrato mencionado.
12. Un método de acuerdo con la Reivindicación 2 o 10, donde el segmento de unión mencionado es un anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo.
13. Un método para aislar células rojas fetales o embrionarias de una muestra de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 12, donde el segmento de unión mencionado es inmovilizado hacia una estructura sólida.
14. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 2, 10 o 12, donde el segmento de unión mencionado es marcado perceptiblemente, o puede ser detectado.
15. Un método para aislar células rojas fetales o embrionarias de una muestra de acuerdo con la Reivindicación 14, donde el marcaje facilita el aislamiento de células.
16. Un método de acuerdo con la Reivindicación 11 donde el producto mencionado es fluorescente o de color.
17. Un método para determinar una anomalía fetal, método que consiste en identificar o aislar células fetales o embrionarias de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y analizar dicha célula fetal o embrionaria en búsqueda de una anomalía fetal.
18. Un método de acuerdo con la Reivindicación 17 donde la anomalía celular fetal se determina por medio del análisis del material genético.
19. Un método de acuerdo con la Reivindicación 18 en el que se detectan anomalías cromosómicas.
20. Un método de acuerdo con la Reivindicación 18 en el que se detectan mutaciones en el ADN.
21. Un kit de partes para la determinación de una anomalía fetal que comprende (a) medios para determinar si una célula contiene o expresa un componente de hígado adulto, que es un componente expuesto a la superficie celular, y (b) medios para analizar una célula en búsqueda de anomalías.
22. Utilización de un segmento de unión que una específicamente un componente de hígado adulto, que es un componente expuesto a la superficie celular en un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 17 a 20.
23. Utilización de un medio para determinar si una célula contiene o expresa un componente de hígado adulto, que es un componente expuesto a la superficie celular para la identificación o aislamiento de una célula roja fetal o embrionaria.
ES98908222T 1997-03-08 1998-03-03 Metodos de diagnostico prenatal in vitro. Expired - Lifetime ES2255150T3 (es)

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