JP2964458B2 - Ｌ―α―グリセリルホスホリル―Ｄ―ミオイノシトール及びその塩の調製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−α−グリセリルホスホリル−Ｄ−ミオイ
ノシトール及びその塩を粗または部分精製リン脂質より
調製する方法に関する。

Ｌ−α−グリセリルホスホリル−Ｄ−ミオイノシトー
ル（GPI）およびその薬学的に許容される塩の調製方法
はこれまで開示されていなかった。

ブラウン（J.Chem.Soc.,3774,1959）及びブロッカロ
フ（J.Am.Chem.Soc.,2591,1959）は純粋なホスファチジ
ルイノシトール（PI）をアシル化することによりシクロ
ヘキシルアンモニウム塩としてGPIを得ている。この物
質は商業的に入手することができないし、工業的に実施
することができないような困難な工程によってしか得ら
れない。

ラファジ（J.Am.Chem.Soc.,3713,1960）は粗とうもろ
こしリン脂質をアシル化してシクロヘキシルアンモニウ
ム塩としてGPIを得ている。しかし濃度勾配溶出により
強塩基性イオン交換樹脂を用いて精製を行っているが、
得られたシクロヘキシルアンモニウム塩は純粋ではな
く、精製を行うために繰り返し再結晶を行わなければな
らなかった。

純度の高くないPIを出発物質として純粋なGPIを得る
ことが困難であることはホースロンによって証明されて
いる（Biochem,J.,195,1959）。ホースロンはバリュウ
ム塩としてGPIを単離しているが、蟻酸アンモニウムと
テトラホウ酸ナトリウム混合物の濃度勾配溶出による強
塩基性イオン交換樹脂によるクロマトグラフィーと精製
PIを用いた場合にのみ純粋なGPIが得られるとの興味深
い知験を得ている。

本発明は、一般式（Ｉ）で示されるGPIのフリーの酸
及びその塩を簡単でかつ経済的な工程で、粗または部分
精製リン脂質より調製する方法を提供する。

（GPI^-）nXⁿ⁺ （Ｉ） 但しGPIはグリセリルホスホリルミオイノシトールア
ニオンであり、 ＸはNa,Ca,Mg,Al,Zn,NH₄であり、 ｎは１ないし３の整数である。

本方法の特徴は特に、蟻酸、酢酸、プロピオン酸のよ
うな有機酸の希釈水溶液を用いて、弱塩基性樹脂で粗GP
Iを精製する所に存在する。まず初めにGPIよりも弱酸性
の不純物［Ｌ−α−グリセリルホスホリルエタノールア
ミン（GPE）,N−アシルGPE等］は有機酸の希釈水溶液で
樹脂から溶出され、GPIは溶出されない。次いで純粋なG
PIがより高い濃度の有機酸水溶液で溶出され、GPIより
も強酸性の不純物［Ｌ−α−グリセリルホスホリルセリ
ン（GPS），グリセロリン酸等の不純物］は溶出されな
い。これらの不純物は有機酸水溶液では溶出されないが
食塩水溶液を用いた場合にのみ溶出することができる。

強塩基性樹脂を用いた場合は、GPEの完全な排出は非
常に困難なことであり、特に、有機酸水溶液で樹脂を洗
浄してGPIを回収することができないため、この単純な
精製を達成することができない。実際、この場合には食
塩水溶液が用いられるが、酸性不純物からGPIを分離す
るため厄介なクロマトグラフィー操作を使う必要があ
る。

本発明方法は以下に要約することができる。

粗または部分精製リン脂質混合物のアルコール（好適
には、メタノールもしくはエタノール）懸濁液をアルカ
リ金属アルコキシド（好適には、ナトリウムまたはカリ
ウムメトキシド、エトキシド、ターシャリーブトキシ
ド）を用いて処理する。反応終了後、不溶性残渣を濾過
し、反応溶液中に再び懸濁させ、この懸濁液を鉱酸（好
適には、塩酸、硫酸、リン酸）もしくは有機酸（好適に
は、蟻酸、酢酸、プロピオン酸等）を用いて、中性もし
くは弱酸性（pH4−７）にpHを調整する。次いで、再度
濾過する。粗GPI NaまたはGPI K（使用したアルコキシ
ドに由来）を含有する固形物を、水に懸濁し（水／固形
物比はv/wで好適には１−２とし）、次いで懸濁液にア
ルコールを添加する（好適には、メタノール、エタノー
ル、イソプロパーノールのいずれかを水を用いておよそ
の容量比v/vで1.5−３）。濾過を行い、沈澱は懸濁液を
調製したと同様の加水アルコール混合液で洗浄する。得
られた水和アルコール抽出物からアルコールを蒸発さ
せ、次いで水溶液は、最初に酸性型にした陽イオン樹脂
に流下させる。次いで弱塩基型樹脂（好適には、ハイド
ロオキサイド、アセテート、ホルメート型にした）を通
す。樹脂は最初に水で洗浄し、ついで１−３％W/Vの濃
度にした有機酸水溶液（好ましくはギ酸、酢酸、プロピ
オン酸）で洗浄する。その後精製GPIは５−10％W/V濃度
に調製した上述の有機酸水溶液で樹脂を洗浄して回収す
る。上記10％W/V濃度より濃縮したGPI濃縮物を得るた
め、回収溶液は減圧下で少量に濃縮する。次いでGPIを
半固形で回収するため、アセトン中に濃縮物を注ぐ。上
清の水を静かに容器を傾けて除き、沈澱はアルコール
（好適には、メタノール、エタノール、イソプロパノー
ル）中に移し、固形酸GPIを単離する。

一般式（Ｉ）の塩は、所望の塩に対応する金属の炭酸
塩、炭酸水素塩、オキサイド、ハイドロオキサイドで、
得られた酸GPIの水溶液を処理し、その後溶液を濃縮
し、最後にアルコール（望ましくはメタノール、エタノ
ール、イソプロパノール）で沈澱物として得ることがで
きる。

実施例1:GPIの調製 脱オレイン化大豆レシチン（1.22kg）をナトリウムメ
トキシド（60g）を含むメタノール（4.51）に懸濁した
溶液を室温で４時間攪拌した。残渣（乾燥物の600gに相
当量）を濾過し、メタノール0.51で２回洗浄し、次いで
メタノール1.31に再度懸濁した。氷酢酸（およそ54ml）
でpH4.5に調製した。残渣は再度濾過し、メタノール300
mlで２回、濾過物を洗浄し、次いで真空下で40℃で乾燥
し、約10％のGPI Naを含有する乾燥物400gを得た。

残渣は800mlの水に懸濁させ、この混合物に、メタノ
ール1.61を緩やかに加え、30分間攪拌した。濾過後、メ
タノール／水、2:1の混合液300mlで２回フィルター上の
残渣を洗浄した。水和アルコール溶液は集め、メタノー
ルを減圧下で蒸発させ、水溶液は脱色のため、活性炭10
gとケイソウ土10gの混合物で２回処理を行った。溶液は
濾過し、そしてamberlite IR−120H樹脂300mlに通し、
樹脂は600mlの水で洗浄した。得られた溶液はamberlite
IR−930H樹脂200mlに通し、最初に樹脂を水で洗浄し
た。次いで３％W/V酢酸水溶液で不純物が完全に溶出し
てこなくなるまで洗浄した（T.L.C.で確認する）。樹脂
はGPIを完全に回収するまで８％W/V酢酸水溶液で洗浄し
た。溶液は真空下で濃縮（約300mlまで）した。ついで
攪拌しながらアセトン4l中に注いだ。混合溶液は６時間
室温で攪拌し、その後上清の水を静かに容器を傾けて除
いた。エタノール600mlを添加し、混合液は室温で５時
間攪拌し、その後上清の水を静かに容器を傾けて除い
た。エタノール300mlをさらに添加し、室温で18時間混
合液を攪拌し、生成物を濾過し、エタノールで洗浄し、
無水リン酸上に置き、30℃で減圧下で乾燥した。GPI31g
を得た。

C₉H₁₉O₁₁P（M.W.＝334.23） 計算値Ｃ＝32.34％ Ｈ＝5.73％ 実測値Ｃ＝32.19％ Ｈ＝5.83％¹ H−NMR（D₂O）：δppm:3.20−3.75（6H,m）;3.75−4.1
0（4H,m）;4.20（1H,m）； Mass: 333＝［Ｍ−１］;259＝［（Ｍ−１）−C₃H₆O₂］;241＝
［（Ｍ−１）−C₃H₆O₂−H₂O］;163＝［C₆H₁₁O₅］ α_Ｄ＝−17.36（ｃ＝２ 水中） m.p.145÷150℃（分解） 実施例2:GPIシクロヘキシルアンモニウム塩の調製 精製酸GPI（実施例１で得た）15gを150mlの水に溶解
した溶液に、シクロヘキシルアミンを添加し、pH8に調
整した。次いで約30mlまで濃縮し、さらにエタノール約
200mlを加え希釈した。濾過後得られた沈澱をエタノー
ル中で再結晶させそして無水リン酸上40℃で真空下で乾
燥させた。GPIシクロヘキシルアンモニウム塩14.5gを得
た。

C₁₅H₃₂O₁₁P（M.W.＝433.4） 計算値Ｃ＝41.57％ Ｈ＝7.44％ Ｎ＝3.23％ 実測値Ｃ＝41.67％ Ｈ＝7.42％ Ｎ＝3.20％¹ H−NMR（D₂O）δppm:1.00−1.20（m;4H;シクロヘキシ
ル）;1.33−1.48（m;2H;シクロヘキシル）;1.48−1.60
（m;2H;シクロヘキシル）;1.67−1.80（m;2H;シクロヘ
キシル）;2.80−3.00（m;CH−10）;3.08（dd;CH−5;J
_5-4＝J_5-6＝9.3Hz）;3.29（dd;CH−3;J_3-2＝2.70Hz;J
_3-4＝9.30Hz）;3.34−3.44（m;CH−４＋CH₂−９）;3.50
（dd;CH−6;J_6-5＝J_6-1＝9.30Hz）;3.60−3.78（m;CH−
１＋CH−８＋CH₂−７）;4.00（dd;CH−2;J_2-3＝J_2-1＝
2.70）;4.60（s;DHO）；¹³ C−NMR（D₂O）（fully decoupled）：δppm:26.19
（s;C−12＋Ｃ−14）;26.68（s;C−13）;32.72（s;C−1
1＋Ｃ−15）;52.74（S;C−10）;64.43（s;C−９）;68.7
0（d;C−7;JC−Ｏ−Ｐ＝5.72Hz）;73.02（d;C−８）;7
3.10（s;C−３）;73.65（m;C−２＋Ｃ−６）;74.58（s;
C−４）;ppm76.32（s,C−５）;78.60（d,C−1;JC−Ｏ−
Ｐ＝5.9Hz）； α_Ｄ＝−13.2（ｃ＝2.09 水中） 実施例3:（GPI）₂Caの調製 精製酸GPI（実施例１で得た）15gを150mlの水に溶解
した溶液に炭酸カルシウムを添加しpH5.5に調整した。
この混合液を濾過、次いでこの溶液を真空下で約30mlま
で濃縮し、さらにメタノール約150ml中に攪拌しながら
入れた。室温で１時間攪拌した後、濾過して得られた沈
澱をメタノールで洗浄した。そして40℃で真空下で乾燥
させた。純粋な（GPI）₂Ca（殆ど水に不溶解性の固体）
15gを得た。

C₁₈H₃₆O₂₂P₂Ca（M.W.＝706.5） 計算値Ｃ＝30.60％ Ｈ＝5.13％ Ca＝5.67％ 実測値Ｃ＝30.56％ Ｈ＝5.12％ Ca＝5.58％¹ H−NMR（D₂O）δppm:3.37（dd,CH−5;J_5-6＝J_5-4＝9.2
7Hz）;3.58（dd,CH−3;J_3-2＝2.78Hz;J_3-4＝9.27Hz）;
3.65−3.75（m;CH−４＋CH₂−９）;3.79（dd,CH−6;J
_6-5＝J_6-1＝9.27Hz）;3.90−4.10（m;CH−１＋CH−８＋
CH₂−７）;4.31（dd,CH−2;J_2-3＝J_2-1＝2.78Hz）;4.80
（s;DHO）¹³ C−NMR（D₂O）（fully decoupled）δppm:69.03（s;C
−９）;73.34（d;C−7;Jc−ｏ−ｐ＝5.6Hz）;77.60（d;
C−８）;77.71（s;C−３）;78.25（m;C−２＋Ｃ−６）;
79.16（s;C−４）;80.88（s;C−５）;83.13（d;C−1;Jc
−ｏ−ｐ＝5.90Hz）； α_Ｄ＝−15.46（ｃ＝2.07 水中） 実施例３に説明したと同様の方法で炭酸マグネシウム
または炭酸バリウムを用いて以下の様な（GPI）₂Mgおよ
び（GPI）₂Baをそれぞれ得た。

C₁₈H₃₆O₂₂P₂Mg（M.W.＝690.74） 計算値Ｃ＝31.30％ Ｈ＝5.25％ Mg＝3.52％ 実測値Ｃ＝31.35％ Ｈ＝5.21％ Mg＝3.50％ α_Ｄ＝−15.68（ｃ＝3.1 水中） C₁₈H₃₆O₂₂P₂Ba（M.W.＝803.78） 計算値Ｃ＝26.89％ Ｈ＝4.51％ 実測値Ｃ＝26.74％ Ｈ＝4.69％ α_Ｄ＝−14.8（ｃ＝3.79 水中） 実施例３に説明したと同様の方法で水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸水素
塩、または炭酸塩を用い溶液のpHを4.5−５に調整し
て、以下の様なGPI Na,GPI KおよびGPI NH₄をそれぞれ
得た。

C₉H₁₈O₁₁PNa（M.W.＝356.21） 計算値Ｃ＝30.35％ Ｈ＝5.09％ 実測値Ｃ＝30.28％ Ｈ＝5.18％ α_Ｄ＝−14.9（ｃ＝3.3 水中） C₉H₁₈O₁₁PK（M.W＝363.32） 計算値Ｃ＝29.75％ Ｈ＝4.99％ 実測値Ｃ＝29.84％ Ｈ＝5.05％ α_Ｄ＝−15.1（ｃ＝2.3 水中） C₉H₁₈O₁₁PNH₄（M.W.＝351.25） 計算値Ｃ＝30.77％ Ｈ＝6.31％ Ｎ＝3.98％ 実測値Ｃ＝30.84％ Ｈ＝6.45％ Ｎ＝3.85％ α_Ｄ＝−16.1（ｃ＝1.4 水中） 上記の塩は実施例３に示したように実施例１の酸GPI
の水溶液を直接処理して得ることが可能である。

実施例4:部分精製ホスファチジルイノシトールからの
（GPI）₂Mgの調製 脱オレイン化大豆レシチン（1kg）をメタノール（２
）に懸濁した溶液を室温で２時間攪拌し、次いで濾過
した。残渣はメタノール800mlで洗浄し、次いでメタノ
ールに再度懸濁し、室温で１時間攪拌した。濾過し、残
渣をメタノール500mlで洗浄し、ナトリウムメトキシド
（40g）を含むメタノール（2.5）に懸濁し、実施例
１、実施例３のように処理した。（GPI）₂Mg25gを得
た。

実施例5:組織由来粗リン脂質から（GPI）₂Baの調製 約10％PI、10％PS、30％PC、30％PEを含有したリン脂
質500gをナトリウムメトキシド30gを含有するメタノー
ル（３）に懸濁した溶液を実施例1,実施例３に従い、
処理を行い、9.6gの（GPI）₂Baを得た。本工程の収量は
一般的な粗リン脂質中のPI含有量と顕著に異なってお
り、含有量の変更を示すものである。

フロントページの続き (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｕｒ ｎａｌ，ｖｏｌｕｍｅ 71，1959，ｐａ ｇｅｓ195〜200 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ ｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏ ｃｉｅｔｙ，Ｖｏｌｕｍｅ 82，20 Ｊ ｕｌｙ 1960，ｐａｇｅｓ 3713〜3715 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07F 9/117 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酸Ｌ−α−グリセリルホスホリル−Ｄ−ミ
   オイノシトール（GPI）（acid −Ｌ−α−glycerylphos
   phoryl−Ｄ−myoinositol）を粗または部分精製リン脂
   質の脱アシル化により調製する方法であって、以下の工
   程からなる調製方法。 ａ） 水和アルコール混合物により粗脱アシル化混合物
   の不溶性残渣からGPI NaまたはGPI Kを抽出する工程、 ｂ） 金属イオンを除去した後、得られる粗GPIを弱塩
   基性樹脂を用いて精製する際に、最初に有機酸水溶液で
   樹脂を洗浄し、中性またはGPIより弱い酸性の不純物を
   除去し、ついでより濃度の高い有機酸水溶液で樹脂を洗
   浄して純GPIを回収する工程。
2. 【請求項２】工程ａ）において使用するアルコール／水
   のV/V比が1.5ないし３であり、アルコールがメタノー
   ル、エタノール、イソプロパノールである請求項１記載
   の方法。
3. 【請求項３】工程ｂ）において蟻酸、酢酸またはプロピ
   オン酸を濃度１ないし３％w/vで使用して不純物を除
   き、次いで蟻酸、酢酸またはプロピオン酸を濃度５ない
   し10％w/vで使用してGPIを回収する請求項１記載の方
   法。
4. 【請求項４】出発物質として粗もしくは部分精製リン脂
   質を用いるものである請求項１ないし３のいずれかに記
   載の方法。
5. 【請求項５】次の一般式（Ｉ）で示されるＬ−α−グリ
   セリルホスホリル−Ｄ−ミオイノシトールの塩を粗また
   は部分精製リン脂質の脱アシル化により調製する方法で
   あって、以下の工程からなる調製方法。 （GPI^-）nXⁿ⁺ （Ｉ） 但しGPIはグリセリルホスホリルミオイノシトールアニ
   オンであり、ＸはNa,Ca,Mg,Al,Zn,NH₄であり、ｎは１な
   いし３の整数である。 ａ） 水和アルコール混合物よりなる粗脱アシル化混合
   物の不溶性残渣からGPI NaまたはGPI Kを抽出する工
   程、 ｂ） 金属イオンを除去した後、得られる粗GPIを弱塩
   基性樹脂を用いて精製する際に、最初に有機酸水溶液で
   樹脂を洗浄し、中性またはGPIより弱い酸性の不純物を
   除去し、ついでより濃度の高い有機酸水溶液で樹脂を洗
   浄し、純GPIを回収する工程、 ｃ） ｂ）で得られたGPIの水溶液にアミン化合物また
   はナトリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウ
   ム及び亜鉛から選ばれる金属の炭酸塩、炭酸水素塩、オ
   キサイドまたはハイドロオキサイドを加え、濃縮後、ア
   ルコールを加えて沈殿物としてGPIの塩を得る工程。