CN102041281A

CN102041281A - 一种磷脂酶水解制备甘油磷酸胆碱(gpc)的方法

Info

Publication number: CN102041281A
Application number: CN 201010248594
Authority: CN
Inventors: 张康逸; 刘元法; 周丽; 钱祥云; 王兴国
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2010-08-09
Filing date: 2010-08-09
Publication date: 2011-05-04

Abstract

本发明公开了一种酶法水解制备甘油磷酸胆碱(GPC)的方法，属于脂质开发应用技术领域。包括如下步骤：以粉末磷脂、醇溶磷脂、高纯PC为原料，在水相中，用磷脂酶水解磷脂酰胆碱(PC)制备甘油磷酸胆碱(GPC)；活性炭脱色，得到GPC水溶液，转化成醇相，采用阳离子树脂吸附解析和阴离子吸附的方法纯化，得到纯度比较高的GPC水溶液，低温、减压旋蒸得到无色透明的L-α-GPC溶液，化学纯度98.8％，光学纯度ee：99％，mp142-143℃，

H₂O含量14％，pH＝5.8)。本发明为制备甘油磷酸胆碱提供了一种新的思路和方法，也增加了磷脂酶在脂质科学中的应用。

Description

一种磷脂酶水解制备甘油磷酸胆碱(GPC)的方法

技术领域

一种磷脂酶水解制备甘油磷酸胆碱(GPC)的方法，涉及到食品化学、精细化学、有机化学和药物化学领域。

背景技术

L-α-甘油磷脂胆碱(L-α-Glycerophosphorylcholine，L-α-GPC)为体内天然存在的水溶性磷脂代谢产物，它的原子结构示意图如下所示。它能穿过血脑屏障，是乙酰胆碱和磷脂酰胆碱合成的胆碱源，是一种重要的的神经递质和磷脂前体。

其中：表示H，

表示C，

表示P，

表示O，

表示N。

L-α-GPC具有重要的药用价值，可以通过静脉注射，也可以通过口服，经研究发现它可以保护肝组织免受有毒的四氯化碳和高脂蛋白类的食品所产生的脂肪酸渗透。L-α-GPC可以进入脂蛋白的结构中，可以快速的被小肠吸收和静脉注射部位的吸收，并通过血液循环达到各个器官(如肝脏、肾和大脑，特别是肝脏)，进行再次循环。此外，L-α-GPC具有抗高血脂的作用，有改善老年人的认知能力和记忆力，及保护血管的作用。

L-α-GPC的制备方法有动物器官直接萃取法、化学合成法、化学水解法、磷脂酶水解法。最早提取L-α-GPC是动物器官萃取法，直接从牛胰脏中萃取纯化得到L-α-GPC的方法(GSchmidt，J.Biochem，1945，161，523)。美国专利No.2864848直接用卵磷脂水解法制备L-α-GPC，利用氯化汞以汞盐的形式沉淀副产物纯化L-α-GPC，过量的汞离子通过H₂S和BaCO₃除去，这种方法效率比较低，得到的L-α-GPC不仅含有未反应的卵磷脂，还残留了大量的有毒的汞离子。Brockerhoff和Yukowski用四丁基氢氧化铵做催化剂水解卵磷脂，得到比较纯的产品，但是需要除去催化剂，并且对产品进行重结晶纯化，整个过程比较复杂，成本比较高，不适合商业规模的生产。Cubero Robles和Roels用醇解蛋黄磷脂制备L-α-GPC，用氯仿和甲醇(2∶1，体积比)纯化提取，通过旋蒸得到沉淀，再用乙醚进行萃取，得到L-α-GPC和L-α-GPE的混合物，然后用硅胶柱进行纯化，在纯化的同时也受到硅酸的污染，需要再进行重结晶提取，这种方法比较繁琐，处理量有限，成本也比较高，严重限定了商业化的规模。

本发明提供一种磷脂酶水解法制备甘油磷酸胆碱(L-α-GPC)的方法，解决了制备L-α-GPC过程中面临的转化率低、纯化困难、产品的纯度不够、并有伴随物存在的难题。通过对酶解反应条件的优化研究，将磷脂中PC的磷脂酶水解率提高到97％，经分离纯化，最终产品纯度达到98％。本发明的反应条件温和，整个体系为水相，无有机溶剂污染，是一种方便、经济、环保、可实现商业化规模制备L-α-GPC的方法。

发明内容

本发明提供了一种磷脂酶水解制备甘油磷酸胆碱L-α-GPC的方法，该方法利用磷脂酶对卵磷脂(PC)酰基进行水解，生成Sn-2-溶血磷脂，发生酰基转移，有Sn-2-溶血磷脂转化成Sn-1-溶血磷脂，磷脂酶对溶血磷脂Sn-1脂肪酸再次水解得到L-α-GPC，将酶反应液进行浓缩，脱色，离子交换树脂纯化，得到无色的L-α-GPC的水溶液，真空条件下除去水分，得到L-α-GPC。

技术方案：以粉末磷脂、醇溶磷脂、高纯PC为原料，磷脂酶在水相体系中水解卵磷脂得到GPC，进行纯化得到L-α-GPC。一种方案：粉末磷脂为原料进行酶解反应，得到L-α-GPC，经脱色和离子交换树脂纯化得到L-α-GPC。另一种方案：醇溶磷脂和高纯PC为原料进行酶解反应，得到GPC，经脱色和离子交换树脂纯化得到L-α-GPC。

主要步骤包括：

(1)酶解反应：将粉末磷脂、醇溶磷脂、高纯PC加到蒸馏水中，形成乳化态磷脂水溶液，添加金属盐，混匀后加入磷脂酶，在加热条件下反应，进行固液分离，得到澄清的酶反应溶液。

(2)酶反应液的脱色：将酶水解反应液，进行浓缩，得到浓缩液，添加脱色剂，在加热条件下，搅拌，过滤除去脱色剂，得到无色的酶反应溶液。

(3)纯化：将水相的脱色液，在减压下旋蒸去水，重新溶到甲醇中，有水相变成醇相，调pH＝10用阳离子树脂吸附解析，再过阴离子树脂纯化，得到L-α-GPC的水溶液，真空条件下除去水分，得到纯的L-α-GPC。

本方法酶解反应是用磷脂酶对卵磷脂(PC)进行水解，酶的添加量为水溶液的质量的0％～5％，金属盐的添加量为水溶液的质量的0％～5％。

本发明在水相体系中进行磷脂的酶解反应，经过脱色、离子交换树脂纯化，得到L-α-GPC，属于开创性的研究。

本发明的脱色是采用吸附脱色，用脱色剂对色素进行吸附达到脱色的目的，本发明采用凹凸棒土或活性炭作为脱色剂，在加热条件下搅拌，过滤，得到无色澄清的酶解反应液。

本发明中醇溶磷脂的酶解反应、产品的脱色、纯化工艺比较简单，无有机溶剂，污染比较小，比较环保，工业化生产比较安全，生产成本比较低，比较易于工业化。

附图说明

图1产品L-α-GPC的LC-MS色谱图。

从图1可以看到只有L-α-GPC成分的峰，其纯度接近100％。

图2产品L-α-GPC的LC-MS/MS质谱图。(L-α-GPC的分子量为257，保留时间5.8min处的峰对应的质荷比(M+1)/q＝258，证明是L-α-GPC的峰。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述的制备方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1

所用的原料为食品级粉末磷脂(其中PC含量约为24％)。

醇溶磷脂的制备：20g粉末磷脂中加入95％乙醇溶液80mL，在55℃水中、300r/min机械搅拌120min，抽滤，得到磷脂乙醇溶液；滤饼在相同条件下重复提取三次，将所得到磷脂的乙醇溶液合并，在40℃真空下进行旋转蒸发，得到7.2g醇溶磷脂固体，PC含量为60.2％，PC回收率为90.6％，乙醇回收。

所得的醇溶磷脂：金黄色，易吸潮、氧化、易分散于水中并形成稳定的乳浊液，不溶于丙酮，溶于乙醇、乙醚和己烷等有机溶剂。

实施例2

所用的醇溶磷脂原料为实施例1的产物(PC含量为60.2％)。

高纯PC的制备：20g醇溶磷脂中加入95％乙醇溶液80mL，在-20℃低温中静置80min，抽滤，得到磷脂乙醇溶液，滤饼在相同条件下重复结晶三次，将所得到磷脂乙醇醇溶液合并，在40℃真空下进行旋转蒸发，得到14.25g醇溶磷脂固体，PC含量为81.5％，PC回收率为95.1％，乙醇回收。

实施例3

所用原料为粉末磷脂、醇溶磷脂和高纯PC。

酶解反应液的制备：5g磷脂(粉末磷脂、醇溶磷脂、高纯PC)中加入150mL去离子水，在水浴中加热，300r/min机械搅拌均质30min，加入0.5mL磷脂酶，再添加金属盐0.3g，反应3h后得到酶水解反应液，过滤，得到澄清的酶解反应液。

实施例4

所用的酶解反应液为实施例3所得的产物。

L-α-GPC混合物脱色：150mL的浓缩酶解液，加入15g活性凹凸棒土脱色剂，在加热条件下，搅拌3h，过滤，得到无色澄清L-α-GPC的反应液。

实施例5

所用的酶解反应液为实施例4脱色后的反应液。

L-α-GPC混合液的纯化：150mL脱色酶解液，将水相的脱色液，在减压下旋蒸去水，重新溶到甲醇中，有水相变成醇相，调pH＝10，在流速2mL/min条件下，D001吸附解析，再过D301除杂，得到澄清的溶液，在减压条件下，进行浓缩，得到50mL的浓缩液，在60℃，在减压条件下，进行旋蒸，最终得到无色透明的L-α-GPC溶液，化学纯度98.8％，光学纯度ee：99％，mp142-143℃，

H₂O含量14％，pH＝5.8)。

实施例6

所用的原料为食品级粉末磷脂(其中PC含量约为24％)。

利用粉末磷脂制备L-α-GPC：5g粉末磷脂(PC含量24％)中加入150mL去离子水，在水浴中加热，300r/min机械搅拌，均质30min，添加金属卤化物0.3g、添加酶0.5mL，酶水解反应3h，过滤，得到酶解反应液150mL，加入15g活性炭，加热搅拌3h，过滤，得到无色澄清L-α-GPC的反应液，将水相的脱色液，在减压下旋蒸去水，重新溶到甲醇中，水相变成醇相，调pH＝10，在流速2mL/min条件下，D001吸附解析，再过D301除杂，得到澄清的溶液，在减压条件下，进行浓缩，得到50mL的浓缩液，得到澄清的溶液，在60℃，减压条件下旋蒸，浓缩，得到得到无色透明的L-α-GPC产品0.404g，得率86.9％，化学纯度98.8％，光学纯度ee：99％，mp142-143℃，

H₂O含量14％，pH＝5.8)。

实施例7

所用的醇溶磷脂原料为实施例1的产物(PC含量为60.2％)

利用醇溶制备L-α-GPC：5g醇溶磷脂(PC含量60.2％)中加入150mL去离子水，在水浴中加热，300r/min机械搅拌，均质30min，添加金属卤化物0.3g、添加酶0.5mL，酶水解反应3h，过滤，得到酶解反应液150mL，加入15g活性炭，加热搅拌3h，过滤，得到无色澄清L-α-GPC的反应液，将水相的脱色液，在减压下旋蒸去水，重新溶到甲醇中，水相变成醇相，调pH＝10，在流速2mL/min条件下，D001吸附解析，再过D301除杂，得到澄清的溶液，在60℃，减压条件下旋蒸，浓缩，得到无色透明的L-α-GPC产品1.022g，得率87.6％，化学纯度98.8％，光学纯度ee：99％，mp142-143℃，

H₂O含量14％，pH＝5.8)。

实施例8

所用的醇溶磷脂原料为实施例2的产物(PC含量为81.5％)

利用高纯PC制备L-α-GPC：5g高纯PC中加入150mL去离子水，在水浴中加热，300r/min机械搅拌，均质30min，添加金属卤化物0.3g、添加酶0.5mL，酶水解反应3h，过滤，得到酶解反应液150mL，加入15g活性炭，加热搅拌3h，过滤，得到无色澄清L-α-GPC的反应液，将水相的脱色液，在减压下旋蒸去水，重新溶到甲醇中，水相变成醇相，调pH＝10，在流速2mL/min条件下，D001吸附解析，再过D301除杂，得到澄清的溶液，在60℃，减压条件下旋蒸，浓缩，得到无色透明的L-α-GPC产品1.407g，得率89.1％，化学纯度98.8％，光学纯度ee：99％，mp142-143℃，

H₂O含量14％，pH＝5.8)。

Claims

1.一种磷脂酶水解法制备甘油磷酸胆碱(L-α-GPC)的方法，其特征在于，包括如下工艺步骤：

(1)磷脂酶水解卵磷脂反应：磷脂中加入去离子水，固液比1∶1～1∶30g/ml，0～75℃水浴，均质后加入金属盐M_XN_Y、磷脂酶，反应0～36h，得到GPC溶液，过滤，得到清夜。

(2)L-α-GPC混合物脱色：浓缩酶解液，加入脱色剂，固液比1∶5～1∶100g/mL，0～90℃，搅拌0～6h，过滤，得到无色澄清溶液。

(3)L-α-GPC纯化：脱色后GPC水溶液，在0～70℃，减压旋蒸，除去水，重新溶于甲醇中，由水相变醇相，调pH＝10，流速0～10mL/min，阳离子树脂吸附解析，再过阴离子树脂，得到L-α-GPC的水溶液，在0～70℃，减压旋蒸，最终得到无色透明的L-α-GPC。

2.低温结晶法制备高纯卵磷脂(PC)的方法，其特征在于，包括如下工艺步骤：

(1)醇溶磷脂的制备：把粉末磷脂中加入低碳链醇中(醇含量70％～100％)，固液比为1∶1～1∶50(g/mL)，0～70℃水浴、搅拌0～5h，分离得到磷脂的醇溶液，不溶物用相同醇溶液萃取1～10次，将所得到醇溶液合并，减压浓缩、干燥得到PC含量为40～65％左右的醇溶磷脂，低碳链醇回收。

(2)低温结晶法制备高纯PC：利用步骤(1)中的醇溶磷脂为原料，将其加入到低碳链醇中(纯度0％～100％)，固液比1∶1～1∶50(g/mL)，在-30～0℃、静置0～3h，分离得到磷脂的醇溶液，不溶物在相同条件下重复低温结晶萃取1～10次，将所得到的溶液合并，在0～55℃、减压浓缩得到金黄色磷脂，其中PC含量为65％～85％，低碳链醇回收。

3.根据权利要求1所述的磷脂酶水解法制备甘油磷酸胆碱(L-α-GPC)的方法，其特征在于所用原料为粉末磷脂、醇溶磷脂、高纯PC。

4.根据权利要求1所述的磷脂酶水解法制备甘油磷酸胆碱(L-α-GPC)的方法，其特征在于所述的磷脂酶解反应中添加的磷脂酶为磷脂酶A₁、磷脂酶A₂。

5.根据权利要求1所述的磷脂酶水解法制备甘油磷酸胆碱(L-α-GPC)的方法，其特征在于所述的磷脂酶解反应中添加的金属盐离子M为Mg、Ca、Ba、Fe、Mn、Cr、Cu、Zn、Co、Pd。

6.根据权利要求1所述的磷脂酶水解法制备甘油磷酸胆碱(L-α-GPC)的方法，其特征在于所述的磷脂酶解反应中添加的金属盐中的负离子X为F、Cl、Br、I、S。

7.根据权利要求1所述的磷脂酶水解法制备甘油磷酸胆碱(L-α-GPC)的方法，其特征在于所述的磷脂酶解反应中添加的金属卤化物的分子式为M_XN_Y。

8.根据权利要求1所述的磷脂酶水解法制备甘油磷酸胆碱(L-α-GPC)的方法，其特征在于所述的酶解液的脱色剂为活性炭、凹凸棒土等中的一种或多种。

9.根据权利要求1所述的磷脂酶水解法制备甘油磷酸胆碱(L-α-GPC)的方法，其特征在于所述酶解液的树脂纯化用的阳离子树脂为强酸性、弱酸性、大孔吸附阳离子树脂的Na型和H型。

10.根据权利要求1所述的磷脂酶水解法制备甘油磷酸胆碱(L-α-GPC)的方法，其特征在于所述酶解液的树脂纯化用的阴离子树脂为强碱性、弱碱性、大孔吸附性阴离子树脂的Cl型和OH型。

11.根据权利要求2所述的醇溶磷脂的制备，其特征在于所述的醇溶磷脂提取用的低碳链醇为甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、异丁醇、戊醇、己醇或戊醇和己醇的异构体。

12.根据权利要求2所述的低温结晶法制备高纯PC，其特征在于所述的低温结晶醇溶磷脂提取用的低碳链醇为甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、异丁醇、戊醇、己醇或戊醇和己醇的异构体。