JP2869479B2 - 透過型レーザー顕微鏡による特定物質撮像方法 - Google Patents

透過型レーザー顕微鏡による特定物質撮像方法

Info

Publication number
JP2869479B2
JP2869479B2 JP7333136A JP33313695A JP2869479B2 JP 2869479 B2 JP2869479 B2 JP 2869479B2 JP 7333136 A JP7333136 A JP 7333136A JP 33313695 A JP33313695 A JP 33313695A JP 2869479 B2 JP2869479 B2 JP 2869479B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
light
laser
specific substance
wavelength
transmission
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP7333136A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH09179037A (ja
Inventor
博 小池
尚二 鈴木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KOIKE SEIKI KK
Original Assignee
KOIKE SEIKI KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by KOIKE SEIKI KK filed Critical KOIKE SEIKI KK
Priority to JP7333136A priority Critical patent/JP2869479B2/ja
Publication of JPH09179037A publication Critical patent/JPH09179037A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2869479B2 publication Critical patent/JP2869479B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)
  • Facsimile Scanning Arrangements (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、資料からの透過光
像を撮像する透過型レーザー顕微鏡を用いて資料中の特
定物質を撮像する特定物質撮像方法に関する。
【0002】
【従来の技術】従来、資料中に存在する例えば、カルシ
ウム等の特定の物質をレーザー顕微鏡により撮像する際
には、透過型ではなく蛍光型レーザー顕微鏡を使用して
いる。
【0003】この従来の撮像方法は、撮像しようとする
特定の物質とのみ作用する蛍光色素(試薬)で資料を染
色する。この色素は、或る波長の励起光で蛍光を発する
が、特定物質と作用した場合には異なった波長の励起光
で蛍光を発するものが使用されている。そして資料染色
後、特定物質と作用した場合に蛍光を発する波長のレー
ザー光を励起光として資料を走査し、蛍光発光部分の存
在位置を疑似カラーで作り、蛍光に無関係な波長に切り
換えて再度走査し、得られた白黒(濃淡)像に前記疑似
カラー像を重ね合わせて位置、形状、分布等をディスプ
レイ上に表示させるようにしている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】このような従来の方式
では、資料を蛍光色素にて染色する必要があり、その作
業に手間と時間を要するという問題があった。
【0005】また、蛍光型レーザー顕微鏡の場合、発光
する蛍光は励起光の1割弱の強さしかなく、このためレ
ーザー光の出力を大きくする必要があるとともに、受光
素子も感度の高いものが必要になり、高価になるという
問題がある。
【0006】更に、蛍光を発光させる波長の励起光と、
これに無関係な波長のレーザー光とによって2回の走査
が必要になり、得られる二つの画像を合成するためのシ
ステムも必要になりシステムが複雑であるという問題が
あった。
【0007】本発明はこれらの各種問題を解決すること
を目的としてなされたものである。
【0008】
【課題を解決するための手段】上述の如き従来の問題を
解決し、所期の目的を達成するための本発明方法の特徴
は、第1に、光源からのレーザー光を照射側対物レンズ
を通して集光させたレーザースポット光を資料表面側か
ら照射して走査させ、該レーザースポット光の該資料の
裏側への透過光を、前記照射側対物レンズと同等の透過
側対物レンズに通し、該レンズで結像させた位置に設け
た凹面鏡に反射させて逆行させ、その逆行光を受光素子
に受光させるようにしてなる透過型レーザー顕微鏡を使
用し、前記光源からは測定しようとする特定物質の分光
透過率特性における吸収帯域にある波長の第1のレーザ
ー光と、前記吸収帯域外にあって第1のレーザー光に近
い波長の第2のレーザー光とを同時に発光させ、その両
レーザー光の逆行光を別々の受光素子に受光させ、両レ
ーザー光の変化の違いにより特定物質を撮像すること、
第2に、上記各受光素子に受光される第1のレーザー光
の逆行光の変化と、第2のレーザー光の逆行光の変化に
差のない部分と差のある部分とを異なった色、例えば差
のない部分を白黒で、差のある部分をカラーで表示さ
せ、白黒画像中に特定物質部分を類似カラーで表示させ
ること、第3に、上記吸収帯域にある波長を特定物質に
指示薬を作用させることにより得られる波長とし、予め
前記指示薬にて処理した資料を使用することにある。
【0009】
【発明の実施の形態】次に本発明の実施の一形態を図面
について説明する。
【0010】図1は、本発明を実施する装置の光路系を
示しており、図において、1は波長の異なったλ1 ,λ
2 波長の2種類のレーザー光を同時に同軸で発光する光
源であり、2は光源1からの照射光aを透過し、同光軸
を逆行して来る反射光bを反射させる偏光ビームスプリ
ッター、3は光源からの照射光をX方向、Y方向に走査
させるための走査系、4は照射側対物レンズ、5は資料
台に支持させた資料、6は照射側対物レンズと同等の透
過側対物レンズ、7は1/4λ波長板、8は凹面鏡であ
る。
【0011】光源1から発光された照射光aは偏光ビー
ムスプリッター2を透過してX,Y走査系3に到り、こ
こでX方向、Y方向の走査方向に動作される。次いで照
射側対物レンズ4でレーザー光を集束させ、資料5上に
結像させてスポット光によって資料上を走査させる。
尚、資料5の厚さ方向に対する結像位置は資料台を動作
させることにより調節できる。資料台5を透過したレー
ザー光は透過側対物レンズ6を通り、ここで再度集束さ
せて凹面鏡8の表面に結像させ、ここで反射させる。
【0012】反射光(図中点線で示す)は照射光(図中
実線で示す)と同じ経路を逆行し、資料背面側から照射
光の結像位置と同じ位置に結像し、資料5を再度透過し
て偏光ビームスプリッター2に到る。
【0013】偏光ビームスプリッター2では1/4λ波
長板7を2回通過した反射光のみが反射されて直角方向
に曲げられる。この偏光ビームスプリッター2からの反
射光軸上にはダイクロミラー9及びミラー10が置か
れ、ダイクロミラー9によりλ1 波長のレーザー光が反
射されて直角方向に曲げられ、ダイクロミラー9を透過
したλ2 波長のレーザー光がミラー10に反射されて直
角方向に曲げられ、それぞれ、別々の受光素子11,1
2に到る。受光素子11,12はそれぞれ、光電変換し
て電気信号をメモリに送り込むようにしている。尚図に
おいて、13は調整器(増幅器)、14はデータ作成部
(CPU)である。
【0014】次に上述した装置を使用し、薬剤処理を行
ってない生の資料を使用した撮像方法について説明す
る。
【0015】資料としては染色作業や指示薬処理を行わ
ない生のままのものを使用する。光源1から発光させる
二種類の波長のレーザー光は、λ1 として資料中から撮
像させようとする特定物質の分光透過率特性の吸収帯域
にある波長を選択し、λ2 として上記吸収帯域外であっ
てλ1 に近い波長を選択する。
【0016】分光透過率特性の吸収帯はその物質に特有
のものであり、図2に示すように物質に波長を変化させ
て光を透過させると、ある帯域において透過率が低下す
る部分があり、その時の波長域が吸収帯域cであり、こ
の範囲内の波長のものをλ1とする。尚、物質毎にこの
吸収帯域が複数あるが、その選択は資料中に含まれると
思われる他の物質と紛わしくない部分を使用する。
【0017】例えば、特定物質がカリウムである場合は
λ1 として583mμ、λ2 として633mμ、ナトリ
ウムである場合にはλ1 として589mμ、λ2 として
633mμの各波長のレーザー光を使用する。
【0018】このようにして、資料をλ1 、λ2 の両レ
ーザー光で走査すると、1走査線における透過率曲線は
図3のようになる。即ち、λ1 は特定物質の存在する部
分で透過率が低下するとともに、その低下程度が特定物
質の密度や厚さに応じて変化する。一方λ2 は資料全般
の要因によって透過率が変化し、特定物質が存在しない
位置ではλ1 もλ2 と略平行となる。
【0019】各位置におけるλ1 、λ2 の各透過率をT
(λ1 ,X),T(λ2 ,X)で表し、両者の差ΔT=
T(λ2 ,X)−T(λ1 ,X)とし、特定物質のない
部分でΔT=0となるように調整器13(可変増幅器)
により調整しておく。従ってΔT>0の位置には特定物
質が存在することを示し、その濃度、厚さ等によりΔT
の値が変化する。一方、ΔT=0の位置ではλ1 、λ2
とも同じ変化を示し、資料全体の濃度や厚さにより変化
する。
【0020】このようにして得られるλ1 、λ2 のレー
ザー光変化による電気信号をデータ作成部14(CP
U)に送る。データ作成部では、λ2 による透過率T
(λ2 ,X)に対応する明暗度(白黒)をその位置のデ
ータとするが、ΔT>0の位置ではこれに代えてΔTに
比例した濃さの疑似カラー(例えば赤)をデータとすれ
ば1走査線毎に白黒の明暗線をバックグラウンドとし、
特定物質位置では疑似カラーとなる。これを図3のグラ
フに合わせて仮の実数を当てはめて示すと第1表の如く
である。所定数の走査線を並べた1走査面では白黒画像
のバックグラウンドに疑似カラーの特定物質画像が得ら
れる。
【0021】次に資料として指示薬にて処理したものを
使用する場合について説明すると、この場合には、ある
薬剤に特定物質が作用することにより、その薬剤の光吸
収帯が変化することが判明している薬剤を指示薬として
使用するものであり、例えば、カルシウムの指示薬とし
て提供されている米国蛍光研究センター開発の「PDA
A」(PURPURATE−1,1´−DIACETI
C ACID TRIPOTASSIUM SALTの
略)(ORGANIC PREPARATIONS A
ND PROCEDURES INT. 21(4)4
93−500(1989))は、通常の吸収帯波長が4
86mμであり、これとカルシウムとが作用する(カル
シウムイオンと結びつく)と吸収帯が524mμに変化
する。
【0022】そこで「PDAA」を作用させた資料を使
用し、前述したλ1 として524mμ波長のレーザー光
を使用し、λ2 として556mμ波長のレーザー光を使
用して前述と同様に走査することにより、前述と同様に
T(λ1 ,X)及びT(λ2,X)を基にし、T
(λ2 ,X)及びΔTをデータとした画像を得ることが
できる。
【0023】
【発明の効果】上述したように本発明においては、透過
型レーザー顕微鏡を使用し、照射側、透過側の往復工程
において資料を2回透過させたレーザー光の変化を受光
素子にて感知させるものであるため、その変化率が大き
く、従って低出力の光源を使用し、しかも高感度の受光
素子を要することなく、良好な画像を得ることができ
る。
【0024】また、1回の走査で特定物質特有の分光透
過率特性における吸収帯域もしくは指示薬の特定物質が
作用した際の吸収帯にある波長のレーザー光と、これ以
外で近い波長のレーザー光とを使用し、これらの吸収率
変化によって画像用の信号を得るようにすることにより
1回の走査でバックグラウンドと特定物質とを同時に表
示させることができる。
【0025】更に、指示薬を使用しない場合には、染色
等の作業が不要なため、その作業が不要となり、手間と
時間が省かれ、生の資料をそのまま直ちに見ることがで
きる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明に係る装置の一実施形態を示す線図であ
る。
【図2】物質の分光透過特性を示すグラブである。
【図3】本発明方法に係る一実施形態における1走査線
の光透過率を示すグラフである。
【符号の説明】
a 照射光 b 反射光 c 吸収帯域 1 光源 2 ビームスプリッター 3 走査系 4 照射側対物レンズ 5 資料 6 透過側対物レンズ 7 波長板 8 凹面鏡 9 ダイクロミラー 10 ミラー 11,12 受光素子 13 調整器 14 データ作成部
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平3−131811(JP,A) 特開 平3−188408(JP,A) 特開 平4−27909(JP,A) 特開 平5−288992(JP,A) 特許2576021(JP,B2) 特公 平6−82173(JP,B2) 特公 平6−82174(JP,B2) 特表 平5−501458(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) G02B 21/00 - 21/36

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 光源からのレーザー光を照射側対物レン
    ズを通して集光させたレーザースポット光を資料表面側
    から照射して走査させ、該レーザースポット光の該資料
    の裏側への透過光を、前記照射側対物レンズと同等の透
    過側対物レンズに通し、該レンズで結像させた位置に設
    けた凹面鏡に反射させて逆行させ、その逆行光を受光素
    子に受光させるようにしてなる透過型レーザー顕微鏡を
    使用し、前記光源からは測定しようとする特定物質の分
    光透過率特性における吸収帯域にある波長の第1のレー
    ザー光と、前記吸収帯域外にあって第1のレーザー光に
    近い波長の第2のレーザー光とを同時に発光させ、その
    両レーザー光の逆行光を別々の受光素子に受光させ、両
    レーザー光の変化の違いにより特定物質を撮像すること
    を特徴としてなる透過型レーザー顕微鏡による特定物質
    撮像方法。
  2. 【請求項2】 各受光素子に受光される第1のレーザー
    光の逆行光の変化と、第2のレーザー光の逆行光の変化
    に差のない部分と差のある部分とを異なった色で表示さ
    せる請求項1に記載の透過型レーザー顕微鏡による特定
    物質撮像方法。
  3. 【請求項3】 吸収帯域にある波長を特定物質に指示薬
    を作用させることにより得られる波長とし、予め前記指
    示薬にて処理した資料を使用する請求項1ももしくは2
    に記載の透過型レーザー顕微鏡による特定物質撮像方
    法。
JP7333136A 1995-12-21 1995-12-21 透過型レーザー顕微鏡による特定物質撮像方法 Expired - Fee Related JP2869479B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP7333136A JP2869479B2 (ja) 1995-12-21 1995-12-21 透過型レーザー顕微鏡による特定物質撮像方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP7333136A JP2869479B2 (ja) 1995-12-21 1995-12-21 透過型レーザー顕微鏡による特定物質撮像方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH09179037A JPH09179037A (ja) 1997-07-11
JP2869479B2 true JP2869479B2 (ja) 1999-03-10

Family

ID=18262703

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7333136A Expired - Fee Related JP2869479B2 (ja) 1995-12-21 1995-12-21 透過型レーザー顕微鏡による特定物質撮像方法

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2869479B2 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19942998B4 (de) * 1999-09-09 2012-02-09 Carl Zeiss Jena Gmbh Mikroskop zur Auf- und Durchlichtmikroskopie
JP5051699B2 (ja) * 2007-05-29 2012-10-17 株式会社リコー レーザ顕微鏡
JP4236123B1 (ja) 2008-04-21 2009-03-11 株式会社林創研 三次元画像取得装置
US8384905B2 (en) * 2009-11-10 2013-02-26 Corning Incorporated Tunable light source for label-independent optical reader

Also Published As

Publication number Publication date
JPH09179037A (ja) 1997-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7424286B2 (ja) 蛍光観察装置及び蛍光観察方法
US4284897A (en) Fluorescence determining microscope utilizing laser light
US7274446B2 (en) Method and arrangement for the deep resolved optical recording of a sample
US7999935B2 (en) Laser microscope with a physically separating beam splitter
EP1650554A2 (en) Biochip reader
JP2000056244A (ja) レ―ザ走査顕微鏡および照明およびまたは検出装置
US20020109840A1 (en) Method for the detection of dyes in fluorescence microscopy
JP3292935B2 (ja) 蛍光分光画像計測装置
JP2006119152A (ja) 照明された試料の波長依存特性把握のための方法および装置
US6248995B1 (en) Confocal microscopic equipment
JP2006512575A (ja) 分析装置および分析方法
US7139073B1 (en) Imaging apparatus
JP2003057554A (ja) レーザ顕微鏡
JP2869479B2 (ja) 透過型レーザー顕微鏡による特定物質撮像方法
JP2001356272A (ja) 画像取得方法及び走査型光学顕微鏡
EP1157268B1 (en) Imaging system for an optical scanner
US20060126170A1 (en) Microscope apparatus, sensitivity setting method for photo detector, control unit, and storage medium
JP3326881B2 (ja) 走査型光学顕微鏡
US7596454B2 (en) Method for separating detection channels of a microscope system
JP2907571B2 (ja) レーザ走査型蛍光顕微鏡
JP2004333579A (ja) レーザ走査顕微鏡
Awamura et al. Color laser microscope
US6632401B1 (en) Device for the detection of a fluorescent dye
JP2002287034A (ja) 走査型光学顕微鏡
JP3539436B2 (ja) 走査型レーザ顕微鏡装置

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090108

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100108

Year of fee payment: 11

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees