JP2787098B2 - 血清又は血液中の物質を妨害除去下に診断検出する方法 - Google Patents
血清又は血液中の物質を妨害除去下に診断検出する方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、キメラモノクロナール抗体又はそのフラグ
メントを診断試験に使用することに関する。
メントを診断試験に使用することに関する。
従来の技術 臨床上の診断において、モノクロナール抗体を製造す
るハイブリドーマ技術が開発されて以来、該抗体は広く
免疫測定に使われている。この際にたいていの場合、モ
ノクロナール抗体はマウス細胞系で製造し、それ故抗原
特異照な超可変領域は別としてマウス特異性領域だけを
有する。このようなマウスからのモノクロナール抗体を
免疫測定に、例えばRIA,IRMA,IEMAに使用する。所謂
“サンドウイツチ”アツセイ、例えばELISA法（enzyme
−linked immunosorbentassay）では診断する際にヒト
の血液又は血清中に含まれる物質を、一方が固相に固定
されておりかつ第２のものが標識を有する２種の抗体を
介して検出する。通常、標識は酵素標識であり、これに
より検出のために呈色反応を惹起させることができる。
るハイブリドーマ技術が開発されて以来、該抗体は広く
免疫測定に使われている。この際にたいていの場合、モ
ノクロナール抗体はマウス細胞系で製造し、それ故抗原
特異照な超可変領域は別としてマウス特異性領域だけを
有する。このようなマウスからのモノクロナール抗体を
免疫測定に、例えばRIA,IRMA,IEMAに使用する。所謂
“サンドウイツチ”アツセイ、例えばELISA法（enzyme
−linked immunosorbentassay）では診断する際にヒト
の血液又は血清中に含まれる物質を、一方が固相に固定
されておりかつ第２のものが標識を有する２種の抗体を
介して検出する。通常、標識は酵素標識であり、これに
より検出のために呈色反応を惹起させることができる。
しかしながらここ数年このような診断検出をする際に
特定の患者では法外に高い偽値が頻繁に確認された。こ
の法外に高い数値は、２つの事情、つまり ａ） ２つの抗体、即ち壁に固定した抗体とシグナル担
持抗体とを抗原により架橋することをベースとする“サ
ンドウイツチ”試験の構想及び ｂ） 患者の血清中で所謂異好性抗体又は抗−マウス−
抗体の形成 が重なる場合に認められる。
特定の患者では法外に高い偽値が頻繁に確認された。こ
の法外に高い数値は、２つの事情、つまり ａ） ２つの抗体、即ち壁に固定した抗体とシグナル担
持抗体とを抗原により架橋することをベースとする“サ
ンドウイツチ”試験の構想及び ｂ） 患者の血清中で所謂異好性抗体又は抗−マウス−
抗体の形成 が重なる場合に認められる。
ヒト異好性抗体は異なる動物種のIgGに対し、とりわ
けマウスのIgGに対して作用し、それ故一般に試験抗体
が関係している。しかし異好性抗体はしばしばラツト、
牛、羊、馬、モルモツト又はサルのIgG、または犬、ネ
コ又はイエウサギのIgGとの交叉反応も呈する。この原
因は種々のIgG分子のＦ（ab′）２フラグメント〔Bosca
to及びStuart共著、Clin.Chem.32巻、1491〜1495頁（19
88年）〕又はFc部分〔Clark及びPrince共著、Clin.Che
m.,33巻、414頁（1987年）〕中の共通のエピトープであ
るように思われる。
けマウスのIgGに対して作用し、それ故一般に試験抗体
が関係している。しかし異好性抗体はしばしばラツト、
牛、羊、馬、モルモツト又はサルのIgG、または犬、ネ
コ又はイエウサギのIgGとの交叉反応も呈する。この原
因は種々のIgG分子のＦ（ab′）２フラグメント〔Bosca
to及びStuart共著、Clin.Chem.32巻、1491〜1495頁（19
88年）〕又はFc部分〔Clark及びPrince共著、Clin.Che
m.,33巻、414頁（1987年）〕中の共通のエピトープであ
るように思われる。
このような異好性抗体はヒトに広く分布しており、恐
らく動物生産物との関わりにより又はその注入により形
成された。人体中での抗−マウス−抗体の発生の原因も
主にそれに帰せられる。
らく動物生産物との関わりにより又はその注入により形
成された。人体中での抗−マウス−抗体の発生の原因も
主にそれに帰せられる。
“サンドウイツチ”アツセイでは、多価異好性抗体又
は抗−マウス−抗体がモノクロナール抗体に、抗原が存
在しなくとも結合することにより検出抗体と固相抗体と
の架橋が惹起され、それ故誤つた試験シグナルが誘発さ
れ、かつ他方では試験抗体の正しい抗原結合が立体的に
阻害される。
は抗−マウス−抗体がモノクロナール抗体に、抗原が存
在しなくとも結合することにより検出抗体と固相抗体と
の架橋が惹起され、それ故誤つた試験シグナルが誘発さ
れ、かつ他方では試験抗体の正しい抗原結合が立体的に
阻害される。
それ故、“サンドウイツチ”イムノアツセイにおける
このような試験の妨害を回避するために、異なる種、例
えばマウス又はラツトのモノクロナール抗体を使用する
ことが提案された〔Boscato及びStuart共著、Clin.Che
m.,43巻、27〜33頁（1988年）〕。しかしこの方法では
前記の課題を解決することはできない。それというのも
既に記載したように、ヒト異好性抗体はいろいろな動物
種のIgGに対して作用するからである。多数の患者の異
好性抗体はマウスIgGとも、またラツトIgGとも反応す
る。現在多高い効率を有するモノクロナール抗体はマウ
ス及びラツトからしか得られないので、自ずから制限さ
れたものとなつている。
このような試験の妨害を回避するために、異なる種、例
えばマウス又はラツトのモノクロナール抗体を使用する
ことが提案された〔Boscato及びStuart共著、Clin.Che
m.,43巻、27〜33頁（1988年）〕。しかしこの方法では
前記の課題を解決することはできない。それというのも
既に記載したように、ヒト異好性抗体はいろいろな動物
種のIgGに対して作用するからである。多数の患者の異
好性抗体はマウスIgGとも、またラツトIgGとも反応す
る。現在多高い効率を有するモノクロナール抗体はマウ
ス及びラツトからしか得られないので、自ずから制限さ
れたものとなつている。
更に、異好性抗体を含有する血清を試験する際に試験
結果に誤差のないようにするために、モノクロナール試
験抗体が由来している種の非イムン（Nicht−Immun）Ig
Gの添加により患者の抗体を飽和することが提案された
（Boscato及びStuartにより）。しかしこのように多量
のマウス抗体を用意することは問題が多く、高価であり
かつ明らかに所望の結果をもたらさない。
結果に誤差のないようにするために、モノクロナール試
験抗体が由来している種の非イムン（Nicht−Immun）Ig
Gの添加により患者の抗体を飽和することが提案された
（Boscato及びStuartにより）。しかしこのように多量
のマウス抗体を用意することは問題が多く、高価であり
かつ明らかに所望の結果をもたらさない。
血清中に含まれる異好性抗体をポリエチレングリコー
ル沈殿により除去することが提案された〔Kahn及びその
他共著、J.Cjin.Endocrin.Metabolism.,66巻、526〜533
頁（1998年）〕。しかしこれもまた経費がかかり、抗原
試験に適用できるだけで、抗体試験には適用できない。
更に、同じ文献に、診断に使用する抗体をヨード化し
て、ヒト抗−マウス−抗体がそれをもはや認識できない
ようにすることが提案されている。しかしこの方法もま
た莫大な経費を必要とし、いずれにせよ抗体の活性損失
をもたらす。
ル沈殿により除去することが提案された〔Kahn及びその
他共著、J.Cjin.Endocrin.Metabolism.,66巻、526〜533
頁（1998年）〕。しかしこれもまた経費がかかり、抗原
試験に適用できるだけで、抗体試験には適用できない。
更に、同じ文献に、診断に使用する抗体をヨード化し
て、ヒト抗−マウス−抗体がそれをもはや認識できない
ようにすることが提案されている。しかしこの方法もま
た莫大な経費を必要とし、いずれにせよ抗体の活性損失
をもたらす。
異好性抗体を抗−ヒト−イムノグロブリン又はプロテ
インＡで除去するという他の提案〔Clin.Chem.,34巻、2
61〜264頁（1988年）〕もまた慣用的な測定には経費が
かかり、かつまた抗原試験にのみ好適で、抗体試験に好
適ではない。
インＡで除去するという他の提案〔Clin.Chem.,34巻、2
61〜264頁（1988年）〕もまた慣用的な測定には経費が
かかり、かつまた抗原試験にのみ好適で、抗体試験に好
適ではない。
発明が解決しようとする課題 それ故、本発明は、患者血清中の異好性抗体の妨害作
用を除きかつ患者血清中の物質である抗原並びに抗体を
妨害されずに定量することを可能にするという課題をベ
ースとする。
用を除きかつ患者血清中の物質である抗原並びに抗体を
妨害されずに定量することを可能にするという課題をベ
ースとする。
課題を解決するための手段 本発明によりこの課題は、ヒト抗体の可変領域の全部
又は一部が、所望の特異性を有するヒト以外のモノクロ
ナール抗体の相応する部分により置換されている前記ヒ
ト抗体より成るキメラモノクロナール抗体又はそのフラ
グメントを患者の血液又は血清中の癌胎児性抗原（CEA;
Cartinoembryonic Antigen）以外の物質の定量的免疫
学的測定に使用することにより解決される。
又は一部が、所望の特異性を有するヒト以外のモノクロ
ナール抗体の相応する部分により置換されている前記ヒ
ト抗体より成るキメラモノクロナール抗体又はそのフラ
グメントを患者の血液又は血清中の癌胎児性抗原（CEA;
Cartinoembryonic Antigen）以外の物質の定量的免疫
学的測定に使用することにより解決される。
キメラ抗体として、ヒト抗体の可変領域（VH及びVL）
をヒト以外のモノクロナール抗体（例えばラツト又は有
利にはマウスから）の相応する領域で置換した前記のヒ
ト抗体を使用すると有利である。モノクロナールヒト抗
体を使用すると特に優れている。キメラ抗体として、VH
及びVLからの超可変領域を一部又は特に有利に完全に、
ヒト以外のモノクロナール抗体（例えばラツト及び有利
にはマウス）の相応する領域で置換した抗体〔リシエイ
プド（reshaped）抗体〕を使用するのも優れている。従
つて、このような優れた抗体はヒト抗体のFc部、Fab部
の定常領域及び可変領域のフレームワーク領域（framew
ork−Bereich）を含有する。“フレームワーク領域”と
は、３個の超可変領域を包囲するかもしくはそれらの間
に存在する、抗体２つの重鎖及び軽鎖のそれぞれ４個の
領域である。このようなキメラ抗体の構成は例えばVerh
oeyen及びRiechmann共著、“バイオアツセイ（Bioassa
y）”、８巻、74〜78頁（1988年）に記載されている。
本発明でキメラ抗体又はそのフラグメントを使用するこ
とにより、試験抗体と異好性抗体との相互作用の危険は
ほとんど回避される。本発明方法はモノクロナール抗体
を使用するすべての測定法、例えば同様に異好性抗体又
は−マウス−抗体により試験結果が誤る恐れのあるRIA
にも利用することができる。しかし本発明はIRMA及びIE
MAのような“サンドウイツチ”法に特に重要かつ好適で
ある。
をヒト以外のモノクロナール抗体（例えばラツト又は有
利にはマウスから）の相応する領域で置換した前記のヒ
ト抗体を使用すると有利である。モノクロナールヒト抗
体を使用すると特に優れている。キメラ抗体として、VH
及びVLからの超可変領域を一部又は特に有利に完全に、
ヒト以外のモノクロナール抗体（例えばラツト及び有利
にはマウス）の相応する領域で置換した抗体〔リシエイ
プド（reshaped）抗体〕を使用するのも優れている。従
つて、このような優れた抗体はヒト抗体のFc部、Fab部
の定常領域及び可変領域のフレームワーク領域（framew
ork−Bereich）を含有する。“フレームワーク領域”と
は、３個の超可変領域を包囲するかもしくはそれらの間
に存在する、抗体２つの重鎖及び軽鎖のそれぞれ４個の
領域である。このようなキメラ抗体の構成は例えばVerh
oeyen及びRiechmann共著、“バイオアツセイ（Bioassa
y）”、８巻、74〜78頁（1988年）に記載されている。
本発明でキメラ抗体又はそのフラグメントを使用するこ
とにより、試験抗体と異好性抗体との相互作用の危険は
ほとんど回避される。本発明方法はモノクロナール抗体
を使用するすべての測定法、例えば同様に異好性抗体又
は−マウス−抗体により試験結果が誤る恐れのあるRIA
にも利用することができる。しかし本発明はIRMA及びIE
MAのような“サンドウイツチ”法に特に重要かつ好適で
ある。
可変領域が換えられているキメラ抗体の製法は文献
〔例えばBrggemann及びその共著、（1987）,J.Exp.Me
d.166巻、1351〜1361頁、Liu及びその共著、（1987）Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA84巻、3439〜3443頁、Whittle及
びその他共著、Protein Engineering,1巻（1987）,499
〜505頁、Nature,314巻（1985）452〜454,J.Immunol.,1
37巻（1986）1066−1074頁、Gene54巻（1987）33−40
頁、及びPCT86/01533並びにヨーロツパ公開特許第02394
00号明細書〕に記載されており、当業者は特別な試験に
必要な条件に相応して変更することができる。キメラ抗
−TSH−抗体（MAK＜TSH＞）の若干変更した製法は実施
例に記載する。
〔例えばBrggemann及びその共著、（1987）,J.Exp.Me
d.166巻、1351〜1361頁、Liu及びその共著、（1987）Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA84巻、3439〜3443頁、Whittle及
びその他共著、Protein Engineering,1巻（1987）,499
〜505頁、Nature,314巻（1985）452〜454,J.Immunol.,1
37巻（1986）1066−1074頁、Gene54巻（1987）33−40
頁、及びPCT86/01533並びにヨーロツパ公開特許第02394
00号明細書〕に記載されており、当業者は特別な試験に
必要な条件に相応して変更することができる。キメラ抗
−TSH−抗体（MAK＜TSH＞）の若干変更した製法は実施
例に記載する。
超可変領域だけが変換されているキメラ抗体（リシエ
イプド抗体）の製法は“ネイチヤー（Nature）",321巻
（1986年）、522〜525頁及び“ネイチヤー”、332巻（1
988年）、323〜327頁に記載されている。抗体のフラグ
メントの製法は公知方法〔例えばJohnstone及びThorpe
共著、Immunochemistryin Practice,Blackwell Scienti
fic（1982年）52〜53頁〕で行なうことができる。
イプド抗体）の製法は“ネイチヤー（Nature）",321巻
（1986年）、522〜525頁及び“ネイチヤー”、332巻（1
988年）、323〜327頁に記載されている。抗体のフラグ
メントの製法は公知方法〔例えばJohnstone及びThorpe
共著、Immunochemistryin Practice,Blackwell Scienti
fic（1982年）52〜53頁〕で行なうことができる。
本発明の優れた実施形では診断のための“サンドウイ
ツチ”イムノアツセイにおいて少なくとも１個のキメラ
モノクロナール抗体は又はそのフラグメントを使用す
る。これにより両方の試験抗体の架橋は回避される。そ
れというのもせいぜい非キメラ抗体が異好性抗体又はマ
ウス抗体と結合し得るだけであり、しかし架橋には両方
の試験抗体の結合が必要だからである。しかしながらた
いていの場合、とりわけ患者血清中に異好性抗体が比較
的高い割合で存在する場合、免疫試験においてとりわけ
交叉反応を回避するためにキメラ抗体だけを使用すると
有利である。
ツチ”イムノアツセイにおいて少なくとも１個のキメラ
モノクロナール抗体は又はそのフラグメントを使用す
る。これにより両方の試験抗体の架橋は回避される。そ
れというのもせいぜい非キメラ抗体が異好性抗体又はマ
ウス抗体と結合し得るだけであり、しかし架橋には両方
の試験抗体の結合が必要だからである。しかしながらた
いていの場合、とりわけ患者血清中に異好性抗体が比較
的高い割合で存在する場合、免疫試験においてとりわけ
交叉反応を回避するためにキメラ抗体だけを使用すると
有利である。
優れた実施形では、キメラモノクロナール抗体を使用
する診断試験はELISA（Enzyme Linked Immunosorbent A
ssay）である。
する診断試験はELISA（Enzyme Linked Immunosorbent A
ssay）である。
たいていの場合、異好性抗体はモノクロナール抗体の
Fc部分に結合するが、あらゆる可能な相互作用を回避す
るために、ヒトモノクロナール抗体の可変領域又は超可
変領域が所望の特異性のモノクロナールマウス抗体の相
応する部分に置換されているキメラ抗体を使用すると優
れている。これにより、交叉反応性を優するヒト抗−マ
ウス−抗体もしくは異好性抗体との相互作用は回避され
る。
Fc部分に結合するが、あらゆる可能な相互作用を回避す
るために、ヒトモノクロナール抗体の可変領域又は超可
変領域が所望の特異性のモノクロナールマウス抗体の相
応する部分に置換されているキメラ抗体を使用すると優
れている。これにより、交叉反応性を優するヒト抗−マ
ウス−抗体もしくは異好性抗体との相互作用は回避され
る。
本発明の優れた実施形では、患者血清中の甲状腺刺激
ホルモン（TSH）を検出するためにELISA試験法によりキ
メラ抗−TSH−抗体又はそのフラグメントを使用する。
このために、クローン化した抗−TSH−MAK−cDNAから、
レセプターとしての２つのマウス免疫グロブリン遺伝子
及びそれぞれ１個のヒトκ−ないしγ１遺伝子の定常領
域により軽鎖及び重鎖のための２つの完全なキメラ遺伝
子を再構成し、これらの発現ベクター中に導入し（例
１）かつ好適な宿主細胞中で発現させた。キメラ抗体は
細胞培地から公知方法により単離した。
ホルモン（TSH）を検出するためにELISA試験法によりキ
メラ抗−TSH−抗体又はそのフラグメントを使用する。
このために、クローン化した抗−TSH−MAK−cDNAから、
レセプターとしての２つのマウス免疫グロブリン遺伝子
及びそれぞれ１個のヒトκ−ないしγ１遺伝子の定常領
域により軽鎖及び重鎖のための２つの完全なキメラ遺伝
子を再構成し、これらの発現ベクター中に導入し（例
１）かつ好適な宿主細胞中で発現させた。キメラ抗体は
細胞培地から公知方法により単離した。
それ故、本発明により、殊に“サンドウイツチ”アツ
セイ法で患者の血清又は血液中の異好性抗体又は抗−マ
ウス−抗体が原因となる、マウスからのモノクロナール
抗体を使用する診断用イムノアツセイの法外に高い試験
結果を回避することができる。
セイ法で患者の血清又は血液中の異好性抗体又は抗−マ
ウス−抗体が原因となる、マウスからのモノクロナール
抗体を使用する診断用イムノアツセイの法外に高い試験
結果を回避することができる。
それ故、本発明の目的は、患者の血清又は血液中の物
質に対して作用する、第一の抗体R1が固相に結合可能で
あるか又は既に結合しておりかつ第２の抗体R2が標識を
有するこの２種の抗体R1及びR2を結合させ、場合により
抗体R1を固相に結合させ、形成されたR1、物質及びR2よ
り成る固相結合の複合体を分離しかつ抗体R2の標識を検
出することにより血清又は血液中の物質を診断検出する
方法であり、その際に少なくとも抗体R1又はR2の一方と
して、キメラモノクロナール抗体又はそのフラグメント
を使用する。
質に対して作用する、第一の抗体R1が固相に結合可能で
あるか又は既に結合しておりかつ第２の抗体R2が標識を
有するこの２種の抗体R1及びR2を結合させ、場合により
抗体R1を固相に結合させ、形成されたR1、物質及びR2よ
り成る固相結合の複合体を分離しかつ抗体R2の標識を検
出することにより血清又は血液中の物質を診断検出する
方法であり、その際に少なくとも抗体R1又はR2の一方と
して、キメラモノクロナール抗体又はそのフラグメント
を使用する。
本発明の範囲において“固相に結合可能”とは抗体R1
が例えばR1のFc部分に対して作用する固相結合の第３抗
体、又はR1に結合したビオチン分子と固相結合のストレ
プタビジンのような付加的な成分を介して固相に結合可
能であるとも理解すると有利である。
が例えばR1のFc部分に対して作用する固相結合の第３抗
体、又はR1に結合したビオチン分子と固相結合のストレ
プタビジンのような付加的な成分を介して固相に結合可
能であるとも理解すると有利である。
この際に例えば次のような試験法の別法がある： ａ） 抗体に対するキメラヒト抗体のFc部分を結合す
る、ヒト抗体のFcフラグメントに対する固相結合の抗体
の使用及び同様に抗原に対する、例えばペルオキシダー
ゼ標識した第２抗体を介して複合体の標識； ｂ） 固相結合のストレプタビジン、ビオチン化した、
抗原に対するキメラ抗体並びに同様に抗原に対して作用
する標識第２抗体の使用； ｃ） マウス抗体のFcγ部分に対する固相結合の抗体、
それと結合可能な、抗原に対して作用するマウス抗体及
び抗原に対して作用する標識キメラ抗体の使用； ｄ） 固相結合のストレプタビジン、ビオチン化した抗
原に対して作用するマウス抗体及び同様に抗原に対して
作用する標識キメラ抗体の使用； ｅ） 抗原に対して作用する、固相結合のキメラ抗体及
び同様に抗原に対して作用する標識マウス抗体の使用；
又は ｆ） 抗原に対して作用する固相結合のマウス応対及び
同様に抗原に対して作用する標識キメラ抗体の使用。
る、ヒト抗体のFcフラグメントに対する固相結合の抗体
の使用及び同様に抗原に対する、例えばペルオキシダー
ゼ標識した第２抗体を介して複合体の標識； ｂ） 固相結合のストレプタビジン、ビオチン化した、
抗原に対するキメラ抗体並びに同様に抗原に対して作用
する標識第２抗体の使用； ｃ） マウス抗体のFcγ部分に対する固相結合の抗体、
それと結合可能な、抗原に対して作用するマウス抗体及
び抗原に対して作用する標識キメラ抗体の使用； ｄ） 固相結合のストレプタビジン、ビオチン化した抗
原に対して作用するマウス抗体及び同様に抗原に対して
作用する標識キメラ抗体の使用； ｅ） 抗原に対して作用する、固相結合のキメラ抗体及
び同様に抗原に対して作用する標識マウス抗体の使用；
又は ｆ） 抗原に対して作用する固相結合のマウス応対及び
同様に抗原に対して作用する標識キメラ抗体の使用。
本発明方法において抗体の標識は放射性標識でも、ま
た他の標識法、例えば酵素標識でもよい。本発明で酵素
標識を使用すると優れており、これは酵素により惹起さ
れた呈色反応を介して検出する。
た他の標識法、例えば酵素標識でもよい。本発明で酵素
標識を使用すると優れており、これは酵素により惹起さ
れた呈色反応を介して検出する。
標識は間接的にその都度の抗体に結合しているビオチ
ンを介して及びストレプタビジンと結合した標識、例え
ばペルオキシダーゼを介して行なうこともできる。固相
としては、例えば反応容器の壁が該当する。
ンを介して及びストレプタビジンと結合した標識、例え
ばペルオキシダーゼを介して行なうこともできる。固相
としては、例えば反応容器の壁が該当する。
前記のすべての別法に抗体全体を使用する代りに該抗
体の一定のフラグメントだけを使用することもできるこ
とは明らかでありかつそれは本発明の実施形である。
体の一定のフラグメントだけを使用することもできるこ
とは明らかでありかつそれは本発明の実施形である。
本発明方法の優れた実施形ではキメラモノクロナール
抗体２種を使用する。これにより、とりわけ異好性抗体
が高濃度で存在する場合に試験結果の正確さが更に高ま
る。
抗体２種を使用する。これにより、とりわけ異好性抗体
が高濃度で存在する場合に試験結果の正確さが更に高ま
る。
キメラモノクロナール抗体を使用する本発明方法は、
抗体と検出すべき物質とからのサンドウイツチの形成を
ベースとするものではない例えばRIAのような診断試験
にも適用することができる。それというのもこのような
試験でも異好性抗体の存在による試験結果の誤差が懸念
されるからである。しかし特に“サンドウイツチ”イム
ノアツセイにとつて重要である。
抗体と検出すべき物質とからのサンドウイツチの形成を
ベースとするものではない例えばRIAのような診断試験
にも適用することができる。それというのもこのような
試験でも異好性抗体の存在による試験結果の誤差が懸念
されるからである。しかし特に“サンドウイツチ”イム
ノアツセイにとつて重要である。
モノクロナール抗体の製造は既に記載した公知方法に
より実施することができる。
より実施することができる。
本発明により、患者の血清又は血液中の異好性抗体又
は抗−マウス−抗体が惹き起こす診断結果の妨害を簡単
にかつ有効に回避することができる。技術水準で提案さ
れたような、モノクロナール抗体が取得された種の非特
異的非イムンIgGの添加の必要性もしくは異好性抗体又
は抗−マウス−抗体の経費のかかる沈殿は本発明により
回避され、明らかに高まつた試験結果の精度が達成され
る。
は抗−マウス−抗体が惹き起こす診断結果の妨害を簡単
にかつ有効に回避することができる。技術水準で提案さ
れたような、モノクロナール抗体が取得された種の非特
異的非イムンIgGの添加の必要性もしくは異好性抗体又
は抗−マウス−抗体の経費のかかる沈殿は本発明により
回避され、明らかに高まつた試験結果の精度が達成され
る。
実施例 次に本発明を添付図面につき実施例により詳説する。
例 １ TSHに対するキメラ抗体の製造（キメラモノクロナール
抗体、キメラ抗−TSH−MAK） ａ） ベクターp11196（第５図）の構成 抗イデイオタイプMAK A2044〔F.Sablitzky及びその他
共著、EMBO J.,4巻、345〜350頁（1985年）〕のＫ遺伝
子からの1.8kbのXba Iフラグメントを末端でDNA−ポリ
メラーゼＩ−クレノウフラグメントをフイリングし（au
ffllen）,Not Iリンカー（５′GCGGCCGC3′）を挿入
し、かつ末端が同様にフイリングされかつNot Iリンカ
ーが挿入されているDra II/Pvu II切断pUC18〔Yanisch
−Perron,C,G.Vieira及びG.Messing共著、Gene33巻、10
3〜119頁（1985年）〕中でクローン化した〔T.Maniati
s,E,F.Ffitsch及びJ.Sambrook共著、Molecular Cloning
−A Laboratory Manual（1982）,Cold Spring Harbor L
aboratory〕。
抗体、キメラ抗−TSH−MAK） ａ） ベクターp11196（第５図）の構成 抗イデイオタイプMAK A2044〔F.Sablitzky及びその他
共著、EMBO J.,4巻、345〜350頁（1985年）〕のＫ遺伝
子からの1.8kbのXba Iフラグメントを末端でDNA−ポリ
メラーゼＩ−クレノウフラグメントをフイリングし（au
ffllen）,Not Iリンカー（５′GCGGCCGC3′）を挿入
し、かつ末端が同様にフイリングされかつNot Iリンカ
ーが挿入されているDra II/Pvu II切断pUC18〔Yanisch
−Perron,C,G.Vieira及びG.Messing共著、Gene33巻、10
3〜119頁（1985年）〕中でクローン化した〔T.Maniati
s,E,F.Ffitsch及びJ.Sambrook共著、Molecular Cloning
−A Laboratory Manual（1982）,Cold Spring Harbor L
aboratory〕。
第５図はベクターp11196の図であり、前記のようにpU
Cベクター〔C.Yanisch−Perron及びその他共著、Gene,3
3巻、103〜119頁（1985年）;pUC18のヌクレオチド位630
〜2675）をベースとして構成した。Not Iフラグメント は機能的に転位された、マウスのＫ遺伝子のＶ領域を有
する。突然変異（ヌクレオチド位６もしくは312）によ
り、Ｖ領域の初めにEcoR V及びＪ領域の終りにXho I切
断部位が導入された。
Cベクター〔C.Yanisch−Perron及びその他共著、Gene,3
3巻、103〜119頁（1985年）;pUC18のヌクレオチド位630
〜2675）をベースとして構成した。Not Iフラグメント は機能的に転位された、マウスのＫ遺伝子のＶ領域を有
する。突然変異（ヌクレオチド位６もしくは312）によ
り、Ｖ領域の初めにEcoR V及びＪ領域の終りにXho I切
断部位が導入された。
ｂ） ベクターp11197（第６図）の構成 抗イデイオタイプMAK A 2044〔F.Sablitzky及びその
共著、EMBO J.4巻、345〜350頁（1985年）〕のγ１遺伝
子からの1kbのEco RI/Hind IIIフラグメントを末端でフ
イリングし、Not Iリンカーを挿入しかつDra II/Pvu II
切断されかつ同様に処理したベクターpUC18〔Yanisch−
Perron,C,G.Vieira及びG.Messing共著、Gene,33巻、103
〜119頁（1985年）〕中にクローン化した。
共著、EMBO J.4巻、345〜350頁（1985年）〕のγ１遺伝
子からの1kbのEco RI/Hind IIIフラグメントを末端でフ
イリングし、Not Iリンカーを挿入しかつDra II/Pvu II
切断されかつ同様に処理したベクターpUC18〔Yanisch−
Perron,C,G.Vieira及びG.Messing共著、Gene,33巻、103
〜119頁（1985年）〕中にクローン化した。
第６図はベクターp11197の図であり、このベクターは
前記のようにpUCベクター〔C.Yanisch−Perron及びその
他共著、Gene,33巻、103〜119頁（1985年）;pUC18のヌ
クレオチド位630〜2675）をベースとして構成した。Not
Iフラグメント は機能的に転位したマウスのγ１遺伝子のVDJ領域を有
する。
前記のようにpUCベクター〔C.Yanisch−Perron及びその
他共著、Gene,33巻、103〜119頁（1985年）;pUC18のヌ
クレオチド位630〜2675）をベースとして構成した。Not
Iフラグメント は機能的に転位したマウスのγ１遺伝子のVDJ領域を有
する。
ｃ） オリゴヌクレオチド方向付け突然変異 第１図のDNA配列中に１位にオリゴヌクレオチドＩを
用いてEcoR V切断位を及び325位（オリゴヌクレオチドI
I）にXho I切断部位を挿入した。オリゴヌクレオチドＩ
のヌクレオチド１〜９は第１図には含まれていない抗−
TSH−MAKのκ鎖のリーダーペプチド領域と相同性であ
る。第１図はMAKの成熟κ鎖を示す。第２図のDNA配列中
の７位（オリゴヌクレオチドIII）にPvu II切断位を及
び344位（オリゴヌクレオチドIV）にPst I切断位を挿入
した。p11196中のMAK A2044〔F.Sablitzky及びその他共
著、EMBOJ.,4巻、345〜350頁（1985）〕のＫ遺伝子のVJ
領域の配列において１位（オリゴヌクレオチドＶ）にEc
oRV切断位を及び310位（オリゴヌクレオチドVI）にXho
I切断位を挿入した（第５図）。すべての突然変異は
“ギヤツプド・ジユプレツクス”法（gapped−duplex−
Method）〔Inouye及びその他共著、Synth.Appl.DNA RN
A,181〜206頁（1987年）、編集者S.A.Narang,Academic
press〕によりプラスミドDNAから出発して実施した。
用いてEcoR V切断位を及び325位（オリゴヌクレオチドI
I）にXho I切断部位を挿入した。オリゴヌクレオチドＩ
のヌクレオチド１〜９は第１図には含まれていない抗−
TSH−MAKのκ鎖のリーダーペプチド領域と相同性であ
る。第１図はMAKの成熟κ鎖を示す。第２図のDNA配列中
の７位（オリゴヌクレオチドIII）にPvu II切断位を及
び344位（オリゴヌクレオチドIV）にPst I切断位を挿入
した。p11196中のMAK A2044〔F.Sablitzky及びその他共
著、EMBOJ.,4巻、345〜350頁（1985）〕のＫ遺伝子のVJ
領域の配列において１位（オリゴヌクレオチドＶ）にEc
oRV切断位を及び310位（オリゴヌクレオチドVI）にXho
I切断位を挿入した（第５図）。すべての突然変異は
“ギヤツプド・ジユプレツクス”法（gapped−duplex−
Method）〔Inouye及びその他共著、Synth.Appl.DNA RN
A,181〜206頁（1987年）、編集者S.A.Narang,Academic
press〕によりプラスミドDNAから出発して実施した。
使つたオリゴヌクレオチド ｄ） ベクターp10195（第７図）の構成 Eco RI及びBam HIで切断したプラスミドpSV2neo〔R.
C.Mulligan,p.Berg共著、Proc.Nat.Acad,Sci.VSA,78
巻、2072〜2076頁（1981年）〕中に、MAK A 2044のＫ遺
伝子のエンハンサー領域〔Nature,307巻、80〜82頁（19
84年）〕を含有する2kbのEcoR I/Asp700−フラグメント
（Asp700はリンカーによりBam HIに移転）をクローン化
した。生成プラスミドのBam HI切断位中に末端のフイリ
ング後、ヒトＫ遺伝子の定常領域を含有するpC1〔H.G.K
lobeck及びその他共著、Nucl.Acids Res.,12巻、6995〜
7006頁（1984年）〕からの2.8kbのEco RIフラグメント
（同様にフイリング）をクローン化した。生成プラスミ
ドのマウスＫエンハンサーの上にのつたXba I切断位を
リンカー挿入によりNot I切断位に転移した。
C.Mulligan,p.Berg共著、Proc.Nat.Acad,Sci.VSA,78
巻、2072〜2076頁（1981年）〕中に、MAK A 2044のＫ遺
伝子のエンハンサー領域〔Nature,307巻、80〜82頁（19
84年）〕を含有する2kbのEcoR I/Asp700−フラグメント
（Asp700はリンカーによりBam HIに移転）をクローン化
した。生成プラスミドのBam HI切断位中に末端のフイリ
ング後、ヒトＫ遺伝子の定常領域を含有するpC1〔H.G.K
lobeck及びその他共著、Nucl.Acids Res.,12巻、6995〜
7006頁（1984年）〕からの2.8kbのEco RIフラグメント
（同様にフイリング）をクローン化した。生成プラスミ
ドのマウスＫエンハンサーの上にのつたXba I切断位を
リンカー挿入によりNot I切断位に転移した。
第７図はベクターp10195を示し、前記のように該ベク
ターはpSV 2 neo〔R.C.Mulligan及びP.Berg共著、Proc.
Nat.Acad.Sci.USA,78巻、2072〜2076頁（1981年）〕を
ベースとして構成した。そのEco RI切断位及びBam HI切
断位の間にマウスのＫエンハンサーを含有するDNAフラ
グメント 並びにヒトＫ遺伝子の定常領域を含有するDNAフラグメ
ント をクローン化した。これはBam HI切断位の欠失をもたら
した。
ターはpSV 2 neo〔R.C.Mulligan及びP.Berg共著、Proc.
Nat.Acad.Sci.USA,78巻、2072〜2076頁（1981年）〕を
ベースとして構成した。そのEco RI切断位及びBam HI切
断位の間にマウスのＫエンハンサーを含有するDNAフラ
グメント 並びにヒトＫ遺伝子の定常領域を含有するDNAフラグメ
ント をクローン化した。これはBam HI切断位の欠失をもたら
した。
ｅ） ベクターp11201（第８図）の構成 Eco RI及びBam HIで切断したプラスミドpSV2gpt〔R.
C.Mulligan,P.Berg,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,78巻、2072
〜2076頁（1981年）〕中に、ヒトγ１遺伝子の定常領域
（γ１−10）を含有する7kbのHind IIIフラグメント
〔N.TAKAHASHI及びその他共著、Cell,29巻、671〜679頁
（1982年）〕をクローン化した。（このもともとのHind
IIIフラグメントをHind III末端のフイリング及びpUC1
9〔C.Yanisch−Perron及びその他共著、Gene,3巻、103
〜119頁（1985年）〕の同様にフイリングしたAsp718切
断位に中間クローン化することによりEco RI−Bam HI−
フラグメントに転移させた。）生成プラスミドのEco RI
切断位中に同一方向で、MAK A 204〔F.Sablitzky及びそ
の他共著、EMBO J.,4巻、345〜350頁（1985年）〕のγ
１遺伝子のエンハンサー領域〔Cell,4巻、885〜897頁
（1985年）〕を含有する1.6kbのHind III−Eco RI−フ
ラグメントを挿入した。その際に、Hind III切断位はア
ダプター（５′AGCTGCGGCCGC3′でハイブリツド形成し
た５′AATTGCGGGCCGC3′）によりNot I切断位に転移し
かつまたEco RI切断位に適合した。
C.Mulligan,P.Berg,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,78巻、2072
〜2076頁（1981年）〕中に、ヒトγ１遺伝子の定常領域
（γ１−10）を含有する7kbのHind IIIフラグメント
〔N.TAKAHASHI及びその他共著、Cell,29巻、671〜679頁
（1982年）〕をクローン化した。（このもともとのHind
IIIフラグメントをHind III末端のフイリング及びpUC1
9〔C.Yanisch−Perron及びその他共著、Gene,3巻、103
〜119頁（1985年）〕の同様にフイリングしたAsp718切
断位に中間クローン化することによりEco RI−Bam HI−
フラグメントに転移させた。）生成プラスミドのEco RI
切断位中に同一方向で、MAK A 204〔F.Sablitzky及びそ
の他共著、EMBO J.,4巻、345〜350頁（1985年）〕のγ
１遺伝子のエンハンサー領域〔Cell,4巻、885〜897頁
（1985年）〕を含有する1.6kbのHind III−Eco RI−フ
ラグメントを挿入した。その際に、Hind III切断位はア
ダプター（５′AGCTGCGGCCGC3′でハイブリツド形成し
た５′AATTGCGGGCCGC3′）によりNot I切断位に転移し
かつまたEco RI切断位に適合した。
第８図はベクターp11201を示し、該ベクターは前記の
ようにpSV2gpt〔P.C.Mulligan及びP.Berg共著、Proc.Na
t.Acad.Sci.USA,78巻、2072〜2076頁（1981年）〕をベ
ースとして構成した。そのEco RI−及びBam HI−切断位
の間に、マウスのイムノグロブリン重鎖のエンハンサー
を含有するDNAフラグメント をかつヒトγ１遺伝子の定常領域を含有するDNAフラグ
メント をクローン化した。
ようにpSV2gpt〔P.C.Mulligan及びP.Berg共著、Proc.Na
t.Acad.Sci.USA,78巻、2072〜2076頁（1981年）〕をベ
ースとして構成した。そのEco RI−及びBam HI−切断位
の間に、マウスのイムノグロブリン重鎖のエンハンサー
を含有するDNAフラグメント をかつヒトγ１遺伝子の定常領域を含有するDNAフラグ
メント をクローン化した。
pSV2gptからのEco RI切断位はNot I切断位に移転し
た。
た。
ｆ） キメラ抗体の軽鎖用発現プラスミドの構成 第１図によるDNAを突然変異により導入した切断位でE
co RV及びXho Iで制限した。Ｖ領域に相応する323bpフ
ラグメントを、同様にEco RV及びXho Iで制限したベク
ターp11196中にクローン化した。生成ベクターp11223を
Not Iで制限し、イムノグロブリン部分に相当する1.8kb
のフラグメントを単離しかつNot Iで制限したベクターp
10195中にクローン化した（第９図）。生成したベクタ
ーp11225（DSM5094）をCsCl密度勾配遠心法〔T.Maniati
s及びその他共著、Molecular Cloning−A Laboratory M
anual（1982年）、Cold Spring Harbor Laboratory〕に
より精製した。
co RV及びXho Iで制限した。Ｖ領域に相応する323bpフ
ラグメントを、同様にEco RV及びXho Iで制限したベク
ターp11196中にクローン化した。生成ベクターp11223を
Not Iで制限し、イムノグロブリン部分に相当する1.8kb
のフラグメントを単離しかつNot Iで制限したベクターp
10195中にクローン化した（第９図）。生成したベクタ
ーp11225（DSM5094）をCsCl密度勾配遠心法〔T.Maniati
s及びその他共著、Molecular Cloning−A Laboratory M
anual（1982年）、Cold Spring Harbor Laboratory〕に
より精製した。
ｇ） キメラ抗体の重鎖用の発現プラスミドの構成 第２図のcDNAを突然変異により導入した切断位でPvu
II及びPst Iで制限した。内部Pst I切断位の結果、Ｖ領
域に相当する231bp及び103bpの２つのフラグメントが生
成する。両方のフラグメントを元の方向において、同様
にPvu II及びPst Iで制限したベクターp11197中にクロ
ーン化した。生成ベクターp11221をNot Iで制限した。
イムノグロブリン部分に相当する1kbのNot Iフラグメン
トをベクターp11201のNot I切断位中にクローン化した
（第10図）。生成ベクターp11224（DSM5093）をCsCl密
度勾配遠心法により精製した〔T.Maniatis及びその他共
著、Molecular Cloning−A Laboratory Manual（1982
年）、Cold Spring Harbor Laboratory〕。
II及びPst Iで制限した。内部Pst I切断位の結果、Ｖ領
域に相当する231bp及び103bpの２つのフラグメントが生
成する。両方のフラグメントを元の方向において、同様
にPvu II及びPst Iで制限したベクターp11197中にクロ
ーン化した。生成ベクターp11221をNot Iで制限した。
イムノグロブリン部分に相当する1kbのNot Iフラグメン
トをベクターp11201のNot I切断位中にクローン化した
（第10図）。生成ベクターp11224（DSM5093）をCsCl密
度勾配遠心法により精製した〔T.Maniatis及びその他共
著、Molecular Cloning−A Laboratory Manual（1982
年）、Cold Spring Harbor Laboratory〕。
ｈ） 哺乳動物細胞を発現プラスミドによりトランスフ
エクション ベクターP11224（DSM5093）並びにベクターp11225（D
SM5094）をそれらの唯一のPvu I切断位（細菌ampR遺伝
子中で線状化した。Sp 2/O Ag14細胞（ATCCCRL1581）
をRPMI培地〔G.E.Moore,R.E.Gerner及びH.A.Franklin共
著、Culture of Normal Human Leucocytes.J.A.M.A.,19
9巻、519〜526頁（1967年）〕上で発育させた。この培
地は牛胎児血清10％、グルタミン20ミリモル／、ピル
ビン酸Na1ミリモル／、８−アザグアニン20μg/及
びアミノ酸〔MEMアミノ酸、組成についてはR.G.Ham著、
Exp.Cell.Res.,29巻、515〜526頁（1963年）参照〕を付
加した。指数的に増殖する細胞（５×105個/ml）を１×
HeBS緩衝液〔G.Chu及びその他共著、Hucl.Acids Res.,1
5巻、1311〜1326頁（1987年）〕中に再懸濁して全量1.2
5×106個/mlにした。線状化したベクターp11224（DSM50
93）及びp11225（DSM5094）をそれぞれ12.5μg/mlの濃
度で添加した。細胞及びDNAを10分間０℃で予め恒温保
持し、引続いてアリコート800μを１回の電気パルス2
30V（Bio Rad Gene Pulser）に暴し、その後で更に０℃
で10分間恒温保持した。その後、RPMI（前記のもの、但
し８−アザグアニンを含まない）中の細胞をクローン化
板上に塗布した。
エクション ベクターP11224（DSM5093）並びにベクターp11225（D
SM5094）をそれらの唯一のPvu I切断位（細菌ampR遺伝
子中で線状化した。Sp 2/O Ag14細胞（ATCCCRL1581）
をRPMI培地〔G.E.Moore,R.E.Gerner及びH.A.Franklin共
著、Culture of Normal Human Leucocytes.J.A.M.A.,19
9巻、519〜526頁（1967年）〕上で発育させた。この培
地は牛胎児血清10％、グルタミン20ミリモル／、ピル
ビン酸Na1ミリモル／、８−アザグアニン20μg/及
びアミノ酸〔MEMアミノ酸、組成についてはR.G.Ham著、
Exp.Cell.Res.,29巻、515〜526頁（1963年）参照〕を付
加した。指数的に増殖する細胞（５×105個/ml）を１×
HeBS緩衝液〔G.Chu及びその他共著、Hucl.Acids Res.,1
5巻、1311〜1326頁（1987年）〕中に再懸濁して全量1.2
5×106個/mlにした。線状化したベクターp11224（DSM50
93）及びp11225（DSM5094）をそれぞれ12.5μg/mlの濃
度で添加した。細胞及びDNAを10分間０℃で予め恒温保
持し、引続いてアリコート800μを１回の電気パルス2
30V（Bio Rad Gene Pulser）に暴し、その後で更に０℃
で10分間恒温保持した。その後、RPMI（前記のもの、但
し８−アザグアニンを含まない）中の細胞をクローン化
板上に塗布した。
トランスフエクションして24時間後からG418（Geneti
cin Gibco,1mg/ml）又はG418と付加的にミコフエノール
酸（３段階で250ng/mlから500ng/mlを介して２μg/mlに
上昇させる。）によつて選択した。両方の選択原理によ
り、ベクターp11224（DSM5093）並びにベクターp11225
（DSM5094）を含有しかつ活性なキメラ抗−TSH−MAK（E
CACC88091403）を発現するクローンが得られた。キメラ
抗−TSH−MAKのκ鎖及びγ鎖のアミノ酸−及びDNA配列
は第３図及び第４図に図示されている。
cin Gibco,1mg/ml）又はG418と付加的にミコフエノール
酸（３段階で250ng/mlから500ng/mlを介して２μg/mlに
上昇させる。）によつて選択した。両方の選択原理によ
り、ベクターp11224（DSM5093）並びにベクターp11225
（DSM5094）を含有しかつ活性なキメラ抗−TSH−MAK（E
CACC88091403）を発現するクローンが得られた。キメラ
抗−TSH−MAKのκ鎖及びγ鎖のアミノ酸−及びDNA配列
は第３図及び第４図に図示されている。
キメラ抗−TSH−MAKを生産するこのハイブリドーマ細
胞系はECACC88091403で寄託（機関:European Collectio
n of Animal Cell Culture,Porton Down,英国）。
胞系はECACC88091403で寄託（機関:European Collectio
n of Animal Cell Culture,Porton Down,英国）。
同様にして次のキメラMAKを製造することができる。
例 ２ 二重MAKサンドウイツチ試験におけるキメラ抗−TSH−MA
Kの作用性の検出 ａ） 抗−TSH−MAK 抗−TSH−MAKとしては、そのκ鎖及びγ鎖のアミノ酸
配列が第１図及び第２図に図示されているMAKを使用し
た。
Kの作用性の検出 ａ） 抗−TSH−MAK 抗−TSH−MAKとしては、そのκ鎖及びγ鎖のアミノ酸
配列が第１図及び第２図に図示されているMAKを使用し
た。
ｂ） 抗−TSH−MAK（第１図及び第２図）に相補性のTS
H結合マウス抗体のペルキオシダーゼ接合体の製造 モノクロナール抗−TSH−抗体（ECACC87122202）のIg
Gフラクションを腹水から硫酸アンモニウム沈殿及びDEA
Eイオン交換体によるクロマトグラフイ〔A.Johnstone及
びR.Thorpe共著、Immunochemistry im Practice,44〜45
頁（1982年）Blackwell Scientific〕により精製した。
IgG200mgからFabフラグメント90mgをJohnston及びThorp
eによる方法（前記文献52〜53頁）で製造した。Fabフラ
グメント50mgをＳ−アセチル−チオ−無水コハク酸と反
応させかつ西ドイツ国特許公開第3825735号明細書、例
8.2の方法により、前重合したマレインイミド−ヘキサ
ノイル−ペルオキシダーゼ50mgと結合させた。AcA22−
クロマトグラフイにより分子量２〜3000000の接合体プ
ールが得られた。収量:13500Uのペルオキシダーゼ（PO
D）活性を有する蛋白質31mg。
H結合マウス抗体のペルキオシダーゼ接合体の製造 モノクロナール抗−TSH−抗体（ECACC87122202）のIg
Gフラクションを腹水から硫酸アンモニウム沈殿及びDEA
Eイオン交換体によるクロマトグラフイ〔A.Johnstone及
びR.Thorpe共著、Immunochemistry im Practice,44〜45
頁（1982年）Blackwell Scientific〕により精製した。
IgG200mgからFabフラグメント90mgをJohnston及びThorp
eによる方法（前記文献52〜53頁）で製造した。Fabフラ
グメント50mgをＳ−アセチル−チオ−無水コハク酸と反
応させかつ西ドイツ国特許公開第3825735号明細書、例
8.2の方法により、前重合したマレインイミド−ヘキサ
ノイル−ペルオキシダーゼ50mgと結合させた。AcA22−
クロマトグラフイにより分子量２〜3000000の接合体プ
ールが得られた。収量:13500Uのペルオキシダーゼ（PO
D）活性を有する蛋白質31mg。
ｃ） 作用試験の実施 1. 抗−TSH−MAKによる参考ELISA（enzyme linked imm
unosorbent assay） 工程1: ミクロ滴定板の凹部をポリクロナール羊（抗−マウス
Ｆｃγ）IgG（免疫吸収させた）５μg/mlを用いて自発
吸着により塗布し（25℃、２時間）、かつHEPES緩衝液1
50ミリモル/NACl150ミリモル（pH7）中の１％−クロテ
イン（Crotein）Ｃを後負荷して（25℃で30分間）残り
の吸着位を飽和した。
unosorbent assay） 工程1: ミクロ滴定板の凹部をポリクロナール羊（抗−マウス
Ｆｃγ）IgG（免疫吸収させた）５μg/mlを用いて自発
吸着により塗布し（25℃、２時間）、かつHEPES緩衝液1
50ミリモル/NACl150ミリモル（pH7）中の１％−クロテ
イン（Crotein）Ｃを後負荷して（25℃で30分間）残り
の吸着位を飽和した。
工程2: 空にした凹部中に、RPMI細胞培地中に溶解したIgG50n
g/mlの濃度の抗−TSH−MAK（例2a）各0.2mlをピペツト
添加し、かつ室温で60分間恒温保持した。対照のために
MAK−IgGを含まない緩衝液を使用した。
g/mlの濃度の抗−TSH−MAK（例2a）各0.2mlをピペツト
添加し、かつ室温で60分間恒温保持した。対照のために
MAK−IgGを含まない緩衝液を使用した。
工程3: 緩衝液Ａで３回洗浄した後で、それぞれ40μのTSH
標準溶液もしくは患者血清（阻害因子を含む、緩衝液Ｂ
中１＋１に稀釈）を凹部１個当り緩衝液B200μの一緒
にピペツト添加し、かつ室温で60分間恒温保持した。
標準溶液もしくは患者血清（阻害因子を含む、緩衝液Ｂ
中１＋１に稀釈）を凹部１個当り緩衝液B200μの一緒
にピペツト添加し、かつ室温で60分間恒温保持した。
TSH標準溶液は牛血清をTSH溶液で増量することにより
製造した。様々に増加させた標準溶液のTSH濃度は市販
のTSH試験（Enzymun−Test ,Boehringer Mannheim Gmb
H社、注文番号736082）で測定することにより関係づけ
た。
製造した。様々に増加させた標準溶液のTSH濃度は市販
のTSH試験（Enzymun−Test ,Boehringer Mannheim Gmb
H社、注文番号736082）で測定することにより関係づけ
た。
工程4: 緩衝液Ａで２回洗浄した後で、それぞれの凹部中にPO
D活性100mU/mlを有する酵素接合体溶液0.2mlを装入した
（ｂ）からの接合体濃縮物を緩衝液Ｃ中で稀釈）。接合
体を室温で60分間恒温保持した。
D活性100mU/mlを有する酵素接合体溶液0.2mlを装入した
（ｂ）からの接合体濃縮物を緩衝液Ｃ中で稀釈）。接合
体を室温で60分間恒温保持した。
工程5: 緩衝液Ｃで３回洗浄後、それぞれの凹部をABTS 基質
（2,2′−アジノ−ジ−〔３−エチルベンゾチアゾリン
−スルホネート〕ABTS 1.9ミリモル／、リン酸塩−
クエン酸−緩衝液（pH4.4）100ミリモル／、過硼酸ナ
トリウム3.2ミリモル／）0.2mlで充填し、かつ室温で
60分間恒温保持した。
（2,2′−アジノ−ジ−〔３−エチルベンゾチアゾリン
−スルホネート〕ABTS 1.9ミリモル／、リン酸塩−
クエン酸−緩衝液（pH4.4）100ミリモル／、過硼酸ナ
トリウム3.2ミリモル／）0.2mlで充填し、かつ室温で
60分間恒温保持した。
凹部中の生成着色溶液の吸光度をミクロ滴定板に好適
な光度計で405nmで測定した。
な光度計で405nmで測定した。
緩衝液A: リン酸カリウム緩衝液pH6.9 16ミリモル／ 牛血清アルブミン 0.2％ NaCl 0.15モル／ 牛IgG 0.1％ 緩衝液B: 羊IgG0.1％を添加した緩衝液Ａ 緩衝液C: リン酸カリウム緩衝液pH6.9 36ミリモル／ 牛血清アルブミン 0.2 ％ NaCl 0.15モル／ デキストランT500 ２％ フエノール 0.01％ （濃度は試験における最終濃度である） 2. キメラ抗−TSH−MAK（例１）によるELISA試験 キメラMAKによる試験は作用試験の実施ｃ）の参考試
験１の工程と全く同様に実施した。但し次の点を変更し
た： 工程１において、ポリクロナール羊（抗ヒト−
Ｆｃγ）−IgG（免疫吸収させた）を塗布した。工程２
ではキメラ抗−TSH−MAK50ng/mlを含有する細胞培養上
澄みの稀釈液をピペツト添加した。キメラ抗−TSH−MAK
の濃度はヒト−Ｆｃγ−特異性ミクロ測定ELISAにより
滴定した。
験１の工程と全く同様に実施した。但し次の点を変更し
た： 工程１において、ポリクロナール羊（抗ヒト−
Ｆｃγ）−IgG（免疫吸収させた）を塗布した。工程２
ではキメラ抗−TSH−MAK50ng/mlを含有する細胞培養上
澄みの稀釈液をピペツト添加した。キメラ抗−TSH−MAK
の濃度はヒト−Ｆｃγ−特異性ミクロ測定ELISAにより
滴定した。
第11図は抗−TSH−MAKを用いた試験である例2c）１の
標準曲線（曲線）及びキメラ抗−TSH−MAKを用いた試
験である例2c）２の標準曲線（曲線）を比較して示す
図である。検量曲線は誤差限界範囲内で同等である。そ
れ故、キメラMAK中のTSH結合部位は不変でありかつキメ
ラMAKはＦｃγ部分においてヒトIgGと同様に挙動する。
標準曲線（曲線）及びキメラ抗−TSH−MAKを用いた試
験である例2c）２の標準曲線（曲線）を比較して示す
図である。検量曲線は誤差限界範囲内で同等である。そ
れ故、キメラMAK中のTSH結合部位は不変でありかつキメ
ラMAKはＦｃγ部分においてヒトIgGと同様に挙動する。
対照としては例2c）２による試験で例2c）１にり羊
（抗マウスＦｃγ）IgG塗布したミクロ滴定板を使用し
た。予想通り、標準試料に関して空値とは異なる吸光度
は得られなかつた。
（抗マウスＦｃγ）IgG塗布したミクロ滴定板を使用し
た。予想通り、標準試料に関して空値とは異なる吸光度
は得られなかつた。
表１に３人の患者の血清の測定値を掲載した（PS71,P
S92,PS99）。測定値から、マウス−二重−MAK−免疫試
験において高い偽値が得られることが知られる。対照と
して、阻害因子を含まないTSH＜0.5μU/mlの正常なヒト
血清の試料PS107を試験した。
S92,PS99）。測定値から、マウス−二重−MAK−免疫試
験において高い偽値が得られることが知られる。対照と
して、阻害因子を含まないTSH＜0.5μU/mlの正常なヒト
血清の試料PS107を試験した。
両方の試験系で得られる血清試料の吸光度をそれぞれ
の標準曲線を用いてTSH μU/試料mlに換算した。
の標準曲線を用いてTSH μU/試料mlに換算した。
キメラ抗−TSH−MAKを用いる試験系において阻害因子
を含有するヒト血清で規定量のTSHが正しく測定される
ことを検査するためにそれぞれの血清にTSH20μU/mlを
加え、同様に測定した。
を含有するヒト血清で規定量のTSHが正しく測定される
ことを検査するためにそれぞれの血清にTSH20μU/mlを
加え、同様に測定した。
患者血清中に含まれているTSHの濃度はEnzymun TSH試
験パツケージ（Boehringer Mannheim Gmb H社、注文番
号736082）で測定した。この試験は抗−マウス−IgG阻
害因子によつて妨害されない。それというのもマウスか
らの抗−TSH−抗体のFabフラグメントとペルオキシダー
ゼとからの接合体の代りに、羊からのポリクロナール抗
−TSH−抗体からのFabフラグメントとペルオキシダーゼ
とからの接合体が含まれているからである。
験パツケージ（Boehringer Mannheim Gmb H社、注文番
号736082）で測定した。この試験は抗−マウス−IgG阻
害因子によつて妨害されない。それというのもマウスか
らの抗−TSH−抗体のFabフラグメントとペルオキシダー
ゼとからの接合体の代りに、羊からのポリクロナール抗
−TSH−抗体からのFabフラグメントとペルオキシダーゼ
とからの接合体が含まれているからである。
実測値:PS71（0.52μU/ml）、PS92（2.2μU/ml）、PS99
（0.9μU/ml） 前記の表の数値から、例2c）１による試験系では阻害
因子を含有する患者血清中に著しく高い見掛け上のTSH
含量の偽値が認められる。キメラ抗−TSH−MAKを使い、
その他は全く同じ試験系（例2c）２）ではこの妨害は完
全に除去される。真に高いTSH含量は誤差限界範囲で正
しく認められる。
（0.9μU/ml） 前記の表の数値から、例2c）１による試験系では阻害
因子を含有する患者血清中に著しく高い見掛け上のTSH
含量の偽値が認められる。キメラ抗−TSH−MAKを使い、
その他は全く同じ試験系（例2c）２）ではこの妨害は完
全に除去される。真に高いTSH含量は誤差限界範囲で正
しく認められる。
第１図はTSHに対するモノクロナール抗体のκ鎖のDNA−
及びアミノ酸配列を示す図、第２図はTSHに対するモノ
クロナール抗体のγ鎖のDNA−及びアミノ酸配列を示す
図、第３図はTSHに対するキメラモノクロナール抗体の
κ鎖のDNA−及びアミノ酸配列を示す図、第４図はTSHに
対するキメラモノクロナール抗体のγ鎖のDNA−及びア
ミノ酸配列を示す図、第５図はベクターp11196の図、第
６図はベクターp11197の図、第７図はベクターp10195の
図、第８図はベクターp11201の図、第９図はκ鎖構成の
クローン化工程の概要を示す図、第10図はγ鎖構成のク
ローン化工程の概要を示す図、第11図は抗−TSH−モノ
クロナール抗体の標準曲線及びキメラ抗−TSH−モノ
クロナール抗体の標準曲線を比較して示す図である。
及びアミノ酸配列を示す図、第２図はTSHに対するモノ
クロナール抗体のγ鎖のDNA−及びアミノ酸配列を示す
図、第３図はTSHに対するキメラモノクロナール抗体の
κ鎖のDNA−及びアミノ酸配列を示す図、第４図はTSHに
対するキメラモノクロナール抗体のγ鎖のDNA−及びア
ミノ酸配列を示す図、第５図はベクターp11196の図、第
６図はベクターp11197の図、第７図はベクターp10195の
図、第８図はベクターp11201の図、第９図はκ鎖構成の
クローン化工程の概要を示す図、第10図はγ鎖構成のク
ローン化工程の概要を示す図、第11図は抗−TSH−モノ
クロナール抗体の標準曲線及びキメラ抗−TSH−モノ
クロナール抗体の標準曲線を比較して示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ヘルムート・レンツ ドイツ連邦共和国トウツツイング・フオ ン‐キユールマン‐シユトラーセ 14 (56)参考文献 特開 昭61−47500（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−201598（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−154696（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−500352（ＪＰ，Ａ) 欧州公開266663（ＥＰ，Ａ１)
Claims (1)
- 【請求項１】患者の血清又は血液中の癌胎児性抗原以外
の物質に対する２種のモノクロナール抗体R1およびR
2（第１の抗体R1は固相に結合可能であるか又は既に結
合しており、かつ第２の抗体R2は標識を有する）を前記
物質と結合させ、固相に結合可能な抗体R1を使用した場
合には抗体R1を固相に結合させ、形成された抗体R1、物
質及び抗体R2より成る固相結合の複合体を分離し、かつ
抗体R2の標識を検出することにより血清又は血液中の物
質を検出する方法であって、少なくとも抗体R1又はR2の
一方として、可変領域の全部又は一部が、所望の特異性
を有するヒト以外のモノクロナール抗体の相応する部分
により置換されているヒト抗体より成るキメラモノクロ
ナール抗体又はそのフラグメントを使用することを特徴
とする、血清又は血液中の癌胎児性抗原以外の物質を異
好性抗体による妨害なしで検出する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3900534A DE3900534A1 (de) | 1989-01-10 | 1989-01-10 | Diagnostischer nachweis unter verwendung von chimaeren antikoerpern |
| DE3900534.8 | 1989-01-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02231567A JPH02231567A (ja) | 1990-09-13 |
| JP2787098B2 true JP2787098B2 (ja) | 1998-08-13 |
Family
ID=6371816
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001652A Expired - Lifetime JP2787098B2 (ja) | 1989-01-10 | 1990-01-10 | 血清又は血液中の物質を妨害除去下に診断検出する方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5614367A (ja) |
| EP (1) | EP0378175B1 (ja) |
| JP (1) | JP2787098B2 (ja) |
| AT (1) | ATE123340T1 (ja) |
| AU (1) | AU629886B2 (ja) |
| CA (1) | CA2007336C (ja) |
| DE (2) | DE3900534A1 (ja) |
| DK (1) | DK0378175T3 (ja) |
| ZA (1) | ZA90136B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| DE3900534A1 (de) * | 1989-01-10 | 1990-07-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Diagnostischer nachweis unter verwendung von chimaeren antikoerpern |
| US5579463A (en) * | 1990-03-30 | 1996-11-26 | Anritsu Corporation | Waveform display apparatus of frequency sweep type for facilitating display of a high definition waveform |
| DE69132242T2 (de) * | 1990-03-30 | 2001-01-25 | Anritsu Corp., Tokio/Tokyo | Anzeigevorrichtung zur einfachen Beobachtung von Signalverläufen bei hoher Auflösung |
| DE4033120A1 (de) * | 1990-10-18 | 1992-04-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur herstellung von chimaeren antikoerpern |
| US5617523A (en) * | 1990-11-30 | 1997-04-01 | Anritsu Corporation | Waveform display apparatus for easily realizing high-definition waveform observation |
| AU689214B2 (en) | 1994-02-01 | 1998-03-26 | United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The | Fusion proteins that include antibody and nonantibody portions |
| US6087088A (en) * | 1997-01-31 | 2000-07-11 | Bayer Corporation | Binding assays using more than one label for determining analyte in the presence of interfering factors |
| US20030171551A1 (en) * | 1997-01-31 | 2003-09-11 | Joseph D. Rosenblatt | Chimeric antibody fusion proteins for the recruitment and stimulation of an antitumor immune response |
| DE19739218A1 (de) * | 1997-09-08 | 1999-03-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Aufreinigung von Substanzen aus einer biologischen Probe |
| ES2185104T3 (es) * | 1997-12-11 | 2003-04-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Eliminacionde las interferencias en procedimientos de diagnostico mediante peptidos de d-aminoacidos. |
| DE19828466A1 (de) | 1998-06-26 | 1999-12-30 | Roche Diagnostics Gmbh | Entstörung von Immunoassays durch Substanzen, die aus den Framework-Regionen von Antikörpern abgeleitet sind |
| US6492497B1 (en) * | 1999-04-30 | 2002-12-10 | Cambridge Antibody Technology Limited | Specific binding members for TGFbeta1 |
| US6680209B1 (en) * | 1999-12-06 | 2004-01-20 | Biosite, Incorporated | Human antibodies as diagnostic reagents |
| DE19962583A1 (de) * | 1999-12-23 | 2001-06-28 | Mueller Hermelink Hans Konrad | Antikörper gegen Plasmazellen |
| EP1258729A3 (en) * | 2001-05-18 | 2004-01-02 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | A method of selecting an antibody, a hybridoma, a monoclonal antibody and use thereof |
| US20040018556A1 (en) * | 2002-07-29 | 2004-01-29 | Cantor Thomas L. | Reagent and method for determination of a substance using an immunoaggregator |
| WO2007011698A2 (en) * | 2005-07-15 | 2007-01-25 | Siemens Medical Solutions Diagnostics | Humanized antibody conjugates and related methods, assays, reagents, and kits |
| DK2220121T3 (en) * | 2007-11-12 | 2015-12-07 | U3 Pharma Gmbh | AXL antibodies |
| CA2759836A1 (en) | 2009-05-11 | 2010-11-18 | U3 Pharma Gmbh | Humanized axl antibodies |
| BR112020005390A2 (pt) * | 2017-09-20 | 2020-09-29 | Mersana Therapeutics, Inc. | composições e métodos para prever a resposta à terapia direcionada ao napi2b |
| CA3109790A1 (en) | 2018-08-17 | 2020-02-20 | Mersana Therapeutics, Inc. | Napi2b-targeted polymer antibody-drug conjugates and methods of use thereof |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6147500A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
| GB8422238D0 (en) * | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
| JPS62201598A (ja) * | 1986-02-28 | 1987-09-05 | Teijin Ltd | マウス−ヒトキメラ抗体ｈ鎖、それをコ−ドするキメラｄｎａ配列、プラスミドおよび細胞 |
| GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
| IL84285A (en) * | 1986-10-27 | 1993-03-15 | Int Genetic Engineering | Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen |
| IL85035A0 (en) * | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
| AU625613B2 (en) * | 1988-01-05 | 1992-07-16 | Novartis Ag | Novel chimeric antibodies |
| IL162181A (en) * | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
| DE3900534A1 (de) * | 1989-01-10 | 1990-07-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Diagnostischer nachweis unter verwendung von chimaeren antikoerpern |
| EP0479901A1 (en) * | 1990-04-25 | 1992-04-15 | City Of Hope | Removal of human anti-murine and heterophilic antibody interference in double antibody eia assays |
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1989
- 1989-01-10 DE DE3900534A patent/DE3900534A1/de not_active Withdrawn
-
1990
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- 1990-01-09 AT AT90100378T patent/ATE123340T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-01-09 DE DE59009163T patent/DE59009163D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-09 EP EP90100378A patent/EP0378175B1/de not_active Expired - Lifetime
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-
1993
- 1993-11-17 US US08/154,738 patent/US5614367A/en not_active Expired - Lifetime
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