JP2752083B2

JP2752083B2 - マクロライド化合物の製造法

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Publication number: JP2752083B2
Application number: JP7042888A
Authority: JP
Inventors: 恵子中川; 芳久塚本; 佐藤　　一雄; 顕雄鳥潟
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1988-03-24
Filing date: 1988-03-24
Publication date: 1998-05-18
Anticipated expiration: 2013-05-18
Also published as: JPH01243996A

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、マクロライド化合物の新規な製造法に関
するものであり、さらに詳しくはミルベマイシン類およ
びその類縁体の製造法に関するものである。ミルベマイ
シンは、一連のマクロライド化合物であつて、特開昭50
−29742号公報、同56−32481号公報等により公知の、下
記式（III）の化合物である。

式中、ＷおよびＸは水素原子を示し、Ｙはメチル基、
エチル基またはイソプロピル基を示し、それぞれミルベ
マイシンA3,ミルベマイシンA4およびミルベマイシンＤ
と称されている。ＷおよびＸが水素原子を示し、Ｙがse
c−ブチル基である化合物は、特開昭54−145699号公報
等に記載されたミルベマイシン類縁体である。Ｘが水素
原子であり、Ｗが４′−（α−Ｌ−オレアンドロシル）
−α−Ｌ−オレアンドロシロキシ基であり、そしてＹが
イソプロピル基またはsec−ブチル基である化合物は、
特開昭54−61198号公報に記載された化合物であり、そ
れぞれ22,23−ジヒドロアベルメクチンBlaおよびBlbと
称されている。また、Ｗが水素原子であり、Ｘが水酸基
であり、そしてＹが１−メチル−１−プロペニル基、１
−メチル−１−ブテニル基または1,3−ジメチル−１−
ブテニル基である化合物は、特開昭61−10589号公報に
記載された化合物であり、LL−Ｆ−28249として知られ
ている。Ｗが水素原子であり、Ｘがオキソ基であり、そ
してＹが１−メチル−１−プロペニル基、１−メチル−
１−ブテニル基または1,3−ジメチル−１−ブテニル基
である化合物は、特開昭61−280496号公報に記載された
化合物である。これらの化合物は、いずれも殺虫、殺ダ
ニおよび駆虫活性を有することが知られている。

本発明者等は、これらミルベマイシン類の新規類縁体
の探索について鋭意努力した結果、上記ミルベマイシン
類を、微生物またはそれが産生する酵素を用いて変換す
ることにより、新規ミルベマイシン類が生産されること
を見出して本発明を完成した。

本発明によれば、下記の一般式（II）で表わされる化
合物を基質とし、このものを下記の一般式（Ｉ）で表わ
される化合物に変換しうる、アミコラータ属、アブシデ
イア属またはカニンガメラ属に属する微生物を、一般式
（II）で表わされる化合物を基質として含有する培地中
で培養するか、または、これらの微生物の培養菌体もし
くは酵素抽出液を一般式（II）で表わされる化合物と接
触させることにより、一般式（Ｉ）で表わされる化合物
を製造することができる。

（式中、Ｘは水素原子、水酸基またはオキソ基を示し、
Ｙは、Ｘが水素原子のときは、メチル基、エチル基、イ
ソプロピル基、sec−ブチル基、１−メチル−１−プロ
ペニル基、１−メチル−１−ブテニル基または1,3−ジ
メチル−１−ブテニル基を示し、そしてＸが水酸基また
はオキソ基のときは、１−メチル−１−プロペニル基、
１−メチル−１−ブテニル基または1,3−ジメチル−１
−ブテニル基を示し、Ｚは水酸基またはヒドロキシイミ
ノ基を示す。）（式中、X,YおよびＺは前記と同意義を示す。）。

本発明の方法は、一般式（II）の化合物の微生物によ
る水酸化に関するものである。本発明の方法において、
12位に結合した28位のメチル基のみ水酸化され、４位、
14位、24位に結合したメチル基および25位に結合したＹ
基は水酸化を受けない。また、３位、８位、10位、14位
の二重結合およびＹ基が１−メチル−１−プロペニル
基、１−メチル−１−ブテニル基または1,3−ジメチル
−１−ブテニル基である場合の31位の二重結合は、いず
れもエポキシ化などの酸化を受けない。本発明の方法の
出発物質である一般式（II）の化合物のうち、Ｘが水素
原子であり、そしてＺがヒドロキシイミノ基である化合
物は特開昭59−108785号公報により公知である。

本発明の方法において用いられる微生物は、アミコラ
ータ属（genus Amycolata）、アブシデイア属（genus A
bsidia）、またはカニンガメラ属（genus Cunninghamel
la）に属する微生物であつて、一般式（II）の化合物を
一般式（Ｉ）の化合物へ変換し得る微生物である。アミ
コラータ属は、以前はノカルデイア属に分類されていた
が、菌体成分の相違により、現在はノカルデイア属から
独立して、新しい属を形成している（International Jo
urnal of Systematic Bacteriology,Vol.36,No.1,p.29,
1986）。

本発明の方法において用いられ、アミコラータ属に属
する菌としては、たとえば、アミコラータ．オートトロ
フイカ（A.autotrophica）をあげることができる。その
代表的なものは、通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されており、微工研菌寄第6182号の寄託番
号が付与されている。この寄託菌は、寄託当時はNocard
ia sp.SANK 62881と称されており、その菌学的性質は特
開昭58−89191号公報に記載されている。

本発明の方法において用いられる微生物の種類と、そ
の代表的な菌株であつて公的な菌株分譲機関に保存され
た菌株はつぎのとおりである。

Amycolata autotrophica FERM P−6182 Absidia coerulea IFO 4423 Cunninghamella echinulata ATCC 9244 これらの微生物のうちでAmycolata autotrophica FER
M P−6182は本発明の方法に最も好ましい。

本発明の方法は、種々の態様で実施することが出来
る。たとえば、（１）微生物を培養した培地中で基質で
ある式（II）の化合物を接触させる方法、（２）微生物
を培養した培地から菌体を集め、これに式（II）の化合
物を接触させる方法、（３）菌体から調製された無細胞
抽出物を式（II）の化合物と接触させる方法等をあげる
ことができる。

変換菌の培養は、通常微生物が利用出来る栄養物を含
有する培地中で培養することにより行なわれる。栄養源
としては、一般の放線菌の培養に使用される公知のもの
を使用することが出来る。

たとえば、炭素源としては、グルコース、シユクロー
ス、マルトース、乳糖、澱粉、グリセリン、水飴、糖
蜜、大豆油等が使用される。また、窒素源としては、大
豆粉、小麦はい芽、肉粉、魚粉、肉エキス、ペプトン、
コーンスティープリカー、乾燥酵母、硝酸アンモニウム
などのアンモニウム塩等が使用される。その他、必要に
応じて、食塩、塩化カリウム、炭酸カルシウム、燐酸塩
等の無機塩のほか、菌の発育を助け、前記の水酸化能を
有する酵素の生産を促進する添加物等を適宜組み合わせ
て使用することが出来る。

培養は好気的条件下で行なわれ、培養温度は20〜30
℃、好適には26〜28℃である。

（１）法は、式（II）の化合物を添加して培養するこ
とにより行なわれる。添加の時期は、使用する変換菌の
至適培養条件、特に培養装置、培地組成、培養温度等に
より異なるが、変換菌の水酸化能が高まり始める時期が
よく、通常は変換菌の培養開始後１−５日経過した時点
が好ましい。原料化合物、すなわち基質の添加量は、培
地に対して0.01−5.0％、好ましくは0.025−2.0％であ
る。

原料化合物添加後の培養は、好気的条件下、上記の培
養温度で行なわれる。培養期間は、原料化合物の添加後
１−８日程度である。

（２）法は、上記（１）の方法により変換菌を少量の
基質の存在下で培養し、変換菌の水酸化能が最大となる
まで培養することにより行なわれる。

すなわち、水酸化能は培地の種類、温度等によつて異
なるが、通常は培養開始後２−３日で最大となるので、
この時点で培養を終了する。集菌は培養物を遠心分離、
瀘過等の方法に付すことによつて行なわれる。集菌され
た変換菌菌体は、通常、生理食塩水、緩衝液等で洗浄し
て使用するのが好ましい。このようにして得られた変換
菌菌体を原料化合物と接触させるには、通常は水性媒体
中、例えばpH5−９の燐酸緩衝液中で行なわれる。接触
による反応は、通常20−45℃、好適には25−35℃で行な
われる。基質の濃度は、通常培地に対して0.01−5.0％
である。反応時間は、基質濃度、反応温度等によるが、
通常は１−５日位である。

（３）法での無細胞抽出液は、上記の方法で得られた
変換菌菌体に物理的又は化学的手法を適用し、たとえ
ば、磨砕、超音波処理等によつて菌体破砕物として、ま
たは有機溶媒、界面活性剤、酵素処理等によつて菌体溶
解液として得られる。

このようにして得られた無細胞抽出液を原料化合物と
接触させるには、上記の変換菌菌体と接触させる方法と
同様にして行なわれる。

変換反応終了後、目的化合物は生成物から既知の方法
で採取、分離、精製することができる。たとえば、得ら
れた生成物を瀘過し、得られた瀘液を酢酸エチルのよう
な、水と混和しにくい有機溶媒で抽出し、抽出液から溶
媒を留去したのち、得られた粗目的化合物をシリカゲ
ル、アルミナ等を用いたカラムクロマトグラフイーに付
し、適切な溶離剤で溶出することによつて分離、精製す
ることができる。

式（II）の化合物の出発原料である天然のミルベマイ
シン類は、発酵生産物であつて、多数の類縁体が種々の
割合で生産され、そして、各類縁体は単離された後にま
たは混合物のままで反応に付される。それゆえ、式（I
I）の化合物は単一化合物もしくはそれらの混合物の何
れでもありうる。

従つて、式（Ｉ）の化合物も単一化合物もしくはそれ
らの混合物として生産されうる。

式（Ｉ）の化合物は、それ自体殺虫、殺ダニおよび駆
虫活性を有し、または殺虫、殺ダニおよび駆虫活性を有
する他の化合物の合成中間体として有用である。

式（Ｉ）化合物は、果樹、野菜及び花きに寄生するナ
ミハダニ（Tetranychus），リンゴハダニ（Panonychu
s）およびサビダニ等の成虫、幼虫及び卵、動物に寄生
するマダニ科（Ixodidae）、ワクモ科（Dermanyssida
e）およびヒゼンダニ科（Sarcoptidae）等に対して優れ
た殺ダニ活性を有している。

さらに、ヒツジバエ（Oestrus）、キンバエ（Lucili
a）、ウシバエ（Hypoderma）、ウマバエ（Gautrophilu
s）等、およびノミ、シラミ等の動物や鳥類の外部寄生
虫；ゴキブリ、イエバエ等の衛生害虫；その他、アブラ
ムシ類、鱗し目幼虫等の各種農園芸害虫に対して活性を
有している。さらにまた、土壤中のネコブセンチユウ
（Meloidogyne）、マツノザイセンチユウ（Bursaphelen
chus）、ネダニ（Rhizoglyphus）等に対しても活性を有
している。

また、式（Ｉ）の化合物は、植物に害を与える昆虫、
特に植物を摂取することによつて害を与える昆虫に対し
ても活性を有している。

さらにまた、式（Ｉ）の化合物は、動物及び人間の駆
虫剤として、優れた殺寄生虫活性を有している。とく
に、豚、羊、山羊、牛、馬、犬、猫および鶏のような家
畜、家禽類およびペツトに感染する線虫に対しても有効
である。

式（Ｉ）の化合物を農園芸用に使用するときは、粉
剤、水和剤、乳剤等のこの分野で周知の製剤に調製して
使用される。必要に応じて、水で希釈されて使用される
ときは、有効成分の濃度は、およそ１−10ppm程度であ
る。

式（Ｉ）の化合物を動物用駆虫剤に使用するときは、
粉剤、錠剤、カプセル、注射剤等のこの分野で周知の製
剤に調製して使用される。経口的に投与されるときは、
投与量は、およそ体重1kgあたり0.01−100mg、好適には
0.5−50mg程度である。

次に、本発明を実施例によつて更に具体的に説明す
る。

実施例1. 下記の組成の培地100mlを含有する500ml容三角フラス
コ20本に、アミコラータ．オートトロフイカ（A.autotr
ophica:微工研菌寄第6182号）を植菌し、28℃,200rpmで
振とう培養した。２日後に、ミルベマイシンA₄（式II:X
＝水素原子、Ｙ＝エチル基、Ｚ＝水酸基）をその５％ジ
オキサン溶液を用いて、最終濃度で0.025％になるよう
に添加し、更に７日間28℃、200rpmで培養した。

培地組成グルコース 1.0％酵母エキス 0.3％麦芽エキス 0.3％ペプトン 0.5％（pH無修正）培養終了後、反応液を酢酸エチル１で３回抽出し、
抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち濃縮した。
残さをシリカゲルカラムクロマトグラフイーで精製し、
28−ヒドロキシミルベマイシンA₄（式I:X＝水素原子、
Ｙ＝エチル基、Ｚ＝水酸基）を32mg（収率6.2％）得
た。

質量スペクトル（m/z）:558（M⁺）,540,522,430,412,
330,264,245,195,167 核磁気共鳴スペクトルδ（CDCl₃）ppm:0.83（d,3H,C
₃₀H₃,J＝6.5Hz）0.99（t,3H,C₃₂H₃,J＝7.3Hz）1.55（s,
3H,C₂₉H₃） 1.87（s,3H,C₂₆H₃）3.08（td,1H,C₂₅H,J＝9.3Hz,2.8H
z）3.27（q,1H,C₂H,J＝2.4Hz）3.40（dd,1H,C₂₈H,J＝1
0.9Hz,8.1Hz） 3.52〜3.63（m,2H,C₂₈H,C₁₇H）3.96（d,1H,C₆H,J＝6.1H
z）4.16（s,1H,C₇OH） 4.29（br.s,1H,C₅H）4.69（d,1H,C₂₇H,J＝14.5Hz）4.71
（d,1H,C₂₇H,J＝14.5Hz） 5.00（t,1H,C₁₅H,J＝7.7Hz）5.30〜5.44（m,3H,C₃H,C₁₁
H,C₁₉H）5.8〜6.25（m,2H,C₉H,C₁₀H）実施例2. 実施例１の方法に従つて、ミルベマイシンA₄を基質と
し、微生物としてAbsidia coerulea IFO 4423を用いて2
6℃で培養を行い、28−ヒドロキシミルベマイシンA₄を
0.5〜5.0％の変換率で得た。

実施例3. 実施例１と同一の組成の培地100mlを含有する500ml容
三角フラスコ20本に、アミコラータ．オートトロフイカ
（A.autotrophica:微工研菌寄第6182号）を植菌し、2
8℃,200rpmで振とう培養した。２日後に、ミルベマイシ
ンA₃（式II:X＝水素原子、Ｙ＝メチル基、Ｚ＝水酸基）
をその５％ジオキサン溶液を用いて、最終濃度で0.025
％になるように添加し、更に７日間28℃、200rpmで培養
した。培養終了後、反応液を酢酸エチル１で３回抽出
し、抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち濃縮し
た。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフイーで精製
し、28−ヒドロキシミルベマイシンA₃（式I:X＝水素原
子、Ｙ＝メチル基、Ｚ＝水酸基）を11.0mg（収率2.11
％）を得、またミルベマイシンA₃を447mg（回収率89.4
％）回収した。

質量スペクトル（m/z）544（M⁺）416,398,330,250,23
1,181,167,153 核磁気共鳴スペクトルδ（CDCl₃）ppm:0.84（d,3H,C
₃₀H₃,J＝6.4Hz）1.15（d,3H,C₃₁H₃,J＝6.1Hz）1.55（s,
3H,C₂₉H）1.87（s,3H,C₂₆H₃）3.22〜3.32（m,2H,C₂H,C
₂₅H）3.40（dd,1H,C₂₈H,J＝10.5Hz,8.1Hz）3.55（dd,1
H,C₂₈H,J＝10.5Hz,5.6Hz）3.52〜3.65（m,1H,C₁₇H）3.9
5（d,1H,C₆H,J＝6.0Hz）4.29（d,1H,C₅H,J＝6.0Hz）4.7
0（m,2H,C₂₇H）5.04（m,1H,C₁₅H）5.28〜5.45（m,3H,C₃
H,C₁₁H,C₁₉H）5.81〜5.96（m,2H,C₉H,C₁₀H）実施例4. 実施例１と同一の組成の培地100mlを含有する500ml容
三角フラスコ１本に、カニンガメラ．エキヌラータ（Cu
nninghamella echinulata ATCC 9244）を植菌し、26℃,
220rpmで振とう培養した。

２日後に、LL−F28249α（式II:X＝Ｚ＝水酸基、Ｙ＝
1,3−ジメチル−１−ブテニル基）をその５％ジオキサ
ン溶液を用いて最終濃度で0.05％になるように添加し、
更に５日間26℃、220rpmで培養した。培養終了後、反応
液を吸引瀘過し、菌体と瀘液とに分けた。瀘液を酢酸エ
チル100mlで３回抽出し、抽出液を無水硫酸ナトリウム
で乾燥したのち濃縮した。菌体を80％メタノール水溶液
50mlで２回抽出し、メタノールを蒸発させた後、瀘液と
同様に酢酸エチルで抽出し、濃縮した。菌体と瀘液とか
らの抽出物を分取薄層シリカゲルクロマトグラフイー
（メルク社製、Art 5744,20×20cm,厚さ0.5mm,酢酸エチ
ルで展開）で精製し、28−ヒドロキシLL−F28249α（式
I:X＝Ｚ＝水酸基、Ｙ＝1,3−ジメチル−１−ブテニル
基）を3.4mg（収率6.6％）得た。

またLL−F28249αを8mg（回収率16％）回収した。

質量スペクトル（m/z）628,610,592,482,464,368,33
0,236,167,151,95 核磁気共鳴スペクトルδ（CDCl₃＋D₂O）ppm:3.27（q,
1H,C₂H,J＝2.4Hz）3.39（dd,1H,C₂₈H,J＝10.5Hz,8.1H
z）3.54（dd,1H,C₂₈H,J＝10.5Hz,5.2Hz）3.65（m,1H,C
₁₇H）3.74（d,1H,C₂₅H,J＝10.9Hz） 3.80（d,1H,C₂₃H,J＝2.4Hz）3.95（d,1H,C₆H,J＝6.5H
z）4.28（br.d,1H,C₅H） 4.69（br.s,2H,C₂₇H）5.00（m,1H,C₁₅H） 5.20（dd,1H,C₃₂H,J＝9.3Hz,1.2Hz） 5.25〜5.41（m,3H,C₃H,C₁₁H,C₁₉H） 5.81〜5.95（m,2H,C₉H,C₁₀H）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:65） (72)発明者鳥潟顕雄東京都品川区広町１丁目２番58号三共株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 17/00 - 17/18 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の一般式（II）で表わされる化合物を
基質とし、このものを下記の一般式（Ｉ）で表わされる
化合物に変換しうる、アミコラータ属、アブシデイア属
またはカニンガメラ属に属する微生物を、一般式（II）
で表わされる化合物を基質として含有する培地中で培養
するか、又は、これ等の微生物の培養菌体もしくは酵素
抽出液を一般式（II）で表わされる化合物と接触させて
一般式（Ｉ）で表わされる化合物に変換し、ついで一般
式（Ｉ）で表わされる化合物を採取することを特徴とす
る一般式（Ｉ）で表わされる化合物の製造法：（式中、Ｘは水素原子、水酸基またはオキソ基を示し、
Ｙは、Ｘが水素原子のときは、メチル基、エチル基、イ
ソプロピル基、sec−ブチル基、１−メチル−１−プロ
ペニル基、１−メチル−１−ブテニル基または１、３−
ジメチル−１−ブテニル基を示し、そしてＸが水酸基ま
たはオキソ基のときは、１−メチル−１−プロペニル
基、１−メチル−１−ブテニル基または１、３−ジメチ
ル−１−ブテニル基を示し、Ｚは水酸基またはヒドロキ
シイミノ基を示す。）：（式中、X,YおよびＺは前記と同意義を示す。）。