JP2749269B2 - カオトロープの再利用方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、組み替えＤＮＡバイオ
テクノロジーを利用してバクテリアから得た、封入体や
不溶性蛋白質を可溶化するのに用いる、カオトロープと
して知られる、変性剤もしくは可溶化剤の再利用の方法
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子組み替え技術により生産されたタ
ンパク質の精製過程では通常、封入体としても知られる
不溶性の異質のタンパク質の分離、続いて、変性と可溶
化、更に続いて再生（ｒｅｎａｔｕｒｅ）をして、生物
活性のあるタンパク質を得るという過程からなる。変性
は通常、カオトロープとして知られる可溶化剤の濃縮溶
液で処理することによりなされる； タンパク質の生物
活性形への再生は、カオトロープを除去するか希釈する
ことにより、自発的に起こる。

【０００３】米国特許第５、０８２、７７５号は、８Ｍ
の尿素による封入体の可溶化ステップ、アルカリ性ｐＨ
緩衝液による希釈ステップ、そして引き続いて中和する
ことによる急速な再生ステップを含むキモシン生産方法
を記載している。

【０００４】国際特許第ＷＯ８３／０４４１８は、不溶
性形のキモシン前駆体の、７Ｍの尿素もしくは６Ｍのグ
アニジン塩酸による可逆的な変性を含む、キモシン生産
方法を記載している。尿素もしくはグアニジン塩酸は透
析により除去され、その後タンパク質は活性キモシンに
変えることができるコンフォメーションに戻る。

【０００５】米国特許第５、２０２、２３９号は、心房
ナトリウム尿排泄ペプチド（ＡＮＰ）を含む封入体の６
Ｍの尿素による可溶化について検討している。精製した
融合した蛋白質は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）由来の蛋白
分解酵素を含んでいる。これらは、固定化したスタフ
（ｓｔａｐｈ）Ｖ８と接触させることにより精製した。
ＡＮＰは分子量１０、０００でカットオフするアミコン
（Ａｍｉｃｏｎ）ＹＭ１０メンブレンによる限外ろ過に
より、高分子量の分解産物から分離している。ＡＮＰに
加え、ろ過液には分解反応から出たＮ−末ペプチドと尿
素を含んでいる。ＡＮＰは、陽イオン交換クロマトグラ
フィーか、ゲルろ過クロマトグラフィーで分離してい
る。この特許はさらに、融合した蛋白質をつくるたくさ
んの他のペプチド物質があり、精製過程では可溶化をす
る事が必要であると記述している。この中には、ウロガ
ストロン、プロインシュリンそれに上皮成長因子を含ん
でいる。

【０００６】

【発明が解決すべき課題】ＤＮＡ組み替え手法は、特定
の蛋白質を細胞抽出物から精製すること、および特にそ
の様な蛋白質を利用可能な形に再生することに関し、特
別な問題を生みだした。ＤＮＡ組み替え手法における最
近の発展は、異種由来の蛋白質を宿主微小生物体、たと
えばバクテリア、酵母および動物細胞で合成することを
可能とした。これは、異種の蛋白の発現に必要なＤＮＡ
配列で宿主細胞を形質転換することにより行われる。も
し、形質転換した宿主細胞でのＤＮＡ配列の発現レベル
が高ければ、その宿主細胞の中に大量の異種由来の蛋白
質が産生される。典型的には、細胞はたいていのこれら
の異種由来の蛋白質を、その細胞の細胞質内の封入体に
隔離する。この様にして隔離された蛋白質は、主として
異種由来のタンパク質のモノマーが、典型的には疎水相
互作用により多数互いに結合したものから成り立ってい
る、不溶性の蛋白質の凝集物の形をしている。この不溶
性の、凝集物形では、蛋白質は典型的にはその好まし
い、生物活性のある、すなわちその目的とするｉｎ ｖ
ｉｖｏの生理応答に効果を持つことができるコンフォメ
ーションをとっていない。

【０００７】それ故、不溶性凝集物から生物活性のある
形での蛋白質を精製する際には、蛋白質の生物活性のあ
るコンフォメーションを保つか、最終的には回復するこ
とができる様なやり方で、蛋白質凝集物を可溶化する方
法が必要である。

【０００８】形質転換した細胞から蛋白質を含む封入体
を回収する最初のステップでは、通常、封入体を取り出
すため、酵素処理と機械的破壊を組み合わせて細胞を破
壊する。封入体に含まれる蛋白質凝集物は不溶性である
ので、得られた細胞物質を遠心すると、異種由来の蛋白
質が、不溶性の凝集物の形ではあるが、主要な量含まれ
るペレットを得る。そのペレットは、脂質、リポポリサ
ッカライドおよび、痕跡量の核酸をも含んでいる。

【０００９】蛋白質を再生するのに典型的に用いる次の
ステップは、不溶性蛋白質凝集物を「可溶化」すること
である。これは、強いカオトロープ、例えばグアニジン
塩酸で膜ペレットを処理し、蛋白質を変性させ、溶解さ
せることにより達成することができる。「可溶化」は、
例えば尿素のように「溶解」するが、目的とする蛋白質
を完全には変性させない、やや弱いカオトロープを用い
ることでも効果があるかも知れない。米国特許第４、６
５２、６３０号を参照。当業者は、どのようにその当業
者特有の方法に合ったカオトロープを選ぶか理解するで
あろう。

【００１０】可溶化剤もしくはカオトロープは、蛋白質
のコンフォメーション要因をこわし、可溶化剤の強さに
応じた程度に、その蛋白質を「アンフォールド」する。
アンフォールディングの程度が大きいほど、その蛋白質
が示す生物活性の程度は減少する。一つもしくは複数
の、上述の「可溶化法」により得られた、可溶化した蛋
白質の溶液は、用いた特定の可溶化法に応じた、アンフ
ォールディングのある段階にある異種由来蛋白質から成
っている。目的蛋白質の生物活性のあるコンフォメーシ
ョンを得るためには、「リフォールド」しなければなら
ない。可溶化した蛋白質の溶液は、封入体および不溶性
細胞断片由来の、他の可溶性のもしくは可溶化したリン
脂質、リポポリサッカライド、蛋白質そして核酸をも含
んでいる。これらはもちろん、異種由来蛋白質をリフォ
ールディングさせる前または後に除去しないといけな
い。

【００１１】可溶化した蛋白質をリフォールドさせるの
に用いる、典型的なリフォールディング法は、大容量の
希釈溶液、通常緩衝液で、可溶化剤を希釈することを含
んでいる。可溶化剤の濃度が、蛋白質のコンフォメーシ
ョン要因がそれ自身有効となる希釈レベル以下になる
と、その蛋白質は自発的に可溶性の、生物活性のあるコ
ンフォメーションにリフォールドする。蛋白質による
が、一旦この「至適希釈レベル」に達すると、リフォー
ルディングは数秒以内もしくは数分以内もしくはこれ以
上の時間以内に始まる。

【００１２】典型的には、希釈は希釈の至適レベルに達
するのに必要な量の希釈溶液と可溶化した蛋白質溶液を
混ぜるという一つのステップで行われる。この希釈法
は、「バッチ」希釈として知られるが、その名前の由来
は希釈溶液を一回の操作で可溶化した蛋白溶液に加える
手順に由来する。このバッチ法を可溶化した蛋白質のリ
フォールディングに用いることには、リフォールディン
グを商業スケールの精製手順で用いるような、大規模な
量で行うとき顕著になる、数々の欠点がある。

【００１３】可溶化した蛋白質溶液は、少なくともある
程度リフォールディングするためには、その体積の通常
何倍も希釈しなければならないため、商業ベースで蛋白
質を精製する方法において、一時に扱う全体積はたいへ
ん大きなものになる。この方法は、深刻な廃棄物問題と
なる、大量の希釈されたカオトロープ溶液を生み出す。

【００１４】例えば、バクテリアによって産生した目的
蛋白質を含む封入体（ＩＢ）を可溶化するのに、だいた
い５−８Ｍの尿素を必要とする。この溶液は、再生を起
こさせるためには３０−５０倍に希釈しなければならな
い。結果として得られる大量の希釈された尿素は、その
量が増えるにつれ深刻な廃溶液処理施設への問題を起こ
す。

【００１５】要するに従来の方法はいづれも、商業生産
に利用したときには希釈尿素廃溶液を生みだし、困難で
高価な廃棄物問題を生ずる。

【００１６】

【課題を解決するための手段】ＤＮＡ組み替え技術によ
りバクテリアや他の細胞から得られた、封入体や不溶性
蛋白質を可溶化するのに用いた、尿素のようなカオトロ
ープの高濃度溶液を再利用する方法が必要であると、長
い間考えられてきた。

【００１７】われわれは、高濃度カオトロープ溶液を、
上述した蛋白質から限外ろ過により分離し、引き続きバ
ッチまたは連続方法において、再利用できることを発見
した。例えば、尿素は、分子量が６０と目的とする蛋白
質に比べたいへん小さい；限外ろ過膜は、カットオフ分
子量（ＭＷＣＯ）が尿素より大きく、目的蛋白質より小
さくなるよう選ばないといけない。その膜は、以下で記
述するプロキモシンの方法の場合約１０−１１という、
高ｐＨに維持しておかないといけない。通常の技量を持
つ作業者は、彼の対象とする方法に合った限外ろ過膜を
選ぶことができるであろう。

【００１８】

【作用】本発明は、蛋白質の精製に関し改良した方法を
供する。その精製では、不溶性形の該蛋白質または該蛋
白質の前駆体は、該前駆体もしくは該蛋白質の遺伝子情
報を持つ宿主生物より産生し、その該不溶性形はカオト
ロープにより該不溶性形を可逆的に変性させることによ
り可溶化して該蛋白質の可溶性形をつくり、ついでカオ
トロープを除去し、該可溶化形を元に戻して、該蛋白質
または該前駆体の可溶性の天然形のものを得るが、そこ
では以下の改良からなる： ａ）限外ろ過により、該可溶化変性形該蛋白質または前
駆体から、該カオトロープの実質的部分を除去し；そし
て ｂ）ステップａ）で除去した該カオトロープを加え、追
加して加えた該不溶性形の該蛋白質または前駆体に対
し、効果的な変性に必要な量のカオトロープを供給し、
それに見合う量の該可溶性形の該蛋白質または前駆体を
生成しする。

【００１９】好ましい面に関しては、この方法は適当な
ベクターで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）によ
り産生され、尿素によって可溶化したキモシンまたはプ
ロキモシンを調製するのに用いられる。

【００２０】この方法の別の面に関しては、少なくとも
５０％の尿素が変性された蛋白質より除去され、バッチ
または連続法のいずれかで再利用される。

【００２１】さらに別の面では、この方法は以下の限外
ろ過膜クリーニングステップを含んでいる： ｃ）保持容量の少なくとも３倍の量のｐＨ１０．３−１
０．５の希釈緩衝液を高速流で流すことにより、システ
ムを洗浄し； ｄ）保持容量の少なくとも３倍の量の５０−５４℃の脱
イオン水（ＤＩＷ）を高流速で流すことにより、洗浄
し； ｅ）ｐＨを９．５−１１．０に保持しながらｄ）のステ
ップを繰り返し； ｆ）遊離の塩素濃度が１８０−２００ｐｐｍになるよう
次亜塩素酸ナトリウム溶液を加え； ｇ）該次亜塩素酸溶液を２０から６０分再循環させる；
そして ｈ）該塩素レベルが０．１５ｐｐｍ未満になるまでＤＩ
Ｗで洗浄する 本発明の方法は一般的なバッチ法で用いることができ、
また米国特許第４、９９９、４２２号で記載しているよ
うな連続方法にも容易に応用できる。

【００２２】この方法は、ＤＮＡ組み替え技術を用い、
バクテリアから産生したいろいろな蛋白質の生産に応用
できる。キモシンおよびプロキモシンに加えてその様な
蛋白質としては、インシュリン、プロインシュリン、牛
すい臓リボヌクレアーゼ、ライソザイム、牛すい臓トリ
プシンインヒビター、インタフェロン類、レニン、プラ
スミノーゲン活性化因子、プロラクチン、ヒトα−１ト
リプシンインヒビター、ファクターＶＩＩＩ、およびこ
れらと同様のものがある。

【００２３】尿素の再利用によるプロキモシンの方法の
要約 プロキモシンの封入体を、５から８Ｍの尿素溶液に溶解
し、そのタンパク質の変性を促進するために、ｐＨをア
ルカリ性に調整する。変性した溶液は次いで、限外ろ過
（ＵＦ）システムにより、その物質を再循環させながら
濃縮する。低分子（尿素と水）はろ液に出る。次いでろ
液は、次のプロキモシンを溶解するバッチでＩＢを溶か
すための尿素の供給に利用する。ＵＦ膜はバッチごと
に、熱水洗浄、アルカリｐＨの熱水の循環による洗浄、
高ｐＨの熱ブリーチの循環による洗浄、それに複数回の
水洗浄でクリーンにする。

【００２４】膜の選択 分子量約４０、０００のプロキモシンの場合、以下の膜
をカオトロープである尿素の再利用のために検討した。

【００２５】Ｋｏｃｈ／Ａｂｃｏｒ ＨＦＫ−１３１−ＶＳＶ；１０，０００ ＭＷＣＯ，ポ
リスルフォン ４インチ らせん形 ２インチ らせん形 ＨＦＫ−１３１−ＶＳＶ ＸＬ−１０００，１０，００
０ ＭＷＣＯ，ポリスルフォン ４インチ らせん形 ＭＳＤ−３２８−ＶＳ Ｖ；５，０００ ＭＷＣＯ，ポ
リスルフォン ４インチ らせん形 ミリポア ＰＴＧＣ；１０，０００ ＭＷＣＯ，ポリス
ルフォン ２インチ らせん形 ミリポア ＰＬＧＣ；１０，０００ ＭＷＣＯ，セルロ
リック ２インチ らせん形 ミリポア ＰＴＴＫ；３０，０００ ＭＷＣＯ，ポリス
ルフォン ２インチ らせん形 ＩＷＴ メンブラロックス Ｐ１９−４０−２００Ａ−
Ｚ−Ｅ；２０，０００ ＭＷＣＯ，酸化ジルコニウムセ
ラミック膜 プロキモシンに関して好ましい膜は、Ｋｏｃｈ／Ａｂｃ
ｏｒ ＨＦＫ−１３１−ＶＳＶ；１０，０００ ＭＷＣ
Ｏ，ポリスルフォン ４インチ らせん形（コッホ メ
ンブレン システム（Ｋｏｃｈ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓ
ｙｓｔｅｍ）、Ｉｎｃ．，Ｍａｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｗ
ｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ ０１８８７）である。この
開示を受けることにより知見を得た、当業者は、カオト
ロープの流出、タンパク質の保持および、繰り返し可能
で実用的な膜クリーニング手順といったことに対する考
慮に基づき、彼または彼女固有のシステムに対する膜を
選択することができるであろう。

【００２６】プロキモシンの方法では、限外ろ過（Ｕ／
Ｆ）への供給液は、約１％の懸濁した固体を含んでい
る。この値は、最小の保持容量で最大の膜表面積となる
パッキングという利点がある、らせんＵ／Ｆシステムを
利用できるのに、十分に低い値である。らせん状の形状
およびその結果として得られる高い、膜面積・保持容量
比は、重要な設計上のポイントである、より高いバッチ
濃度を可能とする。

【００２７】膜のクリーニング 封入体（ＩＢ）を溶解した液流は、適切なクリーニング
を行わないと、使用ごとに累積する、本質的にひどい、
かつ急速な（２０−５０分）膜の目詰まりをひきおこす
ものである。プロキモシンのバッチ方法では、クリーニ
ングが必要とされるまでの最大使用時間は６０分であ
る。

【００２８】バッチ濃縮の最後では、濃縮液はＵ／Ｆシ
ステムから再生希釈タンクに、排出・ポンプされる。濃
縮液の約１０−１５％が典型的には、膜やパイプの表面
に吸着して、Ｕ／Ｆシステムや再循環タンクに残ってい
る。能率よくこの物質をＵ／Ｆシステムから除き、かつ
関連産物を失わないために、システムを早い流速（１９
００ ｆｔ² のシステムで ３５０ｇｐｍ）の、少な
くとも３倍の保持容量（全量約１８０ ガロン）のｐＨ
１０．４の希釈緩衝液で洗浄する。この洗浄は、ＣＩＰ
（適切に清浄な）タンクから、Ｕ／Ｆシステムを経て、
希釈タンク、次いで再生タンクまで流す。

【００２９】可能な限り最大の再生収率を得るために
は、なるべく多くの生成物を、ほとんど即時の希釈レー
トで除去する事が重要である。ゆっくりした希釈では、
顕著で急速な酵素活性の損失が引き起こされる。さら
に、クリーニング行程に入る前の適切な洗浄は重要であ
る。というのは、いかにシステムがよく洗浄されている
かで、化学的な洗浄剤の消費量が大きく影響されるから
である。次の洗浄は、廃液処理施設まで、熱い５０−５
４℃の脱イオン水（ＤＩＷ）を流す。少なくとも保持容
量の３倍を再び高い流速で流すことが推奨される。この
洗浄からの流出液の電導度は、供給したＤＩＷの電導度
まで到達しないといけない。つぎにＣＩＰタンクを、５
０−５４℃のＤＩＷで満たす。この熱いＤＩＷの循環を
開始し、水酸化ナトリウムでｐＨを１０．５に調整す
る。このシステムを、温度およびｐＨを維持したまま約
２０分間循環させ（保持液、浸出液ともＣＩＰタンクに
リサイクルする）、ついでシステム内容物を廃液処理施
設に排出する。

【００３０】次いでシステムを５０−５４℃のＤＩＷで
再びみたし、Ｕ／Ｆを通してシステムを循環させなが
ら、ｐＨを水酸化ナトリウムで再び１０．５とする。一
旦ｐＨと温度が安定したら、遊離塩素濃度が１８０−２
００ｐｐｍになるまでブリーチを加える。代表的なブリ
ーチ消費量は、１９００Ｆｔ²の商用システムの洗浄ご
とに、５％のブリーチ溶液２０ガロンと算定される。高
いブリーチ濃度と、効率のよい洗浄は消費するブリーチ
溶液の量を減少させる。ブリーチは、遊離塩素レベルを
計測しながら、徐々に加える。遊離の塩素は、膜表面の
ゲル層を酸化することにより消費され、遊離塩素レベル
は低下する。最初少しブリーチを加えたところでは、ｐ
Ｈも低下する。ブリーチを加える際にｐＨが低下しない
ことは、膜がほとんどきれいであることのよい指標であ
る。ＣＩＰタンク中の溶液は、膜がきれいになるに従
い、きれいになる（濁度が減少する）。ブリーチ処理中
にＤＩＷの流量レートは劇的に増え、５０−５５℃で、
ＴＭＰが４２．５ｐｓｉｇのとき、８０−１００ＧＦＤ
の流量レートに達する。ブリーチは最小２０分から最大
６０分循環させる。膜の寿命は、遊離塩素レベルが２０
０ｐｐｍを越えかつ、ｐＨが１１を越えかつ、温度が５
７℃を越えると、逆の影響を受ける。これらいづれの条
件にある時間は、厳しくモニタし、制御されないと行け
ない。一旦膜がきれいになったなら、ブリーチ溶液は廃
液処理施設に排出する。それから、システムは遊離塩素
濃度が０．１５ｐｐｍ未満のレベルになるまで、少なく
とも保持容量の３倍の５０−５４℃のＤＩＷで洗浄す
る。ＣＩＰタンクは次いで、室温のＤＩＷで満たし、シ
ステムを循環させる。これは、次のバッチの供給ストッ
クで満たす前にシステムを冷却し、クリーニング行程の
効果を見る指標であるＤＩＷ流量をチェックするために
ある。システムからは、次の供給ストックを入れる直前
に、すべてのＤＩＷを排出する。システムに供給液を満
たす直前に可能な限り多くの水を排出することが重要で
ある。なぜなら、その膜は湿った状態おかれなければな
らず、また尿素再利用方法での水のバランスが、再利用
できる浸出液の量を制限するからである。

【００３１】

【実施例】実施例１ Ａ．プロキモシン封入体の産生 遺伝子的に修飾したバクテリアからのプロキモシンの調
製は、文献でよく知られている。例えば、国際特許第Ｗ
Ｏ ８３／０４４１８、および米国特許第４，９７７，
２４８を参照。

【００３２】手短に説明すると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）を液体栄養培地で培養し、遠心によりペレットにす
る。ペレットにした細胞は、小量の緩衝液に再懸濁し破
裂させ、凋密にパックされた不溶性の凝集物（ＩＢ）の
形をしたプロロキモシンを放出させる。凝集物は２回目
の遠心行程で回収するが、たいていの残りの細胞由来タ
ンパク質や残骸は懸濁液に残る。プロキモシンは、この
ようにして細胞物質の塊から急いで精製する。凝集物を
酸で処理することにより、残っている細胞を殺し、残っ
ているＤＮＡをこわすことができる。ついでプロキモシ
ン凝集物は、アルカリ性尿素溶液で変性させ可溶化す
る。

【００３３】Ｂ．限外ろ過ユニットへのプロキモシンの
供給 １７９３ｇの未希釈の封入体懸濁液（ＩＢ）に、５．８
ｇの燐酸２ナトリウムを含む１０．４Ｍ尿素溶液４４４
０ｇを加えた。この溶液は、尿素が飽和しており、２３
℃での密度は１．１５５−１．１５９である。上記懸濁
液を、９０分間もしくはＩＢが溶けるまで撹はんした。
ついで、水酸化ナトリウムを加えてｐＨを１０．３−１
０．７に上げた。この操作で、体積は約５．５ｌ、密度
は１．１２９となる。この溶液をＵ／Ｆシステムに供給
し、２．５−３．５倍に濃縮しする。

【００３４】Ｃ．限外ろ過 流出と収率のデータは、ＩＢ溶解タンクの排出管に接続
した、Ｋｏｃｈ／ＡｂｃｏｒパイロットプラントＵ／Ｆ
ユニットで取得した。パイロットプラントは、プラント
の水に関して６４ｐｓｉｇで３５ｇｐｍの流速を供給す
る遠心ポンプ、２５０Ｌ再循環タンク、および２つの標
準的なＫｏｃｈ／Ａｂｃｏｒ 直径４インチらせんハウ
ジングを直列に接続したものから構成されていた。２０
０Ｌの浸出液サージタンクをパイロットユニットの上に
おき、浸出液および、簡単に重力流で濃縮液と組み合わ
せた浸出液を、集められるようにした。保持時間は７５
分を越えることはなかった。１２回の試験濃縮と、１１
回のクリーニングを行い、ＨＦＫ−１３１−ＶＳＶ １
０，０００ ＭＷＣＯのＫｏｃｈ／Ａｂｃｏｒポリスル
フォン膜の流出と保持能力を評価した。高速連続運用
は、膜の繰り返しクリーニングと、遠心ポンプが、３．
３倍の高濃縮倍率で使用できることを示した。

【００３５】Ｄ．溶解の繰り返し 密度が１．１１６で尿素の濃度が約７．３Ｍの再利用浸
出液３３４３ｇに、５．８ｇｍｓの固体の燐酸２ナトリ
ウムを加え、ついで固体の尿素を１１００ｇｍｓ加え
た。混合物は２３℃に温めて、浸出液中で固体の尿素を
溶解した。これは、約１０．４Ｍの尿素濃度で、２３℃
で１．１５７−１．１５９の密度を持つ飽和溶液を生成
する。飽和尿素溶液をＩＢ溶液に供給しながら運用する
ことは、バッチごとに尿素の濃度を制御するときによい
方法である。１７９３ｇの未希釈のＩＢに、上で調製し
た１０．４Ｍ尿素溶液を加えた。混合物は、ＩＢが溶け
るまで９０分間、２０℃で撹拌した。ついで、水酸化ナ
トリウムを加え、ｐＨを１０．３−１０．７に上げた。
（収率を改善するには、１０．３−１０．７よりもわず
かに高いｐＨレンジが推奨される。）この操作は、体積
約５．５Ｌ、密度１．１２９の溶液を生成する。このも
のは、ついでＵ／Ｆシステムに供給され、２．５−３．
５倍に濃縮された。１０回の繰り返しに対するプロキモ
シンの平均収率は９３．９％であった。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】キモシンあるいはプロキモシンの調製のた
   めの改良方法であり、不溶性形の該キモシンまたはプロ
   キモシンは、該キモシンもしくはプロキモシンをコード
   する遺伝子を持つ大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）より産生し、
   その該不溶性形は尿素により該不溶性形を可逆的に変性
   させることにより可溶化して、可溶性形の該キモシンま
   たはプロキモシンとし、ついで該尿素を除去し、該可溶
   化形を再生させ、それにより、該キモシンまたはプロキ
   モシンの可溶性の天然形のものを得ることからなる改良
   方法であって： ａ）限外ろ過膜に該尿素を通過させることにより、該可
   溶化変性形の該キモシンまたはプロキモシンから、少な
   くとも５０％の該尿素を除去し；そして ｂ）ステップａ）で除去した該尿素を加え、追加して加
   えた該キモシンまたはプロキモシンによる、該不溶性形
   の増加量に対し、効果的な変性に必要な量の尿素を供給
   し、該可溶性形の該キモシンまたはプロキモシンを生成
   し；該膜を以下のように定期的にクリーニングする： ｃ）保持容量の少なくとも３倍の量のｐＨ１０．３−１
   ０．５の希釈緩衝液の高流速を流すことにより、システ
   ムを洗浄し； ｄ）保持容量の少なくとも３倍の量の５０−５４℃の脱
   イオン水を高流速で流すことにより、洗浄し； ｅ）ｐＨを９．５−１１．０に保持しながらｄ）のステ
   ップを繰り返し； ｆ）遊離の塩素濃度が１８０−２００ｐｐｍになるよう
   次亜塩素酸ナトリウム溶液を加え； ｇ）該次亜塩素酸溶液を２０から６０分再循環させ；そ
   して ｈ）該塩素レベルが０．１５ｐｐｍ未満になるまで脱イ
   オン水で洗浄する。