CZ283304B6

CZ283304B6 - Způsob renaturace denaturovaných bílkovin

Info

Publication number: CZ283304B6
Application number: CS872495A
Authority: CZ
Inventors: Rudolph Dr. Rainer; Stephan Dr. Fischer
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1986-04-08
Filing date: 1987-04-07
Publication date: 1998-02-18
Also published as: DE3783497D1; HUT44046A; FI93842B; CA1304191C; AU7119087A; FI871522A; IL82091A; IE870695L; DE3611817A1; CZ249587A3; ES2038969T3; DD260280A5; JPH0742307B2; KR900005279B1; IE60064B1; JPS62242697A; IL82091A0; HK46896A; HU198514B; GR3007605T3

Abstract

Způsob renaturace denaturovaných bílkovin v roztoku v renaturačním pufru, je založen na tom, že se denaturované bílkoviny, určené k renaturaci postupně rozpouštějí až do dosažení své kritické koncentrace ve zvoleném pufru, čímž za vzniku zprohýbaného meziproduktu, který posléze přejde v konečnou renaturovanou bílkovinu a tvorby inaktivních agregátů bílkoviny, dochází ke snížení koncentrace denaturované bílkoviny. Postup spočívá v tom, že se přidává další podíl bílkoviny, určené k regeneraci v množství, potřebnému k dosažení kritické koncentrace. ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu renaturace denaturovaných bílkovin. Výrazem renaturace bílkovin se v rámci této přihlášky rozumí vytvoření nebo znovuvytvoření normální biologické funkce bílkovin, přičemž se předpokládá, že se přitom znovuvytvoří přírodní sekundární, terciární a popřípadě kvartemí struktura.

Dosavadní stav techniky

Problém renaturace bílkovin má velký význam, poněvadž biologicky aktivní bílkoviny se značně denaturují úkony na nich prováděnými, například při jejich oddělování od průvodních látek, a přitom zcela nebo zčásti ztrácejí zajímavou biologickou aktivitu. Renaturace má význam i u bílkovin, vyrobených synteticky nebo metodami genové technologie, poněvadž se přitom v mnoha případech získá jen správná primární struktura (tedy sekvence aminokyselin), avšak žádoucí využití biologické aktivity předpokládá, že se při renaturaci podaří vytvořit přírodní sekundární, terciární a popřípadě i kvartemí strukturu.

Z patentového spisu US č. 4 530 787 je již známo oxidovat syntetické bílkoviny, které obsahují redukovaný cystein, jodosobenzoátem, za obnovení jejich biologické aktivity. I kdyby tato metoda byla obecně použitelná, vyřešila by pouze dílčí problém renaturace bílkovin.

G. Zettlmeissl, R. Rudolph aR. Jaenicke (Biochemistry, sv. 18, 1979, str. 5567 až 5575) prováděli pokusy s renaturaci oligomemího enzymu, laktátdehydrogenázy, za obnovení její terciární struktury a zjistili přitom, že při takové renaturaci probíhají dvě konkurující si reakce, a to jednak renaturace, jednak tvorba inaktivních agregátů. Pro dosažení dobrých výtěžků při renaturaci muselo být přitom dbáno toho, aby nebyla překročena mezní koncentrace enzymů v roztoku. Obecný způsob renaturace bílkovin však z jejich studie nelze odvodit.

Úkolem vynálezu proto je vytvořit způsob, který by zásadně umožňoval zlepšení renaturace bílkovin.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob renaturace denaturovaných bílkovin v roztoku v renaturačním pufru, při němž se denaturované bílkoviny, určené k renaturaci, postupně rozpouštějí až do dosažení své kritické koncentrace ve zvoleném pufru, čímž za vzniku zprohýbaného meziproduktu, který posléze přejde v konečnou renaturovanou bílkovinu, a tvorby inaktivních agregátů bílkoviny, dochází ke snížení koncentrace denaturované bílkoviny. Postup spočívá v tom, že se přidává další podíl bílkoviny, určené k regeneraci, v množství, potřebném k dosažení kritické koncentrace.

Způsob podle vynálezu spočívá v tom, že co nejvyššího výtěžku renaturované bílkoviny při zároveň maximální rychlosti renaturace lze dosáhnout tehdy, když se v roztoku nepřekročí určitá kritická hodnota koncentrace denaturované k renaturaci určené, bílkoviny, přičemž tato hodnota závisí na druhu příslušné bílkoviny a na podmínkách, za nichž se renaturace provádí. Přitom záleží na tom, aby poměr obou vzájemně si konkurujících reakcí, totiž jednak nežádoucí tvorby inaktivní bílkoviny (například agregátů), jednak tvorby zprohýbaného meziproduktu, který posléze přejde v konečnou renaturovanou bílkovinu, se posunul tak, že bude jen co nejmenší podíl inaktivní bílkoviny. K tomu je zapotřebí mít na zřeteli kritickou koncentraci bílkoviny,

- 1 CZ 283304 B6 určené k renaturaci, jež je specifická pro příslušnou bílkovinu a pro podmínky zpracování, kinetiku renaturace a dobu až do vytvoření zprohýbaného meziproduktu.

Tyto tři parametry, podstatné pro způsob podle vynálezu, je však možno snadno stanovit. Kritickou koncentraci je možno zjistit z kalibrační křivky, která se získá, když se ve zvoleném renaturačním pufru vytvoří různé koncentrace denaturované bílkoviny a měří se dosažený konečný výtěžek renaturované bílkoviny za danou dobu. Kritická koncentrace odpovídá hodnotě, při níž se získá největší výtěžek renaturované bílkoviny. V rámci vynálezu přichází jakožto kritická koncentrace v úvahu koncentrace, odpovídající přibližně 10 % nejvyšší koncentrace.

Rovněž renaturační kinetiku lze stanovit známými metodami. Přitom se při maximální možné koncentraci určuje doba, potřebná pro přeměnu na renaturovanou bílkovinu. Dobu až do vytvoření zprohýbaného meziproduktu lze určit celou řadou způsobů. Jedna z metod určení spočívá v měření cirkulámího dichroismu (CD). Přitom se účelně volí taková vlnová délka, při níž se získá velký signál, a pak se měří příslušná křivka, přičemž zpravidla dochází v poměrně krátké době k prudkému vzestupu a pak se křivka zploští, jakmile se vytvořil zprohýbaný meziprodukt. Další možnost spočívá v tom, že se sleduje mizení skupin SH následkem tvorby intramolekulámích disulfidových můstků. Zde je však třeba dbát toho, že nesmějí vznikat žádné intermolekulámí disulfidové můstky, což lze sledovat kontrolou molekulové hmotnosti, která by se v posledně uvedeném případě zvyšovala.

Ještě jinou možností je měření fluorescence. Spočívá na tryptofanové, respektive tyrosinové fluorescenci, která se mění, když se aromatické zbytky převedou do hydrofobní oblasti zprohýbané bílkoviny. Další možností je omezená proteolýza, poněvadž s přibývající tvorbou zprohýbaného meziproduktu se snižuje i proteolytické štěpení. Je rovněž možné provést toto určení hydrodynamickým měřením. Například se zde měří limitní viskozitní číslo, poněvadž zprohýbaný meziprodukt vede ke vzniku roztoku o nižší viskozitě.

Pro praxi postačuje určit kritickou koncentraci a dobu až do vytvoření zprohýbaného meziproduktu, chráněného proti vedlejší reakci, vedoucí k inaktivní bílkovině, začít vždy s kritickou koncentrací a po odeznění tvorby zprohýbaného meziproduktu znovu doplnit denaturovanou bílkovinu náhradou za bílkovinu, mezitím přeměněnou a z roztoku spotřebovanou. Toto se může dít postupně tím, že se předem určí doby a kritické koncentrace a pak vždy po odeznění tvorby meziproduktu se nahradí známé množství přeměněné denaturované bílkoviny. Alternativně je možno způsob podle vynálezu provádět i nepřetržitě tím, že se vždy nově přidá právě tolik denaturované bílkoviny, kolik jí odchází tvorbou zprohýbaného meziproduktu. Tímto způsobem je možno renaturaci provádět cyklickým postupem, při němž se například bílkovina, určená k renaturaci, rozpuštěná ve vhodném rozpouštědle, například v silně zředěné kyselině chlorovodíkové, nebo v lyofilizované formě nepřetržitě přivádí do renaturačního reaktoru vždy v takovém množství, že optimální renaturační koncentrace zůstává zachována. Současně se nepřetržitě přivádí renaturační pufr v takovém složení, že reakční podmínky, tedy hodnota pH, koncentrace látek a podobně, zůstávají konstantní. Příslušnou konstrukcí reaktoru, který může být vytvořen například v podobě smyčky, a rychlostí proudění, definovanou rychlostí a množstvím přidávané bílkoviny a pufru, je možno určit dobu pobytu v reaktoru, která odpovídá době až do vytvoření zprohýbaného meziproduktu. Poté se reaktivovaná bílkovina nepřetržitě odebírá, například oddělením pomocí ultrafiltrace, reverzní osmózou a podobně, a jako retentát popřípadě podrobí rozdělení na inaktivní agregáty a aktivní bílkovinu. Výhodně se nepřetržitý postup provádí tak, že se oddělený roztok pufru přivádí nepřetržitě zpět do reaktoru.

Při nepřetržitém provádění způsobu podle vynálezu je výhodné přidávat zpočátku jako u nekontinuálního postupu denaturovanou bílkovinu výše popsaným způsobem tak dlouho, až se dosáhne optimální koncentrace renaturované nativní bílkoviny. Jakmile je toho dosaženo, začne se s nepřetržitým odebíráním poměrně koncentrovaného roztoku reaktivované bílkoviny a teprve

-2CZ 283304 B6 pak se přejde na skutečně zcela nepřetržitý postup. Počáteční fáze, v níž se ještě zvyšuje koncentrace reaktivované bílkoviny, je tedy předřazena vlastnímu nepřetržitému provádění. Za optimální koncentraci renaturované bílkoviny se přitom považuje nejvýše možná koncentrace, při níž se ještě nevyskytují žádné problémy, spočívající vtom, že se složky reakční soustavy stávají nerozpustnými.

Výhodně se při způsobu podle vynálezu používá lyofilizované denaturované bílkoviny. Jde-li však o bílkovinu, která se rozpouští jen pomalu a obtížně, přidává se bílkovina v rozpuštěné formě, aby bylo možno definovaně dodržet časový průběh způsobu podle vynálezu.

Způsobem podle vynálezu se sice minimalizuje nežádoucí a s renaturací konkurující tvorba agregátů, nepotlačí se však úplně. Vzniklé inaktivní agregáty však mají podstatně vyšší molekulovou hmotnost a lze je proto snadno oddělit od renaturované bílkoviny dělicími postupy, které využívají tohoto rozdílu v molekulových hmotnostech, tedy například frakcionaci molekulárním sítem, popřípadě ultrafiltraci s vhodnými vylučovacími mezemi, gradientovým odstředěním a podobně. Takto oddělené agregáty se pak mohou po rozpuštění znovu použít při renaturačním postupu.

Jako renaturační pufry přicházejí v úvahu pufry o složení, známém pro tyto účely. Hodnota pH musí být v rámci takové hodnoty pH, při níž má příslušná bílkovina dobrou stabilitu, účelně je blízko hodnoty pH maximální stability. Aby se vyloučil denaturující vliv nečistot, například těžkých kovů, pracuje se účelně v přítomnosti komplexotvomých látek, jako jsou EDTA a podobné sloučeniny. Tak například je v případě laktátdehydrogenázy použitelný fosfátový pufr o pH 6 až 8, který obsahuje přibližně 1 mmol EDTA a 1 mmol DTE (dithiothreitol). Pro lysozym se osvědčil slabě alkalický pufr Tris/HCl, který kromě EDTA obsahuje látku, obsahující skupiny SH a malé množství příslušného disulfidu. Pro renaturací tPA je vhodný například reaktivační pufr, popsaný v německém patentovém spisu (německé patentové přihlášce č. P 3 537 708). Pro četné další bílkoviny jsou známy vhodné renaturační pufry, neboje lze po několika předběžných pokusech nalézt na základě známých vlastností bílkoviny, zejména stability vůči pH, obsahu skupin SH, citlivosti na přítomnost těžkých kovů a podobně.

Bylo známo, že pro renaturací nemají být překročeny určité mezní hodnoty koncentrací. Novým je poznatek, že větší množství denaturované bílkoviny nevyžadují, jak by se dalo očekávat, větší množství roztoku k tomu, aby se získala větší množství renaturované bílkoviny, nýbrž že je možno v tomtéž roztoku dále pracovat neustálým novým přidáváním nebo přerušovaným novým přidáváním denaturované bílkoviny a tím dospět k podstatně vyšším koncentracím renaturované bílkoviny, než bylo možno považovat za možné podle dosavadního stavu techniky.

Vynález je blíže objasněn dále uvedenými příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Pulzovaná reaktivace lysozymu

a) Příprava roztoku enzymu

Stanovení koncentrace (A: adsorpce 1% roztoku při 280 nm), nativní lysozym: A = 26,3, redukovaný lysozym: A = 23,7.

-3CZ 283304 B6

Stanovení specifické aktivity:

rozpustit 2 mg lysozymu v 1 ml roztoku 0,066 mol/1 fosforečnanu draselného, pH 6,2, koncentraci určit z absorpce UV, testovaný roztok: suspendovat 2,5 mg buněčné stěny mikroorganismu Micrococcus lysodeikticus v 10 ml roztoku 0,066 mol/1 fosforečnanu draselného, pH 6,2, test při teplotě 25 °C : 1 ml suspenze buněčné stěny plus 0,03 ml roztoku lysozymu (předem zředěného 1:40), sledovat mizení zákalu při 450 nm,

Specifická aktivita = 60 000 m. j./mg

Redukce/denaturace :

500 mg lysozymu inkubovat 3 hodiny při teplotě 25 °C v roztoku 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 8,6 + 6 mol/1 Gdn.HCl (guanidinhydrochlorid) + 150 mmol/1 DTE, pH upravit na hodnotu 3 a vzorek rozdělit

Podíl A:

Filtrace na gelu Sephadex G 25 F (objem sloupce = 270 ml) v roztoku 0,01 mol/1 HC1, píkové frakce se spojí a lyofilizují,

Podíl B:

Dialýza proti 3 x 1 litr roztoku 0,01 mol/1 HC1 při teplotě 4 °C , lyofilizace.

Oba postupy odsolení (podíl A aB) skýtají redukovaný lysozym, který se neliší v reaktivačních vlastnostech lyofilizovaný, redukovaný enzym se ponechá při teplotě -40 °C v atmosféře dusíku.

Reoxidace/reaktivace :

mg redukovaného lysozymu se rozpustí v 1 ml roztoku 0,01 mol/1 HC1, milipórová filtrace, stanovení koncentrace absorpcí UV, reoxidace při teplotě 25 °C zředěním v roztoku 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 8,2 + 1 mmol/l EDTA + 3 mmol/1 GSH (glutation) + 0,3 mmol/1 GSSG (oxidovaný glutation).

b) Stanovení kritické koncentrace renaturace

Redukce/reoxidace, jak je výše popsána, se provádí měněním koncentrace bílkoviny v reaktivační násadě. Výsledek ukazuje obr. 1, kde je graficky znázorněna závislost reaktivace redukovaného lysozymu na koncentraci po 20 hodinách reoxidace při teplotě 25 °C.

-4CZ 283304 B6

c) Doba až do vzniku zprohýbaného meziproduktu

Redukcí/reoxidací, jak výše popsána, se určí kinetika reaktivace redukovaného lysozymu při koncentraci bílkoviny 0,03 mg/ml, teplota 25 °C. Výsledek je graficky znázorněn na obr. 2.

d) Pulzovaná reaktivace redukovaného lysozymu

Předloží se 1,6, respektive 2,4 ml roztoku 0,125 mol/1 Tris/HCl, pH 8,2 + 1,26 mmol/1 EDTA + 2,75 mmol/1 GSH + 0,375 mmol/1 GSSG.

1. Pokus

V časových intervalech t = 10 minut přidat 20x vždy 20 mikrolitrů redukovaného lysozymu v roztoku 0,01 mmol/1 HC1. Zvýšení koncentrace v jednom pulzu: 0,11 - 0,13 mg/ml. Konečná koncentrace po 20 pulzech: 2,15 mg/ml.

Srovnávací aktivace bez pulzů: Jednorázový přídavek k obdržení stejné konečné koncentrace. Pufrové podmínky odpovídají po zředění výše uvedenému reoxidačnímu pufru.

Po 2 hodinách reaktivace při teplotě 25 °C :

pulzovaná reaktivace : 2200 m. j./mg porovnání bez pulzů: 470 m. j./mg

2. Pokus

V časových intervalech t = 10 minut přidat 20x vždy 30 mikrolitrů redukovaného lysozymu v roztoku 0,01 mol/1 HC1.

Zvýšení koncentrace v jednom pulzu: 0,034 - 0,042 mg/ml

Konečná koncentrace po 20 pulzech: 0,68 mg/ml.

Srovnávací aktivace: Jednorázový přídavek k dosažení stejné konečné koncentrace.

Po 24 hodinách reaktivace při teplotě 25 °C : pulzovaná reaktivace : 10 100 m. j./mg porovnávání bez pulzů: 1400 m. j./mg

Z těchto výsledků vyplývá, že výtěžek reaktivace se při koncentracích bílkoviny větších než 0,1 mg/ml plynule snižuje, při teplotě 25 °C je reaktivace za daných reoxidačních podmínek po 15 minutách téměř úplně skončena(obr. 2), pulzovanou reaktivací podle vynálezu je možno v porovnání s nepulzovanou reaktivací dosáhnout pětiaž sedminásobně vyššího výtěžku.

-5CZ 283304 B6

Příklad 2

Pulzovaná reaktivace LDH-M₄ (4M laktátdehydrogenáza)

a) příprava roztoku enzymu:

Suspenze LDH-M₄ (ze svalu vepře) v (NHO^SCL (výrobce: Boehringer Mannheim, objednací číslo : 107077) se odstředí a usazenina o objemu, rovném 1/6 původního objemu, se vyjme pomocí roztoku 0,1 mol/1 fosforečnanu draselného, pH 7,6 + 1 mmol/1 EDTA + 1 mmol/1 DTE, dialyzuje se proti 2 x 1 litru roztoku stejného pufru při teplotě 4 °C , určení koncentrace přes A = 14 (A = absorpce, l%ního roztoku při 280 nm) , test aktivity při teplotě 25 °C podle R. Hermanna, R. Jaenického a H. Rudolpha. Biochemistry, 20, 1981, str. 5195 až 5201 skýtá specifickou aktivitu = 300 m. j./mg

Denaturace/reaktivace

Denaturace: zředění 1:5 roztokem 0,1 mol/1 H₃PO₄, inkubace 6 minut při teplotě 0 °C.

Reaktivace: zředění 1:3 roztokem 0,1 mol/1 fosforečnanu draselného, pH 12,65 + 1 mmol/1 EDTA + 1 mmol/1 DTE při teplotě 20 °C, po smísení byla hodnota pH roztoku 7,6.

Stanovení kritické koncentrace renaturace

Denaturace/reaktivace se provádějí, jak je výše popsáno, za měnění koncentrace bílkoviny v denaturační vsázce.

Na obr. 3 je znázorněna zjištěná závislost reaktivace LDH-M₄ na koncentraci po denaturaci kyselinou, přičemž aktivita po 20 hodinách reaktivace při teplotě 25 °C je vynesena v závislosti na koncentraci.

c) Stanovení doby až do tvorby zprohýbaného meziproduktu

Denaturací/renaturací, jak je výše popsáno, se určí kinetika reaktivace kyselinou denaturované LDH-M₄ při koncentraci bílkoviny 0,01 mg/ml a teplotě 25 °C. Výsledek je graficky znázorněn na obr. 4.

d) Nepřetržitá reaktivace kyselinou denaturované LDH-M₄

Do uzavřeného reaktoru se nepřetržitě přivádějí kyselinou denaturovaná LDH-M₄ areaktivační pufr.

Použitý reaktivační reaktor je schematicky znázorněn na obr. 5.

Ze zásobníků A a B se nepřetržitě čerpadly Pi a P₂ přivádějí roztok enzymu a denaturační roztok adenaturují se ve směšovacím úseku V_b Roztok denaturovaného enzymu se nepřetržitě přivádí do renaturačního reaktoru V₂. Zároveň se do renaturačního reaktoru V₂ nepřetržitě přivádí

-6CZ 283304 B6 čerpadlem P₃ ze zásobníku G renaturační roztok. Renaturovaný roztok se nepřetržitě odvádí a shromažďuje ve sběrači frakcí. Složení uvedených roztoků a podmínky v reaktoru jsou tyto:

A: 7,43 mg/ml LDH-M4 v roztoku 0,1 mol/l fosforečnanu draselného, pH 7,6 + 1 mmol/1 DTE + 1 mmol/1 EDTA při teplotě 0 °C ,

B: denaturační pufr: 0,1 mol/l H₃PO₄ při teplotě 0 °C ,

C: renaturační pufr: 0,1 mol/l fosforečnanu draselného, pH 12,6 + 1 mmol/1 DTE + 1 mmol/1 EDTA při teplotě 25 °C (pH po smísení s B : 7,6),

Vi : Denaturační objem V¹ = 0,25 ml. Z toho plyne délka doby denaturace 3 minuty při teplotě 0°C.

V₂: Renaturační objem V² = 58 ml, teplota 25 °C ,

Rychlost čerpání: Pi : 1 ml/h

P₂: 4 ml/h

P₃: 10 ml/h.

Při dané velikosti reaktoru a rychlosti čerpání plyne pro střední dobu setrvání molekuly v reaktoru hodnota 2,9 hodiny.

Při provozu byly zachycovány vzorky po 2,5 ml a stanovena konečná reaktivace po 24 hodinách při teplotě 25 °C.

Obr. 6 ukazuje vzestup aktivity při plnění reaktoru. Přibližně po 4 hodinách se dosáhne konstantního výtěžku reaktivace.

Konečná koncentrace reaktivace:	0,5 mg/ml
Výtěžek: nepřetržitá reaktivace :	10,2 m. j./mg
Porovnání bez pulzů:	1,9 m.j./mg.

Výše uvedené výsledky ukazují, že způsobem podle vynálezu se dosáhne přibližně 5,4x vyššího výtěžku než při přímé reaktivaci při stejné konečné koncentraci.

Příklad 3

Pulzovaná reaktivace rec-tPA (tkáňový aktivátor plasminogenu)

a) Příprava refraktivních tělísek

Příprava refraktivních tělísek rozdrcením buněk a různými odstřeďovacími a propíracími postupy se prováděla způsobem podobným způsobu, popsanému v evropském patentovém spise č. EP-AL-0114 506, příklad 7 tPA je v tělískách znečištěna cizí bílkovinou, inaktivní a nerozpustná.

Solubilizace redukci/denaturací:

Refraktivní tělíska z 2,5 g buněk byla inkubována 3 hodiny při teplotě 25 °C v roztoku (10 ml) 0,1 mol/l Tris/HCl, pH 8,6 + 6 mol/l Gdn-HCl + 1 mmol/1 EDTA + 150 mmol/1 DTE, celková bílkovina v refraktivních tělískách po redukci : 41,5 mg, pH upravit na hodnotu 3 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a provést gelovou filtraci přes Sephadex G 25 F (objem sloupce = 270 ml) v 0,01 mol/1 HC1.

b) Stanovení závislosti reaktivace na koncentraci

Kyselá frakce redukované bílkoviny se s maximální reaktivovatelností (c = 0,83 mg/ml) reoxiduje při zředění 1:3 až 1:500 v roztoku 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 10,4 + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/1 L-argininu + 1 mg/ml BSA (sérový albumin skotu) + 1 mmol/1 GSH + 0,2 mmol/1 GSSG.

Podmínky reoxidace při různých zředěních se nastaví na konstantní hodnotu. Po 25 až 27 hodinách reoxidace při teplotě 25 °C se stanoví aktivita. Před měřením aktivity se koncentrace upraví přidáním reoxidačního pufru na stejnou konečnou hodnotu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1 a graficky znázorněny na obr. 7.

Tabulka 1

Závislost reaktivace rec-tPA na koncentraci

Koncentrace* Výtěžek** bílkoviny (Pg/ml) stimulovatelnost (faktor)

277

138

92.2

55.3

27,7

17.3

8,68

5,53

3,95

1,84

31.3

52.4

64.9

74.9

91.5

95.6

100,0

97,8

94,4

85,3

16,8

17,0

18.5

21.5

17.5

25,3

20.5

19,8

20.6

16,7 x Koncentrace bílkoviny při reaktivaci (celková bílkovina) xx Vztaženo na maximální hodnotu reaktivace

c) Stanovení kinetiky reaktivace

Redukce/reoxidace se provedou, jak je výše popsáno.

Vzhledem ke znečištění materiálu nebylo možno měřit dobu až do vzniku zprohýbaného meziproduktu přímo, nýbrž byla tato doba určena nepřímo přes kinetiku reaktivace a variaci četnosti pulzů, a to na přibližně 40 až 60 minut.

Obr. 8 znázorňuje kinetiku reaktivace rec-tPA při celkové koncentraci bílkovin 15 mikrogramů/ml při teplotě 20 °C. Reaktivace je vztažena na konečný výtěžek po 30 hodinách.

d) Pulzovaná reaktivace rec-tPA

-8CZ 283304 B6

V časových intervalech mezi 2 a 45 minutami bylo 15x přidáno vždy 10 mikrolitrů redukované rec-tPA v roztoku 0,01 mol/1 HC1 ke 300 mikrolitrům reaktivačního pufru (25 °C).

Reaktivační pufr před pulzovanou reaktivací:

0,15 mol/1 Tris/HCl, pH 10,5 = 1,5 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/1 L-argininu + 0,3 mmol/1 GSSG+ l,5mmol/l GSH, reaktivní pufr po přídavku redukované bílkoviny:

0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 10,4 + 1 mmol/1 EDTA + 0,33 mol/1 L-argininu + 0,2 mmol/1 GSSG + 1 mmol/1 GSH.

Zvýšení koncentrace v 1 pulzu: 18 až 27 mikrogramů/ml

Konečná koncentrace po 15 pulzech: 227 mikrogramů/ml

Měření aktivity se provádí po 24 hodinách reoxidace při teplotě 20°C. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 :

Tabulka 2

Pulzovaná reaktivace rec-tPA

Doba mezi pulzy (min)	výtěžek* (%)	stimulovatelnost (faktor)
2	31,3	7,1
10	38,6	8,1
20	39,5	9,0
30	44,8	8,2
45	45,8	7,8

x Vztaženo na maximální reaktivaci podle obr. 7.

Komentář:

U použitého výchozího materiálu se výtěžek reaktivace - vztaženo na použité množství bílkoviny - snižuje při koncentracích větších než 20 mikrogramů/ml (obr. 7). Stimulovatelnost přidáním CNBr-FSP (štěpné produkty fibrinu po působení bromkyanu) se ukazuje v rámci přesnosti měření jako nezávislá na reaktivační koncentraci (tabulka 1).

Při teplotě 20 °C činí poločas reaktivace za daných pokusných podmínek 7±2 hodiny.

Výtěžek reaktivace stoupá s prodlužující se dobou mezi aktivačními pulzy (Tabulka 2).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob renaturace denaturovaných bílkovin v roztoku v renaturačním pufru, při němž se denaturované bílkoviny, určené krenaturaci, postupně rozpouštějí až do dosažení své kritické koncentrace ve zvoleném pufru, čímž za vzniku zprohýbaného meziproduktu, který posléze přejde v konečnou renaturovanou bílkovinu, a tvorby inaktivních agregátů bílkoviny dochází ke snížení koncentrace denaturované bílkoviny, vyznačující se tím, že se přidává další podíl bílkoviny, určené k regeneraci, v množství, potřebném k dosažení kritické koncentrace.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se denaturovaná bílkovina přidává diskontinuálně vždy po uplynutí doby, potřebné k vytvoření zprohýbaného meziproduktu, v množství, potřebném k opětnému dosažení kritické koncentrace.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se denaturovaná bílkovina do reakční zóny přidává kontinuálně v množství, odpovídajícím rychlosti tvorby zprohýbaného meziproduktu a potřebném k opětnému dosažení kritické koncentrace.
4. Způsob podle nároků laž3, vyznačující se tím, že se inaktivní agregáty bílkoviny, vznikající v průběhu reakce jako nežádoucí vedlejší produkt, oddělí od renaturované bílkoviny na základě své vyšší molekulové hmotnosti a po rozpuštění se opět podrobí renaturaci.
5. Způsob podle nároků laž4, vyznačující se tím, že se výchozí denaturované bílkoviny užijí v lyofilizované formě.
6. Způsob podle nároků laž4, vyznačující se tím, že se výchozí denaturované bílkoviny použiji v předem rozpuštěné formě.